سلول و بافت
فصلنامه

بیان ژن آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز در باکتری E.coli

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

مولود خیری 1
علی اصغر دلدار 2
محمد‌جواد دهقان‌عصمت آبادی 3
نفیسه پورمهدی 4

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، مجتمع پدافند غیرعامل، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، ایران

2 استادیار، مجتمع پدافند غیرعامل، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، ایران (aad.phd.gene@gmail.com)

3 استادیار، مجتمع پدافند غیرعامل، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، ایران (mohammad_dehghan@mut.ac.ir)

4 دانشجوی دکتری، مجتمع پدافند غیرعامل، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، ایران

https://doi.org/10.61882/JCT.16.2.113
چکیده
هدف: 1،2،4-بوتان تریول (BT)، یک ماده شیمیایی غیرطبیعی با کاربردهای دارویی و نظامی، از ویژگی‫های این ماده است. تولید زیستی BT هدف این تحقیق است، زیرا روش شیمیایی به‫دلیل محدودیت‌های کاتالیزوری و بازده پایین، اقتصادی نیست. تولید آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلازبا هدف تکمیل مسیر آنزیمی سنتز زیستی BT می‌باشد که از زایلوز طی چهار واکنش آنزیمی انجام می‌شود و E. coli با دارا بودن دو آنزیم از این مسیر، با افزودن دو ژن دیگر، قادر به تکمیل آن خواهد بود. مواد و روش‫ها: به‫منظور ساخت سویه E. coli بیان‌کننده آنزیم بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز، ژن mdlC از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. پس از تایید کلونینگ با آزمایش‌های تاییدی، بیان پروتئین با ژل SDS-PAGE و عملکرد آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: پس از انتقال سازواره بیانی به سویه مناسب، حضور باند پروتئینی 56 کیلودالتونی در ژل SDS-PAGE، بیان ژن mdlC را تایید کرد. برای ارزیابی عملکرد آنزیم، وکتور نوترکیب pBAD.mdlC به سویه TOP10 ترنسفرم و تولید BT در محیط کشت با روش HPLC آنالیز شد. نتیجه‌گیری: بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز (BFD)، آنزیمی کلیدی در مسیر تولید بوتان تریول (BT) درE. coli  است. در این مطالعه، ژن mdlC کد کننده BFD از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. سیستم بیانی pET28 به‫دلیل سهولت استفاده انتخاب شد و وکتور pBAD نیز به‫دلیل قابلیت القا مورد استفاده قرار گرفت. بیان پروتئین 56 کیلودالتونی با SDS-PAGE تایید و عملکرد آنزیم در تولید BT با HPLC بررسی شد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

بوتان تریول (BT)
آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز
ژن mdlC
E.Coli
dor -

عنوان مقاله English

Expression of the Benzoylformate Decarboxylase Enzyme Gene in Escherichia coli

نویسندگان English

M Khayyeri Dastgerdi 1
AA Deldar 2
MJ Dehghan 3
N pormahdi 4
1 Faculty of Passive Defense, Malek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran,
2 Faculty of Passive Defense, Malek Ashtar University of Technology, aad.phd.gene@gmail.com, Tehran, Iran,
3 Faculty of Passive Defense, Malek Ashtar University of Technology, mohammad_dehghan@mut.ac.ir ,Tehran, Iran,
4 Faculty of Passive Defense, Malek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran
چکیده English

Introduction: The construction of synthetic pathways within the framework of metabolic engineering is considered a modern approach in biotechnology, enabling the production of valuable compounds from natural biological resources. This strategy focuses on utilizing abundant biomaterials—particularly carbohydrates—for the industrial production of chemical compounds by modifying metabolic pathways in microorganisms. These processes can convert biomass derived from biological sources into fuels, chemicals, and polymers, thereby opening new opportunities for the sustainable production of chemical substances from renewable resources.
Aim: This study specifically focuses on the enzymatic production of benzoylformate decarboxylase (BFD) with the overarching goal of completing the enzymatic pathway for the biosynthesis of BT. This intricate pathway initiates with xylose as the primary carbon source and proceeds through a cascade of four distinct enzymatic reactions. Notably, Escherichia coli (E. coli), possessing two endogenous enzymes integral to this pathway, holds the potential for complete BT biosynthesis upon the introduction of the remaining two requisite genes. This research thus seeks to engineer E. coli as a robust biocatalyst for sustainable BT production. The strategic implementation of a fully functional enzymatic pathway within a well-characterized microbial host, such as  E. coli, promises a more environmentally benign and potentially more efficient route to BT synthesis compared to traditional chemical methods. Furthermore, the ability to manipulate and optimize the expression of these key enzymatic components within E. coli offers opportunities to enhance the overall yield and productivity of the bioproduction process. The successful establishment of such a system could pave the way for large-scale, cost-effective, and sustainable production of this valuable chemical intermediate.
Materials and Methods: To construct an E. coli strain capable of expressing the benzoylformate decarboxylase enzyme, the mdlC gene originating from Pseudomonas putida was amplified and subsequently cloned into both pBAD and pET28 expression vectors. Following the confirmation of successful cloning through rigorous confirmatory assays, protein expression was evaluated using Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), and the enzymatic activity was assessed.
Results: Benzoylformate decarboxylase (BFD) is a pivotal enzyme within the engineered metabolic pathway for producing 1,2,4-butanetriol (BT) in   E.coli. In this study, the mdlC gene, encoding BFD from Pseudomonas putida, was successfully amplified and cloned into the versatile pBAD and the robust pET28 expression vectors. The pET28  system was preferred due to its ease of use and established track record in protein production, while the pBAD vector was strategically employed for its inducible expression capabilities, allowing for controlled protein synthesis. The expression of the  56 kDa target protein was confirmed through SDS-PAGE analysis, and the enzymatic function in the production of BT was subsequently verified using the sensitive and accurate HPLC method. This work lays a crucial foundation for the further optimization and development of a fully functional and efficient microbial cell factory for the sustainable production of this valuable chemical
Conclusion: The successful transfer of the expression construct into an appropriate E. coli host strain was confirmed by the presence of a distinct protein band at approximately 56 kDa on the SDS-PAGE gel, unequivocally verifying the expression of the mdlC gene. To evaluate the functional capacity of the expressed enzyme, the recombinant vector pBAD.mdlC was transformed into the E. coli TOP10 strain. The subsequent production of BT in the culture medium was meticulously analyzed using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC).
                                                           

کلیدواژه‌ها English

Include at least 3 and at most 5 keywords or phrases in separate lines
Butanetriol (BT)
benzyl formate decarboxylase enzyme
mdlC gene
  • مقدمه

ساخت سازواره بیانی یکی از روش‌های جدید عصر حاضر برای تولید مواد مورد نیاز انسان از طبیعت می‌باشد که با علم مهندسی متابولیسم طراحی و انجام می‌شود. یکی از اهداف مهندسی متابولیسم تولید مواد در حجم بالا برای مصارف صنعتی از مواد فراوان موجود درطبیعت است که با اطلاعات به‫دست آمده از طبیعت ، پیشرفت علم زیست شناسی، شناسایی واکنش‌ها و مسیرهای سوخت  وساز مربوط به ارگانیسم‌ها و موجودات مختلف و آشنایی با مواد تشکیل دهنده و مواد حاصل از سوخت و ساز آن‌ها تحقیقات علمی به‫سمت تولید مواد شیمیایی از مولکول‫های زیستی متمایل گشت (1, 2). از میان مولکول‫های زیستی فراوان و در دسترس طبیعت می‫توان به کربوهیدرات‫ها اشاره کرد که بسیاری از محققان از این مولکول‌ها به‫عنوان سوبسترا برای تولید انواع مواد شیمیایی از روش تخمیر میکروبی استفاده می‌کردند. تخمیر میکروبی موجب تبدیل بیومس‌های مشتق شده از قندهای پنج و شش کربنه به سوخت، مواد شیمیایی و پلیمرها می‌شود (3, 4). 1و2و4 بوتان تریول(BT) یک پلی الکل 4 کربنه غیر طبیعی با ارزش بالاست وکاربرد گسترده ای در صنایع نظامی و داروسازی دارد. در زمینه‫ی نظامی بوتان تریول (BT) برای سنتز 1و2و4 بوتان تریول تری نیترات استفاده می‫شود که جایگزین ایمن برای نیترو گلیسیرین که در روش سنتی به‫عنوان ماده منفجره استفاده می‌شد، می‌باشد. BT به‫عنوان پیش‌ساز برای بعضی ترکیبات دارویی ضد سرطان از جمله سرطان روده بزرگ، سرطان سینه و سرطان ریه و ضد ویروسی از جمله ویروس‌های آنفلوآنزا، ویروس هرپس سیمپلکس و ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) قابل استفاده است. هدف از انجام تحقیق تولید آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز برای تکمیل مسیر آنزیمی تولید BT به‫روش زیستی می‌باشدکه این روش ایمن و مقرون به‌صرفه هست. درمسیرهای سنتز مواد شیمیایی به شیوه‫ی سنتی مشکلات بسیاری مثل احتمال آلودگی و شرایط سخت خالص سازی وجود دارد. بنابراین بیوسنتز BT  از منابع تجدید پذیرتوجه زیادی به‫خود جلب کرده است. تولید زیستیBT  چهار مرحله واکنش آنزیمی دارد و در صورت استفاده از زایلوز به‫عنوان سوبسترا، بازده بالاتر و پتانسیل بهتری برای تحقق کاربردهای تجاری درآینده را می‌توان انتظار داشت. تولید زیستی بوتان تریول نیازمند ساخت یک مسیر متابولیکی متشکل از چند آنزیم می‌باشد. با در نظر گرفتن باکتری E.coli به‫عنوان سویه هدف و توده‫های زیستی حاوی زایلوز به‫عنوان سوبسترا و ماده اولیه حضور آنزیم بنزیل فومات دکربوکسیلازدرانتهای این مسیر لازم و ضروری می‌باشد. تولید زیستی این ماده از اهداف پروژه ای است که از طریق دست کاری ژنتیک و مهندسی متابولیک در میزبان مناسب صورت می‫گیرد. سومین آنزیم در مسیر تولید BT آنزیم mdlC یا بنزیل فورمات دکربوکسیلاز می‫باشد که در پژوهش حاضر با تکثیر ژن کد کننده این آنزیم و با وارد کردن آن در وکتور بیانی وانتقال آن درسویه‫ی مناسبی از E.coli بخشی از مسیر تولید بوتان تریول ایجاد می‫شود. این آنزیم سومین مرحله از تولید BT یعنی دکربوکسیله کردن دئوکسی گلیسرول پنتولوسونیک اسید را انجام می‌دهد و با این دکربوکسیله شدن 3-4- د هیدروکسی بوتانول ساخته می‌شود (5، 6 و 7).

واکنش‫های دکربوکسیلازها

دکربوکسیلازها آنزیم‌های مهمی هستند که در شرایط ملایم می‌توانند فرآیند حذف دی‌اکسید کربن را از مولکول‌های آلی کاتالیز کنند. این آنزیم‌ها در تثبیت دی‌اکسید کربن نیز عملکرد مطلوبی دارند، اما به‌کارگیری آن‫ها در مقیاس بزرگ هنوز چالش‌برانگیز است. با این‫حال، واکنش‌های دکربوکسیلاسیون آنزیمی به‫طور فزاینده‌ای در تولید مواد شیمیایی از منابع تجدیدپذیر و در تولید واسطه‌های دارویی استفاده می‌شوند. همچنین، توانایی آن‌ها برای کاتالیز واکنش‌های معکوس همچون تثبیت دی‌اکسید کربن، به‫وجود آورده است. از آن‫جا که دکربوکسیلاسیون یکی از رایج ترین فرایندها در متابولیسم طبیعی است انواع مکانیسم‫های مختلف کاتالیزوری برای تسهیل شکافتن پیوند  C- C و آزادسازی CO2 تکامل یافته است (8، 9 و 10).

با  وجود تنوع ساختاری و مکانیکی، همه دکربوکسیلازها با چالش‫های مشابه روبرو هستند به‌طوری‫که پیوند C- C از گروه کربوکسیلیک باید بی ثبات شود و جفت الکترون حاصل شده از این بی‫ثباتی باید در طول کاتالیز قرار گیرد. این می‫تواند یا با عملکرد کوفاکتور به‫عنوان یک گروه پروستتیک یا بدون آن حاصل شود. دستگاه کاتالیزوری و استفاده از کوفاکتورهای خارجی تاثیر زیادی روی دامنه‫ی سوبسترای دکربوکسیلازها دارد. برخی از آنزیم‫ها طیف گسترده ای از سوبستراهای مختلف و اغلب غیرفعال را می‫پذیرند. برخی دیگر، به‫ویژه آنزیم‫های فاقد کوفاکتور، فقط مختص تعداد کمی ازسوبستراها که اغلب فعال شده هستند، می باشد (9). در جدول1، دسته بندی دکربوکسیلازها را بر اساس نیاز به کوفاکتور نشان داده شده است (11 و 12).

جدول 1: دسته بندی دکربوکسیلازها براساس وابستگی به کوفاکتور

دکربوکسیلازهای غیر وابسته به کوفاکتور

اورنیتین5-مونوفسفات دکربوکسیلاز(OMD)

 

فنولیک اسید دکربوکسیلاز

 

 

 

دکربوکسیلازهای وابسته به پیرودوکسال فسفات(PLP)

آریل مالونات دکربوکسیلاز

لیزین دکربوکسیلاز تولید کادوارین ,پلی آمین

 

L-گلوتامات دکربوکسیلاز,  تولید𝜸-آمینو بوتیریک اسید(GABA)

 

آلفا-کتو اسید دکربوکسیلازهتی وابسته به تیامین پیرو فسفات(ThPD)

پیروات دکربوکسیلاز(PDC)

کتو اسید دکربوکسیلاز شاخه دار(KdcAs)

 

بنزیل فورمات دکربوکسیلاز((BFD در باکتری‌ها، قارچ‫ها و مخمرها یافت شده است. منشا یکی از مهم‫ترین و پر مصرف‫ترینBFD‫ها، باکتری سودوموناسپپوتیدا است. BFD در متابولیسم -mandelate (R) شرکت می‫کند. به‫طور خلاصه (R)-mandelate به بنزیل فورمات پردازش می‌شود که توسط BFD دکربوکسیله شده است. بنزآلدئید حاصل بیشتر به استیل CoA تغییرداده شده است و می‌تواند برای تولید انرژی در چرخه تری کربوکسیلیک اسید سلول مورد استفاده قرار گیرد. برای دکربوکسیلاسیون آنزیم اولویت زیادی به سوبسترای طبیعی یعنی بنزیل فورمات نشان می‌دهد در حالی‫که آلفا-کتو اسید آلیفاتیک با سرعت بسیار کمتری تبدیل می‌شوند (4). همچنین BFD‫ها نیز به‫طور وسیعی برای مهندسی آنزیم مورد استفاده قرارگرفته‌اند.

BFD یک بیوکاتالیست پایدار است که مقادیر زیادی از آن در P.putida یا یک سویه E.coli نوترکیب که حامل ژن BFD باشد به‫دست می‫آید. BFD فعال ترین آنزیم 2-کتواسید دکربوکسیلاز وابسته به ThDP   شناخته شده است که تا کنون کاتالیزور هر دو دکربوکسیلاسیون (واکنش اصلی) و کاربولیگاسیون (واکنش جانبی) را با واکنش‫ های اختصاصی انجام می‫دهد (10).

الکل 4کربنه‌ی 1و2و4 بوتان تریول(BT) ارزش بسیار بالایی در صنعت و دارو سازی دارد. تولید این محصول به‫روش زیستی نسبت به‫روش صنعتی بهینه‫تر است. تولید زیستی BT طی چهار مرحله واکنش آنزیمی دهیدروژناسیون، دکربوکسیلاسیون و الکل دهیدروژناسیون ازسوبسترای زایلوز به‫دست می‫آید. سومین مرحله‌ی این واکش نیاز به عمل دکربوکسیلاسیون دارد که با توجه به کارکرد و اهمیت بیوکاتالیست BFD از این آنزیم در این مرحله استفاده شده است (5). این مطالعه به‫دلیل این‫که به‫روش تولید زیستی انجام شده دارای نوآوری می‌باشد و تا به‫حال در کشور انجام نشده است، تولید این ماده که به‫صورت طبیعی در طبیعت انجام نمی‌گیرد ولی در پژوهش انجام شده نشان داده شد که می‫توان با مهندسی مسیرهای زیستی به تولید این ماده دست یافت.

  • مواد و روش‌ها

تکثیر قطعه ژنی mdlC: با استفاده از نرم افزار Snap Gene 5.2 به آدرس https://www.snapgene.com/ و دانلود فایل توالی ژنومی باکتری P.putida  از سایت NCBI به آدرس  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ به شماره   NBRC14164و با توجه به آنزیم‫های موجود و جایگاه برش آنزیم ها در وکتورهای مورد نظر مثل pBAD پرایمرهایی با جایگاه برشHindIII  و Pst1 طراحی شد (جدول2). با توجه به وکتورpBAD و برادر نظرگرفتن همسو قرار گرفتن ژن با پروموتر ara،  جایگاه برش Pst1 در پرایمر معکوس به‫عنوان یکی دیگر از مکان‫های اتصال ژن زایلوز دهیدروژناز به وکتور در نظر گرفته شد. این پرایمر دارای کدون پایان ATT می‌باشد. این پرایمر نیز از نظر ساختار و مشخصات توسط نرم افزار Oligo Analyser مورد بررسی قرار گرفت. برای تکثیر mdlC (ژن تولید کننده بنزیل فورمات دکربوکسیلاز) از ژنوم باکتری P.putida ابتدا باکتری در محیط LB کشت داده شد و در تراکم سلولی 3 (3OD600:) مراحل استخراج ژنوم انجام شد.  با استفاده از پرایمرهای طراحی شده و روش PCR تکثیر ژن از باکتری P.putida طبق برنامه، ابتدا به‫صورت 5 دقیقه در94 درجه سانتی‫گراد و سپس 30 ثانیه در 94 درجه، 30 ثانیه در 58 درجه، ثانیه در 72درجه برای 8 چرخه و بلافاصله 30 ثانیه در 94 درجه، 30 ثانیه در 65 درجه و 90 ثانیه در 72 درجه برای 22 چرخه و در نهایت 2 دقیقه در 72 درجه انجام گرفت. پس از انجام واکنش محصولات PCR روی ژل آگارز برده شد (13).

 

جدول 2: مشخصات پرایمرها

طول قطغه

توالی

نام پرایمر

1629

5'­CTATCTGCAGAGGAATTACATATGAAGACTGTTCACGGCGCCACTTTACG-3'

put.mdlC.ps.RBS.NdeI.F

5'­GTGTAAGCTTGGATCCGTTCAGGGCTCGATGGTCTG-3'

put.mdlC.HindIII.BamHI.R

 

کلونینگ ژن mdlC در وکتور pET28: پس انجام مراحل استخراج وکتور pET28 و تکثیر ژن، هر دو نمونه با آنزیم‌های NdeI و BamHI برش داده شدند. پس از آماده شدن قطعه و وکتور برش خورده مخلوط لایگیت آماده و در سویه DH5 ترنسفرم شد. کلونی‫های دارای وکتور pET28 قادر به رشد بر روی پلیت LB حاوی کانامایسین بوده که می‌تواند حاوی ژن مورد نظر در این تحقیق نیز باشند. با کمک پرایمرهای طراحی شده mdlC حضور و یا عدم حضور این ژن در کلونی‫هایی که بر روی پلیت پس از انجام مرحله ترنسفرم رشد کردند، با استفاده از ژل SDS-Page بررسی شد (13) (شکل 1).

 

 

 

کلونینگ ژن mdlC به وکتور بیانی pBAD: پس انجام مراحل استخراج وکتور pBAD و تکثیر ژن با آنزیم‌های مناسب برش زده شد. طبق طراحی ژن mdlC  برای ورود به pBAD با pstI وHindIII  برش داده شدند.  پس از آماده شدن قطعه و وکتور برش خورده مخلوط لایگیت آماده شد و پس از استخراج وکتورهای نوترکیب حضور ژن با کمک آنزیم BglII و HindIII در

شکل 1: طراحی مسیر کلونینگ mdlC در وکتور pET28a

سازه pBAD.mdlC مورد بررسی قرار گرفت که خروج ژن و مشاهده آن بر روی ژل آگارز موید ورود ژن در وکتور است. برای تایید ژن کلون شده و اطلاع از تغییرات ایجاد شده حین تکثیر وکتورpBAD.mdlC  تعیین توالی شد و نتیجه آن  با کمک نرم افزار Snap Gene با توالی mdlC سویه  مقایسه شد (13) (شکل 2).

 

 

شکل 2: طراحی مسیر کلونینگ mdlC در وکتور pBAD

 

القا و بیان آنزیم: برای بررسی بیان پروتئین هدف در وکتور pET28، پس از کشت ml ۱۰ از سویه‌‫ی نوترکیب BL21.mdlC، در تراکم سلولی 8/0، OD600 نمونه‌ها به ‫دو حجم 5 میلی‫لیتر تقسیم شدند. به یکی از نمونه‫های BL21 pET28.mdlC  با IPTG با غلظت نهایی mM 2/0 القا و دیگری به‫عنوان شاهد بدون القا ماند. هر 2 نمونه به‫مدت 3 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد شیک شدند. پس از گذشت 3 ساعت از زمان القای میزان تراکم نمونه‌ها درOD600 خوانش و به‫میزان 1 میلی‫لیتر از آن‌ها رسوب داد شد. همچنین پس از لیز و سونیکاسیون BL21 pET28.mdlC باند پروتئین در رسوب مورد بررسی قرار گرفت (13).

 برای بررسی بیان پروتئین هدف در وکتور pBAD، پس از کشت 10 میلی‫لیتر از سویه‌های نوترکیبDH5 pBAD.mdlC  در تراکم سلولی 8/0، OD600 نمونه‌ها به دو حجم 5 میلی‫لیتر تقسیم شدند. به یکی از نمونه‌ها ۵۰ میکرولیتر آرابینوز  20 درصد اضافه شد و دیگری به‫عنوان کنترل منفی، بدون القا باقی ماند. هر2 نمونه به‫مدت 3 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد شیک شدند. پس از گذشت 3 ساعت از زمان القاس میزان تراکم نمونه‌ها درOD600 خوانش و به‫میزان 1 میلی‫لیتر از آن‌ها رسوب داده شد (13). 

آزمایش تولید و برسی آن به‫روش HPLC : برای بررسی عملکرد آنزیم و مسیر ایجاد شده، وکتور pBAD.mdlC که قادر به بیان پروتئین در تمام سویه‫های E.coli است استفاده شد. از آن‫جایی‫که pET28.mdlC تحت پرومومترT7 می‫باشد این وکتور تنها در سویه BL21(DE3) قادر به بیان پروتئین است و چون این سویه فاقد ژن دهیدراتاز  مناسب یعنی مسیر دوم سنتز BT است برای انجام این آزمایش کاربردی ندارد (5). بنابراین وکتور pBAD.mdlC در سویه TOP10 ترنسفرم و مورد آزمایش قرار گرفت. به این‫صورت که سویه  TOP10 pBAD.mdlC به‫همراه TOP10 pBAD به‫عنوان شاهد در حجم 200 میلی‌لیتر کشت داده شدند و پس از انجام مرحله القا تمام حجم محیط سانتریفیوژ و رسوبات باکتری به 50 میلی‌لیتر محیط M9 حاوی زایلونات و AMP منتقل و به‫مدت 48 ساعت در در دمای 27 درجه سانتی‫گراد با دور rpm 180 شیک شدند. پس اتمام زمان آزمایش محیط‫های M9 سانتریفیوژ و با اتیل استات استخراج شیمیایی شدند و از جهت داشتن BT مورد بررسی قرار گرفتند (8).

مشخصات HPLC:

ستون: ODS ۴.۶ میلی‌متر (قطر) × ۲۵ سانتی‌متر (طول)

سیستم Waters 600 :

آشکارساز RID (Refractive Index Detector):

فاز متحرک: آب

  • نتایج

در این پژوهش به‫منظور تکثیر قطعه ژنی mdlc، واکنش زنجیره پلی مراز  توسط پرایمرهای اختصاصی بر روی ژنوم استخراج شده باکتری P.putida صورت گرفت. در بررسی نتیجه و باند قطعه ژن مورد نظر بر روی ژل آگارز در سایز 1629 جفت باز مشاهده شد (شکل3).

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: تکثیر ژن mdlC از ژنوم P.putida. 1) نشانگر DNA /۲) ژن تکثیر شده

 

وکتور pET28 و قطعه ژن آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز (mdlc)، با استفاده از آنزیم‫های Nde1 و BamHI برش داده ­شده و سپس روی ژل برده شده و استخراج شدند (شکل4).

 

 

 

 

 

شکل 4: آماده سازی و برش آنزیمی وکتورها و ژن 1) نشانگر، 2) وکتور برش نخورده pET28، 3) وکتور pET28 برش خورده با NdeI, BamHI، 4) ژن mdlC برش خورده با NdeI, BamHI

 

سپس وکتور و ژن آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز به‫هم متصل شده و پس از آن با تهیه سلول مستعد و همچنین انجام مرحله  ترانسفورماسیون، کلونی‫هایی که درون پلیت ظاهر می‫شوند دارای وکتور pET28 نوترکیب حاوی ژن mdlc می‫باشد و توسط کلونی PCR حضور ژن آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز درون وکتور نوترکیب (pET28.mdlC) تایید شد (شکل 5).

 

 

 

 

 

شکل 5: تایید وکتور pET28.mdlC با برش آنزیمی

 

 به‫منظور اطمینان کامل از حضور قطعه ژن درون وکتور نوترکیب برش آنزیمی توسط آنزیم‫های محدود کننده Nde1 و BamHI  انجام شد. قطعه 1781  بازی مربوط به  ژن mdlc و قطعه 5141 مربوط به وکتور برش خورده است (شکل6).

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6: PCR از کلونی‫های نوترکیبpET28.mdlC، 7( نشانگر DNA / 8,۱) کلونی بدون قطعه، ۲, 3,4,5,6) کلونی نوترکیب دارای ژن mdlC،9) کنترل منفی

به‫منظور انتقال ژن به وکتور pBAD ، پس انجام مراحل استخراج وکتور pBAD و تکثیر ژن با آنزیم‌های pstI وHindIII  مناسب برش زده شد (شکل7).

 

 

 

 

 

شکل 7: آماده سازی و برش آنزیمی وکتورها و ژن، 1) نشانگر، 2) ژن mdlC برش خورده با pstI, HindIII، 3) وکتور برش خورده با pstI, HindIII، 4) وکتور برش نخورده pBAD،

 

 سپس مخلوط حاوی قطعات متصل شده آماده شد و در سویه DH5 ترنسفرم شد. کلونی‫های دارای وکتور pBAD قادر به رشد بر روی پلیت LB حاوی AMP  بوده که می‌تواند حاوی ژن مورد نظر ما نیز باشند. با کمک پرایمرهای طراحی شده mdlC حضور و یا عدم حضور این ژن در کلونی‫‫هایی که بر روی پلیت پس از انجام مرحله ترنسفرم رشد کردند، بررسی شد (شکل8) .

 

 

 

 

 

شکل 8:  PCR از کلونی های نوترکیب 6) نشانگر DNA  /  1) کنترل منفی، ۲, 3, 5,7, 8) کلونی بدون قطعه، ۴,9) کلونی نوترکیب دارای ژن mdlC pBAD.mdlC

 

پس از استخراج وکتورهای نوترکیب حضور ژن با کمک آنزیم BglII و HindIII در سازه pBAD.mdlC مورد بررسی قرار گرفت که خروج ژن و مشاهده آن بر روی ژل آگارز تایید کننده ورود ژن در وکتور است (شکل9). مقایسه نتیجه تعیین توالی وکتور pBAD.mdlC  با  توالی mdlC در نرم افزار Snap Gene ، نشان می‫دهد که تنها کد 2 اسید آمینه در توالی تغییر کرده که می‌تواند به‫دلیل تفاوت ژن باکتری ما با توالی موجود در NCBI باشد.

 

 

 

 

 

 

شکل 9: تایید pBAD.mdlC با برش آنزیمی

 

بعد از انجام موفقیت آمیز مرحله کلونینگ ژنmdlC از سودووناس پوتیدا با توجه به بزرگ بودن قطعه ژنی (bp1629) و با در نظر گرفتن خوانش از دو سوی ژن و تایید آن در وکتور، این محصول را به‫عنوان ژن هدف پذیرفته شد. سپس تعیین توالی این ترکیب انجام شد و وکتور نهایی مورد تایید گرفت. در مراحل بعدی برای القا بیان از طریق مقادیر 0/2درصد ال-آرابینوز برای وکتور pBAD و 2/0 میلی مولار IPTG برای وکتور pET28 طبق کارهای انجام شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت و نتایج حاصل آن به‫روی ژلSDS نشان داد که در هر دو سیستم  در باکتری میزبان نسبت به باکتری فاقد وکتور، پروتئین در سایز مناسب (KDa 56 ) بیان شده است (شکل 10 و 11). مشاهده باندهای پروتئین‌ در عصاره سلولی حاصل از شکست و لیز باکتری نشان دهنده محلول بودن، ساختار مناسب و فعال بودن آنزیم بود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 10: بررسی بیان BL21 pET28.mdlC

 

 

 

 

 

 

 

شکل 11: بررسی بیان DH5 pBAD.mdlC، نشانگر پروتئین، 2) T 3h، 3) T0، 4) سوپ، 5) رسوب

 

در مرحله‫ی بعد باید بررسی فعالیت آنزیم انجام شود. بعد از بیان ژن بنا به شرایط موجود این مطالعه به‫صورت دو مرحله ای صورت پذیرفت. گلوکونوباکتر اکسیدا که در پروژه مورد استفاده قرار گرفته بود توانایی تولید زایلونات را در محیط کشت داشت. بر همین اساس mdlC وارد شده در وکتورهای مذکور را به سویه‌ی TOP10، ترنسفرم شد و TOP10 pBAD.mdlC را در محیط کشت حاوی زایلونات کشت داده شد که از زایلونات موجود در محیط به‫عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت که نتیجه قابل توجهی داشت. نتایج از طریق HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 12 الی 15). در HPLC به‫دلیل شباهت پیک به کنترل مثبت و نیز اختلاف پیک نسبت به باکتری القا نشده بیانگر این است که این آزمایش دوباره باید تکرار شود. برای بررسی فعالیت آنزیم به‫روش  HPLC به مقایسه‫ی چهار نمونه استاندارد BT , استاندارد زایلونات, نمونه شاهد و نمونه‫ی اصلی نیاز بود. در این پروسه ژن مورد نظر با تولید آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز منجر به تبدیل زایلونات موجود در محیط به BT می‫گردید.

 

 

 

 

 

شکل 12: پیک نمونه استاندارد BT

 

کروماتوگرام مربوط به استاندارد BT نشان می‌دهد که نمونه دارای یک ترکیب اصلی است که در زمان حدود ۴.۲ دقیقه جدا شده و با شدت نسبتا بالا توسط آشکارساز ثبت شده است (شکل 12 و جدول 3).

جدول 3: پیک نمونه استاندارد BT

Area

Area

(uV sec)

End Time

(min)

Start Time

(min)

Ret Time

(min)

#

100

56485

5.267

3.983

4.217

1

 

 

                           

 

 

 

 

 

 

شکل 13: پیک نمونه استاندارد زایلونات

 

کروماتوگرام مربوط به استاندارد زایلونات وجود یک ترکیب مشخص  که همان زایلونات می باشد را در نمونه نشان می‌دهد که در زمان حدود ۲.97 دقیقه آشکارسازی شده است (شکل 13 و جدول 4)

 

جدول 4: پیک نمونه استاندارد زایلونات

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 14: پیک نمونه TOP10 pBAD.mdlC – 48 ساعت

کروماتوگرام مربوط به نمونه اصلی، یک نمودار کروماتوگرافی است که مربوط به تحلیل نمونه‌ای از سویه باکتریایی TOP10 حاوی پلاسمید pBAD.mdlC (یک وکتور بیان پروتئین تحت کنترل پروموتر araBAD، که با ال-آرابینوز القا می‌شود) پس از 48 ساعت کشت است. این نمودار برای ارزیابی بیان پروتئین mdlC در طول زمان کشت (48 ساعت، که نشان‌دهنده فاز stationary یا پس از القا است) استفاده شده است (شکل 14 و جدول 5).

 

جدول 5: پیک نمونه TOP10 pBAD.mdlC – 48 ساعت

 

 

 

                                                                  

 

 

 

 

 

 

شکل 15: پیک نمونه شاهد TOP10 pBAD – 48 ساعت

کروماتوگرام مربوط به نمونه شاهد سویه باکتریایی TOP10 حاوی پلاسمید pBAD (بدون القا یا بیان هدفمند پروتئین mdlC) پس از 48 ساعت کشت است. این نمونه شاهد برای مقایسه با نمونه pBAD.mdlC TOP10 استفاده شده و نشان‌دهنده فعالیت پایه (baseline activity) باکتری بدون القا با آرابینوز است شکل 15 و جدول 6).

 

جدول 6: پیک نمونه شاهد TOP10 pBAD – 48 ساعت

 

 

 

  • بحث

اهمیت تولید الکل چهار کربنه‌‌‌‌‌‌‌‌‌ی بوتان تریول در صنایع، دارو سازی و صنعت نظامی می‌باشد. به‫دلیل این‫که تولید این الکل به‫روش شیمیایی از نظر هزینه و خطرات زیستی مقرون به صرفه نیست دانشمندان زیادی برای تولید زیستی محصول، تلاش‫های فراوانی کرده‌اند، تا محصول نهایی از نظر کمیت و کیفیت بهینه باشد.

BT تا قبل از سال ۲۰۰۳ تنها به‫روش شیمیایی قابل تولید بود (14 و 15). از مشکلاتی که این روش دارد تولید مواد جانبی نظیر لاکتید، لاکتون، مالئیک اسید و نمک بورات می‌باشد که باعث کاهش سرعت احیا و بازده، افزایش هزینه تولید و آلودگی محیط زیست می‌شود (16 و 17).

طی تحقیقات انجام شده در 20 سال اخیر، نشان داده شد، که در تولید زیستی این محصول که طی 4 مرحله واکنش آنزیمی صورت می‫پذیرد، در مرحله‌ی سوم واکنش آنزیمی، آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز که از ژن MdlC نشات می‌گیرد، نقش فعالی را ایفا می‌نماید.در میان این چهار مرحله واکنش آنزیمی دو مرحله‌ی آخر از جمله، آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز ثابت ولی آنزیم‫های ابتدایی بسته به‫نوع سوبسترا تغییر می کنند. به‫طور خلاصه تولیدBT در Ecoli به بیان دو آنزیم زایلوز دهیدروژناز و بنزیل فورمات دکربوکسیلاز و مسدود کردن مسیرهای متابولیک طبیعی دی-زایلوز و دی- زایلونات (18) وهمچنین مسیرهایی که سوبسترای آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز را از مسیر تولید BT ، خارج می‫کند (6 و 19)، نیاز دارد. بنابراین، برای ایجاد مسیر تولید BT، در مرحله ی سوم به آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز که،  ژن mdlC، آن را کد می کند نیاز است.

آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز سومین مرحله واکنش آنزیمی در تولید BT می‌باشد که دکربوکسیله کردن دئوکسی گلیسرول پنتولوسونیک اسید را بر عهده دارد و عامل تولید 3-4 دهیدروکسی بوتانال می شود (7 و 20).در این پژوهش‌ها برای تولید میکروبی الکل BT، چون بعضی از آنزیم‫هایی که در تولید این الکل نقش داشتند در باکتری Ecoli وجود داشت، از سویه‫هایی از این باکتری و برای دسترسی به آنزیم‫های تکمیل کننده، باکتری سودوموناس پوتیدا مورد استفاده قرار گرفت، که ژن MdlC از همین باکتری انتخاب شد (6 و 7).

والدزا و همکاران (18)، آنزیم کتو‌اسید دکربوکسیلاز (بنزیل فورمات دکربوکسیلاز) را از سودوموناس پوتیدا جدا و به باکتری E.coli، وارد کردند. ونگ و همکاران (21) برای بهینه سازی تولید بوتان تریول در Ecoli مطالعاتی انجام دادند. آن‫ها در این مطالعات به غربالگری ژن‌های همولوگ مثل 2-کتو اسید دکربوکسیلاز پرداخته، پس از غرباگری به 4 عدد 2-کتواسید دکربوکسیلاز، دست یافتند که از ژن KdcA کد می‫شدند و از باکتری Lactococcus lactis به‌دست می‌آمدند. بیان این ژن‫ها در کنار بیان ژن‫های هومولوگ دیگر در آفزایش تولید BT تاثیر داشت. در سال 2018 به‫وسیله ی چندین استراتژی توسط جینگ وهمکاران (5)، E.coli نوترکیبی جهت افزایش میزان بوتان تریول ساخته شد، یکی از استراتژی‌های طراحی شده جایگزینی ژن kivD از Lactococcus.lactis که یک دکربوکسیلاز با کارایی بالا می‫باشد به‫جای MdlC از سودوموناس پوتیدا بود که باعث افزایش قابل توجهی در تولید BT داشت. طی این پژوهش گونه‌ی دیگری از دکربوکسیلاز به‫نام ایندول پیرووات دکربوکسیلاز (IpcD) از Enterobacter.cloacae  استفاده شد ولی هیچ BT درعصاره محیط کشت گونه ی مخفی نوترکیب ژن ipdC تشخیص داده نشد.

باتوجه به تحقیقات انجام شده و بهره‌وری از میکروارگانیسم‌های متعدد به‫ویژه سودوموناس پوتیدا جهت دسترسی به آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلاز توسط پژوهشگران، در این پژوهش نیز میکروارگانیسم سودوموناس پوتیدا استفاده شد. در ابتدا به دلیل عدم دسترسی به سویه پوتیدا، بررسی‌هایی انجام شد و نتایجی‌که از بررسی توالی دو ژن MdlC در Pseudomonas aeruginosa و Pseudomona putida   به‫دست آمد، نشانگر بالای 80 درصد هم‌ترازی میان دو ژن بود. به‫همین دلیل ابتدا از سودوموناس سویه آئرژینوزا که ژنوم آن در NCBI موجود است استفاده شد و بعد از دسترسی به سودوموناس پوتیدا همان مراحل کلون و بیان روی آن انجام شد.

بر اساس تحقیقات انجام شده توسط دانشمندان مختلف مثل فراست و والدزا (18) طی سال‫های اخیر که از این ژن (MdlC از سودوموناس)، در کنار دیگر ژن‫ها در باکتری E.coli برای تولید BT استفاده کرده اند، به‫همین منظور از این ژن (نه ژن باکتری میزبان) در کنار ژن دیگر  آنزیم‫ها در باکتری E.coli استفاده شد. برای تولید BT نیاز به سیستم بیانی داشتیم. در واقع ژن Mdlc بعد از استخراج از سودوموناس و تکثیر باید از طریق یک وکتور با سیستم بیانی به باکتری میزبان منتقل می‫شد.

کائو و همکاران (22) از باکتریBL21 star(DE3)  E. coli به‫عنوان میزبان استفاده کردند. ویژگی ژنوتایپ این سویه در بالا بردن پایداری mRNA و تو لید پروتیین آن را برای استفاده پروموتر T7که تعداد کپی کم دارد، ایده آل می کرد.بنابرین 2-کتو اسید دکربوکسیلاز از P. putita در وکتور pET28a بین سایت های NcoI و EcoRI برای ایجاد  pET-mdlC کلون شدند ).

طبق کارهای انجام شده توسط دانشمندان که برای بیان این ژن و تولید BT از سیستم بیانی PET استفاده کردند و با توجه به در دسترس بودن، تجربه‫ی استفاده از این سیستم بیانی و سادگی استفاده از آن، از وکتور بیانیpET و از میان آن‫ها از سیستم بیانی pET28 برای بیان ژن MdlC استفاده شد. علاوه بر آن، از وکتور pBAD که سیستم بیانی، با قابلیت القا و بیان مناسب می‌باشد‌، مورد استفاده قرارگرفت .

بعد از انجام موفقیت آمیز مرحله کلونینگ ژنMdlC از سودوموناس آئرژینوزا و در مرحله‫ی بعد سودووناس پوتیدا با توجه به بزرگ بودن قطعه ژنی (bp1629) و با در نظر گرفتن خوانش از دو سوی ژن و تایید آن در وکتور ، این محصول را به‫عنوان ژن هدف پذیرفته شد. سپس تعیین توالی این ترکیب انجام شد و وکتور نهایی مورد تایید گرفت. در مراحل بعدی برای القا بیان از طریق مقادیر 2/0 درصد ال-آرابینوز برای وکتور pBAD و0/2  میلی‫مولار IPTG برای وکتور pET28 طبق کارهای انجام شده در پروژه مورد استفاده قرار گرفت و نتایج حاصل آن به‫روی ژل آگارز نشان داد که در هر دو سیستم  در باکتری میزبان نسبت به باکتری فاقد وکتور، پروتئین در سایز مناسب بیان شده است. در مرحله‫ی بعد باید بررسی فعالیت آنزیم انجام شود.

بعد از بیان ژن بنا به شرایط موجود و با توجه به دو مرحله‫ای بودن کار فراست،کار را به صورت دو مرحله‫ای پیش رفت. گلوکونوباکتر اکسیدا که در پروژه مورد استفاده قرار گرفته بود توانایی تولید زایلونات را در محیط کشت داشت. بر همین اساس MdlC وارد شده در وکتورهای مذکور را به سویه‌ی TOP10، ترنسفرم کردیم و TOP10 pBAD.mdlCرا در محیط کشت حاوی زایلونات کشت داده شد که از زایلونات موجود در محیط به‫عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت که نتیجه قابل توجهی داشت. نتایج از طریق HPLC چک شد. در HPLC شباهت پیک نسبت به کنترل مثبت و اختلاف پیک نسبت به باکتری القا نشده نشان داده شد که این دوباره باید تکرار شود.

5- نتیجه‌گیری

یکی از آنزیم‫های اصلی برای ساخت مسیر تولید BT در E.coli بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز می‌باشد که در این پروژه با کلونینگ ژن کد کننده این آنزیم این مسیر ایجاد شد. ابتدا ژن mdlC از سویه P.putida با کمک پرایمرهای طراحی شده تکثیر و با برش آنزیمی در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. طبق کارهای انجام شده توسط دانشمندان که برای بیان این ژن و تولید BT از سیستم بیانی PET استفاده کردند (23) و با توجه به در دسترس بودن، تجربه‫ی استفاده از این سیستم بیانی و سادگی استفاده از آن، از وکتور بیانیpET و از میان آن‫ها از سیستم بیانی pET28 برای بیان ژن MdlC استفاده شد. علاوه بر آن، از وکتور pBAD که سیستم بیانی، با قابلیت القا و بیان مناسب می باشد، مورد استفاده قرارگرفت. در مرحله بعد بیان ژن با کمک ژل SDS-PAGE بررسی شد که حضور باند پروتئین در KDa 56 موید بیان پروتئین بود. برای بررسی عملکرد آنزیم وکتور نوترکیب pBAD.mdlC در سویه TOP10 ترنسفرم گردید و مراحل آزمایش تولید BT انجام گرفت و محیط کشت بدست آمده به روش HPLC بررسی شد.  در HPLC و مقایسه ای که بین نمودارها صورت گرفت ,پیکی مشابه با پیک اسناندارد BTO دیده شد که می تواند موید حضور و تولید BTO  با آنزیم تولید شده توسط القای ژن mdlc  باشد.

  • تشکر و قدردانی

از دانشگاه صنعتی مالک اشتر برای فراهم آوردن امکانات آزمایشگاهی لازم جهت انجام این تحقیق، صمیمانه سپاسگزاریم.

-

  1. 1.Yim H, Haselbeck R, Niu W, Pujol-Baxley C, et. al. Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1, 4-butanediol. Nature chemical biology. 2011 Jul;7(7):445-52.

    1. Saxena R, Adhikari D, Goyal H. Biomass-based energy fuel through biochemical routes: A review. Renew Sustain Energy Rev. 2009;13(1):167-78.
    2. Valdehuesaa G, Nn K. Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem. 2013;49:25-32.
    3. Park SJ, Kim EY, Noh W, Park HM, et. al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals. Metabolic engineering. 2013 Mar 1;16:42-7.
    4. Jing P, Cao X, Lu X, Zong H, et. al. Modification of an engineered Escherichia coli by a combined strategy of deleting branch pathway, fine-tuning xylose isomerase expression, and substituting decarboxylase to improve 1, 2, 4-butanetriol production. Journal of bioscience and bioengineering. 2018 Nov 1;126(5):547-52.
    5. Saffron C, Frost JW, MI MBIL. Large Scale Green Synthesis of 1, 2, 4-Butanetriol. 2007.
    6. Frost JW. Synthesis of 1, 2, 4-butanetriol enantiomers from carbohydrates. Google Patents; 2011.
    7. Zhang N, Wang J, Zhang Y, Gao H. Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1, 2, 4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli. Enzyme and microbial technology. 2016 Nov 1;93:51-8.
    8. Kourist R, Guterl JK, Miyamoto K, Sieber V. Enzymatic decarboxylation—an emerging reaction for chemicals production from renewable resources. ChemCatChem. 2014 Mar;6(3):689-701.
    9. Iding H, Dünnwald T, Greiner L, Liese A, et. al. Benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida as stable catalyst for the synthesis of chiral 2‐hydroxy ketones. Chemistry–A European Journal. 2000 Apr 17;6(8):1483-95.
    10. Wu N, Mo Y, Gao J, Pai EF. Electrostatic stress in catalysis: structure and mechanism of the enzyme orotidine monophosphate decarboxylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000 Feb 29;97(5):2017-22.
    11. Atsumi S, Hanai T, Liao JC. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 2008;451(7174):86-9.
    12. Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; [date unknown]. Chapter, Restriction Enzymes: A Key to Molecular Cloning and DNA Manipulation.
    13. Lau M. Synthesis and downstream purification of 1, 2, 4-butanetriol [dissertation]. Ann Arbor (MI): Pro Quest LLC; 2006. UMI Microform 3348145.
    14. Mandava VNBR, Varanasi G, Areveli S, Vempati CS, NarayanaR, et al. Preparation of fosamprenavir calcium. 2011. p. 22.
    15. Ikai K, Mikami M, Furukawa Y, Urano T, et. al. Process for preparing 1, 2, 4-butanetriol. United States patent US 6,949,684. 2005 Sep 27.
    16. Stiteler CH, inventors; Pittsburgh Plate Glass Co, assignee. Method of preparing esters of 1, 2, 4-butanetriol. Google Patents, US 2,559,742. 1951 Jul 10.
    17. Valdehuesa KN, Liu H, Ramos KR, Park SJ, et. al. Direct bioconversion of d-xylose to 1, 2, 4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochemistry. 2014 Jan 1;49(1):25-32.
    18. Frost JW, Niu W, inventors; Board of Trustees of the University of Illinois, assignee. Microbial synthesis of d-1, 2, 4-butanetriol. Google Patents, US 7,935,518 B2. 2011 May 3.
    19. Niu W, Molefe MN, Frost J. Microbial synthesis of the energetic material precursor 1, 2, 4-butanetriol. J Am Chem Soc. 2003;125(43):12998-9.
    20. Wang X, Xu N, Hu S, Yang J, et. al. d-1, 2, 4-Butanetriol production from renewable biomass with optimization of synthetic pathway in engineered Escherichia coli. Bioresource Technology. 2018 Feb 1;250:406-12.
    21. Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H. Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep. 2015;5:16621.
    22. Gao Q, Wang X, Hu S, Xu N, et. al. High-yield production of D-1, 2, 4-butanetriol from lignocellulose-derived xylose by using a synthetic enzyme cascade in a cell-free system. Journal of biotechnology. 2019 Feb 20;292:76-83.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 2
تابستان 1404
صفحه 113-131

  • تاریخ دریافت 17 شهریور 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما