سلول و بافت
فصلنامه

بررسی تاثیر سمیت نانوذرات دی اکسید تیتانیوم بر قشر مغز جنین جوجه در دوران جنینی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

ملیحه ریکی 1
احمدرضا راجی 2
امیر افخمی گلی 3
حسین نورانی 4

1 دانشجوی دوره بافت شناسی مقایسه ای ، گروه علوم پایه دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوس مشهد، مشهد، ایران

2 بخش علوم آناتومی گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد

3 دانشیار، گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

4 دانشیار، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

https://doi.org/10.61882/JCT.16.3.228
چکیده
هدف: نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم (Tio2) در صنعت، پزشکی به‫طور گسترده­ای استفاده می­شوند. نانوذرات برای محیط زیست و سلامت انسان به‫ویژه بر سیستم عصبی در حال رشد، مضر هستند. در این مطالعه سمیت جنینی غلظت­های مختلف نانوذرات Tio2 بر بافت قشر مغز جنین جوجه بررسی شد. مواد و روش‏‫ها: در این مطالعه 90 عدد تخم مرغ نطفه­دار به پنج گروه دسته بندی شدند: گروه شاهد (بدون تیمار) و چهار گروه درمانی که دوزهای، صفر (شم)، 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر از نانوذرات Tio2 دریافت نمودند. سپس در روزهای ۷، ۹ و ۱۳، بعد از ارزیابی مورفولوژی، وزن و طول، از مخ و مخچه جنین­ها نمونه بافتی تهیه و 48 ساعت در بافر فرمالین ۱۰ درصد ثابت شد. بعد از مراحل پاساژ بافتی از نمونه­ها برش تهیه و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ­آمیزی شد. سرانجام، مطالعات بافت­شناسی و آسیب­شناسی و هسیتومورفومتری انجام پذیرفت. نتایج: نانوذرات TiO2 باعث مرگ جنین در غلظت­های 25 و 50 میکروگرم بر میلی لیتر در تمام روزها می­شوند. در مطالعات مورفولوژیکی، کاهش وزن و طول جنین­های 13 روزه تیمار شده با غلظت 50 میکروگرم مشاهده شد. همچنین در بررسی­های میکروسکوپی، کاهش تعداد سلول‌های قشر مخ و سلو‫­های پورکنژ قشر مخچه را در جنین‌های 13 روزه تیمار شده با غلظت 50 میکروگرم  نشان داد. ارزیابی‌ها، پرخونی در قشر مخچه را نشان داد. نتیجه گیری: تزریق نانوذرات قبل از انکوباسیون اثرات نامطلوبی بر مغز جنین در حال رشد دارد. به‫طوری‫که آسیب­ها با سن جنینی بیشتر می­شوند و بالاترین آسیب در روز 13 انکوباسیون اتفاق افتاد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

سمیت
نانوذرات دی اکسید تیتانیوم
جنین جوجه
مغز
dor -

موضوعات

عنوان مقاله English

Evaluation of the toxicity effect of titanium dioxide nanoparticles on the brain cortex of chick embryo in embryonic periods

نویسندگان English

Malihe Riki 1
Amir Afkhami goli 3
Hosain Nourani 4
1 PhD student, Facultyy of veterinary Medicine, university of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran. nourani@um.ac.ir
چکیده English

Introduction: Titanium dioxide nanoparticles (TiO2 NPs) are widely used in industry, medicine, food, and cosmetics. TiO2 NPs are harmful to the environment and human health. Changes in the environment may especially affect the growing neurological system. Therefore, it is impossible to overlook their impact on the development of the embryo and reproductive success. A sensitive and widely used model for evaluating the teratogenic potential and developmental toxicity of different nanoparticles is the chicken embryo. At the outset of embryogenesis, the application of TiO2 NPs enables the penetration into various tissues, such as brain precursor cells and structures. Furthermore, the organs are unable to remove the nanoparticles from the egg due to their isolation and enclosure from the mother and the environment. Consequently, the embryos are perpetually exposed to TiO2 NPs during the 20-day embryogenesis period. In recent years, a growing number of studies have been conducted to examine the possible harmful effects of TiO2 NPs due to worries about inadvertent exposure of NPs on humans.
Aim: In this study, the embryonic toxicity of various dosages of TiO2 NPs was investigated in the chicken embryo's brain cortex.
Materials and Methods: In this study, 90 fertilized eggs were divided into five groups: control group (untreated group), four treatment groups that received 0 (sham), 12.5, 25, and 50 μg/mL of TiO2 nanoparticles. The embryos' morphology, weight, and Crown-rump length (CRL) were assessed after 7, 9, and 13 days.   Tissue samples were collected from the cerebrum and cerebellum of the chick embryos. The specimens were immediately fixed in a 10% neutral buffered formalin solution for 48 hours. Subsequently, they were dehydrated through a series of ascending ethanol concentrations (70%, 80%, 90%, and 100%), with each step lasting two hours. The samples were then cleared in xylene for one hour, embedded in paraffin wax, and sectioned at a thickness of 5μm using a microtome. The sections were then mounted on glass slides.  Finally, all tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, and the effects of TiO2 NPs were examined on the histology, pathology, and histomorphometry of the chick embryo cerebrum and cerebellum tissues.
Results: The findings showed that TiO2 NPs cause embryo death in all days at 25 and 50 μg/mL. In morphological studies, the weight and length of 13-day-old embryos treated with 50 μg/mL of TiO2 NPs decreased. Counting of cells (neurons and glial cells) in the cerebral cortex of a 13-day-old chick embryo displayed a significant decrease in the experimental group of 50 μg/ml compared to the control and sham groups. The evaluations showed a decrease in the number of Purkinje cells of the cerebellum cortex in 13-day-old embryos treated with 50 μg/ml of TiO2 NPs.   The group of 13-day-old embryos treated with 50 µg/ml had a considerable capillary hyperemia in the cerebellar cortex.
Conclusion: It was concluded that the in-ovo-administered TiO2 NPs given immediately before incubation have adverse effects on the developing cerebellum and cerebrum. So that the increase of damage happened in older embryos, and the highest damage occurred on day 13 of incubation.

کلیدواژه‌ها English

Toxicity
Titanium dioxide nanoparticles
Chicken embryo
Brain

مقدمه

نانوتکنولوژی را می­توان به‫عنوان تکنولوژی در مقیاس نانومتری یا یک میلیاردم متر تعریف نمود (1). نانوذرات یک گروه از مواد آلی و غیرآلی با محدوده 100-1 نانومتر هستند (2). نانو مواد به‫دلیل اندازه­های نانومتری­شان خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به مقیاس ماکرومتری دارند، زیرا مهم‫ترین عاملی که در این مقیاس تغییر می­کند افزایش نسبت مساحت سطح به حجم است. این عامل باعث تغییر رفتار اتم­های ذره و تغییر تعامل ماده با سایر مواد می‫شود (3). افزایش سطح باعث می­شود تا واکنش­پذیری نانو مواد بسیار زیاد شود، زیرا تعداد مولکول­ها و اتم­های موجود در سطح نسبت به اتم­ها و مولکول­های واقع در حجم بسیار بیشتر است (4). خواص بیولوژیکی نانومواد نیز با کوچکتر شدن اندازه آن‫ها تغییر می­یابد، زیرا در مقیاس نانومتری قادر به عبور از حصارهای بیولوژیکی مانند غشا، سد خونی مغزی و جفت می­باشند (5).

یکی از نانوذرات اکسید فلزی پرکاربرد، دی­اکسید تیتانیوم می­باشند که پودر بی­بو و غیر قابل اشتعالی هستند که به‫وفور تولید می­شوند (6). نانوذرات دی‫اکسید تیتانیوم به‫طور گسترده به‫عنوان رنگدانه­ی سفید در صنایع رنگ، پلاستیک، کاغذ، جوهر، داروسازی، مواد غذایی، لوازم آرایشی، خمیردندان و کرم­های ضد آفتاب مورد استفاده قرار می­گیرند و حتی می­توان از آن‫ها به‫عنوان رنگدانه، برای سفیدکردن شیر بدون چربی استفاده نمود. از طرفی امروزه به‫عنوان جزئی از ایمپلنت­های مفصل به‫خصوص برای ران و زانو کاربرد دارند (7). آن‫ها به‫عنوان مواد فوق العاده ریز می­توانند از طریق مسیرهای مختلف از قبیل تنفس، خوردن، نفوذ پوستی و تزریق، وارد بدن انسان شوند (8).

نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم می­توانند سبب آپوپتوزیس و نکروزیس سلول­­ها شوند. همچنین با تاثیر بر اسپرم زایی، باعث کاهش سلول­های اسپرماتید شده و  با ایجاد التهاب تخمدان و آترزی فولیکول­ها، کاهش باروری موش­های ماده را ایجاد نمودند. از جمله سایر آسیب­های ایجاد شده توسط این نانوذرات، آسیب کبدی، التهاب ریه و ایجاد استرس اکسیداتیو می­باشد. اختلال در ژن­های مربوط به سیستم نورون­های دوپامین و قشر مغز از دیگر اثرات مخرب نانوذرات دی اکسید تیتانیوم است (9-16). سمیت بالقوه نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم نیز در چندین رده سلولی ثابت شده است. القای آپوپتوزیس در سلول‫های PC12 در مدولای غده آدرنال، آسیب اکسیداتیو و آپوپتوزیس سلول­های HepG2 و اختلال عملکرد میتوکندری در سلول­های BRL 3A برخی از گزارش­ها در مورد سمیت سلولی نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم هستند (17-19). مطالعات نشان داده است که سمیت ناشی از نانوذرات می­تواند در زنان باردار تقویت شود. استنشاق یک مرتبه نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم باعث هیچ واکنشی در مورد غیر باردار نمی­شود، در حالی‫که همان مواجهه باعث التهاب حاد ریه­ها در موش باردار BALB/c شده است (20). اگر در این دوره جنین آسیب ببیند، بهبودی آن دشوار و غیرممکن خواهد بود (21). مطالعات مختلف روی موش­های باردار ثابت کرده که نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم آثار مختلفی روی جنین­ها و نوزادان آن‫ها دارد، این نتایج نشان دهنده­ی این است که این نانوذرات قادر به عبور از جفت هستند (22). سمیت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر اساس اختلاف در اندازه آن‫ها در نماتودها و کرم خاکی به اثبات رسیده است (23و24). افزایش در سرعت تغییر لارو به بالغ و ناهنجاری­های ظاهری در گورخرماهی (Zebrafish) و همچنین تغییرات آسیب­شناسی در ماهی کپور، شواهد اندکی بر القای سمیت توسط نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم در جنین­ها می­باشد (25و26).

 جنین جوجه یکی از پرکاربردترین مدل­های حیوانات به‫ویژه در مطالعات زیست پزشکی و جنین­شناسی می­باشد (27). این مدل به‫راحتی دردسترس است و می­توان آن‫را با استفاده از تکنیک­های رشد و نمو مورد مطالعه قرار داد. محققان شباهت­هایی را در الگوهای رشد و نموی جنین جوجه و جنین پستانداران مشاهده نموده­اند. بنابراین، جنین جوجه به‫طور گسترده­ای در مطالعات مختلف به‫عنوان جایگزین مناسبی برای جنین پستانداران مورد استفاده قرار می­گیرد (28). جنین جوجه یک مدل مناسب برای بررسی سمیت سیستم عصبی می­باشد، زیرا سد خونی مغزی، 15 روز پس از انکوباسیون به طور کامل رشد نموده و عمل می­کند (29). استفاده از نانوذرات در آغاز رشد جنینی این امکان را به نانوذرات می­دهد که به بافت­های مختلف از جمله، سلول­های پیشرو مغز و ساختارهای مغز نفوذ نماید. با محصور بودن جنین جوجه و جدا بودن از مادر و محیط، هیچ امکانی برای حذف نانوذرات وجود ندارد و جنین­ها در طول 20 روز رشد جنینی (قبل و بعد از ایجاد BBB) به‫طور دائم در معرض نانوذرات قرار می­گیرند(30). در پرندگان، آغاز رشد نیمکره­های مغزی از تلن‫سفالن می­باشد و با ضخیم شدن تدریجی دیواره­های تلن‫سفالن ادامه می­یابد. بدین‫ترتیب که نوروبلاست­ها به‫صورت شعاعی از نورواپیتلیوم پوشاننده سطح بطنی نیمکره­ها مهاجرت می­نمایند (31). نیمکره­های مخ جنین جوجه 4 روزه دیواره­هایی با ضخامت یکنواخت شامل سلول­های نورو اپی‫تلیال تمایز نیافته می­باشد. در جنین­های 8 روزه ضخامت دیواره بطنی کمی بیشتر از دیواره پشتی است. در روز 9، پس از تکثیر سلولی و مهاجرت در طول تکامل بافتی اولیه سیستم پیچیده عصبی قابل مشاهده است، تا این‫که ساختارها در تلن‫سفالن جنین جوجه 16 روزه مانند جوجه بالغ قابل شناسایی می­شوند (32). در نهایت ویژگی­های بافت­شناسی نیمکره­های مخ جوجه تازه هچ شده شبیه جوجه 24 روزه بالغ می­باشد (33). در مورد مخچه بدین‫ترتیب می­باشد که از قسمت پشتی-جانبی متن‫سفالن رشد می­کند (34و35) و در روز 4 جنینی از نورو اپی‫تلیوم قسمت پشتی بطن چهارم، مخچه جنین جوجه ایجاد می­شود. قشر مخچه در پرندگان نیز مانند سایر گروه­های پستانداران از دو ناحیه زاینده به‫نام ناحیه زاینده بطنی یا VZ (Ventricular germinal zone) و لایه دانه­دار خارجی یا EGL (External granular layer) ایجاد می­شود (36). در اوایل دوره جنینی طی روزهای 4 تا 8 انکوباسیون، از نورو اپی‫تلیوم بطنی دو لایه منتال بیرونی و لایه منتال داخلی تشکیل می­شود. لایه منتال بیرونی شامل دو بخش عمیق است که تبدیل به هسته های مرکزی مخچه شده و بخش سطحی که تبدیل به لایه دانه‫دار داخلی می­شود. لایه منتال داخلی سازنده لایه قشری داخلی بوده که در آینده سلول­های پورکنژ را ایجاد می­نماید (37).

سیسستم عصبی به عوامل متعددی که روی جنین در حال رشد تاثیر می­گذارد، حساس است (38). در این مطالعه، اثرات دوزهای مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بر رشد و نمو و تغییرات بافتی و آسیب­شناسی قشر مغز جنین جوجه در طول دوره جنینی بررسی شدند.

2- مواد و روش­ها

آماده­سازی نانوذرات: در این تحقیق به‫عنوان یک مطالعه کاربردی در ابتدا، نانوذرات Tio2 از Sigma-Aldrich (United Kingdom) تهیه شد. نانوذرات TiO2 مورد استفاده در این تحقیق آناتاز و با خلوص 7/99 درصد بودند.  نانوذرات پس از وزن کردن، در آب دوبار تقطیر حل شدند. سپس در یک دستگاه سونیکاتور پروب (Hielscher USA) به‫مدت ۹۰ دقیقه (سه چرخه 30 دقیقه­ای) به‫منظور کاهش اندازه نانوذرات تحت فراصوت قرار گرفتند. برای مشخص کردن اندازه نانوذرات Tio2 از آنالیزگر اندازه ذرات یا PSA (VASCO, France) و میکروسکوپ الکترونی عبوری یا TEM (EM UC6, Leica) استفاده شدند. اندازه ذرات تیتانیوم حدود 30 نانومتر بودند (شکل 1).

   

شکل 1: مورفولوژی و خصوصیات نانوذرات Tio2. (a) عکس TEM: نشان­دهنده شکل کروی نانوذرات Tio2 با اندازه حدود 30 نانومتر. (b) نمودار PSA: نشان دهنده اندازه نانوذرات در حدود 30 نانومتر

جنین جوجه و گروه­های آزمایشی: در این آزمایش تاییدیه اخلاقی از کمیته اخلاق زیستی دانشگاه فردوسی مشهد با شماره 29915 دریافت شد. برای انجام آزمایشات، تعداد 90 عدد تخم مرغ نطفه­دار نژاد راس لاین (Ross line) با وزن 2±5/5 گرم از شرکت سیمرغ واقع در مشهد، خراسان رضوی، ایران خریداری شد. تخم­ها پس از 48 ساعت در شرایط عادی (دمای 37 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 65 درصد ) انکوبه شدند و از روش شمع­گذاری برای تشخیص تخم­های نطفه­دار، استفاده شد. تخم­ها به‫طور تصادفی به 5 گروه 6 تایی برای گروه­های مختلف تقسیم شدند. در این تحقیق عمل رقیق­سازی توسط نرمال سالین انجام گرفت. گروه کنترل بدون تیمار و گروه شم نرمال سالین دریافت نمودند که انتظار می‫رفت، در بررسی­های انجام شده، بین این دو گروه تفاوت معنی­داری وجود نداشته باشد. اما سایر گروه­ها، محلول­های حاوی 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نانوذرات TiO2 دریافت کردند.

پودر نانوذرات TiO2 پس از حل شدن در نرمال سالین، به‫مدت 30 دقیقه تحت فراصوت قرار گرفت. در روز اول، ابتدا محل کیسه هوایی تخم­مرغ­ها با استفاده از روش نوربینی مشخص و سپس 1/0 میلی­لیتر از محلول تزریق توسط یک سرنگ توبرکولین استریل 1 میلی لیتری، در کیسه هوایی تزریق و تخم ها انکوبه شدند.

بررسی مورفولوژی جنین­ها: پس از 7، 9 و 13 روز از انکوباسیون، وزن جنین و طول تاج - کفل یا CRL (Crown-rump length) ارزیابی شد. از طرفی درصد زنده­مانی جنین­ها نیز در تمام روزها و گروه­های آزمایشی ثبت شد. علاوه بر این، معیارهای همبرگر و همیلتون (Hamburger, Hamilton 1951) برای ارزیابی جنین­ها استفاده شد (39).

بررسی میکروسکوپی مغز: در این مطالعه، نمونه­برداری از قشر مغز انجام گرفت و برای بررسی­های بافت­شناسی از روش­های استاندارد آزمایشگاهی استفاده شد. نمونه­ها به‫مدت 48 ساعت در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. سپس مراحل آبگیری، شفاف­سازی و آغشته­سازی با پارافین در دستگاه پاساژ بافتی انجام گردید. پس از قالب­گیری نمونه­ها، برش­گیری توسط دستگاه میکروتوم نیمه اتوماتیک (مدل لایکای آلمان) و با ضخامت 6 میکرون انجام شد. مقاطع مزبور با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ­آمیزی گردیده و پس از مونته کردن در زیر میکروسکوپ نوری (Nikon U-III multi-point Sensor System, Japan) بررسی شدند. از برنامه­های Image J و DP2-BSW  برای انجام هیستومورفومتری پس از تعیین محل مخ و مخچه از اطلس رشد و نمو جوجه استفاده شد (40). در بررسی­های هیستومورفومتری شمارش تعداد کل سلول­ها (نورون­ و سلول‫های گلیال) و مویرگ­های قشر مخ و مخچه در تمام روزها و گروه­های آزمایشی در فضایی به مساحت 104 میکرومتر مربع انجام شد. همچنین شمارش تعداد سلول­های پورکنژ در 200 میکرومتر در گروه­های آزمایشی و کنترل قشر مخچه در روز 13 انکوباسیون انجام شد. از طرفی، پس از مشخص کردن لایه­های مخچه در روزهای جنینی مورد مطالعه، ضخامت لایه­ها اندازه­گیری و مقایسه شدند (41). در این مطالعه بررسی­ها در رابطه با تکامل بافتی و آسیب شناسی بخش قشری مخ و مخچه جنین­های تحت تیمار با غلظت­های مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در روزهای جنینی مورد مطالعه، انجام شد. بافت­های مغز از لحاظ دژنراسیون، نفوذ سلول­های التهابی، پرخونی و خونریزی توسط متخصص آسیب شناسی مورد بررسی قرار گرفت.

3- آنالیز آماری

برای بررسی آماری، نتایج به‫صورت میانگین±SD (Standard deviation) برای متغیرهای کمی و با فراوانی (درصد) برای متغیرهای کیفی بیان شد. نرمال بودن داده­ها با استفاده از آزمون شاپیرویکس بررسی گردید که برای داده­های غیر نرمال از آزمون کروسکال والیس و مقایسه­های دوتایی دان-بنفرونی و در تجزیه و تحلیل داده­های نرمال از آزمون آنالیز واریانس و مقایسه­های دوتایی توکی استفاده شده است. در بررسی همبستگی بین متغیرها از رگرسیون و ضریب همبستگی پیرسن استفاده شد. نرم افزار مورد استفاده در این پژوهش SPSS v.26 و GraphPad Prism 9 بوده و سطح معنی‫داری آزمون ها کمتر از 05/0 (در نتایج مقادیر کمتر از 05/0 با علامت "*" و مقادیر کمتر از 01/0 با علامت "**" مشخص شده است) در نظر گرفته شد.

4- نتایج

نتایج حاصل از رشد و نمو جنین­ها

نتایج نشان داد در تمام روزها در غلظت­های 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر، مرگ و میر جنین­ها مشاهده شد. بدین‫ترتیب که برای جنین­های تیمار شده با 25 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 در روز 7، 40 درصد و در روزهای 9 و 13 انکوباسیون 20 درصد مرگ و میر مشاهده شد. همچنین برای جنین­های تیمار شده شده با50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 در روز 7 انکوباسیون 17 درصد و در روزهای 9 و 13 انکوباسیون 25 درصد مرگ و میر برای ثبت شد. از طرفی، میزان مرگ و میر جنین­هایی که 5/12 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 دریافت نموده بودند، به 25 درصد رسید (شکل 2). در بررسی­های مورفولوژی جنین­های 13 روزه که با دوز 50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند، کاهش وزن (P=0.0301) و طول (P=0.0347) اتفاق افتاد که نسبت به گروه کنترل دارای اختلاف معنی­دار بودند. اما در سایر روزها و گروه­های آزمایشی تفاوت معنی­داری بین گروه­ها مشاهده نشد (شکل 3).

    

شکل 2: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر درصد زنده­مانی جنین­های جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون در گروه­های کنترل، شم و گروه­های تحت تیمار با غلظت­های 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر.

 

 

شکل 3: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر وزن (a) و طول (b) جنین­های جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون، داده­ها به صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی دار در سطح p< 0.05 است.

نتایج حاصل از بررسی­های آسیب­شناسی و هیستومورفومتریک قشر مغز

تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی مغز در جنین‌های تیمار شده با نانوذرات Tio2، تغییرات آسیب بافتی را در ساختار مغز نشان داد. بررسی­های میکروسکوپی مغز در جنین­های 7 روزه، مانند گروه­های کنترل و شم، در تمام گروه­های آزمایشی مورفولوژی طبیعی را نشان داد.

در بررسی­های هیستومورفومتری شمارش تعداد سلول­ها (نورون­ و سلول های گلیال) در قشر مخ جنین­های 13 روزه کاهش معنی­داری را در گروه آزمایشی 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به گروه­های کنترل و شم ثبت کرد (جدول 1 و شکل 4). اندازه­گیری­های هیستومورفومتری مخچه نشان داد، تعداد کل سلول­های قشر مخچه در هیچ‫کدام از روزها و گروه­های آزمایشی تغییری را نشان نداد (شکل 5). اما تعداد سلول­های پورکنژ در گروه آزمایشی 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر جنین­های 13 روزه در مقایسه با گروه کنترل (0043/0=p) و شم (0193/0= p) کاهش معنی­داری داشتند (شکل 6 و d7). در این تحقیق باوجود این‫که ضخامت کل لایه­های قشر مخچه در روز 13 انکوباسیون در گروه 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به گروه­های کنترل و شم کاهش را نشان داد، اما تفاوت معنی­داری در هیچکدام از گروه­ها و روزهای تحت آزمایش وجود نداشت (شکل7 و 8).

نتایج آسیب­شناسی پرخونی را در برخی گروه­ها نشان داد. براساس این نتایج، در جنین‌های 13 روزه که با 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل و شم افزایش تعداد مویرگ­ها در مخ و مخچه مشاهده شد. هرچند پرخونی در قشر مخ نسبت به گروه کنترل معنی­دار نبود (شکل a9) اما پرخونی در قشر مخچه نسبت به گروه کنترل (0024/0P=) و شم (0198/0P=) معنی­دار بود. همچنین، پس از گذشت 9 روز از انکوباسیون، در مخچه جنین­های تحت تیمار شده با 50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 به‫طور معنی­داری نسبت به گروه کنترل (0091/0P=) و گروه شم (0060/0P=) پرخونی مویرگی مشاهده شد (شکل b9).

 

 

 

 

 

جدول 1: مقایسه تعداد سلول­های لایه قشری مخ در روزهای 7، 9 و 13 جنینی پس از تیمار با نانوذرات Tio2.

day

Groups

 

Control

Sham

12.5µg/ml

25µg/ml

50µg/ml

7th day

42±1601

44±1633

41±1528

45.67±1483

43.09±1477

9th day

63±2836

49±2845

32.23±2817

53±2763

50±2949

13th day

42.01±1036

45.4±1001

58.72±855.7

56.08±868

678±63. 23)a**, b*)

داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند، سطح معنی داری به صورت زیر نشان داده شده است:  a) مقایسه با گروه کنترل(b, مقایسه با گروه شم, * p<0.05  و **p<0.01.

 

  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: برش­های بافت قشر مخ در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین). a: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. b: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. c: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید)، نورون­ها (پیکان سیاه)، سلول­های گلیال (پیکان قرمز). بزرگنمایی 400× در مقیاس 50 میکرومتر. d: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. e: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. f: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید)، نورون­ها (پیکان سیاه)، سلول­های گلیال (پیکان قرمز). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  شکل 5: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد سلول­های قشر مخچه جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند. اختلاف معنی‫داری بین هیچ‫کدام از گروه­های آزمایشی مشاهده نشد.

 

 

شکل 6: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد سلول­های پورکنژ قشر مخچه جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح 05/0 و ** نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح 01/0

است.

 

 

       

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 7: برش­های بافت قشر مخچه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین).a: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. Ⅳ.v: بطن چهارم، 1: لایه منتال داخلی، 2: لایه منتال خارجی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. b: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه حاشیه­ای، 3: لایه قشری داخلی. بزرگنمایی400× در مقیاس 20 میکرومتر. c: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های پورکنژ (پیکان سیاه)، 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه مولکولار اولیه، 3: لایه قشری داخلی (پورکنژ)، 4: لایه گرانولار داخلی.  بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. d: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. Ⅳ.v: بطن چهارم، 1: لایه منتال داخلی، 2: لایه منتال خارجی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. e: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه حاشیه­ای، 3: لایه قشری داخلی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. f: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های پورکنژ (پیکان سیاه)، 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه مولکولار اولیه، 3: لایه قشری داخلی (پورکنژ)، 4: لایه گرانولار داخلی.  بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. g: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. ناحیه شمارش تعداد سلول­های پورکنژ (خطوط سیاه)، محل­های اندازه­گیری شده ضخامت قشر مخچه. بزرگنمایی 100× در مقیاس 200 میکرومتر.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 8: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر ضخامت لایه­های قشر مخچه جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند. اختلاف معنی‫دار بین هیچکدم از گروه­های آزمایشی مشاهده نشد.

شکل 9: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد مویرگ­های قشر مخ (a) و مخچه (b) جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح p< 0.05  و ** نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح p<0.01  است. اختلاف معنی‫دار در هر روز به‫طور جداگانه بررسی شد.

5- بحث

احتمال آسیب به جنین، بیشترین نگرانی دوران بارداری می­باشد. بیشترین احتمال آسیب در انسان، 15 تا 56 روز پس از آخرین روز قاعدگی مادر است که در این دوره، اندام­های جنین تشکیل می­شود. این دوره همان دوره­ای است که مادر از بارداری خود بی­خبر است (42و43).

از آن‫جایی‫که روند رشد جنین جوجه به‫ویژه در 48 ساعت اول مشابه رشد جنین انسان در ماه اول است، جنین جوجه مدل مناسبی برای بررسی مطالعات سمیت جنینی و آسیب­شناسی می­باشد (44و45). رشد جنینی و بافت­شناسی مغز به‫خوبی شناخته شده است و از نظر اندازه­گیری­های هیستومورفومتری ارزشمند است. به خصوص در جوجه، بافت مغز یک مدل قابل مقایسه با پستانداران است که مراحل تمایز بافتی مشابهی دارند (46).

در این مطالعه، تاثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات Tio2 بر رشد و نمو جنین‌های جوجه و همچنین تکامل بافتی مغز در اوایل دوره جنینی بررسی شد. سد خونی مغزی که وظیفه آن محافظت از مغز در برابر مواد سمی­ می­باشد، در جنین جوجه، پس از روز پانزدهم انکوباسیون کاملا توسعه می­یابد. استفاده از نانوذرات Tio2 در ابتدای رشد جنینی، باعث می­شود تا نانوذرات به بافت­های مختلف مانند سلول­ها و ساختارهای پیش ساز مغز نفوذ نمایند. علاوه بر این، به‫دلیل جدا شدن از مادر و محصور بودن جنین­ها، اندام‌ها قادر به حذف نانوذرات نیستند. در نتیجه، جنین‌ها در طول دوره جنین‌زایی 20 روزه، هم قبل و هم بعد از توسعه سد خونی مغزی، همیشه در معرض نانوذرات Tio2 قرار می­گیرند (47و48).

بررسی­های ما نشان داد که نانوذرات TiO2 باعث افزایش مرگ و میر در دوره جنینی می­شود. همچنین کاهش در وزن و طول جنین­ها مشاهده شد. کاهش تعداد سلول‌های قشر مخ و سلول­های پورکنژ قشر مخچه نیز در جنین‌ها اتفاق افتاد. از طرفی ارزیابی‌ها، پرخونی در قشر مخچه را نشان داد.

پاتل و همکاران (49) افزایش مرگ و میر، کاهش وزن و طول جنین­ها را نشان دادند. یافته‌های این مطالعه نیز به‫طور مشابه نشان دهنده ایجاد مرگ و میر در تمام روزهای تحت بررسی جنین­ها پس از تیمار با نانوذرات Tio2 را ثابت کرد. همچنین این تحقیقات نشان دهنده کاهش وزن و طول جنین جوجه تحت تاثیر نانوذرات Tio2 بود. همچنین، براساس بررسی­های انجام شده توسط Islam و همکاران (50) کاهش قابل توجه وزن بدن در گروه­های تحت درمان با نانوذرات Tio2 مشاهده شد.

براساس نتایج ارزیابی بافت‌شناسی ساختار مغز، مطالعات نشان داد که نانوذرات Tio2 منجر به تغییرات مورفولوژیکی در بافت مغز می‌شوند. محققان نشان دادند که مغز موش‌های صحرایی ویستار به‫دلیل حداکثر تجمع تیتانیوم در دوز بالاتر نانوذرات Tio2 دچار بیشترین آسیب مغزی شدند (51).

 این مطالعه پرخونی مویرگی را در قشر مخچه در جنین‌های 13 روزه که با 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل و شم نشان داد. این مساله توسط برخی از محققان، مورد مطالعه قرار گرفته است. در کبد موش‌های صحرایی ویستار پس از مواجهه با نانوذرات Tio2، پرخونی ایجاد شد. نتایج بافت شناسی در ریه همچنین نشان دهنده پرخونی مویرگی در تمام گروه­های آزمایشی موش صحرایی ویستار بود (52). در این تحقیق نیز مشابه تحقیقات گذشته کاهش تعداد سلول­های پورکنژ و پر خونی در مخچه جنین­هایی نشان داده شد که حداکثر دوز را دریافت کردند (53).

نتایج این مطالعه نشان داد که تعداد سلول‌های قشر مخ بین گروه شاهد و نرمال سالین در جنین­های 13 روزه در مقایسه با گروهی که 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 دریافت کردند، به طور معنی‌داری کاهش داشت. با مشاهده تغییرات بافت شناسی و کاهش زنده­مانی سلولی در موش های صحرایی نر، محققان سمیت عصبی نانوذرات Tio2 را نشان دادند (54). یافته­های واسنتراجه و راملینگام (55) با داده­های جمع­آوری شده از تحقیق ما سازگار بود. به گفته این محققان، بافت‌های مغزی گروه‌های تحت درمان با نانوذرات Tio2 تغییرات پاتولوژیک غیرطبیعی را در مقایسه با گروه کنترل نشان دادند. یافته‌های این تحقیق نشان داد که اثرات سمیت نانوذرات TiO2 با افزایش سن جنین و غلظت نانوذرات بیشتر می­شود. با توجه به تحقیقات محدود در مورد سمیت نانوذرات Tio2 در جنین جوجه، ارزیابی­های بیشتری برای درک خواص سمیت وابسته به غلظت نانوذرات Tio2 و در سنین­ بالاتر دوره جنینی و پس از تولد مورد نیاز است. مکانیسم مهمی که در پشت اثرات نوروتوکسیک Tio2 وجود دارد، توانایی آن در افزایش عوامل استرس اکسیداتیو و در عین حال کاهش عوامل آنتی اکسیدانتی در داخل سلول است. این نانوذرات با افزایش سطح H2O2 و مالون دی­آلدهید باعث آسیب سلولی می­شوند (56).

6- نتیجه­گیری

نتایج این مطالعه سمیت نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم را تایید نمود و نشان داد که میزان مرگ و میر جنین­های جوجه تحت تاثیر نانوذرات Tio2 قرار گرفت و همچنین باعث کاهش وزن و طول جنین­ها در روز 13 انکوباسیون شد. بررسی سمیت عصبی به‫دنبال تجویز نانوذرات Tio2 تغییرات مورفولوژیکی مغز را نشان داد. در بالاترین دوز دریافتی، کاهش تعداد سلول‌های قشر مخ و کاهش تعداد سلول­های پورکنژ مخچه جنین­های 13 روزه رخ داد. همچنین پرخونی مویرگی در قشر مخچه به‫وجود آمد. بنابراین، تحقیقات بیشتر برای تایید سمیت نانوذرات Tio2 و برای درک کامل ارتباط بین غلظت نانوذرات و زمان آسیب به جنین در دوران بارداری مادر ضروری است.

تشکر و قدردانی

این مقاله بخشی از پایان­نامه دکتری تخصصی رشته بافت­شناسی مقایسه­ای تحت عنوان «ارزیابی سمیت نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم بر رشد و نمو مغز و تغییرات آسیب­شناسی در جنین جوجه» است، بدین‫وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد، جهت تصویب و حمایت مالی، همچنین از کارشناس محترم آزمایشگاه بافت شناسی دانشکده دامپزشکی جناب آقای پورادیبی کمال تشکر و قدردانی را داریم.

مقدمه

نانوتکنولوژی را می­توان به‫عنوان تکنولوژی در مقیاس نانومتری یا یک میلیاردم متر تعریف نمود (1). نانوذرات یک گروه از مواد آلی و غیرآلی با محدوده 100-1 نانومتر هستند (2). نانو مواد به‫دلیل اندازه­های نانومتری­شان خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به مقیاس ماکرومتری دارند، زیرا مهم‫ترین عاملی که در این مقیاس تغییر می­کند افزایش نسبت مساحت سطح به حجم است. این عامل باعث تغییر رفتار اتم­های ذره و تغییر تعامل ماده با سایر مواد می‫شود (3). افزایش سطح باعث می­شود تا واکنش­پذیری نانو مواد بسیار زیاد شود، زیرا تعداد مولکول­ها و اتم­های موجود در سطح نسبت به اتم­ها و مولکول­های واقع در حجم بسیار بیشتر است (4). خواص بیولوژیکی نانومواد نیز با کوچکتر شدن اندازه آن‫ها تغییر می­یابد، زیرا در مقیاس نانومتری قادر به عبور از حصارهای بیولوژیکی مانند غشا، سد خونی مغزی و جفت می­باشند (5).

یکی از نانوذرات اکسید فلزی پرکاربرد، دی­اکسید تیتانیوم می­باشند که پودر بی­بو و غیر قابل اشتعالی هستند که به‫وفور تولید می­شوند (6). نانوذرات دی‫اکسید تیتانیوم به‫طور گسترده به‫عنوان رنگدانه­ی سفید در صنایع رنگ، پلاستیک، کاغذ، جوهر، داروسازی، مواد غذایی، لوازم آرایشی، خمیردندان و کرم­های ضد آفتاب مورد استفاده قرار می­گیرند و حتی می­توان از آن‫ها به‫عنوان رنگدانه، برای سفیدکردن شیر بدون چربی استفاده نمود. از طرفی امروزه به‫عنوان جزئی از ایمپلنت­های مفصل به‫خصوص برای ران و زانو کاربرد دارند (7). آن‫ها به‫عنوان مواد فوق العاده ریز می­توانند از طریق مسیرهای مختلف از قبیل تنفس، خوردن، نفوذ پوستی و تزریق، وارد بدن انسان شوند (8).

نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم می­توانند سبب آپوپتوزیس و نکروزیس سلول­­ها شوند. همچنین با تاثیر بر اسپرم زایی، باعث کاهش سلول­های اسپرماتید شده و  با ایجاد التهاب تخمدان و آترزی فولیکول­ها، کاهش باروری موش­های ماده را ایجاد نمودند. از جمله سایر آسیب­های ایجاد شده توسط این نانوذرات، آسیب کبدی، التهاب ریه و ایجاد استرس اکسیداتیو می­باشد. اختلال در ژن­های مربوط به سیستم نورون­های دوپامین و قشر مغز از دیگر اثرات مخرب نانوذرات دی اکسید تیتانیوم است (9-16). سمیت بالقوه نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم نیز در چندین رده سلولی ثابت شده است. القای آپوپتوزیس در سلول‫های PC12 در مدولای غده آدرنال، آسیب اکسیداتیو و آپوپتوزیس سلول­های HepG2 و اختلال عملکرد میتوکندری در سلول­های BRL 3A برخی از گزارش­ها در مورد سمیت سلولی نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم هستند (17-19). مطالعات نشان داده است که سمیت ناشی از نانوذرات می­تواند در زنان باردار تقویت شود. استنشاق یک مرتبه نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم باعث هیچ واکنشی در مورد غیر باردار نمی­شود، در حالی‫که همان مواجهه باعث التهاب حاد ریه­ها در موش باردار BALB/c شده است (20). اگر در این دوره جنین آسیب ببیند، بهبودی آن دشوار و غیرممکن خواهد بود (21). مطالعات مختلف روی موش­های باردار ثابت کرده که نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم آثار مختلفی روی جنین­ها و نوزادان آن‫ها دارد، این نتایج نشان دهنده­ی این است که این نانوذرات قادر به عبور از جفت هستند (22). سمیت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر اساس اختلاف در اندازه آن‫ها در نماتودها و کرم خاکی به اثبات رسیده است (23و24). افزایش در سرعت تغییر لارو به بالغ و ناهنجاری­های ظاهری در گورخرماهی (Zebrafish) و همچنین تغییرات آسیب­شناسی در ماهی کپور، شواهد اندکی بر القای سمیت توسط نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم در جنین­ها می­باشد (25و26).

 جنین جوجه یکی از پرکاربردترین مدل­های حیوانات به‫ویژه در مطالعات زیست پزشکی و جنین­شناسی می­باشد (27). این مدل به‫راحتی دردسترس است و می­توان آن‫را با استفاده از تکنیک­های رشد و نمو مورد مطالعه قرار داد. محققان شباهت­هایی را در الگوهای رشد و نموی جنین جوجه و جنین پستانداران مشاهده نموده­اند. بنابراین، جنین جوجه به‫طور گسترده­ای در مطالعات مختلف به‫عنوان جایگزین مناسبی برای جنین پستانداران مورد استفاده قرار می­گیرد (28). جنین جوجه یک مدل مناسب برای بررسی سمیت سیستم عصبی می­باشد، زیرا سد خونی مغزی، 15 روز پس از انکوباسیون به طور کامل رشد نموده و عمل می­کند (29). استفاده از نانوذرات در آغاز رشد جنینی این امکان را به نانوذرات می­دهد که به بافت­های مختلف از جمله، سلول­های پیشرو مغز و ساختارهای مغز نفوذ نماید. با محصور بودن جنین جوجه و جدا بودن از مادر و محیط، هیچ امکانی برای حذف نانوذرات وجود ندارد و جنین­ها در طول 20 روز رشد جنینی (قبل و بعد از ایجاد BBB) به‫طور دائم در معرض نانوذرات قرار می­گیرند(30). در پرندگان، آغاز رشد نیمکره­های مغزی از تلن‫سفالن می­باشد و با ضخیم شدن تدریجی دیواره­های تلن‫سفالن ادامه می­یابد. بدین‫ترتیب که نوروبلاست­ها به‫صورت شعاعی از نورواپیتلیوم پوشاننده سطح بطنی نیمکره­ها مهاجرت می­نمایند (31). نیمکره­های مخ جنین جوجه 4 روزه دیواره­هایی با ضخامت یکنواخت شامل سلول­های نورو اپی‫تلیال تمایز نیافته می­باشد. در جنین­های 8 روزه ضخامت دیواره بطنی کمی بیشتر از دیواره پشتی است. در روز 9، پس از تکثیر سلولی و مهاجرت در طول تکامل بافتی اولیه سیستم پیچیده عصبی قابل مشاهده است، تا این‫که ساختارها در تلن‫سفالن جنین جوجه 16 روزه مانند جوجه بالغ قابل شناسایی می­شوند (32). در نهایت ویژگی­های بافت­شناسی نیمکره­های مخ جوجه تازه هچ شده شبیه جوجه 24 روزه بالغ می­باشد (33). در مورد مخچه بدین‫ترتیب می­باشد که از قسمت پشتی-جانبی متن‫سفالن رشد می­کند (34و35) و در روز 4 جنینی از نورو اپی‫تلیوم قسمت پشتی بطن چهارم، مخچه جنین جوجه ایجاد می­شود. قشر مخچه در پرندگان نیز مانند سایر گروه­های پستانداران از دو ناحیه زاینده به‫نام ناحیه زاینده بطنی یا VZ (Ventricular germinal zone) و لایه دانه­دار خارجی یا EGL (External granular layer) ایجاد می­شود (36). در اوایل دوره جنینی طی روزهای 4 تا 8 انکوباسیون، از نورو اپی‫تلیوم بطنی دو لایه منتال بیرونی و لایه منتال داخلی تشکیل می­شود. لایه منتال بیرونی شامل دو بخش عمیق است که تبدیل به هسته های مرکزی مخچه شده و بخش سطحی که تبدیل به لایه دانه‫دار داخلی می­شود. لایه منتال داخلی سازنده لایه قشری داخلی بوده که در آینده سلول­های پورکنژ را ایجاد می­نماید (37).

سیسستم عصبی به عوامل متعددی که روی جنین در حال رشد تاثیر می­گذارد، حساس است (38). در این مطالعه، اثرات دوزهای مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بر رشد و نمو و تغییرات بافتی و آسیب­شناسی قشر مغز جنین جوجه در طول دوره جنینی بررسی شدند.

2- مواد و روش­ها

آماده­سازی نانوذرات: در این تحقیق به‫عنوان یک مطالعه کاربردی در ابتدا، نانوذرات Tio2 از Sigma-Aldrich (United Kingdom) تهیه شد. نانوذرات TiO2 مورد استفاده در این تحقیق آناتاز و با خلوص 7/99 درصد بودند.  نانوذرات پس از وزن کردن، در آب دوبار تقطیر حل شدند. سپس در یک دستگاه سونیکاتور پروب (Hielscher USA) به‫مدت ۹۰ دقیقه (سه چرخه 30 دقیقه­ای) به‫منظور کاهش اندازه نانوذرات تحت فراصوت قرار گرفتند. برای مشخص کردن اندازه نانوذرات Tio2 از آنالیزگر اندازه ذرات یا PSA (VASCO, France) و میکروسکوپ الکترونی عبوری یا TEM (EM UC6, Leica) استفاده شدند. اندازه ذرات تیتانیوم حدود 30 نانومتر بودند (شکل 1).

   

شکل 1: مورفولوژی و خصوصیات نانوذرات Tio2. (a) عکس TEM: نشان­دهنده شکل کروی نانوذرات Tio2 با اندازه حدود 30 نانومتر. (b) نمودار PSA: نشان دهنده اندازه نانوذرات در حدود 30 نانومتر

جنین جوجه و گروه­های آزمایشی: در این آزمایش تاییدیه اخلاقی از کمیته اخلاق زیستی دانشگاه فردوسی مشهد با شماره 29915 دریافت شد. برای انجام آزمایشات، تعداد 90 عدد تخم مرغ نطفه­دار نژاد راس لاین (Ross line) با وزن 2±5/5 گرم از شرکت سیمرغ واقع در مشهد، خراسان رضوی، ایران خریداری شد. تخم­ها پس از 48 ساعت در شرایط عادی (دمای 37 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 65 درصد ) انکوبه شدند و از روش شمع­گذاری برای تشخیص تخم­های نطفه­دار، استفاده شد. تخم­ها به‫طور تصادفی به 5 گروه 6 تایی برای گروه­های مختلف تقسیم شدند. در این تحقیق عمل رقیق­سازی توسط نرمال سالین انجام گرفت. گروه کنترل بدون تیمار و گروه شم نرمال سالین دریافت نمودند که انتظار می‫رفت، در بررسی­های انجام شده، بین این دو گروه تفاوت معنی­داری وجود نداشته باشد. اما سایر گروه­ها، محلول­های حاوی 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نانوذرات TiO2 دریافت کردند.

پودر نانوذرات TiO2 پس از حل شدن در نرمال سالین، به‫مدت 30 دقیقه تحت فراصوت قرار گرفت. در روز اول، ابتدا محل کیسه هوایی تخم­مرغ­ها با استفاده از روش نوربینی مشخص و سپس 1/0 میلی­لیتر از محلول تزریق توسط یک سرنگ توبرکولین استریل 1 میلی لیتری، در کیسه هوایی تزریق و تخم ها انکوبه شدند.

بررسی مورفولوژی جنین­ها: پس از 7، 9 و 13 روز از انکوباسیون، وزن جنین و طول تاج - کفل یا CRL (Crown-rump length) ارزیابی شد. از طرفی درصد زنده­مانی جنین­ها نیز در تمام روزها و گروه­های آزمایشی ثبت شد. علاوه بر این، معیارهای همبرگر و همیلتون (Hamburger, Hamilton 1951) برای ارزیابی جنین­ها استفاده شد (39).

بررسی میکروسکوپی مغز: در این مطالعه، نمونه­برداری از قشر مغز انجام گرفت و برای بررسی­های بافت­شناسی از روش­های استاندارد آزمایشگاهی استفاده شد. نمونه­ها به‫مدت 48 ساعت در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. سپس مراحل آبگیری، شفاف­سازی و آغشته­سازی با پارافین در دستگاه پاساژ بافتی انجام گردید. پس از قالب­گیری نمونه­ها، برش­گیری توسط دستگاه میکروتوم نیمه اتوماتیک (مدل لایکای آلمان) و با ضخامت 6 میکرون انجام شد. مقاطع مزبور با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ­آمیزی گردیده و پس از مونته کردن در زیر میکروسکوپ نوری (Nikon U-III multi-point Sensor System, Japan) بررسی شدند. از برنامه­های Image J و DP2-BSW  برای انجام هیستومورفومتری پس از تعیین محل مخ و مخچه از اطلس رشد و نمو جوجه استفاده شد (40). در بررسی­های هیستومورفومتری شمارش تعداد کل سلول­ها (نورون­ و سلول‫های گلیال) و مویرگ­های قشر مخ و مخچه در تمام روزها و گروه­های آزمایشی در فضایی به مساحت 104 میکرومتر مربع انجام شد. همچنین شمارش تعداد سلول­های پورکنژ در 200 میکرومتر در گروه­های آزمایشی و کنترل قشر مخچه در روز 13 انکوباسیون انجام شد. از طرفی، پس از مشخص کردن لایه­های مخچه در روزهای جنینی مورد مطالعه، ضخامت لایه­ها اندازه­گیری و مقایسه شدند (41). در این مطالعه بررسی­ها در رابطه با تکامل بافتی و آسیب شناسی بخش قشری مخ و مخچه جنین­های تحت تیمار با غلظت­های مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در روزهای جنینی مورد مطالعه، انجام شد. بافت­های مغز از لحاظ دژنراسیون، نفوذ سلول­های التهابی، پرخونی و خونریزی توسط متخصص آسیب شناسی مورد بررسی قرار گرفت.

3- آنالیز آماری

برای بررسی آماری، نتایج به‫صورت میانگین±SD (Standard deviation) برای متغیرهای کمی و با فراوانی (درصد) برای متغیرهای کیفی بیان شد. نرمال بودن داده­ها با استفاده از آزمون شاپیرویکس بررسی گردید که برای داده­های غیر نرمال از آزمون کروسکال والیس و مقایسه­های دوتایی دان-بنفرونی و در تجزیه و تحلیل داده­های نرمال از آزمون آنالیز واریانس و مقایسه­های دوتایی توکی استفاده شده است. در بررسی همبستگی بین متغیرها از رگرسیون و ضریب همبستگی پیرسن استفاده شد. نرم افزار مورد استفاده در این پژوهش SPSS v.26 و GraphPad Prism 9 بوده و سطح معنی‫داری آزمون ها کمتر از 05/0 (در نتایج مقادیر کمتر از 05/0 با علامت "*" و مقادیر کمتر از 01/0 با علامت "**" مشخص شده است) در نظر گرفته شد.

4- نتایج

نتایج حاصل از رشد و نمو جنین­ها

نتایج نشان داد در تمام روزها در غلظت­های 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر، مرگ و میر جنین­ها مشاهده شد. بدین‫ترتیب که برای جنین­های تیمار شده با 25 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 در روز 7، 40 درصد و در روزهای 9 و 13 انکوباسیون 20 درصد مرگ و میر مشاهده شد. همچنین برای جنین­های تیمار شده شده با50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 در روز 7 انکوباسیون 17 درصد و در روزهای 9 و 13 انکوباسیون 25 درصد مرگ و میر برای ثبت شد. از طرفی، میزان مرگ و میر جنین­هایی که 5/12 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 دریافت نموده بودند، به 25 درصد رسید (شکل 2). در بررسی­های مورفولوژی جنین­های 13 روزه که با دوز 50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند، کاهش وزن (P=0.0301) و طول (P=0.0347) اتفاق افتاد که نسبت به گروه کنترل دارای اختلاف معنی­دار بودند. اما در سایر روزها و گروه­های آزمایشی تفاوت معنی­داری بین گروه­ها مشاهده نشد (شکل 3).

    

شکل 2: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر درصد زنده­مانی جنین­های جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون در گروه­های کنترل، شم و گروه­های تحت تیمار با غلظت­های 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر.

 

 

شکل 3: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر وزن (a) و طول (b) جنین­های جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون، داده­ها به صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی دار در سطح p< 0.05 است.

نتایج حاصل از بررسی­های آسیب­شناسی و هیستومورفومتریک قشر مغز

تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی مغز در جنین‌های تیمار شده با نانوذرات Tio2، تغییرات آسیب بافتی را در ساختار مغز نشان داد. بررسی­های میکروسکوپی مغز در جنین­های 7 روزه، مانند گروه­های کنترل و شم، در تمام گروه­های آزمایشی مورفولوژی طبیعی را نشان داد.

در بررسی­های هیستومورفومتری شمارش تعداد سلول­ها (نورون­ و سلول های گلیال) در قشر مخ جنین­های 13 روزه کاهش معنی­داری را در گروه آزمایشی 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به گروه­های کنترل و شم ثبت کرد (جدول 1 و شکل 4). اندازه­گیری­های هیستومورفومتری مخچه نشان داد، تعداد کل سلول­های قشر مخچه در هیچ‫کدام از روزها و گروه­های آزمایشی تغییری را نشان نداد (شکل 5). اما تعداد سلول­های پورکنژ در گروه آزمایشی 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر جنین­های 13 روزه در مقایسه با گروه کنترل (0043/0=p) و شم (0193/0= p) کاهش معنی­داری داشتند (شکل 6 و d7). در این تحقیق باوجود این‫که ضخامت کل لایه­های قشر مخچه در روز 13 انکوباسیون در گروه 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به گروه­های کنترل و شم کاهش را نشان داد، اما تفاوت معنی­داری در هیچکدام از گروه­ها و روزهای تحت آزمایش وجود نداشت (شکل7 و 8).

نتایج آسیب­شناسی پرخونی را در برخی گروه­ها نشان داد. براساس این نتایج، در جنین‌های 13 روزه که با 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل و شم افزایش تعداد مویرگ­ها در مخ و مخچه مشاهده شد. هرچند پرخونی در قشر مخ نسبت به گروه کنترل معنی­دار نبود (شکل a9) اما پرخونی در قشر مخچه نسبت به گروه کنترل (0024/0P=) و شم (0198/0P=) معنی­دار بود. همچنین، پس از گذشت 9 روز از انکوباسیون، در مخچه جنین­های تحت تیمار شده با 50 میکروگرم بر میلی­لیتر نانوذرات Tio2 به‫طور معنی­داری نسبت به گروه کنترل (0091/0P=) و گروه شم (0060/0P=) پرخونی مویرگی مشاهده شد (شکل b9).

 

 

 

 

 

جدول 1: مقایسه تعداد سلول­های لایه قشری مخ در روزهای 7، 9 و 13 جنینی پس از تیمار با نانوذرات Tio2.

day

Groups

 

Control

Sham

12.5µg/ml

25µg/ml

50µg/ml

7th day

42±1601

44±1633

41±1528

45.67±1483

43.09±1477

9th day

63±2836

49±2845

32.23±2817

53±2763

50±2949

13th day

42.01±1036

45.4±1001

58.72±855.7

56.08±868

678±63. 23)a**, b*)

داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند، سطح معنی داری به صورت زیر نشان داده شده است:  a) مقایسه با گروه کنترل(b, مقایسه با گروه شم, * p<0.05  و **p<0.01.

 

  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: برش­های بافت قشر مخ در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین). a: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. b: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. c: بافت قشر مخ در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید)، نورون­ها (پیکان سیاه)، سلول­های گلیال (پیکان قرمز). بزرگنمایی 400× در مقیاس 50 میکرومتر. d: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. e: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. f: بافت قشر مخ در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های در حال تقسیم (پیکان سفید)، نورون­ها (پیکان سیاه)، سلول­های گلیال (پیکان قرمز). بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  شکل 5: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد سلول­های قشر مخچه جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند. اختلاف معنی‫داری بین هیچ‫کدام از گروه­های آزمایشی مشاهده نشد.

 

 

شکل 6: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد سلول­های پورکنژ قشر مخچه جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح 05/0 و ** نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح 01/0

است.

 

 

       

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 7: برش­های بافت قشر مخچه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین).a: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. Ⅳ.v: بطن چهارم، 1: لایه منتال داخلی، 2: لایه منتال خارجی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. b: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه حاشیه­ای، 3: لایه قشری داخلی. بزرگنمایی400× در مقیاس 20 میکرومتر. c: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های پورکنژ (پیکان سیاه)، 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه مولکولار اولیه، 3: لایه قشری داخلی (پورکنژ)، 4: لایه گرانولار داخلی.  بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. d: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 7 انکوباسیون. Ⅳ.v: بطن چهارم، 1: لایه منتال داخلی، 2: لایه منتال خارجی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. e: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 9 انکوباسیون. 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه حاشیه­ای، 3: لایه قشری داخلی. بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. f: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه 50 میکروگرم بر میلی لیتر جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. سلول­های پورکنژ (پیکان سیاه)، 1: لایه گرانولار خارجی، 2: لایه مولکولار اولیه، 3: لایه قشری داخلی (پورکنژ)، 4: لایه گرانولار داخلی.  بزرگنمایی 400× در مقیاس 20 میکرومتر. g: بافت قشر مخچه در حال رشد گروه کنترل جنین جوجه در روز 13 انکوباسیون. ناحیه شمارش تعداد سلول­های پورکنژ (خطوط سیاه)، محل­های اندازه­گیری شده ضخامت قشر مخچه. بزرگنمایی 100× در مقیاس 200 میکرومتر.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 8: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر ضخامت لایه­های قشر مخچه جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD بیان شده­اند. اختلاف معنی‫دار بین هیچکدم از گروه­های آزمایشی مشاهده نشد.

شکل 9: مقایسه تاثیر نانوذرات Tio2 بر تعداد مویرگ­های قشر مخ (a) و مخچه (b) جنین جوجه در روزهای 7، 9 و 13 انکوباسیون. داده­ها به‫صورت mean±SD  بیان شده­اند. * نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح p< 0.05  و ** نشان دهنده وجود اختلاف معنی‫دار در سطح p<0.01  است. اختلاف معنی‫دار در هر روز به‫طور جداگانه بررسی شد.

5- بحث

احتمال آسیب به جنین، بیشترین نگرانی دوران بارداری می­باشد. بیشترین احتمال آسیب در انسان، 15 تا 56 روز پس از آخرین روز قاعدگی مادر است که در این دوره، اندام­های جنین تشکیل می­شود. این دوره همان دوره­ای است که مادر از بارداری خود بی­خبر است (42و43).

از آن‫جایی‫که روند رشد جنین جوجه به‫ویژه در 48 ساعت اول مشابه رشد جنین انسان در ماه اول است، جنین جوجه مدل مناسبی برای بررسی مطالعات سمیت جنینی و آسیب­شناسی می­باشد (44و45). رشد جنینی و بافت­شناسی مغز به‫خوبی شناخته شده است و از نظر اندازه­گیری­های هیستومورفومتری ارزشمند است. به خصوص در جوجه، بافت مغز یک مدل قابل مقایسه با پستانداران است که مراحل تمایز بافتی مشابهی دارند (46).

در این مطالعه، تاثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات Tio2 بر رشد و نمو جنین‌های جوجه و همچنین تکامل بافتی مغز در اوایل دوره جنینی بررسی شد. سد خونی مغزی که وظیفه آن محافظت از مغز در برابر مواد سمی­ می­باشد، در جنین جوجه، پس از روز پانزدهم انکوباسیون کاملا توسعه می­یابد. استفاده از نانوذرات Tio2 در ابتدای رشد جنینی، باعث می­شود تا نانوذرات به بافت­های مختلف مانند سلول­ها و ساختارهای پیش ساز مغز نفوذ نمایند. علاوه بر این، به‫دلیل جدا شدن از مادر و محصور بودن جنین­ها، اندام‌ها قادر به حذف نانوذرات نیستند. در نتیجه، جنین‌ها در طول دوره جنین‌زایی 20 روزه، هم قبل و هم بعد از توسعه سد خونی مغزی، همیشه در معرض نانوذرات Tio2 قرار می­گیرند (47و48).

بررسی­های ما نشان داد که نانوذرات TiO2 باعث افزایش مرگ و میر در دوره جنینی می­شود. همچنین کاهش در وزن و طول جنین­ها مشاهده شد. کاهش تعداد سلول‌های قشر مخ و سلول­های پورکنژ قشر مخچه نیز در جنین‌ها اتفاق افتاد. از طرفی ارزیابی‌ها، پرخونی در قشر مخچه را نشان داد.

پاتل و همکاران (49) افزایش مرگ و میر، کاهش وزن و طول جنین­ها را نشان دادند. یافته‌های این مطالعه نیز به‫طور مشابه نشان دهنده ایجاد مرگ و میر در تمام روزهای تحت بررسی جنین­ها پس از تیمار با نانوذرات Tio2 را ثابت کرد. همچنین این تحقیقات نشان دهنده کاهش وزن و طول جنین جوجه تحت تاثیر نانوذرات Tio2 بود. همچنین، براساس بررسی­های انجام شده توسط Islam و همکاران (50) کاهش قابل توجه وزن بدن در گروه­های تحت درمان با نانوذرات Tio2 مشاهده شد.

براساس نتایج ارزیابی بافت‌شناسی ساختار مغز، مطالعات نشان داد که نانوذرات Tio2 منجر به تغییرات مورفولوژیکی در بافت مغز می‌شوند. محققان نشان دادند که مغز موش‌های صحرایی ویستار به‫دلیل حداکثر تجمع تیتانیوم در دوز بالاتر نانوذرات Tio2 دچار بیشترین آسیب مغزی شدند (51).

 این مطالعه پرخونی مویرگی را در قشر مخچه در جنین‌های 13 روزه که با 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل و شم نشان داد. این مساله توسط برخی از محققان، مورد مطالعه قرار گرفته است. در کبد موش‌های صحرایی ویستار پس از مواجهه با نانوذرات Tio2، پرخونی ایجاد شد. نتایج بافت شناسی در ریه همچنین نشان دهنده پرخونی مویرگی در تمام گروه­های آزمایشی موش صحرایی ویستار بود (52). در این تحقیق نیز مشابه تحقیقات گذشته کاهش تعداد سلول­های پورکنژ و پر خونی در مخچه جنین­هایی نشان داده شد که حداکثر دوز را دریافت کردند (53).

نتایج این مطالعه نشان داد که تعداد سلول‌های قشر مخ بین گروه شاهد و نرمال سالین در جنین­های 13 روزه در مقایسه با گروهی که 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات Tio2 دریافت کردند، به طور معنی‌داری کاهش داشت. با مشاهده تغییرات بافت شناسی و کاهش زنده­مانی سلولی در موش های صحرایی نر، محققان سمیت عصبی نانوذرات Tio2 را نشان دادند (54). یافته­های واسنتراجه و راملینگام (55) با داده­های جمع­آوری شده از تحقیق ما سازگار بود. به گفته این محققان، بافت‌های مغزی گروه‌های تحت درمان با نانوذرات Tio2 تغییرات پاتولوژیک غیرطبیعی را در مقایسه با گروه کنترل نشان دادند. یافته‌های این تحقیق نشان داد که اثرات سمیت نانوذرات TiO2 با افزایش سن جنین و غلظت نانوذرات بیشتر می­شود. با توجه به تحقیقات محدود در مورد سمیت نانوذرات Tio2 در جنین جوجه، ارزیابی­های بیشتری برای درک خواص سمیت وابسته به غلظت نانوذرات Tio2 و در سنین­ بالاتر دوره جنینی و پس از تولد مورد نیاز است. مکانیسم مهمی که در پشت اثرات نوروتوکسیک Tio2 وجود دارد، توانایی آن در افزایش عوامل استرس اکسیداتیو و در عین حال کاهش عوامل آنتی اکسیدانتی در داخل سلول است. این نانوذرات با افزایش سطح H2O2 و مالون دی­آلدهید باعث آسیب سلولی می­شوند (56).

6- نتیجه­گیری

نتایج این مطالعه سمیت نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم را تایید نمود و نشان داد که میزان مرگ و میر جنین­های جوجه تحت تاثیر نانوذرات Tio2 قرار گرفت و همچنین باعث کاهش وزن و طول جنین­ها در روز 13 انکوباسیون شد. بررسی سمیت عصبی به‫دنبال تجویز نانوذرات Tio2 تغییرات مورفولوژیکی مغز را نشان داد. در بالاترین دوز دریافتی، کاهش تعداد سلول‌های قشر مخ و کاهش تعداد سلول­های پورکنژ مخچه جنین­های 13 روزه رخ داد. همچنین پرخونی مویرگی در قشر مخچه به‫وجود آمد. بنابراین، تحقیقات بیشتر برای تایید سمیت نانوذرات Tio2 و برای درک کامل ارتباط بین غلظت نانوذرات و زمان آسیب به جنین در دوران بارداری مادر ضروری است.

تشکر و قدردانی

این مقاله بخشی از پایان­نامه دکتری تخصصی رشته بافت­شناسی مقایسه­ای تحت عنوان «ارزیابی سمیت نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم بر رشد و نمو مغز و تغییرات آسیب­شناسی در جنین جوجه» است، بدین‫وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد، جهت تصویب و حمایت مالی، همچنین از کارشناس محترم آزمایشگاه بافت شناسی دانشکده دامپزشکی جناب آقای پورادیبی کمال تشکر و قدردانی را داریم.

-

1. Ochekpe N A, Olorunfemi P O, Ngwuluka N C. Nano technology and drug delivery part1: Background and Applications. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2009;8(3):265-274.
2. Vishwas M, Sharma SK, Rao KN, Mohan S, et al. Influence of surfactant and annealing temperature on optical properties of sol–gel derived nano-crystalline Tio2 thin films. Spectrochim Acta Part A Molecular and Biomedical Spectroscopy 2010;75(3):1073-7.
3. Alfano M, Pagnotta I, Pantano M. A review of patented worls on the mechanical characterization of materials at micro and nano scale. Recent Patents on Nanotechnology 2011;5(1):37-45.
4. Doktycz M, Simpson M. Nano enable synthetic biology. Molecular Systems Biology 2007;3(125):125.
5. Risha G, Boyer E, Evans B, Kuo K, et al. Characterization of nano-sized particles for propulsion application. MRS Fall Meeting 2003;800:243-254.
6. Kroll A, Pillukat MH, Hahn D, Schnekenburger J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment:  limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2009;72(2):370
7. Shi H, Magaye R, Castranova V, Zhao J. Titanium dioxide nanoparticles: a review of current toxicological data. Particle and Fibre Toxicology 2013;10:1-33.
8. Jin CY, Zhu BS, Wang XF, Lu QH. Cytotoxicity of titanium dioxide nanoparticles in mouse fibroblast cells. Chemical Research in Toxicology 2008; 21(9):1871-1877.
9. Hayati Roodbari N, Parivar K, Rezaee S, Badiee A. Comparison of the effects of nano titanium dioxide with 10nm diameter on testis and E-pididymis of edult male mice NMRI strain in “in vivo” conditions. Environment and Behavior - Sage Journals 2014;3:27-38.
10. Hayati Roodbari N, Parivar K, Badiei A, Zolfaghari Barogh S. Cytotoxic effects of nano-titanium dioxide on forelimb bud development in NMRI mouse embryos in vivo. Journal of Advances in Medical and Biomedical Research 2014;22:11- 24.
11. Umezawa M, Tainaka H, Kawashima N, Shimizu M, et al. Effect of fetal exposure to titanium dioxide nanoparticle on brain development & minus; brain region information. The Journal of Toxicological Sciences 2012;37:1247-1252.
12. Dehghani N, Noori A, Modaresi M. Investigating the effect of titanium dioxide nanoparticles on the growth and sexual maturation of male rats. International Journal of Basic Sciences Applied Research 2014;3:772-776.
13. Zhao X, Ze Y, Gao G, Sang X, et al. Nanosized TiO(2)-induced reproductive system dysfunction and its mechanism in female mice. PLoS One 2013;8:e59378.
14. Jeon YM, Kim WJ, Lee MY. Studies on liver damage induced by nanosized-titanium dioxide in mouse. Journal of Environmental Biology 2012;34:283-287.
15. Chen T, Yan J, Li Y. Genotoxicity of titanium dioxide nanoparticles. Search Results Web results Journal of Food and Drug Analysis 2014;22:95-104.
16. Gui S, Sang X, Zheng L, Ze Y, et al. Intragastric exposure to titanium dioxide nanoparticles induced nephrotoxicity in mice, assessed by physiological and gene expression modifications. material sciences, biomaterials, and nanomedicine. Particle and Fibre Toxicology 2013;10:(4) 1186/1743-8977.
17. Shichang L, Lanju X, Tao Zh, Guogang R, Zhuo Y. Oxidative stress and apoptosis induced by nanosized titanium dioxide in PC12 cells. Toxicology 2010;267:172-177.
18. Shukla RK, Kumar M, Gurbani D, Pandey AK. et al. TiO2 nanoparticles induce oxidative DNA damage and apoptosis in human liver cells. Nanotoxicology. 2013; 7(1):48-60.
19. Hussain SM, Gearhart J, SchlagerJJ. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Toxicology in Vitro 2005;19(7):975-83.
20. Petzoldt AG, Sigrist SJ. Synaptogenesis. Current Biology 2014;24:R1076 80.
21. Fedulov AV, Leme A, Yang Z, Dahl M, et al. Pulmonary exposure to particles during pregnancy causes increased neonatal asthma susceptibility. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2008;38(1):57-67.
22. Yeh GC, Taoc PL, Chen JY, Lai MC, et al. Dextromethorphan attenuates morphine withdrawal syndrome in neonatal rats passively exposed to morphine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2002 ;453(2-3):197-202.
23. Mohammadipour A, Fazel A, Haghir H, Motejaded F, et al. Maternal exposure to titanium dioxide nanoparticles during pregnancy; impaired memory and decreased hippocampal cell proliferation in rat offspring. Environmental Toxicology and Pharmacology 2014;37(2):617–25.
24. Li Y, Wang W, Wu Q, Li Y, et al. Molecular control of TiO2-NPs toxicity formation at predicted environmental relevant concentrations by Mn-SODs proteins. PLOS One 2012;7,e44688.
25. Hu, CW, Li M, Cui YB, et al. Toxicological effects of TiO2 and ZnO nanoparticles in soil on earthworm Eisenia fetida. Soil Biology and Biochemistry 2010;42,586–591.
26. Clemente Z, Castro V, Moura M, Jonsson C, et al. Toxicity assessment of TiO2 nanoparticles in zebrafish embryos under different exposure conditions. Aquatic Toxicology 2014;147:129–139.
27. Korn MJ, Cramer KS. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments 2007;8:306.
28. Pourquie O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mechanisms of Development 2004;121:1069-1079.
29. Wakai S, Hirokawa N. Development of the blood–brain barrier to horseradish peroxidase in the chick embryo. Cell Tissue Research 1978;195:195–203.
30. Prasek M, Sawosz E, Jaworski S, Grodzik M, et al. Influence of nanoparticles of platinum on chicken embryo development and brain morphology. Nanoscale Research Letters 2013;8:251.
31. Ulinski PS and Margoliash D. Neurobiology of the reptile-bird transition. In: Jones EG & Peters A (Editors), Cerebral Cortex. Plenum Press, New York 1990;217-265.
32. Fujimoto E, Miki A, Mizoguti H. Histochemical studies of the differentiation of microglia cells in the cerebral hemispheres of chick embryos and chicks. Histochemistry 1987;87:209-216.
33. Kallen B. Embryogenesis of brain nuclei in the chick telencephalon. Ergebnisse Anatomie Entwicklung Geschichte 1962;36: 62- 82.
34. Nickel R, Schummer A, Seiferle E . Anatomy of the Domestic Birds. Paul Parey, Berlin, Hamburg, Germany 1977.
35. Mial RC and Reckess GZ . The cerebellum and the timing of coordinated eye and hand tracking. Brain and Cognition 2002;48:212-226.
36. Espinar A, Piera V, Carmona A and Guerrero JM. Histological changes during development of the cerebellum in the chick embryo exposed to a static magnetic field. Bioelectromagnetics 1997;18:36-46.
37. Feirabend HKP. Development of longitudinal patterns in the cerebellum of the chicken (Gallus Domesticus): A Cytoarchitectural study on the genesis of cerebellar modules. European Journal of Morphology1990;28(2-4):169-223.
38. Fults DW, Towle AC, Lauder JM and Maness PF. PP60c-src in the developing cerebellum. Molecular and Cellular Biology 1985;5(1):27-32.
39. Hamburger V and Hamilton H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology 1951;88, 49–92.
40. Bellairs and Mark Osmond. The Atlas of Chick Development. Academic Press is an imprint of Elsevier 2014;426-546.
41. Akar S and Sur E. The development of chicken cerebellar cortex and the determination of AgNOR activity of the Purkinje cell nucle. Belgian Journal of Zoology 2010;140(2):214-222.
42. Gunaydın B. Gebenin Gebeligi ile Ilgili Olmayan Cerrahi Girisimlerinde Anestezi Yonetimi. Turk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Dernegi Dergisi. Effect of sugammadex administration on neural tube development in 48-h chick embryos. Microscopy Research and Techinique 2023;1–10. 
43. Sylvester GC, Khoury MJ, Lu X, Erickson JD. First-trimester anesthesia exposure and the risk of central nervous system defects: a population-based case-control study. American Journal of Public Health 1994;84(11):1757-1760.
44. Selcuk ML, Colakoglu F. Stereological, embryological and histomorphometric studies on embryonic development of cerebellum and cerebellar Purkinje cells in chicks. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi 2023;29(4):343-350.
45. Lee H, Nagele R. Neural tube closure defects caused by papaverine in explanted early chick embryos. Teratology 1979;20(2):321-331.
46. Akar S, Sur E. The development of chicken cerebellar cortex and the determination of AgNOR activity of the Purkinje cell nuclei. Belgian Journal of Zoology 2010; 140 (2): 216-224.
47. Wakai S, Hirokawa N () Development of the blood–brain barrier to horseradish peroxidase in the chick embryo. Cell Tissue Research 19781; 95:195–203.
48. de Boer AG and Gaillard PJ. Drug targeting to the brain. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 2007; 47:323–355.
49. Patel S, Jana S, Rajlakshmi C, Thakore S, et al. TiO2 nanoparticles induce omphalocele in chicken embryo by disrupting Wnt signaling pathway. Scientific Reports 2018;8(1).
50. Islam, S., Amin, N., Begum, D. (2024). Effects of Titanium Dioxide Nanoparticles on Chick Embryo: Immunomodulatory, Hepatic and Biochemical Alterations. Veterinary Medicine and Science, 10, e70105.
51. Grissa I, ElGhoul J, Mrimi R, El-Mir L, Ben Cheikh H, Horcajada P. In deep evaluation of the neurotoxicity of orally administered TiO2 nanoparticles. Brain Research Bulletin 2020;155,119-128.
52. Doudi M  and  Setorki M.  Influence of Titanium Dioxide Nanoparticles on Oxidative Stress and Pulmonary Dysfunction. Zahedan Journal of Research in Medical Sciences 2015;17(9): e1062
53. Mirkatuli HA, Baghban M, Yahyaei B. Comparison of the possible histopathological changes of the rat neonatal cerebellum induced by toxic and nontoxic doses of biological silver nanoparticles with chemical silver nanoparticles. Brain and Behavior 2021;11: e2319.
54. Latif M.A, Jabeen F,  Ali M, Rasul A,  Naz Sh, et al. Neurotoxic effects of titanium dioxide nanoparticles on the brain of male sprague dawley rats. Pakistan Journal of Pharmaceutical Science 2019;32(5):2311-2316.
55. Vasantharaja D, Ramalingam V. Neurotoxic effect of titanum dioxid nanoparticles: biochemical and pathological approach in male wistar rats. International Journal of Applied Pharmaciutics 2018; 4:0975-7058.
56. Wang J, Li N, Zheng L, Wang S, et al. P38- Nrf-2 signaling pathway of oxidative stress in mice caused by nanoparticle TiO2. Biological Trace Element Research 2011; 140:186-197.
 
سلول و بافت
دوره 16، شماره 3
پاییز 1404
صفحه 228-244

  • تاریخ دریافت 01 آبان 1403
  • تاریخ بازنگری 02 تیر 1404
  • تاریخ پذیرش 06 مهر 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما