فصلنامه
نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران، shabnam.mazandarani@yahoo.com
2 استاد، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران، garoosi@eng.ikiu.ac.ir
3 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران، r.haddad@eng.ikiu.ac.ir
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Introduction: The construction of synthetic pathways within the framework of metabolic engineering is considered a modern approach in biotechnology, enabling the production of valuable compounds from natural biological resources. This strategy focuses on utilizing abundant biomaterials—particularly carbohydrates—for the industrial production of chemical compounds by modifying metabolic pathways in microorganisms. These processes can convert biomass derived from biological sources into fuels, chemicals, and polymers, thereby opening new opportunities for the sustainable production of chemical substances from renewable resources.
Aim: This study specifically focuses on the enzymatic production of benzoylformate decarboxylase (BFD) with the overarching goal of completing the enzymatic pathway for the biosynthesis of BT. This intricate pathway initiates with xylose as the primary carbon source and proceeds through a cascade of four distinct enzymatic reactions. Notably, Escherichia coli (E. coli), possessing two endogenous enzymes integral to this pathway, holds the potential for complete BT biosynthesis upon the introduction of the remaining two requisite genes. This research thus seeks to engineer E. coli as a robust biocatalyst for sustainable BT production. The strategic implementation of a fully functional enzymatic pathway within a well-characterized microbial host, such as E. coli, promises a more environmentally benign and potentially more efficient route to BT synthesis compared to traditional chemical methods. Furthermore, the ability to manipulate and optimize the expression of these key enzymatic components within E. coli offers opportunities to enhance the overall yield and productivity of the bioproduction process. The successful establishment of such a system could pave the way for large-scale, cost-effective, and sustainable production of this valuable chemical intermediate.
Materials and Methods: To construct an E. coli strain capable of expressing the benzoylformate decarboxylase enzyme, the mdlC gene originating from Pseudomonas putida was amplified and subsequently cloned into both pBAD and pET28 expression vectors. Following the confirmation of successful cloning through rigorous confirmatory assays, protein expression was evaluated using Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), and the enzymatic activity was assessed.
Results: Benzoylformate decarboxylase (BFD) is a pivotal enzyme within the engineered metabolic pathway for producing 1,2,4-butanetriol (BT) in E.coli. In this study, the mdlC gene, encoding BFD from Pseudomonas putida, was successfully amplified and cloned into the versatile pBAD and the robust pET28 expression vectors. The pET28 system was preferred due to its ease of use and established track record in protein production, while the pBAD vector was strategically employed for its inducible expression capabilities, allowing for controlled protein synthesis. The expression of the 56 kDa target protein was confirmed through SDS-PAGE analysis, and the enzymatic function in the production of BT was subsequently verified using the sensitive and accurate HPLC method. This work lays a crucial foundation for the further optimization and development of a fully functional and efficient microbial cell factory for the sustainable production of this valuable chemical
Conclusion: The successful transfer of the expression construct into an appropriate E. coli host strain was confirmed by the presence of a distinct protein band at approximately 56 kDa on the SDS-PAGE gel, unequivocally verifying the expression of the mdlC gene. To evaluate the functional capacity of the expressed enzyme, the recombinant vector pBAD.mdlC was transformed into the E. coli TOP10 strain. The subsequent production of BT in the culture medium was meticulously analyzed using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC).
کلیدواژهها English
هندوانه با نام علمی Citrullus lanatus گیاهی علفی، یکساله و رونده از خانواده Cucurbitaceae است. خانواده Cucurbitaceae شامل 120 جنس و 825 گونه است که در مناطق گرمسیری و معتدل در سراسر جهان رشد میکنند (1). هندوانه بهطور عمده از طریق بذر تکثیر میشود. ارقام هندوانه شامل ارقام دانهدار (دیپلوئید) و ارقام هیبرید بیدانه (تریپلوئید) میباشند (2). هیبریدهای تریپلوئید هندوانه اولین بار در سال 1947 در ژاپن گزارش شدند (3) . هیبریدها در اکثر محصولات کشاورزی باعث افزایش عملکرد، افزایش پایداری عملکرد و بهبود مقاومت در برابر تنشهای غیر زیستی و زیستی میشوند. ارقام هیبرید بدون دانه بهدلیل عدم وجود دانه، بازارپسندی بیشتر و همچنین ارزش اقتصادی بیشتر برای کشاورزان نسبت به ارقام دانهدار محبوبیت بیشتری دارند و بهطور گستردهای در دسترس هستند (4).
با وجود عدم تولید بذر در ارقام هیبرید تریپلوئید، تولید این ارقام نیازمند گردهافشانی میباشد، زیرا تشکیل میوه و کیفیت آن به هورمونهای رشد آزاد شده در هنگام رشد لوله گرده و لقاح تخمک وابسته است (5). نکته حائز اهمیت این است که گردهافشانی در هندوانههای هیبرید نیازمند انتقال دانه گرده از ارقام دانهدار میباشد زیرا گرده خود این ارقام زنده نمیباشند (6). بنابراین گلهای نر در ارقام تریپلوئید سهم بسیار محدودی در تولید گرده و گردهافشانی دارند. ازاینرو، گردهافشانی در ارقام هندوانه بیدانه بسیار چالشبرانگیزتر از ارقام دانهدار است (2). علاوه بر این، باوجود هزینههای زیاد، بذرهای تریپلوئید بهخوبی جوانه نمیزنند. بنابراین روشهای مبتنی بر کشت بافت گیاهی بهمنظور تولید گیاهانی با ثبات از نظر ژنتیکی در ارقام هیبرید و تریپلوئید از اهمیت بالایی برخوردار است، زیرا میتواند گامی مهمی در کاهش وابستگی به واردات بذور اینگونه ارقام باشد (7). در سالهای اخیر روش کشت بافت گیاهی بهعنوان یک فناوری نوین، پتانسیل زیادی برای پاسخگویی به تقاضای روزافزون جهانی در زمینه توسعه کشاورزی پایدار دارد. کشت بافت گیاهی کمکهای قابلتوجهی برای بهبود علوم کشاورزی ارائه کرده و امروزه بهعنوان یک ابزار ضروری در کشاورزی نوین مشارکت میکند. با توجه به پیشرفتهای اخیر در کشت بافت گیاهی، امروزه میتوانیم تعداد زیادی گیاه را از یک بذر یا ریزنمونه با صفات موردنظر تکثیر کنیم. علاوه بر این، استفاده از کشت بافت گیاهی فضای موردنیاز برای آزمایشهای مزرعهای را کاهش میدهد و میتوان تعداد زیادی از گیاهان عاری از بیماری را از طریق انتخاب دقیق و فنهای استریل تولید کرد (8). روش ریزازادیادی، تکثیر سریع گیاهان موردنظر را از ریزنمونههای محدود تسهیل میکند و همچنین از نیاز به تولید بذر در هر فصل جلوگیری میکند. علاوه بر این استفاده از این تکنیک، مشکلاتی همانند عملکرد پایین بذر، هزینه بالای تولید بذر، جوانهزنی ضعیف، قوه نامیه پایین و نهالهای ضعیف را نیز نسبت به تکثیر با استفاده از بذر بر طرف میکند (7).
هر چند ریزازدیادی در شرایط درون شیشه روشی مهم برای تولید گیاهچههای یکسان ازنظر ژنتیکی میباشد، ولی ریزازدیادی در شرایط آزمایشگاهی ممکن است موجب ایجاد تغییرات نامطلوب و تنوع سوماکلونال شود (9). کشت سلول و بافت گیاهی در شرایط درون شیشه، بهطور سنتی برای تولید، حفاظت و بهبود منابع گیاهی استفاده میشود که در این روش انتظار میرود که تکثیر کلونال، گیاهانی با یکنواختی ژنتیکی تولید کند (10). با اینحال براون اولین مشاهدات را از تنوع ناشی از کشتهای سلول و بافت در شرایط دورنشیشه که امروزه بهعنوان تنوع سوموکلونال شناخته میشود را گزارش کرد (11). بنابراین حفظ ثبات ژنتیکی گیاهان پس از چند نسل واکشت در شرایط درون شیشه یکی از بزرگترین مشکلات استفاده از این تکنیک بهمنظور تولید گیاهان یکنواخت میباشد (10). با اینحال، لارکین و اسکوکرافت تنوع سوماکلونال را بهعنوان روشی جدید برای تولید گیاهانی با ویژگیهای عملکردی بهبود یافته معرفی کردند و این موضوع در سالهای بعد توسط سایر محققان نیز مستند شده است (12). از آن زمان تاکنون با استفاده از این روش گیاهان جدیدی دارای ویژگیهایی همانند مقاومت در برابر عوامل بیماریزا، متحمل به تنشهای زیستی و غیر زیستی و همچنین گیاهانی با میزان بهرهوری بسیار بالاتر نسبت به گیاه اولیه تولیدشدهاند (10). درهرصورت این موضوع که تحت شرایط درونشیشه کلونهای حاصل از گیاهان یکسان ازنظر ژنتیکی، پس از بازیابی، فنوتیپهای متفاوتی را نشان میدهند، در بسیاری از ریزنمونههای تحت تاثیر ریز ازدیادی مشاهده میشود. تنوع سوماکلونال ممکن است در سطح فنوتیپی بیان شود و ممکن است منها ژنتیکی یا اپیژنتیکی داشته باشد (13). ازجمله مهمترین عوامل موثر بر ایجاد تنوع سوماکلونال در شرایط کشت بافت را میتوان ژنوتیپ گیاهی، انحرافات کروموزومی، منبع ریزنمونه، اثرات هورمون رشد، دوزهای موادی که در محیط کشت استفاده میشود، مدتزمان کشت سلولی، نوع محیط کشت، نوع ریزنمونه، ماهیت ژنوتیپ گیاهان، مدتزمان کشت و استفاده از تنظیمکنندههای رشد گیاهی میتوان نام برد (14, 15).
بهمنظور بررسی وجود تنوع در گیاهان علاوه بر نشانگرهای مورفولوژیکی، میتوان از نشانگرهای مولکولی نیز استفاده کرد. نشانگرهای مبتنی بر DNA تحت تاثیر شرایط محیطی یا مراحل رشد گیاه قرار نمیگیرند و این ویژگی برتر آنها در ارزیابی تنوع ژنتیکی میباشد (16). ازجمله نشانگرهای DNA برای بررسی تنوع ژنتیکی میتوان ISSR، SSR، AFLP، RAPD و RFLP را نام برد (17). نشانگر ISSR نوعی نشانگر نیمه تصادفی است که دارای بخشهای دارای نوکلئوتیدهای تکراری مانند GT، AC و AG میباشد (18). ازجمله مزایای استفاده از تکنیک ISSR میتوان به این موارد اشاره کرد که نیاز به آگاهی قبلی در مورد توالی ژنوم ندارد و الگوهای چندشکلی و چندمکانی ایجاد میکند. هر باند تولیدشده مربوط به قسمتی از توالی DNA میباشد که با دو ریز ماهوارهی معکوس شده پوشیده شده است. محصولات تکثیرشده معمولا ۲۰۰ تا ۲۰۰۰ جفت باز طول دارند و با روشهای الکتروفورز آگارز و اکریلامید قابل بررسی میباشند و نیاز به استفاده از مواد رادیواکتیو ندارند (19). بهعلت استفاده از آغازگرهای بلند (۱۶ تا ۲۵ مری) در مقایسه با آغازگرهای RAPD (۱۰ مری) تکرارپذیری ISSR بسیار بالاست (20).
در پژوهشهای قبلی ترکیب سیتوکینین و اکسین روی باززایی شاخسارهها توضیح دادهشده است. در مطالعات مختلف بهخوبی نشان دادهشده است که سیتوکینینها تقسیم سلولی را تحریک میکنند و در از بین بردن خواب جوانههای جانبی، القای تشکیل جوانههای نابهجا، رشد جوانههای جانبی و کنترل چرخه سلولی نقش مهمی را ایفا میکنند، در حالیکه اکسینها در شروع تقسیم سلولی، سازماندهی سلولهای مریستمی که باعث ایجاد بافت تمایزنیافته (کالوس) یا اندامهای معین (شاخهها)، گسترش سلولی، اسیدی شدن دیواره سلولی، غالبیت راسی و تشکیل ریشه میشوند. از این نظر، دستکاری تعادل سیتوکینین: اکسین برونزا میتواند به نفع یک الگوی رشدی یا جهتدهی به یک برنامه اندامزایی باشد (21). در مطالعهای محققین تاثیر غلظتهای مختلف TDZ روی صفات طول ساقه، تعداد برگ و تعداد شاخه را در گیاه هندوانه بررسی کردند. یافتههای آنها آشکار کرد که هر سه صفت طول ساقه، تعداد برگ و تعداد شاخه با افزایش غلظت TDZ از 25/0 میلیگرم بر لیتر به 4 میلیگرم بر لیتر بهطور چشمگیری کاهش مییابد (22). در پژوهشی پستلین سولانو و همکاران (23)، اثر واکشتهای پشت سر هم را روی تنوع سوماکلونال در گیاه Vanilla planifolia با استفاده از نشانگر ISSR بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که با افزایش تعداد نسلهای واکشت در شرایط درون شیشه ( 5 واکشت پشت سرهم) درصد پلیمورفیسم مشاهدهشده نیز افزایش یافت (23). با توجه به اهمیت هندوانه در بین محصولات کشاورزی ایران و اهمیت استفاده از روشهای نوین بهمنظور تکثیر این گیاه همانند روش ریزازدیادی و همچنین عدم بررسی میزان تنوع ژنتیکی ایجادشده در اثر هورمونهای استفادهشده در محیط کشت و نسلهای پشت سر هم واکشت، در این پژوهش با استفاده از کشت جوانههای جانبی، ریز ازدیادی رقم جابانی هندوانه در چند نسل تحت تاثیر هورمونهای رشد در شرایط درونشیشه مورد بررسی قرار گرفت و ضمن بهینه نمودن نرخ پرآوری، میزان تنوع سوماتیکی احتمالی گیاهان ازدیاد شده در نسلهای تکثیر با والدین آنها بهوسیله نشانگر ISSR مقایسه شد.
۲- مواد و روشها
ضدعفونی و کشت بذرها: بهمنظور ضدعفونی، ابتدا بذرها بهمدت 24 ساعت در شرایط تاریکی و دمای 4 درجه سانتیگراد در آب خیسانده شدند. پس از جدا کردن پوستهی چوبی، بذرهای حاصل ابتدا با آب شهری و مایع ظرفشویی شسته شد و پس از آن سه بار با آب مقطر آبکشی شدند (24). بذرها در هود لامینار ایرفلو با الکل 70 درصد بهمدت 60 ثانیه و سپس با هیپوکلریت (W/V) 3 درصد بهمدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. پس از هر مرحله ضدعفونی بذرها 3 مرتبه با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرها پس از برطرف کردن رطوبت سطحی توسط کاغذ صافی استریل، روی محیط کشت MS 8/1 حاوی 5/6 گرم در لیتر آگار کشت شدند (24). بذرهای کشت شده در اتاقک رشد با دورهی نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی در دمای 2±25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از گذشت یک هفته بذرهای جوانهزده به شیشههای 900 میلیلیتر حاوی محیط کشت MS کامل منتقل شده و بهمدت 3 هفته تحت شرایط دمایی 2±25 درجه سانتیگراد و طول دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند تا گیاهان به اندازه کافی رشد کرده و جوانه جانبی مناسبی بهعنوان ریزنمونه تهیه شود (25). ریزازدیادی با استفاده از جوانههای جانبی و در 4 نسل در روی محیط کشت MS با تیمارهای تنظیمکنندههای رشد انجام شد. پس از واکشت سوم از هر نسل صفات تعداد جوانه جانبی، طول نوساقه، تعداد برگ در نوساقه یادداشتبرداری و در تجزیه آماری استفاده شد. مناسبترین تیمارهای تنظیمکننده رشد مشخص شده و بهعنوان تیمارهای تنطیمکننده رشد نسل بعد انتخاب شد.
تیمارهای هورمونی: نسل اول ریزازدیادی: بهمنظور ریزازدیادی سه هفته پس از رشد گیاه در شرایط درونشیشه و افزایش اندازه گیاه بهحد مطلوب (دارا بودن بیش از سه جوانه جانبی در هر گیاهچه)، جوانههای جانبی جداشده و در هر شیشه تعداد سه ریزنمونه در دو نوع تیمار هورمونی شامل سه غلظت از هورمون IAA (0، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر) و سه غلظت از هورمون BAP (0، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر) و همچنین سه غلظت از هورمون IAA (0، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر) و سه غلظت از هورمون TDZ (0، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر) در سه تکرار و بهصورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی قرار داده شد. ریزنمونهها به فاصله 21 روز سه بار در محیط کشت مشابه واکشت شدند. در انتهای واکشت سوم این نسل از ریزازدیادی دادههای حاصل از بررسی صفات مورد بررسی با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 26 آنالیز شد و مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.
نسل دوم ریزازدیادی: در نسل دوم ریزازدیادی بر مبنای نتایج نسل قبل ترکیبهای هورمون TDZ حذف و جوانههای جانبی تشکیل شده روی ساقههای حاصل از واکشت سوم آن نسل جدا شده و به تعداد سه ریزنمونه در هر شیشه با ترکیبهای هورمونی شامل سه غلظت از هورمون IAA (0، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر) و چهار غلظت از هورمون BAP (0، 1 ، 2 و 3 میلیگرم بر لیتر) در پنج تکرار و به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی قرار داده شد. ریزنمونهها به فاصله 21 روز سه بار در محیط کشت مشابه واکشت شدند. در انتهای واکشت سوم این نسل از ریزازدیادی دادههای حاصل از بررسی صفات تعداد برگ، تعدادجوانه جانبی و طول ساقه با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 26 آنالیز شد و مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت. سپس بهترین تیمارهای هورمونی برای استفاده در نسل سوم ریزازدیادی انتخاب شدند.
نسل سوم ریزازدیادی: در نسل سوم ریز ازدیادی با توجه به نتایج نسل قبل از غلظتهای صفر، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 1 و 2 میلیگرم بر لیتر BAP در 6 تکرار به عنوان تیمارهای منتخب استفاده شد. بدینمنظور، جوانههای جانبی گیاهچههای حاصل از واکشت سوم نسل دوم ریزازدیادی بریده شده و در تیمارهای هورمونی منتخب بهصورت ازمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی قرار گرفتند. در این نسل نیز سه واکشت با فاصله زمانی 21 روز در محیط کشت حاوی تیمارهای منتخب انجام شد. و همانند نسل های قبل ریز ازدیادی پس از یاداشت صفات رشدی آنالیز داده، مقایسه میانکین و انتخاب بهترین تیمارها برای ادامه نسل 4 ریز ازدیادی انجام شد.
نسل چهارم ریزازدیادی: برای انجام نسل چهارم ریزازدیادی بر اساس دادههای حاصل از واکشت سوم نسل قبل ریزازدیادی جوانههای جانبی سه تیمار هورمونی شامل صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP، 1 میلیگرم بر لیتر IAAو 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP انتخاب شدند. سپس جوانههای جانبی حاصل از گیاهان رشد یافته در نسل قبل از گیاهچه ها جدا شده و جهت بررسی غلظت تاثیر غلظت های هورمونی منتخب در نسل 4 ریز ازدیادی به محیط کشت MS حاوی تیمار هورمونی منتخب بهصورت طرح کاملا تصادفی متعادل منتقل شدند. سپس همانند نسلهای قبل ریز ازدیادی ریزنمونهها سه مرتبه با فاصله 21 روز در محیط کشت حاوی هورمونهای منتخب واکشت شدند. دادههای حاصل از بررسی صفات تعداد برگ، تعدادجوانه جانبی و طول ساقه با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 26 آنالیز و مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.
نمونهبرداری جهت استخراج DNA و بررسی مولکولی: بدین منظور برگ گیاهان حاصل از واکشت سوم هر نسل از ریزازدیادی (سه نمونه از هر تیمار) برداشت و سپس نمونههای با هم مخلوط شدند و بلافاصله در ازت مایع تثبیت گردیدند تا نمونههای انتخابشده برای استخراج DNA نماینده تمامی گیاهچههای موجود در واکشت سوم هر نسل از ریزازدیادی باشد. ریزنمونههای برداشت شده تا زمان انتخاب تیمارهای منتخب در نسل چهارم ریزازدیادی، در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
ریشهدار کردن گیاهچهها در شرایط درونشیشه: به منظور تعیین بهترین غلظت هورمونی جهت ریشهزایی، شاخسارههای کاملا رشدیافته حاصل از نسل چهارم ریزازدیادی به محیط کشت MS حاوی هورمونهای 5/0 میلیگرم بر لیتر NAA و 5/0 میلیگرم بر لیتر BAP (26) و همچنین محیط کشت MS عاری از هورمون منتقل شد. سپس ظروف کشتشده به اتاقک رشد منتقل و پس از سه هفته از گیاهچههای ریشهدار شده برای سازگاری استفاده شد.
سازگاری گیاهچه رشد یافته در شرایط گلخانهای: گیاهچههای کامل به آرامی از آگار جدا شده و پس از شستشوی ریشه آنها با آب مقطر، در گلدانهای کوچکی که با ترکیبی ازکوکوپیت، پرلیت، پیت ماس و خاک مزرعه استریل با نسب 1:1:1:1 پر شده بود قرار داده شدند.گلدانها با مقدار کمی آب مقطر مهپاش شده و برای حفظ حداکثر رطوبت، با درب پلاستیکی شفاف پوشانده شده و به ژرمیناتور تحت شرایط دمایی 2±25 درجه سانتیگراد و طول دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. جهت انجام سازگاری تدریجی و تهویه بهتر هر روز یک سوراخ تا سازگاری کامل به شرایط طبیعی (حداکثر 14 روز) در درب پلاستیکی ایجاد شد و آبیاری هر 24 ساعت انجام گرفت (27). در دوره آبیاری 24 ساعته گیاهان دچار تجمع آب در بافت شدند بنابراین مدت زمان آبیاری به 48، 72 و 96 ساعت تغییر کرد، همچنین به منظور بهینهسازی روش سازگاری تعداد سوراخهای روی درپوش در طول زمان تغییر یافت. در آخرین آزمایش، آبیاری با محلول حاوی عناصر درشت مغذی، ریز مغذی و آهن انجام شد که متاسفانه گیاهی به سازگاری نرسید.
استخراج DNA ژنومی و بررسی کیفیت نمونه استخراج شده: استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش حیدری جاپلاقی و همکاران (28) انجام شد. سنجش کمی و کیفی DNAاستخراجشده با استفاده از اسپکتروفتومتر و جذب در طیفهای مختلف نوری نمونه (A260/A230 و A260/A280) و الکتروفورز روی ژل آگارز 8/0 درصد مورد بررسی قرار گرفت.
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) نشانگرهای مولکولی: در این پژوهش بهمنظور مطالعه تغییرات ژنتیکی احتمالی در نسلهای ریزازدیادی از 5 نشانگر مولکولی ISSR به عنوان آغازگر استفاده شد (29, 30). در این واکنش از مسترمیکس (شرکت آمپلیکون ساخت دانمارک) استفاده شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 5/12 میکرولیتر مسترمیکس، 1 میکرولیتر DNA الگو رقیق شده با غلظت 50 نانوگرم، 1 میکرولیتر آغازگر و آب دیونیزه تا رسیدن به حجم 25 میکرولیتر انجام شد. برنامه واکنش زنجیرهای پلیمراز شامل واسرشته سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه، واسرشتهسازی ثانویه در دمای 94 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه، اتصال آغازگرها به رشته الگو بهمدت 70 ثانیه (دمای اتصال آغازگرها 45 تا 49 درجه سانتیگراد متناسب با آغازگر متغیر بود)، گسترش رشته جدید در دمای 72 درجه سانتیگراد بهمدت 70 ثانیه به تعداد 35 چرخه و در نهایت گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد بهمدت 8 دقیقه، قرارگیری نمونهها بهمدت 1 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد بود. توالی و دمای اتصال آغازگرها در جدول 1 شرح داده شده است (30).
جدول 1: توالی نوکلئوتیدی و دمای اتصال آغازگرهای مورد استفاده برای تعیین تنوع ژنتیکی
|
نام آغازگر |
توالی آغازگر(3‘→5‘) |
دمای اتصال |
|
UBC-808 |
AGAGAGAGAGAGAGAGC |
49 |
|
UBC-825 |
ACACACACACACACACT |
47 |
|
UBC-826 |
ACACACACACACACACC |
49 |
|
UBC-864 |
ATGATGATGATGATGATG |
45 |
|
P2 |
AGAGAGAGAGAGAGAGT |
47 |
الکتروفورز فرآوردههای تکثیرشده و امتیازدهی الگوهای باندی نشانگر: مشاهده محصولات تکثیر شده بهوسیله PCR با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 2/1 درصد انجام شد. پنج میکرولیتر از هر محصول PCR در چاهکها ریخته شد. تانک الکتروفورز به منبع تامین برق با ولتاژ ثابت 90 ولت متصل و الکتروفورز بهمدت یکساعت انجام شد. سپس رنگآمیزی با محلول اتیدیومبروماید انجام و ژلها با استفاده از دستگاه ژل داک (شرکتUVP BioImaging System، مدل CA91789، آمریکا) عکسبرداری شدند.
امتیازدهی الگوهای باندی نشانگرها بهصورت دستی بهصورت کدهای صفر (عدم وجود باند) و یک (وجود باند) انجام و دادههای حاصل وارد نرمافزار اکسل شدند. درصد چندشکلی (Percentage of Polymorphism) برای هر کدام از آغازگرها بهصورت نسبت تعداد باندهای چندشکل به تعداد کل باندهای تولید شده توسط هر آغازگر و با استفاده از فرمول PIC = 1-ΣPi2 محاسبه شد (31). همچنین شاخص نشانگری (Marker Index) با استفاده از معادله MI= PIC×(np+β) برای همه نشانگرها محاسبه شد که در آن PIC محتوای اطلاعات چندشکلی، np تعداد کل جایگاههای ژنی چندشکل و β نیز از فرمول β=np/(np+nnp) میآید که در آن np تعداد باندهای تک شکل و nnp تعداد باندهای یک شکل میباشد (32). مشاهده فاصله ژنتیکی ژنوتیپها با استفاده از روش UPGMA و نرم افزار NTSYS-pc 2.02 تعیین شد (33). علاوه بر این، از نرم افزار GeneAlex 6.501 برای تخمین معیارهای آماری تنوع ژنتیکی، شاخص اطلاعات شانون و درصد چندشکلی مکانها، تجزیه واریانس مولکولیو واریانس بین و درون تیمارها برای نمونهها استفاده شد (34).
برای انجام مطالعه از آزمایشهای فاکتوریل بر مبنای طرح کامل تصادفی و برای تجزیه و تحلیل دادههای حاصل، از نرمافزار SPSS نسخه 26 استفاده شد. مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح اشتباه 5 درصد انجام شد.
تاثیر IAA، BAP و TDZ روی صفات ریختشناختی گیاه در نسل اول ریزازدیادی
با انجام آنالیز واریانس مشخص شد که غلظتهای مختلف IAA و BAP و اثر متقابل آنها و همچنین غلظتهای مختلف IAA و TDZ و اثر متقابل آنها اثر معنیداری در سطح احتمال 1 درصد روی تعداد برگ، طول ساقه و تعداد جوانه جانبی در محیط کشت MS داشتند (جدول2). همانطور که در شکلهای 1 الف و ب مشاهده میشود بیشترین تعداد برگ و جوانه جانبی در بین غلظتهای مختلف IAA در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر IAA و بیشترین تعداد برگ و جوانه جانبی در بین غلظتهای مختلف BAP در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر BAP تولیدشده است (شکل 1 ت و ث). نتایج حاصل از بررسی تعداد برگ و تعداد جوانههای جانبی تحت تاثیر برهمکنش غلظتهای مختلف IAA و BAP نشان داد که بیشترین تعداد برگ (با میانگین 34 عدد در ریز نمونه) و جوانه جانبی (با میانگین 66/10 عدد در ریز نمونه) در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP تشکیلشده است که این نتایج تاثیر مثبت برهمکنش دو هورمون IAA و BAP را در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر از هر هورمون را نشان میدهد (جدول3).
جدول 2: تجزیه واریانس اثر غلظتهای مختلف IAA، BAP و TDZ بر تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در نسل اول ریزازدیادی
|
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
|
تعداد برگ |
طول ساقه |
تعداد جوانه جانبی |
||
|
IAA |
2 |
** 3333/160 |
**2961/11 |
** 7037/26 |
|
TDZ |
2 |
** 4444/576 |
**4937/6 |
** 4814/34 |
|
TDZ × I AA |
4 |
** 4444/24 |
**6371/1 |
** 8703/2 |
|
خطا |
18 |
1851/2 |
0333/0 |
5555/0 |
|
ضریب تغییرات ( درصد) |
|
97/7 |
67/6 |
76/10 |
|
IAA |
2 |
** 9259/14 |
**1487/4 |
** 7777/1 |
|
BAP |
2 |
** 4814/13 |
**4331/1 |
** 7777/2 |
|
IAA × BAP |
4 |
** 7037/9 |
**6741/1 |
** 2222/1 |
|
خطا |
18 |
1481/1 |
0190/0 |
2222/0 |
|
ضریب تغییرات ( درصد) |
|
14/23 |
48/12 |
28/28 |
در بین غلظتهای صفر، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر IAA بیشترین طول ساقه با میانگین 79/3 سانتیمتر مربوط به تیمار شاهد بود که نسبت به تیمار 1 و 2 میلیگرم بر لیتر IAA تفاوت معنیداری را نشان داد (شکل 1پ). در بین غلظتهای مختلف BAP نیز بیشترین طول ساقه در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 2 ج). نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل بین غلظتهای مختلف IAA و BAP نشان داد که بیشترین طول ساقه با میانگین 23/5 سانتیمتر در ریز نمونه مربوط به تیمار شاهد است (جدول 3).
|
طول ساقه (سانتیمتر در ریزنمونه) |
تعداد جوانه جانبی ( تعداد در ریزنمونه) |
تعداد برگ (تعداد در ریزنمونه) |
غلظت BAP (mg/l) |
غلظت IAA (mg/l) |
|
a145/0 ± 233/5 |
d33/0 ± 66/4 |
f 57/0 ± 11 |
صفر |
صفر |
|
d087/0 ± 75/2 |
cd33/0 ± 66/5 |
de 57/0 ± 18 |
1 |
|
|
c035/0 ± 39/3 |
b33/0 ± 33/8 |
c 52/1 ± 22 |
2 |
|
|
b176/0 ± 23/4 |
e33/0 ± 66/2 |
g 88/0 ± 33/7 |
صفر |
1 |
|
d145/0 ± 56/2 |
c33/0 ± 33/6 |
f 57/0 ± 13 |
1 |
|
|
e088/0 ± 76/1 |
b57/0 ± 8 |
b 66/0 ± 66/25 |
2 |
|
|
e060/0 ± 68/1 |
b57/0 ± 8 |
e 57/0 ± 16 |
صفر |
2 |
|
e058/0 ± 50/1 |
b57/0 ± 8 |
cd 57/0 ± 20 |
1 |
|
|
e058/0 ± 50/1 |
a33/0 ± 66/10 |
a 15/1 ± 34 |
2 |
جدول 3: اثر متقابل غلظتهای مختلف IAA و BAP روی صفت تعداد جوانهی جانبی، تعداد برگ و طول ساقه در نسل اول ریزازدیادی (±SE میانگین)
|
|
|
|
|
ت |
ث |
ج |
|
|
شکل 1: مقایسه میانگین اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA روی صفات الف) تعداد برگ ب) تعداد جوانهی جانبی و پ) طول ساقه
و اثر اصلی غلظتهای مختلف BAP روی صفات ت) تعداد برگ، ث) تعداد جوانهی جانبی و ج) طول ساقه
نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی IAA نشان داد که بیشترین تعداد برگ با میانگین 11/6 عدد در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA تولید شد که در مقایسه با شاهد و 2 میلیگرم بر لیتر IAA بهترتیب 07/62 و 75/52 درصد افزایش نشان میدهد. (شکل2 الف). همچنین بیشترین تعداد برگ تحت تاثیر غلظتهای مختلف TDZ در تیمار شاهد تشکیل شد (شکل 2 ت). اثرات متقابل بین غلظتهای مختلف IAA و TDZ نشان داد که بیشترین تشکیل برگ مربوط به تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و صفر TDZ میباشد که این مقدار نسبت به شاهد 05/141 درصد افزایش نشان داد (جدول 4).
بیشترین تعداد جوانه جانبی تحت اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA و TDZ بهترتیب در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و تیمار شاهد مشاهده گردید (شکل 2 ب و ث). مطالعه نتایج حاصل از اثرات متقابل IAA و TDZ روی تشکیل تعداد جوانه جانبی نشان داد که بیشترین تعداد جوانه جانبی با میانگین 33/3 عدد در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و صفر TDZ مشاهده گردید و کمترین تعداد جوانه جانبی نیز در تیمار صفر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر TDZ مشاهده شد که این نشان میدهد با افزایش غلظت هورمون TDZ تعداد جوانه جانبی کاهش مییابد (جدول 4).
بررسی نتایج شکل 2 پ نشان میدهد که در بین غلظتهای مختلف IAA بیشترین طول ساقه در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر IAA ایجاد گردید که تفاوت معنیداری با سایر غلظتها نشان داد و بیشترین طول ساقه نیز در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر TDZ مشاهده گردید (شکل 2 ج). بررسی مقایسه میانگین اثرات متقابل تنظیمکنندههای رشد IAA وTDZ نشان داد که بیشترین طول ساقه در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر IAA و صفر TDZ ایجاد شد که با سایر تیمارهای آماری تفاوت معنیداری نشان داد، (جدول 4).
|
پ |
ب |
الف |
|
|
|
|
|
ج |
ث |
ت |
|
|
|
|
شکل 2: مقایسه میانگین اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA روی صفات الف) تعداد برگ ب) تعداد جوانهی جانبی و پ) طول ساقه
و اثر اصلی غلظتهای مختلف TDZ روی صفات ت) تعداد برگ، ث) تعداد جوانهی جانبی و ج) طول ساقه
جدول 4: اثر متقابل غلظتهای مختلف IAA و TDZ روی صفت تعداد جوانهی جانبی، تعداد برگ و طول ساقه در نسل اول ریزازدیادی (±SE میانگین)
|
طول ساقه (سانتیمتر در ریزنمونه) |
تعداد جوانه جانبی ( تعداد در ریزنمونه) |
تعداد برگ (تعداد در ریزنمونه) |
غلظت TDZ (mg/l) |
غلظت IAA (mg/l) |
|
e067/0 ± 23/0 |
bcd 33/0 ± 33/1 |
bc577/0 ± 4 |
صفر |
صفر |
|
e032/0 ± 36/0 |
bc33/0 ± 66/1 |
bc33/0 ± 33/4 |
1 |
|
|
c120/0 ± 33/1 |
d33/0 ± 66/0 |
c57/0 ± 3 |
2 |
|
|
a088/0 ± 03/3 |
a33/0 ± 33/3 |
a20/1 ± 66/9 |
صفر |
1 |
|
d073/0 ± 83/0 |
b0 ± 2 |
b33/0 ± 33/5 |
1 |
|
|
b119/0 ± 78/1 |
cd0 ± 1 |
bc33/0 ± 33/3 |
2 |
|
|
d063/0 ± 72/0 |
b0 ± 2 |
bc577/0 ± 4 |
صفر |
2 |
|
d073/0 ± 74/0 |
bcd 33/0 ± 33/1 |
bc577/0 ± 4 |
1 |
|
|
d020/0 ± 90/0 |
bc33/0 ± 66/1 |
bc577/0 ± 4 |
2 |
اثر غلظتهای مختلف IAA و BAPروی صفات ریختشناختی در نسلهای دوم تا چهارم ریزازدیادی
مطالعه اثر غلظتهای مختلف هورمونهای IAA و BAP روی صفات تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در نسل دوم و سوم ریزازدیادی نشان داد که غلظتهای مختلف BAP و همچنین برهمکنش IAA وBAP تاثیر معنیداری در سطح احتمال 1 درصد روی این صفات دارند ، درحالیکه اعمال غلظتهای مختلف IAAدر این دو نسل تاثیر معنیداری در سطح احتمال 5 درصد روی تعداد برگ و تاثیر معنیداری در سطح احتمال 1درصد روی صفات تعداد جوانه جانبی و طول ساقه نشان دادند (جدول 5 و6).
جدول 5: تجزیه واریانس اثر غلظتهای مختلف IAA و BAP بر تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در نسل دوم ریزازدیادی
|
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
|
تعداد برگ |
تعداد جوانه جانبی |
طول ساقه |
||
|
IAA |
2 |
* 050/3 |
**701/2 |
**701/2 |
|
BAP |
3 |
** 127/41 |
**55/30 |
**146/2 |
|
IAA × BAP |
6 |
** 627/12 |
**51/7 |
**083/1 |
|
خطا |
48 |
591/0 |
558/0 |
033/0 |
|
ضریب تغییرات ( درصد) |
|
80/10 |
19/28 |
53/15 |
جدول 6: تجزیه واریانس اثر غلظتهای مختلف IAA و BAP بر تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در نسل سوم ریزازدیادی
|
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
||
|
تعداد برگ |
تعداد جوانه جانبی |
طول ساقه |
|||
|
IAA
|
2 |
* 3611/109 |
**6944/4 |
**575/3 |
|
|
BAP |
1 |
** 0278/140 |
**3611/17 |
**558/1 |
|
|
IAA × BAP |
2 |
** 0278/505 |
**1944/35 |
**660/0 |
|
|
خطا |
30 |
1389/19 |
2611/1 |
092/0 |
|
|
ضریب تغییرات ( درصد) |
|
40/22 |
11/25 |
95/12 |
|
بررسی نتایج نشان داد که بیشترین تعداد برگ در نسل دوم ریزازدیادی تحت تاثیر اثر اصلی IAA در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر و تحت تاثیر اثر اصلی 3 میلیگرم بر لیتر حاصل شد (شکل 3 الف و ت). نتایج اعمال غلظتهای مختلف IAA روی تشکیل تعداد جوانه جانبی و طول ساقه نشان داد که بیشترین تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در تیمار شاهد مشاهده گردید ( شکل 3 ب و ت) درحالیکه غلظتهای مختلف BAP بیشترین تعداد جوانه جانبی در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر و بیشترین طول ساقه نیز در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 3 ث و ج). نتایج برهمکنش حاصل از اثر متقابل هورمونهای IAA و BAP در نسل دوم ریزازدیادی نشان داد که بیشترین تعداد برگ در تیمار 3 میلیگرم بر لیتر IAA و 3 میلیگرم بر لیتر BAP تشکیلشده است که با تیمار 1 میلیگرم بر لیترIAA و 3 میلیگرم بر لیتر BAP تفاوت معنیداری را نشان نداد (جدول 7). بیشترین تعداد جوانه جانبی نیز در غلظت صفر IAA و بهترتیب غلظتهای صفر و 1 میلیگرم بر لیتر BAP، 1 میلیگرم بر لیترIAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 2 میلیگرم بر لیترIAA و میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده گردید که تفاوت معنیداری را با هم نشان ندادند (جدول 6). بیشترین طول ساقه نیز در نسل دوم ریزازدیادی تحت تاثیر برهمکنش غلظتهای مختلف هورمونهای IAA و BAP در تیمار شاهد مشاهده شد (جدول7).
|
الف |
ب |
پ |
|
|
||
|
ت |
ث |
ج |
|
|
|
شکل 3: مقایسه میانگین اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA روی صفات الف) تعداد برگ ب) تعداد جوانهی جانبی و پ) طول ساقه
و اثر اصلی غلظتهای مختلف BAP روی صفات ت) تعداد برگ، ث) تعداد جوانهی جانبی و ج) طول ساقه
در نسل دوم ریزازدیادی
جدول 7: اثر متقابل غلظتهای مختلف IAA و BAP روی صفت تعداد جوانهی جانبی، تعداد برگ و طول ساقه در نسل دوم ریزازدیادی (±SE میانگین)
|
طول ساقه (سانتیمتر در ریزنمونه) |
تعداد جوانه جانبی ( تعداد در ریزنمونه) |
تعداد برگ (تعداد در ریزنمونه) |
غلظت BAP (mg/l) |
غلظت IAA (mg/l) |
|
a 245/0 ± 6/2 |
a 245/0 ± 6/4 |
b 438/0 ± 2/8 |
صفر |
صفر |
|
bc 04/0 ± 44/1 |
a 245/0 ± 4/4 |
ef 0316/0 ± 6/5 |
1 |
|
|
bcd 058/0 ± 38/1 |
b 374/0 ± 8/2 |
cd 438/0 ± 2/7 |
2 |
|
|
e 051/0 ± 76/0 |
c 245/0 ± 6/0 |
de 658/0 ± 4/6 |
3 |
|
|
cd 055/0 ± 3/1 |
b 316/0 ± 2 |
b 516/0 ± 6/8 |
صفر |
1 |
|
cd 037/0 ± 28/1 |
b 316/0 ± 2 |
f 316/0 ± 6/4 |
1 |
|
|
b 045/0 ± 6/1 |
a 447/0 ± 5 |
f 483/0 ± 2/5 |
2 |
|
|
e 037/0 ± 52/0 |
c 200/0 ± 8/0 |
a 316/0 ± 6/9 |
3 |
|
|
e 037/0 ± 68/0 |
b 316/0 ± 2 |
d 483/0 ± 8/6 |
صفر |
1 |
|
e 24/0 ± 66/0 |
b 4/0 ± 6/2 |
f 316/0 ± 6/4 |
1 |
|
|
d 037/0 ± 18/1 |
a 510/0 ± 4/4 |
bc 483/0 ± 2/8 |
2 |
|
|
e 037/0 ± 72/0 |
c 245/0 ± 6/0 |
a 316/0 ± 4/10 |
3 |
در بررسی نتایج حاصل از ریزازدیادی نسل سوم، مطالعه تاثیر اثر اصلی هورمونهای IAA و BAP روی تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی نشان داد که بیشترین تعداد برگ و جوانه جانبی تحت تاثیر این دو هورمون بهترتیب در غلظت 2 و 1 میلیگرم بر لیتر IAA (شکل 4 الف و ب) و2 و 1 میلیگرم بر لیتر BAPتشکیلشده است (شکل4 ت و ث) . در بین غلظتهای مختلف IAA بیشترین طول ساقه با میانگین 81/2 سانتیمتر در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر و برای BAP در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر مشاهده شد ( شکل 4 پ و ج). نتایج برهمکنش حاصل از اثر متقابل هورمونهای IAA و BAP در نسل سوم ریزازدیادی نشان داد که بیشترین تعداد برگ بدون تفاوت معنیدار بهترتیب در تیمارهای 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP، بیشترین تعداد جوانه جانبی در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP و بیشترین طول ساقه نیز در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP تشکیلشده است ( جدول8).
جدول 8: اثر متقابل غلظتهای مختلف IAA و BAP روی صفت تعداد جوانهی جانبی، تعداد برگ و طول ساقه در نسل سوم ریزازدیادی (±SE میانگین)
|
طول ساقه (سانتیمتر در ریزنمونه) |
تعداد جوانه جانبی ( تعداد در ریزنمونه) |
تعداد برگ (تعداد در ریزنمونه) |
غلظت BAP (mg/l) |
غلظت IAA (mg/l) |
|
b 07/0 ± 40/2 |
bc 30/0 ± 83/4 |
b 57/1 ± 83/21 |
1 |
صفر |
|
b 13/0 ± 58/2 |
d 33/0 ± 66/2 |
c 10/2 ± 83/10 |
2 |
|
|
b 09/0 ± 33/2 |
c 36/0 ± 4 |
c 64/1 ± 66/14 |
1 |
1 |
|
a 04/0 ± 29/3 |
b 55/0 ± 66/5 |
ab 44/1 ± 16/25 |
2 |
|
|
c 12/0 ± 69/1 |
d 22/0 ± 50/2 |
c 24/1 ± 16/16 |
1 |
2 |
|
c 06/0 ± 80/1 |
a 74/0 ± 16/7 |
a 40/2 ± 50/28 |
2 |
|
الف |
ب |
پ |
|
|
|
|
|
ت |
ث |
ج |
|
|
|
|
شکل 4: مقایسه میانگین اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA روی صفات الف) تعداد برگ ب) تعداد جوانهی جانبی و پ) طول ساقه
و اثر اصلی غلظتهای مختلف BAP روی صفات ت) تعداد برگ، ث) تعداد جوانهی جانبی و ج) طول ساقه در نسل سوم ریزازدیادی
مطالعه آنالیز واریانس تاثیر تیمارهای اعمالشده روی تعداد برگ در نسل چهارم ریزازدیادی نشان داد که هر سه تیمار اعمالشده اثر معنیداری در سطح احتمال 1 درصد روی تشکیل برگ، تشکیل جوانه جانبی و طول ساقه دارند (جدول 9). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که بیشترین تعداد برگ، جوانه جانبی در نسل چهارم ریزازدیادی در تیمار میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP تشکیل شد (شکل5 الف و ب). مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف استفاده شده در نسل چهار ریزازدیادی بهمنظور بررسی طول ساقه تشکیلشده نشان داد که بیشترین طول ساقه در تیمار صفر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده میشود (شکل 5 پ).
|
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
|
تعداد برگ |
تعداد جوانه جانبی |
طول ساقه |
||
|
تیمار |
2 |
428/1 ** |
055/5 ** |
388/22 ** |
|
خطا |
15 |
131/0 |
466/0 |
988/2 |
|
ضریب تغییرات ( درصد) |
|
32/23 |
59/24 |
88/20 |
جدول 9: تجزیه واریانس اثر غلظتهای مختلف IAA و BAP بر تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی ، طول ساقه، در نسل چهارم ریزازدیادی
|
الف |
ب |
|
|
|
پ |
|
شکل 5: مقایسه میانگین اثر اصلی غلظتهای مختلف IAA و غلظتهای مختلف BAP بر صفت الف) تعداد برگ، ب) تعداد جوانهی جانبی و پ) طول ساقه در نسل چهارم ریزازدیادی (اعداد داخل پرانتز نشاندهنده غلظتهای هورمونی مورد استفاده در آن تیمار میباشد)
نشانگرهای ISSR
در این مطالعه UBC-864 و UBC-808 بهترتیب با 17 و 14 باند بیشترین تعداد باند را نشان دادند. در استفاده از آغازگرها درمجموع تعداد 60 باند مشاهده شد. 26 مورد (3/43 درصد) از باندهای مشاهدهشده چندشکلی نشان دادند (جدول 10). در میان تیمارهای مورد بررسی در نسل 3 ریزازدیادی تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP با 9 جایگاه، بیشترین تعداد جایگاه پلیمورفیسم را نشان داد. درحالیکه کمترین جایگاه پلیمورفیسم مربوط به نسل 1 ریزازدیادی و تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP با دو جایگاه پلیمورفیسم بود (جدول 11). بیشترین تعداد باند مشاهده شده مربوط به آغازگر UBC-864 با 17 باند (تعداد باندهای کلی برای هر آغازگر شمارششده است) و کمترین تعداد مربوط به آغازگر P2 با 9 باند مشاهدهشده بود. متوسط تعداد باندهای بهدستآمده با استفاده از آغازگرها 12 باند بود. بیشترین تعداد باندهای دارای چندشکلی بهترتیب مربوط به آغازگرهای UBC-808 (13 باند)( شکل 6)، UBC-864 (6 باند)، UBC-825 (4 باند) و P2 (3 باند) بودند. در میان آغازگرهای موردبررسی UBC-826 هیچ چندشکلی را در میان جایگاههای مشاهدهشده نشان نداد. در میان آغازگرهای مورداستفاده UBC-808 با شاخص نشانگری 15/8 بهعنوان مناسبترین آغازگر و UBC-826 با شاخص نشانگری صفر کمترین مقدار اطلاعات را در این مطالعه در اختیار قرار میدهد (جدول 10). بررسی درصد چندشکلی در نسلهای مختلف نشان داد که بیشترین درصد چندشکلی مربوط به نسل 3 تحت تیمار با 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP میباشد (جدول11).
جدول 10: درصد چندشکلی، تعداد مکانهای تکثیرشده چندشکل، محتوای اطلاعات چندشکل و شاخص نشانگری در مطالعه حاضر
|
آغازگر |
تعداد مکان تکثیرشده |
تعداد مکان چند شکل |
درصد چندشکلی |
ضریب جاکارد |
(PIC) |
(MI) |
||
|
Min |
Max |
Mean |
||||||
|
UBC-826 |
10 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
|
UBC-864 |
17 |
6 |
3/35 |
87/0 |
94/0 |
9/0 |
25/0 |
59/1 |
|
UBC-825 |
10 |
4 |
40 |
8/0 |
1 |
9/0 |
6/0 |
65/2 |
|
P2 |
9 |
3 |
3/33 |
88/0 |
1 |
96/0 |
62/0 |
05/2 |
|
UBC-808 |
14 |
13 |
86/92 |
42/0 |
1 |
77/0 |
58/0 |
15/8 |
|
مجموع |
60 |
26 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
میانگین |
12 |
2/5 |
33/43 |
- |
- |
- |
41/0 |
89/2 |
شکل 6: باندهای مشاهدهشده در نمونههای تحت تیمار در نسلهای مختلف ریزازدیادی با استفاده از آغازگر UBC-808. پیکانها: جایگاههای پلیمورفیسم مربوط به آغازگر UBC-808، M: خطکش مولکولی 1Kb، C: کنترل منفی، DP = Donor Plant: شاهد، 1 الی 4: نسل 1 تا 4 ریزازدیادی تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP ، 5 الی 8: نسل 1 تا 4 ریزازدیادی تیمار 1میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP ، 9 الی 12: نسل 1 تا 4 ریزازدیادی تیمار 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP (بیشترین تعداد جوانه در تیمار 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP با میانگین 66/10 جوانه جانبی در هر ریزنمونه، با 3 جایگاه چندشکلی مربوط به آغازگر UBC-808 و 10 مکان تکثیر).
با توجه به تعداد باندهای مربوط به چندشکلی میتوان دریافت که UBC-808، UBC-864، UBC-825 و P2 آغازگرهای مناسبتری جهت بررسی تنوع ژنتیکی هندوانهها هستند. در این مطالعه، آغازگر UBC-826 با کمترین تعداد چندشکلی مشاهده شده، آغازگر مناسبی جهت جداسازی جمعیتها شناخته نشد. در میان آغازگرهای مورد استفاده UBC-808 با شاخص نشانگری 15/8 بهعنوان مناسبترین آغازگر و UBC-826 با شاخص نشانگری صفر کمترین مقدار اطلاعات را در این مطالعه در اختیار قرار میدهد (جدول 9). بررسی درصد چندشکلی در نسلهای مختلف نشان داد که بیشترین درصد چندشکلی مربوط به نسل 3 ریز ازدیادی تحت تیمار با 2 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP میباشد (جدول 11).
بر مبنای دادههای آغازگرهای مورد بررسی، دندروگرام مربوط به نسلهای مختلف تحت تیمار رسم شد (شکل 7). بر اساس دندروگرام رسم شده، بیشترین تشابه به نمونه شاهد در نسل 1 ریزازدیادی و تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده شد و بیشترین فاصله از نمونه شاهد نیز در نسل ریز ازدیادی و 3 تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده شد که این نتایج با کمترین و بیشترین جایگاههای چند شکل بهدستآمده با آغازگرهای مختلف که پیش از این اشاره شد، مطابقت دارد. بر اساس دندروگرام، نسلهای 1 و 2 شباهت بیشتری نسبت به نمونه شاهد داشته و به آن نزدیکتر هستند. شاخص جاکارد شاخصی است که میزان تشابه بین دو مجموعه مختلف را اندازهگیری کند. در زمینه چندشکلی ژنتیکی، این شاخص بهعنوان یکی از روشهای محاسبه تفاوتها و تشابههای میان مجموعههای ژنتیکی مورد استفاده قرار میگیرد. مقادیر بالای شاخص جاکارد نشاندهنده تشابه بیشتر بین دو مجموعه است یعنی عناصر مشترک زیادی بین دو مجموعه وجود دارند و این مجموعهها به هم شباهت بیشتری دارند. مقدار پایین شاخص جاکارد نشاندهنده تفاوت بیشتر بین دو مجموعه است. بررسی مجموع ضرایب جاکارد بهدستآمده برای تیمارهای مختلف نیز نشان داد که در نسل اول ریزازدیادی تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP بیشترین مقدار ضریب جاکارد مربوط به 5 آغازگر را داشته (مجموع ضرایب جاکارد 5 آغازگر برابر 84/4) و کمترین مقدار ضریب جاکارد (مجموع ضرایب جاکارد 5 آغازگر برابر 32/4) نیز در نسل سوم ریزازدیادی و تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده شد (شکل7). با بررسی نتایج بهدستآمده با استفاده از نرمافزار GenALEX، شاخص تنوع ژنتیکی Nei بین صفر تا 097/0 به دست آمد. همچنین درصد واریانس مولکولی بر اساس آنالیز AMOVA در جمعیت 89 درصد و در بین جمعیت 11 درصد محاسبه شد.
جدول 11: درصد چندشکلیهای مربوط به نسلهای مختلف تحت تیمار با هورمونها (اعداد داخل پرانتز نشاندهنده غلظتهای هورمونی مورد استفاده در آن تیمار میباشد)
|
نسلهای ریزازدیادی |
نوع تیمار |
نوع آغازگر |
||||
|
UBC-825 |
UBC-826 |
UBC-864 |
P2 |
UBC-808 |
||
|
نسل اول ریزادیادی |
IAA (35)/BAP (35) |
10 درصد |
0 |
25/6 درصد |
0 |
0 |
|
IAA (35)/BAP (2) |
10 درصد |
0 |
25/6 درصد |
0 |
27/27 درصد |
|
|
IAA (2)/BAP (2) |
20 درصد |
0 |
25/6 درصد |
1/11 درصد |
18/18 درصد |
|
|
نسل دوم ریزادیادی |
IAA (35)/BAP (35) |
10 درصد |
0 |
25/6 درصد |
0 |
36/36 درصد |
|
IAA (35)/BAP (2) |
0 |
0 |
5/12 درصد |
0 |
1/9 درصد |
|
|
IAA (2)/BAP (2) |
20 درصد |
0 |
25/6 درصد |
0 |
18/18 درصد |
|
|
نسل سوم ریزادیادی |
IAA (35)/BAP (35) |
0 |
0 |
25/6 درصد |
1/11 درصد |
45/45 درصد |
|
IAA (35)/BAP (2) |
20 درصد |
0 |
25/31 درصد |
0 |
18/18 درصد |
|
|
IAA (2)/BAP (2) |
0 |
0 |
25/6 درصد |
0 |
63/63 درصد |
|
|
نسل چهارم ریزادیادی |
IAA (35)/BAP (35) |
10 درصد |
0 |
25/6 درصد |
1/11 درصد |
36/36 درصد |
|
IAA (35)/BAP (2) |
0 |
0 |
25/6 درصد |
1/11 درصد |
27/27 درصد |
|
|
IAA (2)/BAP (2) |
20 درصد |
0 |
5/12 درصد |
0 |
1/9 درصد |
|
شکل 7: دندروگرام 13 هندوانه مورد بررسی در پژوهش حاضر با استفاده از الگوریتم UPGMA (اعداد داخل پرانتز نشاندهنده غلظتهای هورمونی مورداستفاده در آن تیمار میباشد).
در پژوهش وانگ و همکاران (24)، گزارش کردند که مدتزمان مورد نیاز برای اینکه جوانههای جداشده در کشت درونشیشه هندوانه بتوانند بهصورت طبیعی رشد کنند بهصورت تقریبی 20 روز است که با یافتههای تحقیق کنونی مطابقت دارد. نتایج بررسی ازدیاد طول ساقه و بهترین زمان مورد نیاز برای واکشت گیاه در مطالعه کنونی نیز نشان داد که واکشت گیاهان پس از گذشت 21 روز بهترین نتیجه را از نظر رشد گیاه در بردارد. گیاهچههای ایجادشده پس از گذشت مدتزمان مشخص باید به محیط کشت جدید منتقل شوند، در غیر اینصورت گیاهچهها بهسرعت زرد شده یا میمیرند. با اینحال قضاوت در مورد بهترین زمان قطع گیاهچه و انتقال آن به محیط کشت جدید به کمی تجربه نیاز دارد، زیرا فقط جوانههایی که کاملا تمایزیافتهاند میتوانند در محیط کشت رشد کنند. اگر قطعه جداشده بهمنظور واکشت زودتر از زمان مقرر از گیاهچه جدا شود بهکندی رشد میکند و یا میمیرد و اگر قطعه جداشده بهمنظور واکشت خیلی دیرتر از زمان مقرر از گیاهچه جدا شود، قادر به جذب مواد مغذی از محیطکشت نخواهد بود (24).
نتایج بررسی تاثیر غلظتهای مختلف TDZ روی صفات مورد بررسی نشان داد که با افزایش غلظت TDZ در محیطکشت سه صفت تعداد برگ، تعداد جوانه جانبی و طول ساقه کاهش یافت، بهطوریکه با افزایش غلظت TDZ از صفر به 2 میلیگرم بر لیتر همه صفات یادشده کاهش نشان دادند. بدرالدین و همکاران (22)، تاثیر غلظتهای مختلف TDZ روی صفات طول ساقه، تعداد برگ و تعداد شاخه را در گیاه هندوانه بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که هر سه صفت طول ساقه، تعداد برگ و تعداد شاخه با افزایش غلظت TDZ از 25/0 میلیگرم بر لیتر به 4 میلیگرم بر لیتر بهطور چشمگیری کاهش یافت که با نتایج تحقیق حاضر همخوانی داشت. در پژوهشی دیگر نتایج مشابهی از اثر منفی TDZ روی رشد طول ساقه و طول شاخه در غلظتهای بالای این هورمون روی دو رقم خیار "چای لای" و "بیگ سی" توسط محققین گزارششده است (35). علاوه بر این، برخی از پژوهشگران گزارش کردند که گیاهچههای گونههای مختلف ازجمله حبوبات و کدوتنبل در حضور TDZ در محیط کشت، رشد خود را متوقف کردند (36). یکی از دلایل کاهش صفات مورد بررسی در پژوهش حاضر احتمالا عدم تجزیه TDZ در محیط کشت و در نتیجه تجمع و افزایش غلظت این هورمون در محیط کشت باشد، زیرا در مطالعه کنونی واکشت ریزنمونهها هر 21 روز (سه واکشت در هر نسل ریزازدیادی) در محیط کشت حاوی مقادیر هورمونی مشابه با واکشت قبل انجام میگرفت، بنابراین احتمال دارد با توجه به عدم تجزیه TDZ در ریزنمونهها مقدار این هورمون برای رشد گیاه از حد مجاز بهویژه در غلظتهای بالاتر آن فراتر رفته باشد و این افزایش غلظت TDZ در گیاه و محیطکشت تاثیر منفی در رشد گیاه و صفات مورد بررسی در پژوهش حاضر داشته است (37). گووینداراج (38)، نیز در مطالعه ای گزارش کرد که افزایش مقدار TDZ در گیاه میتواند از طریق کاهش رشد مریستم انتهایی منجر به کاهش طول ساقه شود، همچنین افزایش TDZ ممکن است از طریق تغییر مسیر تمایز سلولی بهسمت تشکیل کالوس یا شاخه زایی غیر طبیعی از رشد جوانههای جانبی جلوگیری کند.
همانطور که در نتایج ذکر شد با توجه به اینکه در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر BAP در نسل اول ریزازدیادی نتایج بسیار مطلوبی روی صفات مورد بررسی نشان داد در نسل دوم ریزازدیادی بهمنظور بررسی تاثیر غلظتهای بالاتر BAP روی این صفات، غلظت 3 میلیگرم بر لیتر BAP در محیط کشت اعمال شد. نتایج نشان داد که افزایش غلظت BAP در نسل دوم ریزازدیادی منجر به افزایش صفات مورد بررسی نسبت به 2 میلیگرم بر لیتر در این نسل نشد. علاوه بر این نتایج برهمکنش غلظتهای مختلف IAA با غلظت 3 میلیگرم بر لیتر BAP نشان داد که افزایش غلظت BAP در محیط کشت نه تنها منجر به افزایش معنیداری در تعداد جوانه جانبی و طول ساقه در حضور غلظتهای مختلف IAA نشده است، بلکه این صفات نسبت به کاربرد 2 میلیگرم بر لیتر BAP در حضور غلظتهای مختلف IAA کاهش نیز نشان میدهند. در پژوهشی، عزیزان و زکریا (39)، تاثیر غلظتهای NAA و BAP را روی تکثیر هیبرید خیار ژاپنی با استفاده از ریزنمونهی نوک شاخه بررسی کردند. نتایج آنها آشکار کرد که با افزایش غلظت BAP تکثیر اندامهای هوایی افزایش یافت و سپس افزایش غلظت BAP از یک حد بهینه منجر به کاهش تکثیر اندامهای هوایی شد، بهطوریکه آنها غلظت 5/1 میلیگرم بر لیتر BAP و 5/0 میلیگرم بر لیتر را NAA بهعنوان بهترین تیمار بهمنظور تکثیر اندامهای هوایی گزارش کردند. در پژوهشی جورج و شرینگتون (40)، غلظت مناسب BAP برای تکثیر اندام هوایی را در محدوده غلظت 1 تا 3 میلیگرم بر لیتر گزارش کردند. این تفاوت در غلظت بهینه BAP جهت رشد گیاهچه در بررسیهای مختلف نشان میدهد که گیاهان مختلف و همچنین نوع بافت مورد استفاده در گیاه مشابه به غلظتهای متفاوتی از این هورمون برای رشد مطلوب نیاز دارند (39) و غلظتهای بالاتر هورمون BAP در محیط کشت میتواند برای گیاه سمی باشد که این سمیت ممکن است منجر به جلوگیری از رشد اندامهای هوایی گیاه شود (40). در مطالعات مختلف دلایل متعددی برای تاثیر منفی غلظتهای بالای BAP روی رشد و نمو گیاه گزارششده است که از مهمترین آنها میتوان به چند مورد همانند برهم خوردن تعادل غلظتهای اکسین و سیتوکنین در گیاه که این امر میتواند منجر به مهار رشد ریشه بهدلیل کاهش انتقال اکسین و همچنین ایجاد ناهنجاریهای مورفولوزیکی مانند ضخیم شدن برگ و کوتاه شدن میانگرهها شود (41). از طرفی غلظتهای بالای BAP میتواند تولید گونههای اکسیژن فعال مانند سوپر اکسید و پراکسید هیدروژن را در گیاه افزایش دهد که این امر باعث آسیب به غشاهای سلولی و پروتئینها میشود (42). از دیگر دلایل کاهش شاخصهای رشدی در اثر افزایش غلظت BAP در تحقیق حاضر میتوان به این نکته اشاره کرد که هورمون BAP در غلظتهای بالا میتواند در سیگنالدهی سلولها تداخل ایجاد کرده و تقسیم سلولی را مختل کند و در نتیجه از این طریق منجر به کاهش شاخه زایی و توقف رشد در کشت بافت شود (43).
در این مطالعه افزایش غلظت BAP در محیط کشت منجر به کاهش طول ساقه گردید. روستیکاواتی و همکاران (44)، نشان دادند که غلظت بالای سیتوکینین میتواند از کشیدگی سلول جلوگیری کند، بهنحویکه در غلظتهای بالای سیتوکینین در محیط کشت ریزنمونهها بهسختی طولشان افزایش مییابد. علاوه بر این نتایج ما نشان داد که هر چند با افزایش غلظت BAP طول ساقه کاهش مییابد، ولی تعداد جوانه جانبی تا غلظت مشخصی از BAP (2میلیگرم بر لیتر) افزایش یافت و سپس تعداد جوانه جانبی نیز با افزایش غلظت BAP (3 میلیگرم بر لیتر) کاهش یافت. این نتایج نشان میدهد که افزایش غلظت BAP تا غلظت بهینه برای هر گیاه باعث افزایش تعداد شاخهها میشود و این افزایش در تعداد شاخههای جدید تشکیلشده، افزایش طول ساقه را مهار میکند (45).
در مطالعه کنونی با وجود استفاده از غلظتهای هورمونی مشابه در نسلهای مختلف ریزازدیادی، تفاوتهایی در صفات مورد مطالعه با وجود شرایط یکسان برای رشد مشاهده گردید که احتمالا به این دلیل است که اندازه ریزنمونههای اولیه در هنگام واکشت (تک جوانه جانبی) در هر نسل ریزازدیادی متفاوت بوده است و بنابراین ترکیب محیطکشت مورد نیاز برای رشد این ریزنمونهها بهصورت برابر نیز متفاوت است (46). روستیکاواتی و همکاران (44)، در مطالعهای گزارش کردند که هرچه اندازه ریزنمونه کوچکتر باشد، توانایی باززایی آن نیز کاهش مییابد، اما از طرف دیگر احتمال ایجاد آلودگی در محیطکشت نیز کاهش مییابد. علاوه بر این، این تفاوت در صفات مورد بررسی میتواند به علت تفاوت در حضور هورمونهای درونی موجود در ریزنمونهها باشد (46). کاهیاتی و همکاران (46)، گزارش کردند که هر ریزنمونه میتواند دارای مقادیر متفاوتی از مواد مغذی و هورمون باشد که این امر این باعث ایجاد تفاوت در رشد مشاهدهشده در گیاهچههای درون شیشه تحت تاثیر هورمونهای خارجی اضافهشده به محیط کشت میشوند. محققین در پژوهشی دیگر روی گیاه Curcuma angustifolia گزارش کردند که اندازه مناسب ریزنمونهها برای باززایی در شرایط آزمایشگاهی 2 تا 3 سانتیمتر میباشد. در این اندازه، در دسترس بودن ذخایر غذایی و هورمون برای رشد این گیاه کافی بود بهطوریکه ریزنمونهها قادر به تکثیر شاخسارههای زیادی در شرایط درونشیشه بودند (47).
بررسی نتایج حاصل از تاثیر برهمکنش غلظتهای مختلف IAA و BAP نشان داد که در تیمارهای حاوی غلظت 2 میلیگرم بر لیتر BAP بههمراه غلظتهای 2، 1 و 2 میلیگرم بر لیتر IAA بهترتیب در نسلهای اول، دوم و سوم ریزازدیادی بیشترین تعداد جوانه جانبی را تشکیل شد. بنابراین میتوان اظهار داشت که برهمکنش غلظتهای بهینه هورمونهای BAP و IAA در شرایط درون شیشه نقش مهمی در القای شاخسارهها در نسلهای مختلف ریزازدیادی هندوانه دارند. در مطالعات مختلف بهخوبی نشان دادهشده است که سیتوکینینها تقسیم سلولی را تحریک میکنند و در از بین بردن خواب جوانههای جانبی، القای تشکیل جوانههای نابهجا، رشد جوانههای جانبی و کنترل چرخه سلولی نقش مهمی را ایفا میکنند، در حالیکه اکسینها در شروع تقسیم سلولی، سازماندهی سلولهای مریستمی که باعث ایجاد بافت تمایزنیافته (کالوس) یا اندامهای معین (شاخهها)، گسترش سلولی، اسیدی شدن دیواره سلولی، غالبیت راسی و تشکیل ریشه میشوند از این نظر، دستکاری تعادل سیتوکینین: اکسین برونزا میتواند به نفع یک الگوی رشدی یا جهتدهی به یک برنامه اندامزایی باشد (21).
در مطالعه کنونی برهمکنش هورمونهای IAA و BAP و TDZروی ریزازدیادی هندوانه مورد بررسی قرار گرفت. در میان دو سیتوکینین مورد استفاده برهمکنش IAA و BAP نتایج بهتری از برهمکنش IAA و TDZ روی صفات مورد بررسی نشان داد. این یافتهها با نتایج بررسی داساری و همکاران (18)، همخوانی نداشت. در پژوهشی داساری و همکاران (18)، گزارش کردند که در بین تنظیمکنندههای رشد گیاهی مختلف (BAP، TDZ، IAA، NAA و IBA) بیشترین میزان باززایی شاخساره در گیاه Citrullus colocynthis (L.) در اثر برهمکنش بین TDZ و IAA ایجاد گردید که این یافتهها با نتایج بررسی حاضر همخوانی نداشت. که این امر میتواند به دلیل تفاوتهایی همانند نوع رقم هندوانه مورد بررسی، غلظت تنظیمکنندههای رشد مورداستفاده و نوع ریزنمونه استفادهشده باشد. از طرفی در مطالعات مختلف گزارش شده است که تاثیر بیشتر برخی از هورمونها روی افزایش صفاتی همانند طول ساقه، یا تعداد جوانه جانبی نسبت برخی دیگر از هورمونها میتواند به دلایلی همانند تفاوت در ساختار شیمیایی و پایداری آنها، نحوه تعامل هر هورمون با گیرندههای مخصوص به خود در سلول گیاهی ، تفاوت در متابولیسم و نوع انتقال هورمون در گیاه، مسیرهای سیگنالدهی که یک هورمون برای رسیدن به هدف خود در گیاه باید طی کند و همچنین وجود گیرندههای اختصاصی بر روی گیاهان برای برخی از هورمونها باشد (41, 47).
تنوع سوماکلونال به تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در گیاهان باززایی شده گفته میشود که با وجود مزیت آن در ایجاد تنوعی از گیاهان پر محصول و مقاوم در برابر بیماری و استرسهای محیطی، بهدلیل ایجاد بی ثباتی ژنتیکی ممکن است مشکلاتی را بههمراه داشته باشد. بررسی این ﺗﻐﯿﯿﺮات همواره یکی از دﻏﺪﻏﻪﻫﺎی ﻣﺤﻘﻘﺎن در حوزه کشاورزی اﺳﺖ. کشت بافت از جمله مواردی است که موجب ایجاد تنوع سوماکلونال در گیاهان باززایی شده میشود. این تنوع در برخی موارد میتواند حتی در فنوتیپ گیاهان ایجادشده نسبت به گیاه پایه مادری ظاهر شود. تاکنون عوامل مختلفی در رابطه با ایجاد تنوع سوماکلونال مطرح شدهاند که از جمله آنها میتوان به نوع کشت بافت، نوع ژنوتیپ گیاه، استفاده از هورمونهای گیاهی و زمان کشت اشاره کرد (48, 49). مطالعات مختلف نشان دادهاند که استفاده از اکسین و سیتوکینینها بهعنوان هورمونهای رشد میتواند موجب ایجاد جهش و در نتیجه تنوع سوماکلونال در گیاهان مورد استفاده در کشت بافت شود (51). علاوه بر این مطالعات نشان دادهاند کشت درون شیشه خود بهعنوان عاملی در ایجاد جهشهای ژنتیکی و درنتیجه تنوع سوماکلونال نقش دارد (52). با توجه به موارد اشارهشده میتوان بیان کرد که باززایی غیرجنسی نیز میتواند موجب ایجاد تنوع سوماکلونال شود (53). بررسی دندروگرام رسم شده و ضریب جاکارد برای نسلهای مختلف تحت تیمار با IAA و BAP نشاندهنده این مورد است که با افزایش نسلهای ریزازدیادی، گیاهان حاصل فاصله ژنتیکی بیشتری را از گیاه پایه مادری نشان میدهند که این نتیجه میتواند به اثر واکشتهای پشت سرهم در ایجاد جهشهای ژنتیکی و تنوع سوماکلونال اشاره داشته باشد (52). پستلین سولانو و همکاران (23)، اثر کشتهای دورهای بر تنوع سوماکلونال گیاه Vanilla planifolia را با استفاده از 10 نشانگر ISSR بررسی کردند. نتایج این گروه نشان داد که کشتهای دورهای تا واکشت پنجم باعث افزایش نرخ رشد گیاه میشود و پس از آن میزان رشد گیاه کاهش مییابد. علاوه بر این، نتایج آنالیز نشانگر ISSR در پژوهش آنها نشان داد که با افزایش تعداد نسلهای واکشت در شرایط درون شیشه (5 واکشت پشت سرهم) درصد پلیمورفیسم مشاهدهشده نیز افزایش یافت (23)، که مطابق با نتایج مطالعه حاضر است. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تعداد جایگاههای چندشکل مشاهدهشده در نسلهای 3 و4 بسیار بیشتر از نسل اولیه بود. بنابراین میتوان گفت که واکشتهای پشت سر هم و همچنین افزایش تعداد نسل واکشت میتواند یکی از عوامل ایجاد تنوع سوماکلونال در گیاهان و همچنین افزایش چندشکلی مشاهدهشده توسط نشانگر ISSR در شرایط درونشیشه باشد.
نتایج مطالعه آرجیموس گنزالز و همکاران (53)، نشان داد که بازسازی غیرمستقیم ساقه باعث ایجاد تنوع سوماکلونال، در حضور 2,4-D در ترکیب با Kin و BAP میشود. همچنین نتایج آنها نشان داد که BAP در ترکیب با NAA یا IBA ریزنمونههایی با ثبات ژنتیکی تولید میکند که این امر نشان میدهد که نوع هورمون و غلظت هورمونی مورد استفاده نیز تاثیر بسزایی در ایجاد تنوع سوماکلونال و افزایش مشاهده تعداد باندهای چندشکل توسط نشانگر ISSR در شرایط درونشیشه دارد. در مطالعه پیشرو نیز مشاهده شد که در میان تیمارهای هورمونی مورد استفاده تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP در نسل 3 ریزازدیادی با 9 جایگاه چندشکلی بیشترین و تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP در نسل 1 ریزازدیادی با 2 جایگاه چندشکل کمترین تعداد جایگاه پلیمورفیسم را دارند. با اینحال هرچند نحت تاثیر نوع و همچنین غلظتهای مختلف هورمونهای مورد استفاده در تحقیق کنونی چندشکلی مشاهده گردید اما الگوی منظمی از تاثیر کاهش و افزایش این فاکتورها در کاهش و افزایش ایجاد جهش و تنوع سوماکلونال در شرایط درونشیشه مشاهده نشد.
درصد چندشکلی، نسبت تعداد ژنوتیپهای مختلف یا نسبت تنوع ژنتیکی در یک جمعیت را نشان میدهد (54). اگر درصد چندشکلی برابر با صفر باشد، این نشانگر ناچند شکل یا تقریبا همگن است، یعنی همه یا بیشتر ژنوتیپها یکسان هستند و اگر درصد چندشکلی برابر با 100 باشد، این نشانگر کاملا چندشکل است، یعنی همه ژنوتیپها مختلف هستند (55). درصد چندشکلی بهعنوان یک معیار مهم در بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتها، مطالعات اکولوژیکی و ژنتیک جمعیتی مورد استفاده قرار میگیرد. این معیار نشان میدهد که چقدر یک جمعیت یا گونه از نظر ژنتیکی متنوع است (56). در پژوهشهای مختلفی گزارششده است که نشانگری که PIC بیشتری را نشان دهد، گزینه مناسبتری جهت بررسی چندشکلیهاست. آغازگر P2 با بیشترین مقدار PIC (62/0) و پس از آن آغازگر UBC-825 با PIC برابر با 6/0 بالاترین میزان PIC را در پژوهش حاضر را بهخود اختصاص دادند. از آنجایی که هر چه مقدار PIC به عدد 1 نزدیکتر باشد، فراوانی بیشتری از چندشکلی برای آن جایگاه در جمعیت مورد مطالعه را نشان میدهد، این نتایج نشاندهنده انتخاب صحیح و کارایی بالای این آغازگرها برای مطالعه کنونی میباشد. در مطالعه نهتانی و همکاران (32)، که به بررسی تنوع ژنتیکی 24 جمعیت بومی هندوانه ایران و یک رقم خارجی با استفاده از 10 نشانگر ISSR پرداختند، مشخص شد آغازگر UBC-864 بیشترین مقدار PIC (91/0) و بیشترین تعداد باند (15 باند) را تولید کردند. علاوه بر این، آنها گزارش کردند که در مجموع 75 مکان چندشکلی با متوسط تعداد باند 7/8 به ازای هر آغازگر تولید شد. نتایج آنها نشان داد که آغازگر UBC-864 بیشترین مقدار PIC و بعد از آن آغازگرهای، UBC-810، UBC-825 و P2 بودند. بر اساس گزارش این گروه، این آغازگرها را میتوان در تحلیل ژنتیکی مجموعههای دیگر ژرم پلاسمهای هندوانه در پژوهشهای دیگر استفاده کرد.
شاخص نشانگری (MI) معیاری است که بهمیزان اطلاعات مورد استفاده در یک نشانگر مولکولی اشاره دارد (58). این شاخص معمولا در مطالعات ژنتیک جمعیتی مورد استفاده قرار میگیرد و نشان میدهد چه میزان اطلاعات در یک نشانگر مولکولی جمعآوریشده است (59). بر این اساس اگر MI بیشتر باشد، نشانگر مولکولی اطلاعات بیشتری ارائه میدهد و در تحلیل ژنتیکی جمعیت مورد استفاده قرار میگیرد (58). معمولا از شاخص نشانگری برای انتخاب بهترین نشانگرها در مطالعات جمعیتی و افزایش کارآیی تحلیلهای ژنتیکی استفاده میشود (60). مقدار شاخص نشانگری آغازگرهای استفادهشده در تحقیق حاضر در بازه 15/8-0 محاسبه شد و آغازگرهای UBC-808 (15/8MI=)، UBC-825 (65/2MI=) و P2 (05/2MI=) بیشترین شاخص نشانگری را در بین آغازگرهای مورد استفاده نشان دادند. در مطالعه نهتانی و همکاران (32)، نیز شاخص نشانگری آغازگرهای ISSR بین 88/11-11/0 محاسبه شد. آغازگرهای UBC-864، UBC-823، UBC-826 و UBC-808 بهترتیب با میزان شاخص نشانگری 88/11، 9/9، 74/7 و 74/7 بالاترین مقادیر MI را نسبت به دیگر آغازگرها نشان دادند. با توجه به اینکه شاخص نشانگری معیار مناسبی جهت پیشبینی عملکرد یک نشانگر در یک ژرم پلاسم است (58). در نتیجه آغازگرهای UBC-808، UBC-825 و P2 که بیشترین شاخص نشانگری را در پژوهش حاضر داشتند میتوانند گزینههای مناسبی برای بررسی ژرم پلاسم هندوانههای بومی ایران باشند.
در پژوهش حاضر، نتایج نشان داد که با افزایش غلظت TDZ در محیط کشت از صفر به 2 میلیگرم بر لیتر مقدارصفات مورد بررسی کاهش یافت که نشاندهنده مناسب نبودن این هورمون بهمنظور ریزازدیادی هندوانه از طریق تکثیر جوانههای جانبی میباشد. در بخش مطالعه تاثیر غلظتهای مختلف BAP روی تعداد جوانه جانبی مشاهده شد که هورمون BAP تا یک غلظت مشخص تاثیر معنیداری روی افزایش این صفت داشت ولی غلظتهای بالاتر BAP در محیط کشت منجر به کاهش تعداد جوانه جانبی شد. در مقایسه بین تاثیر دو سیتوکنین BAP و TDZ روی تعداد جوانه جانبی نیز نتایج نشان داد که استفاده از هورمون BAP نسبت به TDZ بهمنظور القای جوانههای جانبی مناسبتر است. علاوه بر این هورمون BAP در مقایسه با TDZ در برهمکنش با IAA نیز نتایج بهتری را روی صفات مورد بررسی نشان داد. بخش دیگر نتایج این مطالعه مربوط به بررسی تاثیر نسلهای پشت سر هم ریزازدیادی روی ایجاد تنوع ژنتیکی در گیاه هندوانه بود که نتایج حاصل از مطالعه نشانگر ISSR نشان داد که نسلهای پشت سر هم ریزازدیادی منجر به ایجاد تنوع ژنتیکی در گیاهان حاصل از والد مادری در نسلهای بالاتر ریزازدیادی شد، بهطوریکه در میان نسلهای مورد بررسی در نسل 3 ریزازدیادی (تیمار 1 میلیگرم بر لیتر IAA و 2 میلیگرم بر لیتر BAP) با 9 جایگاه، بیشترین تعداد جایگاه چندشکل مشاهده شد، درحالیکه کمترین جایگاه چند شکل مربوط به نسل 1 ریزازدیادی (تیمار صفر میلیگرم بر لیتر IAA و 1 میلیگرم بر لیتر BAP) با 2 جایگاه چند شکل بود و گیاهان حاصل از این نسل بیشترین تشابه را به والد مادری از خود نشان دادند. در نتیجه تعداد نسلهای ریزازدیادی بر تنوع سوماکلونال و رشد درون شیشه گیاه هندوانه تاثیر میگذارد. درهرصورت اگر هدف از کشت درونشیشهای ایجاد تنوع بهمنظور تولید گیاهان جدید باشد تنوع ایجادشده در نسلهای بالاتر ریزازدیادی در کشت درونشیشه هندوانه میتواند یک برنامه اصلاحی امیدوارکننده برای اصلاح این گیاه در آینده ارائه دهد و اگر حفظ ثبات ژنتیکی و شباهت به والد مادری هدف انجام ریز ازدیادی باشد پیشنهاد میشود که ریزنمونهها حداکثر تا دو نسل ریزازدیادی از نتاج نسلها قبل برای تکثیر استفاده شده و پس از آن دوباره از والد مادری شوند.
-
