سلول و بافت
فصلنامه

ایجاد یک سازه لنتی ویروسی نوترکیب حاوی ژن PDX1 کلون شده با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

عظیمه اخلاق پور 1
محسن بصیری 2
مریم مبارک قمصری 3
سیده نفیسه حسنی 4

1 استادیار، گروه سلول‫های بنیادی و سرطان، دانشکده زیست فناوری، دانشگاه تخصصی فناوری‫های نوین آمل، آمل، ایران.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

2 دکتری تخصصی، گروه سلول‫های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، موسسه زیست شناسی و فناوری سلول‫های بنیادی رویان، تهران، ایران‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

3 استادیار، گروه زیست فناوری میکروبی، دانشکده زیست فناوری، دانشگاه تخصصی فناوری‫های نوین آمل، آمل، ایران‬‬‬‬‬‬

4 دانشیار، گروه سلول‫های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، موسسه زیست شناسی و فناوری سلول‫های بنیادی رویان، تهران، ایران‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

https://doi.org/10.61882/JCT.16.3.277
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه، ایجاد موتاسیون در ژن PDX-1 جوجه، از طریق ایجاد یک gRNA مکمل با قسمتی از ژن PDX-1 است. هدف این رویکرد ایجاد جهش‌های هدفمند با کاربردهای درمانی بالقوه در ژن‌درمانی است. مواد و روش‌ها: جهت حذف و تغییرات در  ژن PDX-1 جوجه، توالی RNA راهنمای تکی (single guide RNA, sgRNA) از نرم افزار اینترنتی CRISPR Design Tool طراحی شد. و از طریق آنزیم‌های برشی و واکنش الحاق در وکتور لنتی ویروسی LentiCRISPRv2GFP کلون شد و از طریق شوک حرارتی در سلول‌های میزبان Escherichia coli Top10 ترانسفورم شد.  نتایج: نتایج PCR یک قطعه تکثیر شده به‫طول ۲۶۷ جفت باز (bp) را نشان داد که نشان‌دهنده وجود ژن sgPDX-1 بود. این قطعه روی ژل آگارز قابل مشاهده بود. علاوه بر این، هضم معکوس با دو آنزیم محدودکننده، یک قطعه ۲۰۰۰ جفت بازی جدا شده از ناقل را تولید کرد. نتایج تعیین توالی، موفقیت‌آمیز بودن فرآیند کلونینگ را تایید کرد. نتیجه‫گیری: ژن PDX-1 مرغ در یک وکتور لنتی‌ویروسی حاوی ساختار CRISPR/Cas9 کلون شد. وکتور نوترکیب LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 با موفقیت به‫دست آمد. ساختار ژنی توسعه‌یافته در این مطالعه پتانسیل قابل توجهی برای بررسی عملکرد ژن و استفاده در ژن‌درمانی دارد. در نتیجه، استفاده از این ساختار ممکن است امکان ایجاد یک مدل حیوانی در جنین‌های مرغ با نقص، از جمله حفره خالی اندام یا بافت، را فراهم کند. چنین مدلی امکان بررسی و درمان نقص‌ها را با استفاده از داروها و رده‌های سلولی خاص فراهم می‌کند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

سیستم کریسپر-کس
ویرایش ژن
لنتی ویروس
RNA راهنما

عنوان مقاله English

Creation of a lentiviral recombinant construct containing the PDX1 gene using the CRISPR/Cas9 system

نویسندگان English

A Akhlaghpour 1
M Basiri 2
M Mobarak Qamsari 3
SN Hassani 4
1 p.h.D., Department of Stem Cells and Cancer, Faculty of Biotechnology, Amol University of Special Modern Technologies, Amol, Iran.
2 p.h.D.,Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran
3 p.h.D., Department of Microbial Biotechnology, Faculty of Biotechnology, Amol University of Special
4 p.h.D., Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran
چکیده English

Introduction: Homeodomain transcription factor 1 (PDX-1) is necessary for proper pancreatic development and β-cell function. The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) system, in conjunction with CRISPR-associated protein 9 (Cas9), facilitates modifications, particularly deletions, within the genome. The use of lentiviral vectors for gene transfer to somatic stem cells has increased significantly. They harbor advantageous features, including a relatively high gene loading capacity, a diminished likelihood of gene expression silencing following integration into the genome, and high efficiency in delivering genes to a variety of target cells. Furthermore, they elicit no undesirable immune reactions and offer a broad selection of alternative envelope proteins.
Aim: This study aims to introduce a mutation in the chicken PDX-1 gene. A guide RNA (gRNA) will be designed to complement a specific region of the PDX-1 gene. This approach aims to create targeted mutations with potential therapeutic applications in gene therapy.
 
Materials and Methods: The PDX-1 gene was cloned using the LentiCRISPRv2GFP vector. To delete and modify the PDX-1 gene, a specific single guide RNA (sgRNA) sequence is designed. This sgRNA sequence is approximately 100 base pairs (bp) in length, with about 76 bp derived from the scaffold segment already integrated into the LentiCRISPRv2GFP vector.
The region responsible for binding the sgRNA to the target genomic sequence is 20 nucleotides long and is complementary to 20 nucleotides in exon one of the PDX-1 gene. The CRISPR Design Tool (http://crispr.mit.edu) was used to design a specific sgRNA sequence targeting the PDX1 locus (sgPDX1).
The double-stranded oligonucleotide fragment and the LentiCRISPRv2GFP vector were subjected to enzymatic digestion using the BsmbI restriction enzyme. To create the LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 vector, the cleaved sgPDX1 sequence was joined with the cleaved vector. This was accomplished by mixing the vector and nucleotide fragment and subjecting them to a ligation reaction using the T4 ligase enzyme. The resulting vector contains a transcript of the sgRNA, specifically sgPDX1.
The heat shock method was employed to transform Escherichia coli Top10 host cells with the cloned LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 vector. To confirm the presence of the sgPDX-1 gene in the vector, a polymerase chain reaction (PCR) was conducted using primers targeted at a portion of the U6 promoter sequence (forward primer) and a segment downstream of the sgRNA gene region (reverse primer). Additionally, each PCR product was analyzed using enzymatic digestion with EcoRV and BsmBI enzymes. To confirm the successful cloning, the PCR product was sequenced.
Results: The PCR results showed an amplified fragment measuring 267 base pairs (bp), which indicated the presence of the sgPDX-1 gene. This was visualized on an agarose gel. Additionally, the reverse digestion with two restriction enzymes produced a 2000 bp fragment isolated from the vector. The sequencing results confirmed that the cloning process was successful.
Discussion: Genome editing technology has been highlighted in bird species due to their significant potential for economic production and creating models for biological research. The application of CRISPR gene editing technology in avian research has yielded promising advancements, particularly in the modification of somatic cells and tissues in birds. By precisely targeting primordial germ cells (PGCs), researchers can implement specific genetic modifications within the chick genome, thereby facilitating the development of genetically edited chicks. Numerous studies have investigated the role of the PDX-1 gene in gene therapy using the CRISPR/Cas9 system across various organisms. However, this study is the first to design and produce a recombinant construct containing the chicken PDX1 gene using a lentiviral vector with the CRISPR/Cas9 construct. This advancement aims to create a practical research platform for future studies by enabling the direct transfer of this recombinant construct into chick embryos and cells.
Conclusion: The chicken PDX-1 gene was cloned into a lentiviral vector containing the CRISPR/Cas9 construct. The recombinant vector LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 was successfully obtained. The gene construct developed in this study has significant potential for investigating gene function and for use in gene therapy. Consequently, utilizing this construct may enable the creation of an animal model in chicken embryos featuring defects, including an empty organ or tissue cavity. Such a model will allow for the investigation and treatment of the defects using specific drugs and cell lines.

کلیدواژه‌ها English

CRISPR-Cas system
Gene editing
Lentivirus
RNA Guide

1-    مقدمه

یکی از فن‌آوری‌های ویرایش ژنوم که می‌تواند باعث ایجاد تغییرات به‫خصوص از نوع حذف در ژنوم شود، سیستم پروتئینی مرتبط با تناوب‌های کوتاه پالیندرومی فاصله دار منظم خوشه ای (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas9) یا CRISPR/Cas9  می‌باشد.

این فناوری متشکل از اجزای ژنومیکی (CRISPR) و پروتئومیکی (Cas) می‌باشد که در ابتدا در ارتباط با سیستم ایمنی القایی در تقریبا 75درصد از باکتری‫‌ها و آرکی‌‫ها در پاسخ به حمله فاژها و انتقال پلازمید در طبیعت شناسایی شد. باکتری‌ها با این سیستم قادر به شناسایی ویروس جدید و حذف آن شدند (1, 2). قسمت ژنومی شامل توالی‌های کوتاه پالیندرمی منظم تکراری بوده که در میان آن‌ها توالی‌های کوتاه متغیری به‫نام فاصله انداز یا spacer وجود دارد. طول توالی تکرارشونده از 25 تا 40 نوکلئوتید متغییر است. درحالی‫که طول توالی فاصله انداز از 21 تا 71 نوکلئوتید متغیر می‌باشد (1). در طی فرآیند ایمن سازی، قطعات کوتاهی از DNA خارجی در قسمت فاصله انداز آرایه CRISPR در کروموزوم میزبان ادغام می‌شوند، در نتیجه یک سابقه ژنتیکی از عفونت قبلی ارائه می‌شود که میزبان را قادر می‌سازد از تهاجم آینده به همان مهاجم جلوگیری کند. با رونویسی و پردازش از منطقه فاصله انداز جدید، RNA های کوتاه بالغ به‫نام (cRNA) CRISPR RNA، ایجاد می‌شود که از قسمت '5 اش مکمل قطعه فاصله انداز خارجی است و از قسمت'3 مکمل با ناحیه منظم پالیندرمی تکراری است. هیبریداسیون بین فاصله انداز در cRNA و توالی مکمل از هدف خارجی در سیستم CRISPR، موجب تحریک فعالیت سیستم اندونوکلئازی Cas شده که منجر به شناسایی و تخریب قطعه DNA یا RNA خارجی در ورود دوم به همان یاخته می‌شود (3). یک موتیف حاوی توالی حفاظت شده کوتاه (2 تا 5 جفت باز) به‫نام موتیف مجاور فاصله انداز اولیه (PAM) Protospacer adjacent motif، که در مجاورت توالی هدف‌گیری شده با crRNA روی DNA مهاجم قرار دارد، نقش اساسی در انتخاب و تخریب DNA هدف در اکثر سیستم‌های CRISPR/Cas ایفا می‌کند. سیستم‫های CRISPR به 6 تیپ مختلف تقسیم می‌شوند. در این میان، تیپII ، دارای یک اندونوکلئاز تکی ویژه DNA به‫نام Cas-9 می باشد که با دومین‌های نوکلئازی ویژه‫اش برای هر رشته از DNA، منجر به ایجاد شکست در دو رشته DNA می‌شود. همچنین یک قطعه RNA کوتاه اضافی، به‫نام قطعه فعال کننده ترانس cRNA یا tracer-RNA نیز در این سیستم حضور دارد که با ناحیه منظم تکراری در cRNA جفت می‌شود تا یک ساختار RNA هیبریدی دو گانه‫ای را تشکیل دهد. این RNA راهنمای دو گانه که RNA راهنما guide RNA (gRNA)، نامیده می‌شود، اندونوکئاز Cas9 را هدایت می‌کند تا دو رشته DNA حاوی یک توالی هدف مکمل 20 نوکلئوتیدی و PAM مجاور را برش دهد (3و 4). بنابراین این فناوری، متشکل از یک کمپلکس نوکلئوپروتئینی است که حاوی پروتئین Cas9 و یک RNA راهنمای تکی (sgRNA) می‌باشد که باعث ایجاد شکست‌هایی در دو رشته DNA می‌شود (4). در طول فرآیند تعمیر ازنوع مستعد خطا (error-prone) وابسته به دو رشته، با اتصال انتهای غیر همولوگ، منجر به ایجاد درج‌ها یا حذف‌های کوچک  (Indel) در آن منطقه ژنوم می‌شوند و این تغییرات کوچک، می‌تواند منجر به جابجایی و تغییر در چارچوب خواندن و اختلال عملکردی نهایی پروتئین‌های هدف شود. از آنجایی‫که سیستم CRISPR/Cas9 تنها به یک جفت اولیگونوکلئوتید حاوی توالی هدف نیاز دارد، آماده سازی پلاسمید برای اختلال ژن هدف با کارایی گزارش شده‫ی بالای 80 درصد، در مقایسه با سایر تکنیک‌های به کار رفته در مهندسی ژنتیک، بسیار آسان تر و مقرون به صرفه تر است (5). این استراتژی به‫طور موفقیت آمیزی در هدف گذاری ژنی در کشت‌های سلولی و تولید ارگانیسم‌های موتانت شده کاربرد دارد (4). سیستم CRISPR/Cas9 یک ابزار ساده و توانا در ویرایش ژنوم در موجودات مختلف از جمله دام (جوجه، بز و...)، خوک، و خرگوش می‌باشد (6-10). این سیستم از قدرت بالایی در راستای بررسی عملکرد ژن و کاربرد در ژن درمانی، برخوردار است (6). در این راستا، این سیستم از مناسب ترین روش‌ها در مطالعات تکوینی در جنین جوجه نیز می‌باشد (11).

 فـــــاکتور رونویـــــسی هومئـــــودمین(Homeodomain transcription factors)  یا PDX-1 دارای یک نقش مهم و اصلی در بقای سلول‌های β پانکراس می‌باشد. به‫عنوان یک فاکتور رونویسی کلیدی در تنظیم بیان ژن انسولین موثر بوده و همچنین نقش این فاکتور در تکوین و رشد طبیعی پانکراس از طریق تعیین بلوغ و تمایز سلول‌های پیش ساز پانکراس ضروری است. اهمیت PDX-1 در لوزالمعده با ایجاد آژنزیس پانکراس در موش‌های پوچ PDX-1 مشخص می‌شود. بنابراین، PDX-1 برای رشد مناسب پانکراس و نیز عملکرد سلول‌های بتا مورد نیاز است (12).

در دهه گذشته، در میان حاملین ژنی مختلف، استفاده از وکتورهای مبتنی بر لنتی ویروس‌ها، با هدف کاربردهای بالینی، در انتقال پایدار ژن‌ها به سلول‌های بنیادی سوماتیک و سلول‌های T افزایش داشته است. وکتورهای لنتی ویروسی، دارای ظرفیت بارگیری ژنی نسبتا بالا، کاهش احتمال خاموش شدن بیان ژن پس از ورود به ژنوم، کارایی بالا در ارئه ژن‌ها به سلول‌های مختلف هدف، افزایش بالای میزان بیان ژن، عدم ایجاد واکنش‌های ایمنی ناخواسته و داشتن طیف وسیع انتخابی در پروتئین‌های انولوپ جایگزین می‌باشند. این عوامل استفاده تقریبا انحصاری از وکتور‌های لنتی ویروسی را در دهه گذشته برای انتقال پایدار ژن‌ها به سلول‌های بنیادی سوماتیک و سلول‌های T با هدف کاربردهای بالینی توجیه می‌کند (13-15). در این مطالعه، ژن PDX-1 جوجه، جهت ایجاد موتاسیون‌های هدفمند با کاربرد‌های درمانی و ژن درمانی، در وکتور لنتی ویروسی حاوی سازه CRISPR/Cas9 کلون شده که با هدف تولید مدل حیوانی در جنین جوجه دارای نقص و کنام خالی اندام یا بافت مورد نظر می‌باشد، تا از طریق دارو و رده سلولی خاص بتوان این نقص را بررسی و درمان کرد.

 

2-    مواد و روش­ها

وکتور LentiCRISPRv2GFP: جهت کلون نمودن ژن PDX-1 از وکتوری به‫نام LentiCRISPRv2GFP به‫صورت هدیه ای از دیوید فلدسر (Addgene، آمریکا) استفاده شد.

طراحی و کلون کردن RNA راهنما یا (sgRNA) Single guide RNA : در این مطالعه که از نوع بنیادی- کاربردی می‌باشد، جهت کلون نمودن ژن PDX-1 در وکتور LentiCRISPRv2GFP، ژن PDX-1  (XM_040658386.2)  از سایت NCBI به آدرسncbi.nlm.gov  دریافت شد. ژن PDX-1 بر روی کروموزوم شماره یک در جوجه قرار دارد. این ژن حاوی دو اگزون شماره یک و دو می‫باشد. جهت حذف و تغییرات در این ژن، توالی RNA راهنمای تکی یا sgRNA طراحی می‌شود. که این توالی در حدود bp 100 طول دارد. حدود bp76 از این توالی به بخش داربست تعلق دارد که در وکتور مربوطه (LentiCRISPRv2GFP) در محدوده bp 7282-7357 روی وکتور، از پیش تعبیه شده است. ناحیه‌ای که مسئول اتصال sgRNA به توالی ژنومی هدف است، bp20 طول دارد که مکمل 20 نوکلئوتید از اگزون شماره یک از ژن PDX-1 است که شامل توالی رهبر و توالی پیرو به‫شرح ذیل می باشد.

5'-CACCGTTGACAGCTCGCCGCTCCGT-3' و      

 5'-AAACACGGAGCGGCGAGCTGTCAAC-3

برای طراحی توالی sgRNA ویژه لوکوس PDX1 (sgPDX1) از نرم‌افزار اینترنتیCRISPR Design Tool (http://crispr.mit.edu) استفاده شد (16). برای اتصال دو الیگونوکلئوتید و تولید قطعه دو رشته‌ای و کلون کردن این قطعه در وکتور LentiCRISPRv2GFP به‫طریق زیر عمل خواهد شد.

1. برای اتصال دو الیگونوکلئوتید به یکدیگر و تشکیل یک قطعه کوتاه دورشته‌ای مخلوط تهیه شد. مخلوط حاوی دو رشته سنس و آنتی سنس از الیگونوکلئوتیدهای مورد نظر از اگزون یک ژن PDX-1 به‫همراه آنزیم T4 لیگاز (برند سیناکلون، ایران)، در حجم مشخصی از واکنش می‌باشد.

2. مخلوط فوق با استفاده از دستگاه ترموسایکلر ( برند bio rad مدل T100، آمریکا)، ابتدا برای 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‫گراد نگه‫داری خواهد شد و سپس دما تا 25 درجه سانتی‫گراد با شیب دمایی 6 درجه سانتی‫گراد در دقیقه کاهش داده شد. که منجر به اتصال دو قطعه به یکدیگر می‌شود.

 واکنش هضم آنزیمی قطعه الیگونوکلئوتیدی و وکتور: وکتور LentiCRISPRv2GFP، پس از تکثیر و تخلیص از باکتری اشریشیاکلی در واکنش هم‫زمان هضم و اتصال به‫کار گرفته شد.  قطعه الیگونوکلئوتیدی دو رشته ای تولید شده و وکتور LentiCRISPRv2GFP، تحت هضم آنزیمی با آنزیم برشی Bsmb1 (برند کیاژن، ژاپن)، با توالی برشی CGTCTCN (7353-7373bp)  قرار داده شد. آنزیم Bsmb1 پایین دست محل تشخیص خود را می‌شکافد و می‌تواند بازهای 4 نوکلئوتیدی آویزان از هر قسمت ' 5 دلخواه را ایجاد کند.

الحاق قطعات برشی از  sg PDX-1 (sgRNA)به وکتور LentiCRISPRv2GFP: جهت اتصال توالی sg PDX-1 برش خورده با آنزیم Bsmb1 و وکتور برش خورده با همان آنزیم، مخلوط وکتور و قطعه نوکلئوتیدی برش خورده در واکنش الحاق با آنزیم T4 لیگاز قرار گرفت. تا وکتور LentiCRISPRv2GFP-sgPDX-1 به‫دست آید که که یک رونوشت از  sgRNA یا sgPDX-1 را ایجاد کرده، که می‫تواند یک توالی منحصر به فرد واقع در اگزون 1 ژن PDX-1 جنین جوجه را هدف قرار دهد. واکنش الحاق بعد از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی، به‫وسیله آنزیم T4 لیگاز و طی واکنشی انجام شد. این مخلوط حاصل از وکتور و آنزیم به‫مدت 16 ساعت در دمای 10-12 درجه سانتی‫گراد قرار داده شد. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین دو انتهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود. زمان طولانی واکنش این امکان را می‌دهد که آنزیم لیگاز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی استری را داشته باشد.

ترانسفورم وکتور کلون شده LentiCRISPRv2GFP-sgPDX-1 به میزبان باکتریایی: جهت تراریخت نمودن سلول‌های میزبان Escherichia coli Top10 با وکتور کلون شده LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 ، از روش شوک گرمایی استفاده شد. این فرایند به ترتیب زیر صورت گرفت:

1. ابتدا ویال سلول‌های مستعد از دمای 70- درجه سانتی‫گراد خارج شده و روی یخ قرار داده شد، تا به‫آرامی ذوب شوند.

2. حداکثر 10 میکرولیتر از محصول واکنش الحاقی در شرایط استریل به 200 میکرولیتر از سوسپانسون سلول‌های مستعد اضافه و پس از مخلوط کردن، به‫مدت 30 دقیقه ویال‌ها بر روی یخ نگه‫داری شد.

3. جهت اعمال شوک حرارتی، ویال‌ها از یخ خارج شده و در بن ماری (برندBSH25D ،آلمان)، با دمای 42 میکرولیتر به‫مدت 90 ثانیه قرار داده شدند.

4. بلافاصله ویال ها به‫مدت 3 دقیقه در ظرف حاوی یخ قرار داده شد.

5. به ویال مورد نظر در شرایط استریل 1 میلی‫لیتر از محیط (LB) Luria-Bertani، مایع )از برند سیگما آلدریچ، آمریکا)، بدون آنتی بیوتیک اضافه شد و به‫مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. در این مدت سلول‌ها ضمن ترمیم آسیب‌های ناشی از تیمار CaCl2 و تکانه حرارتی، پروتئین مقاومت آنتی‌بیوتیکی را که توسط پلاسمید کد می‌شود بیان می‌کنند.

6. ویال ها به‫مدت 3 دقیقه با سرعت ×g 2000 سانتریفوژ (از برند ترموفیشر، آمریکا)، خواهند شد و محلول رویی دور ریخته شد. رسوب در 50 میکرولیتر محیط LB مایع دوباره حل شد و بر روی محیط LB آگاردار (جامد) حاوی آنتی‌بیوتیک مربوطه (آمپی‫سیلین به غلظت‌ 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر، برند سیگما آلدریچ، آمریکا)، کشت داده و  به‫مدت 15 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شد. سلول‌هایی که حاوی پلاسمید باشند می‌توانند روی محیط رشد کنند اما آن‫هایی که فاقد DNA هستند قادر به رشد در محیط آنتی‫بیوتیک‌دار نیستند و با این غربالگری می‌توان سلول‌های حاوی DNA نوترکیب را از دیگر سلول‌ها تفکیک کرد.

تایید کلون های به‫دست آمده: الف- روش کلونی PCR: جهت تایید حضور ژن sgPDX-1 در وکتور LentiCRISPRv2GFP، با استفاده از پرایمرهای طراحی شده مربوط به بخشی از توالی پروموتر U6 (forward)، بالادست ناحیه sgRNA و قسمتی از پایین دست ناحیه ژن  sgRNA(Reverse)، واکنش زنجیره ای پلیمراز انجام شد. در ژل آگارز، قطعه تکثیر شده با اندازه bp 267 ردیابی شد.

ب- روش هضم آنزیمی:  هریک از کلونی‌های به‫دست آمده که در روش کلونی PCR، با استفاده از دو آنزیم برشی EcoRV و Bsmb1 ( برند کیاژن، ژاپن) در واکنش هضم آنزیمی قرار گرفتند. انتظار می‌رود قطعه ای با اندازه bp 2000 از وکتور جدا شود.

ج- توالی یابی: جهت تایید نهایی کلون شدن ژن sgPDX-1، هریک از باندهای به‫دست آمده در روش کلونی PCR، برای توالی یابی (شرکت پیشگام، ایران) ارسال شد.

3- نتایج

وکتورLentiCRISPRv2GFP، bp 13129طول دارد و حاوی ژن مقاومت به آمپی سیلین می‌باشد. در حدود (KDa 4/158) bp4104روی وکتور، متعلق به توالی  Cas-9می باشد که پایین دست پروموتر EF-1-alpha core  قرار دارد. همچنین، حدود bp76 از توالی مربوط به gRNA نیز بر روی این وکتور (bp 7282 bp -7257) و در پایین دست پروموتر hU6 قرار دارد. توالی مربوط به ژن گزارشگرGFP  (pb717) نیز پایین دست توالی Cas-9 قرار دارد (شکل 1).

 

شکل 1: نمایش شماتیک ازA: کروموزوم شماره یک در جوجه. و دو اگزون موجود در ژن PDX-1 که طراحی sgRNA منطبق بر اگزون شماره یک می‫باشد. B: نقشه شماتیکی از وکتور LentiCRISPRv2GFP.

 

ژن PDX-1 از کروموزوم یک جوجه، با اندازه bp 4754 و دارای دو ناحیه اگزون یک و دو می‌باشد که قطعه الیگونوکلئوتیدی sgRNA منطبق بر این قسمت می‌باشد.

نتایج هضم آنزیمی و واکنش الحاق

با روش هضم آنزیمی با آنزیم Bsmb1 قطعه‫ای با دو انتهای چسبنده هم در وکتور و هم در قطعه الیگونوکلئوتیدی از ناحیه اگزون یک از ژن PDX-1 به‫دست آمد که در واکنش الحاق به یکدیگر متصل شدند.

نتایج واکنش ترانسفورم و تایید کلون

پس از واکنش ترانسفورم، کلونی‌های حاوی وکتور کلون شده LentiCRISPRv2GFP-sgPDX-1)) (شکل 2)، به‫دست آمد.

شکل 2: کلونی‫های حاصل از کشت بعد از واکنش ترانسفورم

 

حضور وکتور LentiCRISPRv2GFP-sgPDX-1، در هر یک از کلونی‌ها با استفاده از روش کلونی PCR (شکل 3) و هضم آنزیمی ( شکل 4 (تایید شد. همچنین هر یک از کلون های به‫دست آمده، از طریق توالی یابی مورد تایید نهایی قرار گرفت (شکل 5).

شکل 3: کلنی PCR با استفاده از پرایمرهای طراحی شده از پروموتر U6 (فوروارد) و پایین دست ژن sgPDX-1 (ریورس). قطعه‫ای با اندازه bp 267 مورد انتظار، به‫دست آمد.

 

شکل 4: هضم آنزیمی وکتور کلون شده با آنزیم Bsmb1 و EcoRV و مشاهده باند bp2000

شکل 5: تایید کلون ژن sgPDX-1 در کلونی‌های حاوی وکتور LentiCRISPRv2GFP با توالی یابی

4- بحث

رشد سریع تکنولوژی اصلاح ژنوم، تحقیقات بر روی عملکرد ژن­های خاص و تولید مدل­های حیوانی را آسان کرده است. در حیوانات اهلی این تکنولوژی می­تواند ارزش زیادی هم در بخش تحقیقات و هم در بخش اقتصادی داشته باشد. برای مثال می‌توان به افزایش تولید حیوانات و یا تولید حیوانات مقاوم به بیماری اشاره داشت. در گونه­های پرندگان نیز کاربرد تکنولوژی اصلاح ژنوم به‫دلیل قابلیت بالای آن‫ها از لحاظ تولیدات اقتصادی و همچنین ایجاد مدل­هایی برای تحقیقات بیولوژیکی تاکید فراوان شده است (17).

روش‌هایی که برای ایجاد پرندگان تراریخت استفاده می‌شوند بیشتر به‫منظور انتقال ژن‌های خارجی درون سلول‌های هدف می‌باشند. تاکنون روش­های مختلفی برای ایجاد پرندگان تراریخت پیشنهاد شده است. با این وجود به‫دلیل تفاوت­های ساختاری و فیزیولوژیکی که میان پرندگان و پستانداران وجود دارد، راندمان تولید پرندگان تراریخت که توانایی انتقال ویژگی­های ژن هدف به نسل بعد را داشته باشند، متغیر بوده است. از روش­های متعددی شامل تزریق به‫داخل پیش هسته (Pronuclear Microinjection)  انتقال از طریق هسته سلول­های بدنی Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)، انتقال از طریق ویروس­ها (Viral Infection)، انتقال از طریق سلول­های بنیادی جنینی (ESCGT) Embryonic Stem Cell Gene Transfer، انتقال از طریق بیضه Testis Mediated Gene Transfer (TMGT)، انتقال از طریق اسپرم Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT)، انتقال از طریق سلول­های بلاستودرم جنینی، انتقال از طریق سلول­های زاینده اولیه Primordial Germ Cell (PGC)، سلول­های بنیادی اسپرم Spermatogonial Stem Cells (SSC) ، و انتقال ژن به‫واسطه ترنسپوزون یا تکنیک­هایی که برای هدف­گیری ژن و اصلاح ژنوم هستند که همانند مگانوکلئازها، نوکلئازهای انگشت روی (ZFN) Zinc finger nuclease، نوکلئازهای افکتوری شبه فعال کننده رونویسی (TALEN) Tale transcription activator- like effector nuclease  و CRISPR/Cas9 برای دست­ورزی ژنتیکی طیور استفاده شده است (18, 19).

ویژگی کاربردی مدل جوجه، بر اساس زمان تولید مثل کوتاه و جمعیت بالای افراد نسل شان است که دستیابی به نتایج مطلوب را تسهیل می‫کند. شباهت الگوی گلیکوزیلاسیون پروتئین به انسان، پیچیدگی بیوشیمیایی کم پروتئین‌های بومی تخم مرغ و تولید داروی زیستی مقرون به صرفه یکی از مزایای استفاده از مدل جوجه است. در پرندگان، تغییرات ژنی با استفاده از سیستم CRISPR در مطالعاتی محدود به هدف گیری سلول‌های سوماتیکی پرندگان و بافت‌ها گزارش شده است. اصلاحات ژنتیکی خاص ژنوم جوجه را می‌توان با هدف قرار دادن سلول‌های زایای اولیه (PGCs) و تولید جوجه‌های ویرایش شده ژنتیکی ایجاد نمود (11).

فاکتور رونویسی PDX-1توسط ژن هومئودومین شبه Hox کد می‌شود که نقش مهمی در رشد پانکراس، تمایز سلول‌های β و حفظ عملکرد سلول‌های β بالغ دارد. تحقیقات در مورد رابطه بین PDX-1 و دیابت به‫دلیل افزایش شیوع دیابت شیرین یا دیابت ملیتوس، توجه زیادی را به خود جلب کرده است. مطالعات اخیر نشان داده اند که بیان بیش از حد PDX-1 رشد پانکراس را تنظیم می‌کند و باعث تمایز سلول‌های β و ترشح انسولین می‌شود. همچنین نقش حیاتی در بازسازی سلولی، ویرایش ژن و توسعه دارو ایفا می‌کند. برعکس، عدم وجود PDX-1 حساسیت به دیابت ملیتوس را افزایش می‌دهد (20). در پژوهش حاضر، ابتدا با استفاده از نرم افزار اینترنتیCRISPR Design Tool، قطعه gRNA 20 نوکلئوتیدی مکمل با اگزون یک از ژن PDX-1 جوجه، طراحی و آماده شد. قطعه الیگونوکلئوتئدی از sgRNA راهنما و ناحیه ورودی وکتور با آنزیم Bmsb1 برش‫گر و آنزیم DNA لیگاز ناقل نوترکیب ساخته شد. وکتور لنتی ویروسی LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 حاوی ناقل نوترکیب با روش شوک حرارتی به میزبان باکتریایی ترانسفورم شد. با استفاده از روش کلونی PCR و توالی یابی قطعه bp267 تکثیر شده و هضم آنزیمی از منطقه bp 2000 حاوی قطعه gRNA،کلون به‫دست آمده مورد تایید قرار گرفت. 

در این مطالعه برای اولین بار، یک سازه نوترکیب حاوی ژن PDX-1 جوجه، با استفاده از وکتور لنتی ویروسی حاوی سازه CRISPR/Cas9 طراحی و تولید شد تا در آینده بتوانیم با انتقال مستقیم این سازه نوترکیب به جنین و سلول جوجه، بستری کاربردی برای تحقیقات فراهم آوریم. تاکنون مطالعات زیادی بر روی اثر و نقش ژن PDX-1 با هدف ژن درمانی به کمک سازه CRISPR/Cas9 در موجودات مختلف انجام شده است (21-23). در مطالعه ای توسط Liu و همکاران (24)، با حذف ژن بیان کننده پروتئین تیروزین فسفاتاز-۱ حاوی دومین ۲ سارکوم یاSHP-1  از سلول‌های T CD8+ به‫روش CRISPR ، فعالیت ضد‌توموری در برابر کارسینوم هپاتوسلولار در مدل انسانی کارسینومای هپاتوسلولار با PDX را افزایش دادند به گونه‫ای که توانستند با ترکیب این سلول‌های اصلاح‌شده با داروی سیمواستاتین به‌طور هم‌افزا اثر درمانی را تقویت کرده و مقاومت به ایمنی‌درمانی را کاهش داند. همچنین در مطالعه ای توسط Hu و همکاران (25)، که به توسعه یک پلتفرم فعال سازی رونویسی مبتنی بر CRISPR-dCas-9 (dCas-9: نسخه غیر برش دهنده Cas-9) پرداخته اند، توانستند فعال سازی ژن‌ها را به‫طور دقیق در زمان و مکان به خصوص در مدل‫های موشی دیابتی (از طریق فعال سازی ژن PDX-1 و توموری کنترل کنند. بنابراین این پلتفرم، یک ابزار قدرتمند برای تصویر سازی (miRNA) microRNA، و ژن درمانی با کنترل دقیق زمانی و مکانی است، که قابلیت انتقال بالینی داشته و می تواند در درمان سرطان و دیابت در آینده کاربردی شود.

سیستم CRISPR/Cas9 می‌تواند ابزار مفیدی برای اصلاح ژنوم از طریق حذف و تغییر عملکرد ژن باشد. و ثابت شده است که روشی آسان‌تر و سودمندتر در مقایسه با سایر تکنیک‌های ویرایش ژنتیکی، مانند TALEN و ZFN هم در مدل‌های حیوانی و هم در پزشکی انسانی و دامپزشکی است (24). مزایای بسیاری در استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 نسبت به دو روش گفته شده وجود دارد. از جمله این‫که، سیستم CRISPR توانایی ایجاد جهش در توالی‌های متیله و غیر متیله را دارد و برای ایجاد جهش تنها به حداقل 20 نوکلئوتید نیاز دارد. درحالی‫که روش‌های مبتنی بر جهش مانند TALEN و ZFN، فاقد توانایی در برش جایگاه متیله بوده و با صرف هزینه، زمان و پیچیدگی‌های زیادتری باید بر روی تغییر توالی‌های اسیدآمینه ای متمرکز باشند (25, 26). همچنین جهش‌های مورد نظر را می‫توان با سرعت از طریق توالی یابی سنتی سنگر و بدون انتخاب نشانگر ردیابی و بررسی کرد. به‫علاوه، چندین gRNA را می‌توان در یک آرایه CRISPR وارد نموده تا چندین لوکوس و حتی چندین منطقه را در یک لوکوس ژنی مورد هدف قرار دهد و کتابخانه‌های gRNA بزرگی را نیز می‌توان برای ایجاد ناک اوت‌هایی در مقیاس ژنوم در ارگانیسم میزبان تولید کرد (27). هرچند کاربرد سیستم CRISPR/Cas9 در ویرایش ژن و اصلاح ژنوم در گونه‌های پرندگان هنوز در حال پیشرفت است، اما در چندین مطالعه، جهش موفق درج- حذف Insertion-deletion (indel)، با واسطه CRISPR/Cas9 در رده‌های سلولی پرندگان نشان داده شده است. در مطالعه‌ای توسط Jinsoo Ahn و همکاران (29)، با استفاده از وکتور مبتنی بر آرایه CRISPR چندین جهش ایندل در لوکوس ملانوفیلین بلدرچین با کارایی بالا در تغییر ژن ایجاد شد. در مطالعه دیگری توسط Qisheng Zuo و همکاران (30)، با استفاده از سازه CRISPR/Cas9 با کارایی 40 درصد و هدف گذاری ژن C1EIS به نقش آن در تمایز سلول‌های بنیادی جوجه (ESCs) به سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی (SSCs) پی بردند. به‫طوری‫که با ایجاد موتاسیون در این ژن، این تمایز مهار می‌شود. در مطالعه دیگری توسط Yani Zhang و همکاران (31) که با هدف بررسی عملکرد ژن  Stra8در فرآیند تمایز ESCs جوجه به SSCs بود، نتایج نشان داد که Cas9/gRNA نه تنها منجر به حذف ژن Stra8 می‌شود، بلکه نشان می‌دهد که تولید SSCs توسط ناک‌داون ژن Stra8 در شرایط آزمایشگاهی مسدود می‌شود. بنایراین نشان دادند که سیستم CRISPR/Cas9 می‌تواند واسطه ژن Stra8 پایدار در سلول‌های جوجه باشد و تمایز ECSs به SSCs را مهار کند.

5- نتیجه­گیری

با توجه به مزایای ذکر شده از کاربرد سازه CRISPR و وکتورهای لنتی ویروسی در ویرایش ژنوم، جهت ایجاد موتاسیون‌های هدفمند با کاربرد‌های درمانی و ژن درمانی، ژن PDX-1 جوجه، در وکتور لنتی ویروسی حاوی سازه CRISPER/CAS9 کلون شد و ناقل نوترکیب LentiCRISPRv2GFP-sgPDX1 به‫دست آمد. سازه ژنی تولید شده در این مطالعه، از قدرت بالایی در راستای  بررسی عملکرد ژن و کاربرد در ژن درمانی، برخوردار است. بدین‫ترتیب با استفاده از چنین سازه ای، می‌توان در جهت تولید مدل حیوانی در جنین جوجه دارای نقص و کنام خالی اندام یا بافت اقدام کرد تا از طریق دارو و رده سلولی خاص بتوان این نقص را بررسی و درمان نمود.

6- تشکر و قدردانی

 بدین‫وسیله از همکاران محترم بخش مهندسی ژنتیک پژوهشگاه رویان تهران که در انجام این کار ما را همراهی نمودند و از این موسسه به جهت تامین بودجه این تحقیق قدردانی و تشکر می‌نماییم.

-

 
1.    Qu D, Lu S, Wang P, Jiang M, et al. Analysis of CRISPR/Cas system of Proteus and the factors affected the functional mechanism. Life Sci. 2019; 231:116531.
2.    Chekani-Azar S, Gharib Mombeni E, Birhan M, Yousefi M. CRISPR/Cas9 gene editing technology and its application to the coronavirus disease (COVID-19): a review. J Life Sci Biomed. 2020;10(1):1-9.
3.    Jiang F, Doudna JA. CRISPR–Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017; 46:505-29.
4.    Briner AE, Barrangou R. Guide RNAs: a glimpse at the sequences that drive CRISPR–Cas systems. Cold Spring Harb Protoc. 2016;2016(7):pdb. top090902.
5.    Basiri M, Behmanesh M, Tahamtani Y, Khalooghi K, et al. The convenience of single homology arm donor DNA and CRISPR/Cas9-nickase for targeted insertion of long DNA fragment. Cell J. 2016;18(4):532-9.
6.    Oishi I, Yoshii K, Miyahara D, Kagami H, et al. Targeted mutagenesis in chicken using CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 2016; 6:23980.
7.    Li Q, Qin Z, Wang Q, Xu T, et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Comput Struct Biotechnol J. 2019; 17:689-98.
8.    Xu X, Gao D, Wang P, Chen J, et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Sci Rep. 2018; 8:11649.
9.    Proudfoot C, Lillico S, Tait-Burkard C. Genome editing for disease resistance in pigs and chickens. Anim Front. 2019;9(3):6-12.
10. Kalds P, Zhou S, Cai B, Liu J, et al. Sheep and goat genome engineering: from random transgenesis to the CRISPR era. Front Genet. 2019; 10:750.
11. Brackett B, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1971;68(2):353-7.
12. Chojnacka-Puchta L, Sawicka D. CRISPR/Cas9 gene editing in a chicken model: current approaches and applications. J Appl Genet. 2020;61(2):221-9.
13. Jonsson J, Carlsson L, Edlund T, Edlund H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 1994;371(6498):606-9.
14. Poletti V, Mavilio F. Designing lentiviral vectors for gene therapy of genetic diseases. Viruses. 2021;13(8):1526.
15. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996;272(5259):263-7.
16. Balaggan K, Ali R. Ocular gene delivery using lentiviral vectors. Gene Ther. 2012;19(2):145-53.
17. Chojnacka-Puchta L, Kasperczyk K, Plucienniczak G, Sawicka D, et al. Primordial germ cells (PGCs) as a tool for creating transgenic chickens. Pol J Vet Sci. 2012;15(1):31-5.
18. Brackett B, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1971;68(2):353-7.
19. Park TS, Kang KS, Han JY. Current genomic editing approaches in avian transgenesis. Gen Comp Endocrinol. 2013; 190:144-8.
20. Zhang Y, Fang X, Wei J, Miao R, et al. PDX-1: a promising therapeutic target to reverse diabetes. Biomolecules. 2022;12(12):1785.
21. Krishnamurthy M, Kechele DO, Broda T, Zhang X, et al. Using human induced pluripotent stem cell–derived organoids to identify new pathologies in patients with PDX1 mutations. Gastroenterology. 2022;163(4):1053-63. e7.
22. Bheeman C, Vann K, Astapova O. The role of PDX1 in beta cell response to GLP1. J Endocr Soc. 2024;8(Suppl 1): bvae163.971.
23. Zhang WH, Zhuang JH, Guo YY, Chen XY, et al. Pancreatic agenesis and altered m6A methylation in the pancreas of PDX1-mutant cynomolgus macaques. Zool Res. 2024;45(6):1188-200.
24. Liu H, Wang G, Yu X, Luo J, et al. CRISPR/Cas9-mediated SHP-1-knockout T cells combined with simvastatin enhances anti-tumor activity in humanized-PDX HCC model. i Science. 2025;28(4):108745.
25. Hu C, Sun X, Guo B, Wang F. Toehold-based CRISPR-dCas9 transcriptional activation platform for spatiotemporally controllable gene therapy in tumor and diabetic mouse models. ACS Nano. 2025;19(12):45678-90.
26. Mançanares ACF, Cabezas J, Manríquez J, de Oliveira VC, et al. Edition of prostaglandin E2 receptors EP2 and EP4 by CRISPR/Cas9 technology in equine adipose mesenchymal stem cells. Animals. 2020;10(6):1078.
27. Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 2013;31(7):397-405.
28. Wang S, Peng Z, Wang S, Yang L, et al. KRAB-type zinc-finger proteins PITA and PISA specifically regulate p53-dependent glycolysis and mitochondrial respiration. Cell Res. 2018;28(5):572-92.
29. Ahn J, Lee J, Park JY, Oh KB, et al. Targeted genome editing in a quail cell line using a customized CRISPR/Cas9 system. Poult Sci. 2017;96(5):1445-50.
30. Zuo Q, Jin K, Wang Y, Song J, et al. CRISPR/Cas9-mediated deletion of C1EIS inhibits chicken embryonic stem cell differentiation into male germ cells (Gallus gallus). J Cell Biochem. 2017;118(8):2380-6.
31. Zhang Y, Wang Y, Zuo Q, Li D, et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 2017;12(2): e0172207.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 3
پاییز 1404
صفحه 277-290

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما