سلول و بافت
فصلنامه

اثر پیش‌برنده آپوپتوزیس آگرین‫بی (Augerin B) در رده سلولی سرطان کولورکتال HT29‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

الهه امینی 1
ابوالفضل شاکری 2
آذر شیخ الاسلامی 3

1 استادیار، گروه علوم جانوری، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

2 دانشیار، گروه فارماکوگنوزی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

3 استادیار، گروه پژوهشی بیولوژی سلولی و پزشکی بازساختی، جهاد دانشگاهی واحد استان قم، قم، ایران

https://doi.org/10.61882/JCT.16.2.185
چکیده
هدف: در سال­های اخیر فراورده­های طبیعی اثرات ضد سرطان ارزشمندی ارائه کرده‫اند. جهت درک مکانیسم مولکولی اثر آگرین‫بی (Aguerin B) در سرطان کولورکتال، هدف این پژوهش بررسی نوع مرگ سلولی القا شده توسط آگرین‫بی و بیان فاکتور سرکوب‫گر تومور p53  در سلول‫های سرطان کلورکتال HT29 است. مواد و روش‏ها: سلول‫های سرطان کلورکتال در محیط کشت DMEM غنی شده با 10 درصد سرم جنین گاوی و 1 درصد آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین درون پلیت 96 خانه کشت شد. پس از گذشت 24 ساعت، سلول‫ها توسط آگرین‫بی (غلظت‫های 1 تا 8 میکروگرم بر میلی‫لیتر) به‫مدت 24 و 48 ساعت تیمار شدند. آزمون MTT جهت ارزیابی بقای سلول‫ها، رنگ‫آمیزی اکریدین-اورنج-پروپودیوم-یداید، کیت کاسپاز 3، 9 و کیت DCF-DA جهت تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط آگرین‫بی و از qRT-PCR جهت ارزیابی بیان p53  در سطح رونویسی استفاده شد. نتایج: یافته­ها نشان داد آگرین‫بی به‫صورت وابسته به دوز و زمان موجب القای اثرات سیتوتوکسیک در سلول‫های سرطان کولورکتال می‫شود. غلظت 6/4 میکروگرم بر میلی­لیتر به‫عنوان غلظت میانه مهاری (IC50) مشخص شد. رنگ آمیزی اکریدین-اورنج-پروپودیوم-یداید نشان­دهنده القای آپوپتوزیس تحت تیمار با غلظت میانه مهاری آگرین‫بی بود. افزایش فعالیت کاسپاز 3 و 9 و افزایش میزان ROS، نشان‫دهنده القای آپوپتوزیس از طریق مسیر میتوکندری تحت تیمار با آگرین‫بی بود. به‫علاوه، افزایش بیان p53  نشان‫دهنده اثر سرکوب­گر تومور تحت تیمار با آگرین‫بی بود. نتیجه‏گیری: با توجه به اعمال سمیت موثر و اثر القاکننده آپوپتوزیس، آگرین‫بی به‫عنوان یک ترکیب موثر در مهار سلول‫های سرطان کولورکتال انسانی HT29 در مطالعات پیش بالینی و بالینی پیشنهاد می­شود. 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

آپوپتوزیس نئوپلاسم‌های کولورکتال
کاسپاز
ژن سرکوبگر تومور
dor -

عنوان مقاله English

Apoptosis-promoting effect of Augerin B in HT29 colorectal cancer cell line

نویسندگان English

E Amini 1
A Shakeri 2
A Sheikholeslami 3
1 Department of Animal Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
2 Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran
3 Department of Mesenchymal Stem Cells, Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Qom, Iran
چکیده English

Introduction: Colorectal cancer (CRC) is the second most commonly diagnosed malignant tumor in the world, with about 1,926,425 new cases estimated for 2022. The most therapeutic approaches for CRC include surgery, chemotherapy, targeted medicine, and radiation therapy. Each of these treatments exerts side effects such as fatigue, constipation, loss of appetite, and low blood cell counts. Natural products have provided valuable anticancer effects for years. An increasing number of studies have elucidated that plant-based natural compounds can act as an alternative chemotherapy option against CRC. It has been demonstrated that herbal bioactive compounds such as flavonoids, alkaloids, peptides, terpenoids, and steroids have the potential to effectively treat CRC. Sesquiterpenoid lactones, a subclass of terpenoid compounds, have been shown to induce anti-tumor effects. Aguerin B, a sesquiterpene lactone, exhibits cytotoxic effects against some types of tumors.
Aims: The current study aims to investigate the effect of Aguerin B on HT29 colorectal cancer, and assess the molecular mechanism of Aguerin B in colorectal cancer by evaluating the type of cell death it induces and its effect on the expression of the tumor suppressor gene p53 in HT29 colorectal cancer cells.
Materia and Methods: Colorectal cancer cells were purchased from the Iranian Biological Resource Center. HT29 cells were cultured in DMEM medium enriched with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotics in 96-well plates. After 24 hours, the cells were treated with Aguerin B (variable concentrations from 1 to 8 μg/ml) for 24 and 48 hours. Cell viability was assessed using the MTT assay. Acridine orange-propidium iodide staining, caspase-3 and caspase-9 activity assays, using DCF-DA kits, were used to determine the type of cell death induced by Aguerin B. Additionally, qRT-PCR was used to evaluate p53 expression at the transcriptional level.
Results: The findings demonstrated that Aguerin B exerts cytotoxic effects on colorectal cancer cells in a dose- and time-dependent manner, with an IC50 (Inhibitory Concentration) value of 4.6 μg/ml. Acridine orange-propidium iodide staining confirmed apoptosis induction at the IC50 concentration of Aguerin B. The cultivated activity of caspase-3 and -9, along with elevated ROS levels, indicated apoptosis induction via the mitochondrial pathway. Furthermore, the upregulation of p53 suggests the tumor-suppressive effect of Aguerin B in colorectal cancer cells.
Discussion: Among the cell death mechanisms, the induction of apoptosis is a more profound mechanism of cell death mediated by anticancer bioactive compounds extracted from natural sources. Recent investigations have been focused on cancer therapeutic techniques that increase the apoptosis rate in tumor cells by disrupting mitochondrial biogenesis, leading to mitochondrial dysfunction. Caspases, as proteolytic enzymes, play a significant role as effector molecules in the apoptosis-induced cell death pathway. HT29 cells are sensitive to the chemotherapeutic drugs 5-fluorouracil and oxaliplatin, which are standard treatment options for colorectal cancer, and therefore were selected as chemotherapy-responsive colorectal cancer cells in this study. The results of this study exhibited that Aguerin B can induce cytotoxicity and anticancer effects in HT29 colorectal cancer cells in a dose- and time-dependent manner. This compound is also able to induce its properties through the recruitment of the intrinsic pathway, the caspase-dependent pathway in HT29 cells. Nevertheless, the role of p53 mutations in the pathogenesis of CRC has been recognized. The obtained data showed that Aguerin B can exert its anti-cancer potential. Previously, it was found that some natural products, including sesquiterpenoids, can also exert their suppressive effects against cancers by targeting the p53-MDM2 pathway.
Conclusion: Given its potent cytotoxicity and apoptosis-inducing effects, Aguerin B, which can suppress HT29 cells, appears to be an effective compound for obstructing human colorectal cancer cells, warranting further investigation in the pre-clinical phase and clinical studies.

کلیدواژه‌ها English

apoptosis colorectal neoplasms caspases tumor suppressor gene

مقدمه

سرطان کولورکتال (CRC: colorectal cancer) چهارمین سرطان شایع و دومین علت مرگ ناشی از سرطان در ایالات متحده است. مدیریت درمان CRC که از حالت موضعی خارج و حالت متاستازی پیدا کرده است شامل داروهای مختلف، چه به‫صورت ترکیبی و چه به‫صورت منفرد است. انتخاب درمان بر اساس در نظر گرفتن اهداف درمان، نوع و زمان درمان قبلی، مشخصات جهشی تومور و پروفایل­های سمیت متفاوت داروهای تشکیل دهنده است (1). در اواخر دهه 1990، سرطان کولورکتال چهارمین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان در افراد زیر 50 سال بود، اما در حال حاضر اولین عامل مرگ و میر در مردان و دومین عامل مرگ و میر در زنان به‫شمار می­رود. انجمن سرطان آمریکا برآورد کرده است که در سال 2024، 152810 نفر در ایالات متحده به سرطان روده بزرگ مبتلا خواهند شد و 53010 نفر بر اثر این بیماری جان خود را از دست خواهند داد (2).              

عوامل مختلفی مانند سابقه خانوادگی، بیماری­هایی مانند دیابت نوع 2، بیماری­های التهابی روده، چاقی و رژیم غذایی عاری از فیبر، سن بالا، مصرف نوشیدنی­های الکلی و سیگار در ابتلا به سرطان کولورکتال نقش اساسی دارند (3). افرادی که در رژیم غذایی آن­ها مقدار زیادی از چربی­های ترانس، کلسترول، کربوهیدرات و الکل دیده می­شود در مقایسه با افرادی که به‫طور مکرر فیبر، سلنیوم، کلسیم، روی و منیزیم، ویتامین­هایی نظیر B12 و B6، امگا 3 ، امگا 6، مصرف می­کنند، احتمال ابتلای CRC در آن‫ها بیشتر است (4). به‫طور کلی روش­های درمان سرطان کولورکتال شامل شیمی­درمانی، پرتو درمانی، جراحی، و روش­های ترکیبی است که هر یک دارای معایبی همچون القای عوارض جانبی بر بافت­های نرمال، عود و رشد مجدد تومور هستند (5).

مطالعات نشان داده است ناهنجاری در عملکرد آپوپتوزیس در پاتوژنز سرطان کولورکتال (آغاز و پیشرفت سرطان) و مقاومت نسبت به روش­های درمان و داروهای شیمیایی نقش دارد. از این‫رو القای آپوپتوزیس مکانیسم اصلی اعمال سمیت سلولی برای انواع روش­های درمان سرطان کولورکتال از جمله شیمی­درمانی و پرتودرمانی به شمار می­رود (6). در سال 2022، محققین نشان دادند سلول‫های سرطانی که درون تومور تحت آپوپتوزیس قرار گیرند از طریق فعال­سازی کاسپازها قادر به رهایش فاکتورهای جاذب شیمیایی از جمله اینترلوکین 8 هستند که نوتروفیل­ها را به‫سمت توده توموری جذب می­کند (7).

p53  یک فاکتور رونویسی القا شده توسط استرس است که ژن­های پایین دست متنوعی را برای اعمال عملکرد تنظیمی در فرآیندهای سیگنالینگ متعدد تنظیم می‫کند. تقریبا در 50-40 درصد از سرطان کولورکتال اسپورادیک جهش p53  رخ می­دهد که ارتباط نزدیکی با پیشرفت سرطان دارد. انواع مختلف جهش p53  نقش بنیادی در تعیین رفتار بیولوژیکی سرطان کولورکتال از جمله میزان تهاجم و جایگاه متاستاز دارند. به‫علاوه مطالعات نشان داده است بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال که دارای p53  جهش یافته هستند مقاومت بیشتر و پیش آگهی ضعیف­تری نسبت به شیمی­درمانی دارند (8).

در سال‌های اخیر، برخی از ترکیبات کوچک مولکول به‫منظور بررسی فعال‌سازی و بازیابی p53  از طریق مکانیسم‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفته‌اند (9). در طب سنتی، فراورده­های طبیعی گیاهی با دارا بودن اثرات ضد تکثیری، آنتی‫اکسیدانت، ضد التهابی و ضد رگ­زایی به‫عنوان منبع جدیدی از داروهای ضد سرطان شناخته شده­اند (10). تعدادی از فراورده­های طبیعی شناسایی شده­اند که با ایجاد توقف چرخه سلولی و القای آپوپتوزیس، کاهش تکثیر سلولی و رگ‌زایی، مهار تهاجم و متاستاز به سلول‫های تومور، اثرات شیمیایی پیشگیرانه خود را بر سرطان کولورکتال اعمال می‌کنند (11).

سسکوئی­ترپن لاکتون­ها گروهی از ترکیبات طبیعی دارای فعالیت ضد سرطان هستند که در گیاهان خانواده Asteraceae به‫وفور وجود دارند و اثرات خود را با واکنش با گروه­های عاملی موجود بر روی پروتئین­ها و آنزیم­ها، به‫ویژه گروه تیول، اعمال می­کنند (12). اولین بار چیکا و همکاران (13) پس از آنالیز فیتوشیمیایی از بخش هوایی Centaurea deflexa فعالیت ضد تکثیری دو سسکوئی­ترپن لاکتون تحت عنوان آگرین‫بی (Aguerin B) و 15 15-nor-guaianolide  را بر روی سلول‫های سرطانی پانکراس و روده بزرگ انسانی بررسی کردند. نتایج پژوهش آن‫ها نشان داد از بین دو ترکیب تنها آگرین بی­دارای نقش پیش برنده آپوپتوزیس است و دلیل آن وجود حلقه α-متیلن-γ-لاکتون موجود در آگرین‫بی است.

با وجود تحقیقات پیشین، هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر آگرین‫بی بر رده سلولی آدنوکارسینوم کولورکتال انسانی HT29 و بررسی اثر آن بر روی استرس اکسیداتیو، القای آپوپتوزیس و بیان ژن سرکوب­گر تومور p53  است.

2- مواد و روش­ها

تهیه آگرین بی: این ترکیب سسکوئی ترپن لاکتون در مطالعات قبلی از عصاره دی کلرومتان گیاه Centaurea behen توسط کروماتوگرافی بر روی سیلیکاژل با پیک 1750 تا 1780 که مشخصه جذبی حلقه لاکتونی در طیف FTIR است جداسازی و توسط RP-HPLC با خلوص بالای 95 درصد خالص سازی شد و در درمای 20- درجه سانتی‫گراد تا زمان استفاده نگه‫داری شد  (14).

کشت سلولی: این پژوهش تجربی آزمایشگاهی تحت نظارت و تایید کمیته اخلاق دانشگاه خوارزمی با کد IR.KHU.REC.1402.088  انجام شد. سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 از بانک سلولی مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران خریداری شدند. سلول‫ها در محیط‌ DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و آنتی ‌بیوتیک پنی‫سیلین-استرپتومایسین 1 درصد در دمای 37 درجه سانتی‌گراد درون انکوباتور CO2 5 درصد کشت داده شدند.

ارزیابی زنده مانی سلول‫ها: سلول‫های سرطان کولورکتال به تعداد 103×5 در هر چاهک از پلیت 96 کشت شدند و به‫مدت 24 و 48 ساعت تحت تیمار با غلظت­های مختلف آگرین‫بی از 1 تا 8 میکروگرم بر میلی­لیتر قرار گرفتند. گروه کنترل، سلول‫های سرطانی بودند که تحت تیمار قرار نگرفتند. جهت بررسی عدم تاثیر حلال اتانول (جهت آماده سازی استوک آگرین‫بی که پس از رقیق سازی با محیط کشت از آن غلظت‫های مختلف تیمار ساخته شد) میزان حلال به‫کار رفته  به‫عنوان شم در نظر گرفته شد. پس از گذشت زمان موردنظر، بررسی تراکم سلول‫های گروه­های تیماری و کنترل زیرمیکروسکوپ اینورت بررسی شد. سپس 10 میکرولیتر MTT (5 میلی گرم بر میلی­لیتر) به‫هر چاهک اضافه شد و به‫مدت 3 تا4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شد. در نهایت 80 میکرولیتر DMSO جهت انحلال کریستال­های فورمازان به‫هر چاهک اضافه و در طول موج 560 نانومتر جذب نوری خوانش شد. بر اساس جذب نوری نمونه نسبت به کنترل، درصد بقا محاسبه شد.

ارزیابی آپوپتوزیس و نکروز: سلول‫های سرطان کولورکتال به تعداد 104×2 کشت شدند و پس از 48 ساعت تیمار با غلظت­های مهارکننده تکثیر آگرین‫بی توسط تیمار آنزیمی با تریپسین از کف پلیت جدا و پس از شستشو با PBS، با 10 میکرولیتر از سوسپانسیون رنگی حاوی 100 میکروگرم بر میلی­لیتر آکریدین­اورنج (AO) و پروپودیوم یداید (PI) رنگ آمیزی و در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند.

بررسی فعالیت کاسپاز 3 و 9: سلول‫های سرطان کولورکتال به تعداد 105×2 کشت شدند. بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار، سلول‫های گروه کنترل و تیماری از کف پلیت جدا و پس از سانتریفیوژ، محیط رویی برداشته شده و به هر نمونه 50 میکرولیتر از بافر لیزکننده سلولی موجود در کیت شرکت Abcam  کاسپاز 9 و 3 به ترتیب (ab39401, ab65607) افزوده شد. سپس نمونه­ها 10 دقیقه بر روی یخ قرار گرفتند و در دور 10000 به­مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند. محیط رویی برای تعیین غلظت پروتئین به‫روش بردفورد استفاده شد. برای ارزیابی فعالیت کاسپاز، 50 میکرولیتر از DDT و 2 x buffer و 5 میکرولیتر از سوبسترای کاسپاز 9 (LEHD-p-NA) و سوبسترای کاسپاز 3 (DEVD-p-NA) به نمونه کنترل و تیماری اضافه و به‫مدت 2 ساعت درون انکوباتور انکوبه شدند. سپس، جذب هر نمونه در طول موج 400 یا 450 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد.

اندازه گیری میزان ROS : سلول‫های سرطان کولورکتال به تعداد 105×2 کشت شدند و 48 ساعت تحت تیمار با غلظت میانه مهاری آگرین‫بی قرار گرفتند. تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) با استفاده از کیت DCFDA  (2'-7'-دی کلروفورسئین دی استات) و زیر میکروسکوپ فلورسانس به طور کیفی بررسی شد. به‫طور خلاصه، پس از تیمار، سلول‫ها با 5 میکرومولار رنگ DCFDA به‫مدت 10 دقیقه انکوبه و سپس توسط PBS شستشو شدند. سپس تعیین مقدار ROS درون سلولی با بررسی شدت فلورسنت DCFDA در زیر میکروسکوپ فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز بیان ژن p53   توسط q-RT-PCR: جهت بررسی اثر آگرین‫بی بر بیان ژن سرکوب­گر تومور P53  بر سلول‫های سرطانی کولورکتال HT29، سلول‫ها به تعداد 105×6  درون فلاسک T12.5 کشت داده شدند. پس از 48 ساعت تیمار سلول‫ها با غلظت میانه مهاری این ترکیب، RNA از نمونه کنترل و تیماری استخراج و cDNA توسط کیت پارس طوس سنتز شد.

برای انجام qRT-PCR، 5/12 میکرولیتر master mix، 5/2 میکرولیتر پرایمر و 10 میکرولیتر cDNA برای نمونه کنترل و تیماری مجزا مخلوط و تحت 35 سیکل دمایی (فعال­سازی در 95 درجه سانتی­گراد به‫مدت 5 دقیقه، دناتوراسیون در 95 درجه به‫مدت 5 ثانیه، اتصال و گسترش در 60 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 10 ثانیه) قرار گرفت. داده­های کمی با روش آستانه مقایسه ای (Ct) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. β-اکتین به‫عنوان ژن مرجع داخلی استفاده شد (جدول 1). داده­ها به‫صورت نسبت ژن مرجع به ژن هدف با استفاده از فرمول زیر بیان شد:

 ΔCt = Ct  - (ژن مدنظر) Ct   (ژن مرجع)

 برای تعیین سطوح بیان نسبی، از فرمول زیر استفاده شد:

 ΔΔCt = ΔCt - (درمان شده) ΔCt (کنترل)

سپس نسبت بیان ژن مدنظر به مرجع در نمونه تیماری نسبت به کنترل از فرمول 2−ΔΔCt محاسبه شد.

 

جدول 1: توالی پرایمر ژن­های p53  و β-actin

ژن

توالی پرایمر فوروارد

توالی پرایمر ریورس

دمای ذوب

p53

CCAGGGCAGCTACGGTTTC

CTCCGTCATGTGCTGTGACTG

R: 61/4

F: 61/9

β-actin

GGCTGTATTCCCCTCCATCG

CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

F: 59/7

R: 59/3

 

3- آنالیز آماری

نتایج حاصل پس از سه بار تکرار (n=3) با استفاده از آزمون آماری استنباطی، نرم افزار SPSS 22 و روش one-way ANOVA در مورد آزمون MTT و سایر آزمون­ها توسط روش student-T test و آزمون تعقیبی توکی تحلیل شد و سطح 05/0>p به‫عنوان سطح معنی‫دار نظر گرفته شد.

4- نتایج

بررسی زنده­مانی سلول‫های HT29

 نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که سلول‫های HT29 درحضور غلظت­های مختلف آگرین بی (1 تا 8 میکروگرم بر میلی­لیتر) موجب کاهش زنده­مانی سلول‫ها به‫صورت وابسته به دوز و زمان می­شود. اما در گروه شم، تغییر معنی‫داری در بقای سلول‫ها مشاهده نشد. محاسبات نشان داد غلظت میانه مهاری یا IC50 ترکیب آگرین‫بی پس از گذشت 48 ساعت 65/4 میکروگرم بر میلی لیتر بود که برای ارزیابی نوع مرگ سلولی القا شده در آزمون­های بعدی مورد استفاده قرار گرفت (نمودار 1).

 

نمودار 1:  اثر غلظت­های مختلف آگرین‫بی بر بقای سلول‫های HT29 توسط آزمون MTT پس از 24 و 48 ساعت از تیمار. داده­ها 3 بار تکرار و به‫صورت انحراف معیار ± میانگین بیان شدند (001/0>* **p ,01/0>n=3; **p)

 

همچنین تصاویر میکروسکوپی نشان دهنده کاهش در تعداد و تراکم و همچنین تغییر شکل سلول‫های HT29 تحت تیمار با آگرین‫بی بود (شکل 1).

 

شکل 1: ارزیابی تعداد و مورفولوژی سلول‫های HT29 پس از تیمار با اگرین بی. A: گروه کنترل، B: تحت تیمار با دوز 2 میکروگرم بر میلی لیتر، C: تحت تیمار با دوز 4 میکروگرم بر میلی‫لیتر و D: تحت تیمار با دوز 8 میکروگرم بر میلی‫لیتر.  Scale bar: 100µm

ارزیابی آپوپتوزیس و نکروز توسط رنگ آمیزی اکریدین اورنج/ پروپودیوم یداید

 بر اساس داده­های شکل 2 سلول‫های HT29 در گروه کنترل (بدون تیمار) به رنگ  سبز رنگ­آمیزی شدند که موید زنده بودن سلول‫ها و سلول‫های تحت تیمار با غلظت میانه مهاری یا IC50 از ترکیب آگرین‫بی به رنگ سبز مایل به زرد و زرد مایل به نارنجی رنگ­آمیزی شدند که بیانگر مرگ سلولی آپوپتوزیس می­باشد. بنابراین آگرین‫بی از طریق القای آپوپتوزیس سمیت خود را روی سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 اعمال کرده است.

 

شکل 2: آزمون اکریدین اورنج/ پروپودیوم یداید جهت ارزیابی نوع مرگ سلولی. تصویر بیانگر القاء آپوپتوزیس در غلظت میانه مهاری ترکیب آگرین‫بی در سلول‫های HT29 است. A: سلول‫های HT29  گروه کنترل؛ B: سلول‫ها تحت تیمار با دوز میانه مهاری آگرین بی. Scale bar: 10µm

 

 

ارزیابی نوع مسیر القای آپوپتوزیس

 جهت تعیین نوع مسیر القای آپوپتوزیس توسط غلظت میانه مهاری آگرین‫بی از آزمون بررسی فعالیت کاسپاز 3 و 9 استفاده شد. همان‫طور که در نمودار 2 نشان داده شده است افزایش جذب کاسپاز 3 در مقایسه با کاسپاز 9 در سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 تحت تیمار با غلظت میانه مهاری آگرین بیمشاهده می­شود که بیانگر القای مسیر آپوپتوزیس درونی یا میتوکندری در پیشبرد اثرات آگرین‫بی در سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 است.

 

 

 

 

 

نمودار 2: اثر غلظت میانه مهاری آگرین‫بی بر فعالیت آنزیم­های کاسپاز 3 و کاسپاز 9 در سلول‫های HT29 پس از 48 ساعت تیمار. داده­ها به‫صورت انحراف معیار ± میانگین بیان شدند ( 0.05.>p*)

به‫منظور درک این مطلب که آیا فعالیت پیش برنده آپوپتوزیس ترکیب آگرین‫بی به افزایش تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن در سلول‫های سرطانی HT29 نسبت داده می­شود یا خیر، میزان ROS توسط کیت DCF-DA اندازه­گیری شد. بررسی میکروسکوپی نشان داد سلول‫های HT29 تحت تیمار با آگرین‫بی موجب افزایش میزان ROS می­شود که از طریق افزایش میزان رنگ در شکل 3، در مقایسه با گروه کنترل مورد تایید است. بنابراین این سسکوئی ترپن لاکتون از طریق مسیر میتوکندری قادر به القای آپوپتوزیس در سلول‫های HT29 است.

 

 

 

 

 

 

شکل 3: اثر آگرین‫بی بر میزان تولید ROS درون سلولی توسط کیت DCF-DA در سلول‫های سرطان کولورکتال HT29. a: سلول‫های HT29  گروه کنترل، b: سلول‫ها تحت تیمار با دوز میانه مهاری آگرین‫بی. بزرگنمایی ×200

بررسی بیان ژن p53  توسط روشq RT-PCR

 نتایج ارزیابی بیان ژن نشان داد که میزان بیان ژن  p53  در گروه تحت تیمار با غلظت میانه مهاری  آگرین‫بی در مقایسه با گروه کنترل (سلول‫های HT29 فاقد تیمار) به‫صورت معنادار افزایش یافته است که این افزایش با *p≤0.05 معنی‫دار بود (نمودار 3).

 

نمودار 3: بررسی میزان بیان ژن p53  در سلول‫های HT29 تحت تیمار با غلظت میانه مهاری آگرین‫بی با روش qRT-PCR. 05/0.>p*

 

5- بحث

در میان مکانیسم­های مرگ سلولی، القای آپوپتوزیس مکانیسم موردنظر برای مرگ سلولی سلول‫های سرطانی است که می‫تواند با کم‫ترین عارضه جانبی توسط ترکیبات ضد سرطان مستخرج از منابع طبیعی انجام ­شود (15). مطالعات نشان داده است استفاده از فراورده های طبیعی گیاهی دارای اثرات پرو آپوپتوزیسی به‫صورت تنها یا به‫صورت ترکیبی در سنتز سبز ترکیبات نانو همانند نانوفیبرها که در درمان سرطان مورد استفاده قرار دارند، می­تواند نویدبخش بستر درمانی نوین در آینده باشد (16). بنابراین اثبات اثرات ضد سرطان ترکیبات طبیعی گیاهی همواره مدنظر محققین قرار دارد.

سلول‫های HT29 نسبت به داروهای شیمی درمانی 5-فلوئورواوراسیل و اگزالی­پلاتین به‫عنوان گزینه­های درمانی استاندارد برای سرطان کولورکتال حساس هستند و بنابراین در این پژوهش به‫عنوان سلول‫های سرطان کولورکتال پاسخ دهنده نسبت به شیمی­درمانی انتخاب شدند (17). نتایج پژوهش حاضر نشان داد آگرین‫بی قادر به اعمال سمیت سلولی و اثر ضد سرطان در رده HT29 سرطان کولورکتال به‫صورت وابسته به دوز و زمان است. همچنین این ترکیب قادر است اثرات خود را از طریق القای آپوپتوزیس و مسیر وابسته به کاسپاز از طریق مسیر درونی در این سلول‫ها اعمال کند.

  مطالعات نشان داده است کاسپازها نقش موثری در القای آپوپتوزیس دارند. طی مسیر آپوپتوزیس پس از رهایش سیتوکروم c از میتوکندری، کاسپاز 9 فعال می­شود. کاسپاز 9 از طریق فعال­کردن کاسپاز اجرایی 3 با القای فعالیت پروتئولیتیک قادر به کلیواژ تنوعی از پروتئین­های عملکردی و ساختاری است (20-18). در خصوص عملکرد ضد سرطان فراورده­های طبیعی، بر اساس یافته­ها این ترکیبات می‌توانند از طریق مهار زنجیره تنفسی میتوکندری، افزایش ROS، اختلال در پتانسیل غشای میتوکندری، آزادسازی فاکتورهای پرو آپوپتوزیسی، فعال کردن خانواده پروتئین کاسپاز و هدف گیری انتخابی تقسیم میتوکندری، آپوپتوزیس را در سلول‫های سرطان کولورکتال القا کنند. از جمله فراورده­های طبیعی که اثرات ضد سرطان خود را در سرطان کولورکتال از طریق فعال­سازی و افزایش بیان کاسپاز3 یا 9 اعمال می­کنند می­توان به کریپتوتانشینون، آمورفروتین، آپی­ژنین، بایکالین، دیوسین، امودین، پسورالیدین، پلی فیلین، تیمول و لوناسین اشاره کرد. در این میان برخی ترکیبات همانند کاستیسین، و کورکومین از طریق افزایش بیان هر دو کاسپاز 3 و 9 قادر به القای آپوپتوزیس از طریق مسیر میتوکندری و اعمال اثر ضدسرطان بر روی سرطان کولورکتال هستند (21). حسینی و همکاران  (22) سطوح بیان ژن­های کاسپاز را در سلول‫های تومور کولورکتال SW480 بررسی کردند و نشان دادند تحت تاثیر پپتید نیسین بیان mRNA کاسپاز 9 و 8 و 6 و 3 در سلول‫های توموری کولورکتال گروه تیماری در مقایسه با گروه کنترل بیشتر است. شافعی پور و همکاران (23) نشان دادند ترکیب مونوترپن آلفا-پینین دارای اثرات ضد تکثیری بر روی سلول‫های سرطان کلورکتال انسانی HT-29 است. این ترکیب قادر است از طریق افزایش بیان ژن‫های پرو آپوپتوزیسی Bax و کاسپاز 3، مهار Bcl-2 و سرکوب مسیر سیگنالینگ PI3K  و Akt نقش ضد سرطان خود را اعمال کند.

مطالعات پیشین بر روی اثرات ضدسرطان و پرو آپوپتوزیسی سسکوئی ترپن لاکتون­ها صورت گرفته است. در سال 2018 تیم پژوهشی حاضر، فعالیت 6 سسکوئی ترپن لاکتون را از جمله آگرین‫بی(استخراج شده از گیاه Centaurea behen L که گونه­ای متعلق به خانواده آستراسه است) بر روی سلول‫های سرطان تخمدان A2780  ارزیابی کرد. نتایج نشان داد آگرین‫بی قادر به اعمال اثر توکسیک روی سلول‫های سرطان تخمدان با IC50= 1.62 µg/ml است.  همچنین این ترکیب قادر به اعمال اثرات ضد رگ­زایی از طریق مهار تکثیر سلول‫های اندوتلیال بندناف جنینی است (14). Chen و همکاران (24) گزارش کردند آنتروسین  به‫عنوان یک سسکوئی ترپن لاکتون مکانیسم مرگ سلولی آپوپتوزیس را از طریق تعدیل نشانگرهای آپوپتوزیس مختلف آغاز می‫کند و منجر به افزایش سطح کلیواژ کاسپاز 3، کاسپاز 9 و PARP همراه با افزایش بیان Bax و  کاهش Bcl-2 در سلول‫های سرطان پروستات PC3-KD می­‫شود.

Liu و همکاران  (25) اثبات کردند آلانتولاکتون از طریق کاهش Bcl-2، و افزایش بیان ژن پرو آپوپتوزیسی Bax و سرکوب‫گر تومور p53  و همچنین فعال کردن کاسپازهای 3 و 12، القا کننده آپوپتوزیس در سلول‫های MCF-7 است (25). در مطالعات اخیر در یک پژوهش اثر ترکیبی نانوی آرتمیزینین و متفورمین بر روی سلول های سرطان سینه T-47D مورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد این درمان ترکیبی از طریق افزایش Bax، و همچنین فعال کردن کاسپاز 7 و کاسپاز 3 القاکننده آپوپتوزیس در سلول‫های سرطانی است.

تکوین و توسعه سرطان کولورکتال یک فرآیند چند عاملی و چند مرحله‌ای است که شامل فعال شدن انکوژن‌ها و غیرفعال کردن ژن‌های سرکوب­گر تومور است (26). مطالعات نشان داده است پیشرفت سرطان کولورکتال به‫دنبال جهش در ژن‌های APC، K-Ras و p53  رخ می­دهد. جهش ژن p53  در سرطان کولورکتال در 34 درصد از تومورهای پروگزیمال کولون و 45 درصد از تومورهای دیستال کولورکتال رخ می­دهد. اکثر این جهش­ها در اگزون 5 تا 8 (دومین اتصال یابنده به DNA) و عمدتا در برخی از کدون ها مانند 175، 245،248، 273 و 282 رخ می­دهد که شامل انتقال G به A، C به T است و منجر به جایگزینی یک اسیدآمینه در پروتئین p53  می‫شود (27 و 28). در خصوص مکانیسم عمل p53  در القای آپوپتوزیس سلول‫های سرطانی، یافته‫ها نشان می‫دهد p53  از طریق اثر بر پروتئین‫های پرو آپوپتوزیسی PUMA, NOXA قادر به مهار اعضای آنتی آپوپتوزیسی خانواده Bcl2 همانند MCL-1, BCL-XL است. در مرحله بعد p53  قادر به فعال‫سازی BAX, BAK و متعاقبا رهایی سیتوکروم C، شکل گیری آپوپتوزوزم و فعال‫سازی کاسپارهای اجرایی است. از طرفی p53  قادر است از طرق دیگری همچون بیان تعدادی از microRNA، از جمله تحریک miR-34 ژن Bcl-2 را هدف قرار دهد و موجب کاهش فاکتورهای پیش برنده بقای سلول‫های سرطانی شود (29).

مطالعات نشان داده است به‫کارگیری داروها یا ترکیباتی که بتوانند منجر به افزایش عملکرد p53   و فعالسازی مجدد آن به‫عنوان عامل سرکوب‫گر توموری شوند، می تواند کاربرد زیادی در مهار سرطان داشته باشد. (30). اپی کاتچین گالات (ECG)  به‫عنوان یکی از مهم­ترین ترکیبات پلی فنولی موجود در چای سبز از طریق تحریک بیان p53 ، p21، MAPKs (پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن)، تثبیت p53  توسط مهار تجزیه پروتئین و RNA و توقف چرخه سلولی در G0/G1 قادر به اعمال اثرات ضدتوموری در سرطان کولورکتال است (9). در پژوهش Al-Fatlawi و همکاران (31) گزارش شد پارتنولید به‫عنوان یک سسکوئی‫ترپن لاکتون موجب مهار تکثیر رده‫های سلولی سرطان دهانه رحم انسان (SiHa) و سرطان پستان (MCF-7) می­شود و سلول‫های تحت تیمار شده با پارتنولید با تغییر در سطوح بیان ژن‌های p53 ، Bax، کاسپازهای 3، 6 و 9- و mRNA ژن Bcl-2 موجب القای آپوپتوزیس در این سلول‫های سرطانی شدند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد آگرین‫بی قادر به افزایش سطح بیان فاکتور سرکوب­گر تومور p53  است و از این طریق قادر به مهار سلول‫های سرطانی HT29 است. ماسیلینیک اسید یک تری­ترپن و دارای خواص ضدسرطانی قوی در مقابل سلول‫های سرطان کولورکتال است. بررسی آزمون­های آزمایشگاهی نشان داده است این ترکیب از طریق تداخل با پروتئین­های اسکلت سلولی در سلول‫های HT29 دارای اثر ضد توموری است (33). همچنین پژوهش‫گران نشان دادند ماسیلینیک اسید از طریق مکانیسم القای بیان JNK، p53 ، و افزایش فاکتورهای مسیر میتوکندری قادر به توقف چرخه سلولی و القای آپوپتوزیس در سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 است (33). در پژوهش‫های دیگر  فعالیت القاکننده آپوپتوزیس از طریق فعالسازی p53  در مورد سسکوئی ترپن لاکتون­هایی همچون کاستونولید، ایزوالانتول استون در رده های سلولی سرطانی اثبات شده است (31 و 34).

6- نتیجه­گیری

درمجموع، آگرین‫بی به‫عنوان یک سسکوئی­ترپن لاکتون با القای اثرات پیش برنده آپوپتوزیس و القا از طریق مسیر درونی یا میتوکندری قادر به مرگ موثر سلول‫های سرطان کولورکتال HT29 است. از این‫رو با توجه به اعمال اثرات توکسیک در غلظت­های پایین (6/4 میکروگرم بر میلی‫لیتر) این ترکیب می­تواند به‫عنوان کاندیدی برای درمان سرطان کولورکتال در مطالعات پیش بالینی و بالینی پیشنهاد شود. از جمله محدودیت‌های این مطالعه جهت کاربرد در پژوهش­های بالینی می­توان به عدم بررسی فاکتورهای دخیل در آپوپتوزیس در سطح پروتئین، عدم استفاده از کنترل مثبت، یا محدودیت مدل سلولی اشاره کرد.  از این‫رو، مطالعات تکمیلی در مدل موشی جهت بررسی اثرات پرو‫ آپوپتوزیسی آگرین‫بی بر تومور کلورکتال مورد نیاز است.

 7- تشکر و قدردانی

از حمایت معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه خوارزمی به‫جهت تصویب و تامین مالی و همراهی کارشناسان محترم آزمایشگاه مرکزی دانشگاه خوارزمی جهت آنالیز دستگاهی صمیمانه سپاسگزاریم. بخشی از هزینه انجام طرح تحت عنوان " بررسی اثر ضد سرطان Augerin B بر سرطان کولون در شرایط in vitro و in vivo " از گرنت (شماره  قرارداد 27449) دانشگاه خوارزمی تامین شده است.

-

  1. Benson AB, Venook AP, Adam M, Chang G, et al. Colon cancer, version 3.2024, NCCN clinical practice guidelines in oncology. Natl Compr Canc Netw. 2024; 22 (2D): e240029. doi: 10.6004/jnccn.2024.0029.
  2. Siegel RL, Giaquinto AN, Jemal A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin . 2024; 74(1): 12-49 doi: 10.3322/caac.21820.
  3. Sawicki T, Ruszkowska M, Danielewicz A, Niedźwiedzka E, et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers (Basel). 2021; 13(9): 2025. doi: 10.3390/cancers13092025.
  4. Pericleous M, Mandair D, Caplin ME. Diet and supplements and their impact on colorectal cancer. J Gastrointest Oncol. 2013; 4(4): 409.-23.doi: 10.3978/j.issn.2078-6891. 2013.003.
  5. Kumar A, Gautam V, Sandhu A, Rawat K, et al. Current and emerging therapeutic approaches for colorectal cancer: A comprehensive review. World J Gastrointest Surg. 2023; 15(4): 495-19. doi: 10.4240/wjgs.v15.i4.495.
  6. Zhang L, Yu J. Role of apoptosis in colon cancer biology, therapy, and prevention. Curr Colorectal Cancer Rep. 2013; 9(4): 10.1007/s11888-013-0188-z.
  7. Schimek V, Strasser K, Beer A, et al. Tumour cell apoptosis modulates the colorectal cancer immune microenvironment via interleukin-8-dependent neutrophil recruitment. Cell Death Dis. 2022; 13(113). https://doi.org/10.1038/s41419-022-04585-3
  8. Takayama T, Miyanishi K, Hayashi T, Sato Y, et al. Colorectal cancer: genetics of development and metastasis. J Gastroenterol. 2006; 41(3): 185-92. doi: 10.1007/s00535-006-1801-6.
  9. Li XL, Zhou J, Chen ZR, Chng WJ. P53 mutations in colorectal cancer-molecular pathogenesis and pharmacological reactivation. World J Gastroenterol. 2015; 21(1): 84-93. doi: 10.3748/wjg.v21.i1.84.
  10. Asma ST, Acaroz U, Imre K, Morar A, et al. Natural products/bioactive compounds as a source of anticancer drugs. Cancers. 2022; 14(24): 6203. doi: 10.3390/cancers14246203.
  11. Rajamanickam S & Agarwal R. Natural products and colon cancer: current status and future prospects. Drug Deve Res. 2008; 69(7): 460-71. doi: 10.1002/ddr.20276.
  12. Babaei G, Aliarab A, Abroon S, Rasmi Y, et al. Application of sesquiterpene lactone: A new promising way for cancer therapy based on anticancer activity. Biomed Pharmacother. 2018; 106: 239-46. doi: 10.1016/j.biopha.2018.06.131.
  13. Chicca A, Tebano M, Adinolfi B, Ertugrul K, et al. Anti-proliferative activity of aguerin B and a new rare nor-guaianolide lactone isolated from the aerial parts of Centaurea deflexa. Euro J Med Chem. 2011; 46(7): 3066-070. doi: 10.1016/j.ejmech. 2011.03.011.
  14. Shakeri A, Amini E, Asili J, Masullo M, et al. Screening of several biological activities induced by different sesquiterpene lactones isolated from Centaurea behen L. and Rhaponticum repens (L.) Hidalgo. Nat Prod Res. 2018; 32(12): 1436-440.doi: 10.1080/14786419. 2017. 1344661.
  15. Chaudhry G-e-S, Md Akim A, Sung YY, Sifzizul TMT. Cancer and apoptosis: The apoptotic activity of plant and marine natural products and their potential as targeted cancer therapeutics. Front Pharmacol. 2022; 13: 842376. doi: 10.3389/fphar. 2022. 842376.
  16. Khoshnazar SM, Asadi A, Karimian A, Abdolmaleki A, et al. Applications of nanofibers in the diagnosis and treatment of cancer. Iran J Blood Cancer. 2022; 14(2): 92-107. doi: 10.58209/ijbc.14.2.92
  17. Folkvord S, Flatmark K, Seierstad T, Røe K, et al. Inhibitory effects of oxaliplatin in experimental radiation treatment of colorectal carcinoma: does oxaliplatin improve 5-fluorouracil-dependent radiosensitivity? Radiothe Oncol. 2008; 86(3): 428-34. doi: 10.1016/j.radonc.2007.10.012.
  18. Kowalczyk T, Sitarek P, Skała E, Toma M, et al. Induction of apoptosis by in vitro and in vivo plant extracts derived from Menyanthes trifoliata L. in human cancer cells. Cytotechnology. 2019; 71(1): 165-80.doi: 10.1007/s10616-018-0274-9.
  19. Hensley P, Mishra M, Kyprianou N. Targeting caspases in cancer therapeutics. Biol Chem. 2013; 394(7): 831-43. doi: 10.1515/hsz-2013-0128.
  20. Brentnall M, Rodriguez-Menocal L, De Guevara RL, Cepero E, et al. Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis. BMC Cell Biol. 2013; 14(32): 1-9. doi: 10.1186/1471-2121-14-32.
  21. Wei F, Nian Q, Zhao M, Wen Y, et al. Natural products and mitochondrial allies in colorectal cancer therapy. Biomed Pharmacother. 2023; 167: 115473. doi: 10.1016/j.biopha.2023.115473.
  22. Hosseini SS, Hajikhani B, Faghihloo E, Goudarzi H. Increased expression of caspase genes in colorectal cancer cell line by Nisin. Arch Clin Infect Dis. 2020; 15(2): e97734. https://doi.org/10.5812/archcid.97734.
  23. Shafieipour S, Zamanian Y, Hadipour E. et al. Exploring the effects of alpha-pinene on apoptosis induction in human colon cancer cells via the PI3K/AKT signaling pathway: an in vitro study. Egypt J Med Hum Genet. 2025; 26(27). https://doi.org/10.1186/
  24. Chen YA, Tzeng DTW, Huang YP, Lin CJ, et al. Antrocin sensitizes prostate cancer cells to radiotherapy through inhibiting PI3K/AKT and MAPK signaling pathways. Cancers (Basel). 2018; 11(1): 34.doi: 10.3390/cancers11010034.
  25. Liu J, Liu M, Wang S, He Y, et al. Alantolactone induces apoptosis and suppresses migration in MCF-7 human breast cancer cells via the p38 MAPK, NF-κB and Nrf2 signaling pathways. Int J Mol Med. 2018; 42(4): 1847-856. doi: 10.3892/ijmm.2018.3751.
  26. Qi L, Ding Y. Screening of tumor suppressor genes in metastatic colorectal cancer. Biomed Res Int. 2017; 2017:2769140. doi: 10.1155/2017/2769140.
  27. López I, Oliveira LP, Tucci P, Alvarez-Valín F, et al. Different mutation profiles associated to P53 accumulation in colorectal cancer. Gene. 2012; 499(1):81-7.doi: 10.1016/j.gene.2012.02.011.
  28. Aubrey BJ, Kelly GL, Janic A, Herold MJ, et al. How does p53 induce apoptosis and how does this relate to p53 -mediated tumour suppression? Cell Death Differ. 2018; 25(1):104-13. doi: 10.1038/cdd.2017.169.
  29. Liebl MC, Hofmann TG. The Role of p53 Signaling in Colorectal Cancer. Cancers (Basel). 2021; 13(9):2125. doi: 10.3390/cancers13092125.
  30. Tsukamoto S. Natural products that target p53 for cancer therapy. J Nat Med. 2025. https://doi.org/10.1007/s11418-025-01906-6.
  31. Al-Fatlawi AA, Al-Fatlawi AA, Irshad M, Rahisuddin, Ahmad A. Effect of parthenolide on growth and apoptosis regulatory genes of human cancer cell lines. Pharm Biol. 2015; 53(1): 104-09.
  32. Rufino-Palomares EE, Reyes-Zurita FJ, García-Salguero L, Mokhtari K, et al. Maslinic acid, a triterpenic anti-tumoural agent, interferes with cytoskeleton protein expression in HT29 human colon-cancer cells. J Proteomics. 2013; 83: 15-25. doi: 10.1016/j.jprot. 2013.02. 031.
  33. Reyes-Zurita FJ, Pachón-Peña G, Lizárraga D, Rufino-Palomares EE, et al. The natural triterpene maslinic acid induces apoptosis in HT29 colon cancer cells by a JNK-p53 -dependent mechanism. BMC Cancer. 2011; 11:154. doi: 10.1186/1471-2407-11-154.
  34. Jin C, Zhang G, Zhang Y, Hua P, et al. Isoalantolactone induces intrinsic apoptosis through p53 signaling pathway in human lung squamous carcinoma cells. PLoS One. 2017; 12(8): e0181731. doi: 10.1371/journal.pone.0181731.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 2
تابستان 1404
صفحه 185-199

  • تاریخ دریافت 16 شهریور 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما