سلول و بافت
فصلنامه

بررسی تاثیر هم افزایی صدمات کروموزومی ناشی از تیمار هم‫زمان وین بلاستین و آرسنیک بر رده سلولی HDF با استفاده از آزمون میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته‫ای‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

خدیجه عبدی ولمی 1
فرهنگ حداد 2
مریم مقدم متین 3

1 کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران، کدپستی 09177948974 azadeh.abdi1991@gmail.com

2 دانشیار، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران، کدپستی 09177948974، haddad@um.ac.ir

3 استاد، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران، کدپستی 09177948974، matin@um.ac.ir

https://doi.org/10.61882/JCT.16.2.156
چکیده
هدف: آرسنیک یکی از فلزات سنگین موجود در محیط زندگی انسان است که تاثیرات خطرناک آن بر سلامت کروموزوم‫ها و همچنین القای سرطان مدت‫هاست که اثبات شده است. عمده صدمات آرسنیک به‫شکل شکستگی‫های کروموزومی می‫باشد. این صدمات ناشی از توان این فلز سنگین در ایجاد رادیکال‫های آزاد و به‫دنیال آن واکنش آن‫ها با مولکول DNA، است. به‫دلیل ارتباط نزدیک بین ناپایداری‫های تعدادی کروموزومی و سرطان، این سوال مطرح است که آیا القای سرطان توسط آرسنیک می‫تواند از طریق القای این نوع ناهنجاری‫ها نیز باشد؟ مواد و روش‏ها: در این مطالعه تاثیر کروموزومی هم‫زمان سه غلظت 100، 200 و 300 ng/ml از آرسنیک به‫همراه سه غلظت 75/0، 1 و 2 ng/ml از وین بلاستین، یک آنیوژن شناخته شده، بر القای صدمات کروموزومی در رده سلولی HDF با استفاده از آزمون میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته‫ای مورد بررسی قرار گرفت.  نتایج: تیمار با آرسنیک ضمن کاهش قدرت زیستایی سلول، باعث ایجاد صدمات کروموزومی شد. همچنین تیمار هم‫زمان با وین بلاستین میزان صدمات کروموزومی را به شکل معنی‫داری بین حدود سه تا هفت برابر در مقایسه با تیمار با وین بلاستین به‫تنهایی، افزایش داد. نتیجه‏گیری: نتایج بیانگر این است که تیمار با آرسنیک زمینه مناسب ایجاد اختلالات کروموزومی القایی با وین بلاستین را فراهم می‫نماید. این تاثیر ممکن است از طریق تداخل مستقیم آرسنیک با مکانیسم‫های کنترل صحت تقسیم سلولی بوده یا با ایجاد جهش در ژن‫های دخیل در این فرآیندها باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

آرسنیک
فلز سنگین
وین بلاستین
میکرونوکلئوس
رده سلولی HDF
dor -

عنوان مقاله English

Investigating the synergistic effect of chromosomal damage caused by the co-treatment with Vinblastine and Arsenic on HDF cell line using Micronucleus assay on Binucleated cells

نویسندگان English

Kh Abdi Velmi 1
F Haddad 2
M Moghadam-Matin 3
1 M.Sc, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2 Associate Professor, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Professor, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
چکیده English

Introduction: Heavy metal refers to any metal with relatively high density, with toxic effects even at ppb levels. Heavy metals are one of the main threats to human health. Arsenic (As) is a heavy metal found in our living environment due to its widespread use in industrial activities. Exposure to As and its absorption by different tissues may lead to damage to cardiovascular function, skin lesions, high blood pressure, and diabetes. As harmful effects on chromosome integrity have been proven a long time ago. It has also been classified as a potent carcinogen by the Environmental Protection Agency (EPA) and the International Agency for Research on Cancer (IARC).  One of the damages caused by As is chromosome breakages. These damages are the result of this heavy metal's ability in producing free radicals and their interaction with the DNA molecule. The role of aneuploidy in cancer induction has been suggested in several investigations. Aneuploidy can lead to drastic changes in the genetic balance of normal cells, potentially forcing them towards cancer formation.
Aims: Due to the close relation between chromosome instability and cancer induction and the ability of As to induce cancer, the question arises whether As can also play a role in chromosome instability? The design of this study is based on answering this question.
Materials and methods: In this study, to analyze potential cell toxicity and chromosome abnormalities induced in different treatments, MTT and Micronucleus assay on Binucleated cells were used, respectively. Cell toxicity of different doses of As was investigated on HDF cells. According to the results of MTT, three non-toxic doses of 100, 200, and 300 ng/ml were selected. To be able to understand the effect of As treatment on chromosome instability induced by aneugenic agent, vinblastine was used. Vinblastine is classified as an aneugen in several studies. Co-treatment of three doses of As and three doses of 0.75, 1.00, and 2.00 ng/ml of vinblastine (Vin) on the induction of chromosome abnormalities was investigated on the HDF cell line using the Micronucleus assay on Binucleated cells.
Results: According to the results of the MTT assay, cell toxicity induced by As at 24, 48, and 72 hours was at doses of 604.3, 397.3, and 228.6, respectively.   As also led to chromosomal abnormalities. Mean frequency of micronucleated binucleates (BiMn) was 0.296, 0497, and 7.270 for 100, 200, and 300 ng/ml, respectively, compared to the frequency of BiMn in the control (0.078). Vinblastine treatment also significantly increased the frequency of BiMn in all doses used compared to the control. Finally, Co-treatment with three doses of vinblastine and three doses of As significantly increased chromosomal abnormalities to almost three to seven times compared to solo vinblastine treatment.
Discussion: Results indicate that As can induce chromosomal abnormalities, which is represented by an increase in BiMn frequency. In addition, co-treatment with vinblastine and As leads to higher chromosomal abnormalities compared to solo treatment with vinblastine. Significant increase in frequency of BiMn in the later experiment suggests that As provides a suitable ground for chromosomal abnormalities induced by other aneugenic agents, here, vinblastine. This effect might be the result of direct interference of As with mechanisms of cell division control or inducing mutation in genes involved in such mechanisms through oxidative species, which leads to an increase in their errors. In both cases, the results of this study reveal an alternative mechanism for As-induced tumor formation.
Conclusion: As not only involves cancer formation by direct damage to chromosomes but also provides a suitable ground for chromosomal mis-segregation in cell divisions, which is believed to be a main step towards cancer formation.  

کلیدواژه‌ها English

Arsenic
heavy metal
vinblastine
micronucleus
HDF cell line

مقدمه:

فلزات سنگین و تاثیرات مضر آن‫ها بر سلامت انسان مدت‫هاست که مورد توجه محققین قرار دارد. انسان از طرق مختلف از جمله روش‫های طبیعی مثل آب‫های آشامیدنی و یا انجام فعالیت‫های صنعتی مانند ساخت ظروف شیشه‫ای، آلیاژهای فلزی، صنایع میکروالکتریک، آفت‫کش­های کشاورزی و نگه­دارنده­های چوب به‫طور مستمر در معرض این فلزات قرار می‫گیرد (1). یکی از انواع فلزات سنگین آرسنیک است که در فعالیت‫های صنعتی کاربرد گسترده‫ای دارد. قرار گرفتن در معرض آرسنیک و تجمع آن در بافت‫ها منجر به اختلالاتی در عملکرد قلب، ایجاد زخم­های ­پوستی، القای بیماری­های عروق محیطی، فشار خون، بیماری پای سیاه، دیابت، نوروتوکسیسیتی و سرطان می‫شود (2). آرسنیک توسط EPA و IARC از جمله سرطان‫زاهای گروه یک دسته بندی شده است (3). تخمین زده می‌شود که بیش از 58 میلیون نفر در سراسر جهان  در معرض سطوح سرطان‌زا از آرسنیک قرار دارند (4). افزایش غلظت آرسنیک در محیط ‌زیست تهدید عمده‌ای برای سلامتی انسان به‫شمار می‌رود. این فلز می‫تواند از طریق استنشاق، بلع و تماس پوستی جذب بافت‫ها شده و منجر به اثرات ژنتیکی و سرطانی مثل سرطان پوست شود. علاوه بر این، این عنصر ممکن است از جفت عبور کرده و منجر به افزایش میزان سقط خودبه‌خودی، وزن کم هنگام تولد و مشکلات دیگر در جنین شود (5). افراد ازنظر زیست ‌محیطی به‫طور عمده از طریق آب آشامیدنی در معرض آرسنیک قرار می‌گیرند. قرار گرفتن طولانی‌مدت در معرض این فلز سنگین یکی از دلایل اصلی ایجاد سرطان است (6). آرسنیک همچنین در درمان افراد مبتلا به سرطان به‫عنوان یک داروی شیمی درمانی استفاده می‫شود (7).

سرطان بیماری است که سالانه باعث مرگ و میر هزاران انسان در سراسر جهان می‫شود. میزان مرگ ومیر ناشی از سرطان به مراتب بیشتر از مرگ به‫علت سکته مغزی و سایر بیماری‫های قلبی و عروقی است (8). یکی از عوامل مهم دخیل در ایجاد سلول‫های سرطانی، آنیوپلوئیدی است (9, 10). بیش­ ‌از ‌30 درصد از ‌تومورهای بافت­های ‌جامد  و ‌15 درصد ‌از ‌سرطآن‫های ‌خون ‌درجاتی ‌از ‌آنیوپلوئیدی ‌را ‌نشان ‌می­دهند (11)‌. شواهد حاکی از این است که سیر ‌تکاملی ‌سلول‫های ‌سرطانی ‌از ‌حالت ‌خوش‌خیم ‌به‫حالت ‌تهاجمی و بدخیم ‌با‌ افزایش‌ آنیوپلوئیدی مرتبط است (12).

وین بلاستین اولین آلکالوئید‌ طبیعی ‌با‌ عملکرد ‌ضد تکثیری ‌است ‌که‌ در‌ سال ‌1958در ‌عصاره ‌برگ­های ‌گیاه Vinca rosea کشف ‌شد. این‌ ماده یک ‌داروی ‌ضد‌ توموری ‌قوی ‌است‌ که ‌کاربرد‌ گسترده‫ای‌ در ‌شیمی‌درمانی ‌سرطان ‌دارد. وین بلاستین با توانایی ایجاد اختلال در عملکرد رشته‫های توبولینی دوک تقسیم، آنیوپلوئیدی را القا می کند (13, 14). این ماده امروزه به‫عنوان یک آنیوژن قدرتمند شناخته شده و در مطالعات متعددی به‫منظور القای آنیوپلوئیدی مورد استفاده قرار گرفته است (15, 16).

آزمون میکرونوکلئوس روشی بسیار کارآمد، سریع و قابل اعتماد جهت بررسی صدمات کروموزومی است (17). در این روش صدمات ساختاری مانند شکستگی‫های کروموزومی و یا کروماتیدی و صدمات تعدادی مانند جاماندگی کروموزومی در حین مهاجرت قابل بررسی است. قطعات کروموزومی یا ‌کروموزوم‫ها‫ی کامل جامانده در مرحله آنافاز و مهاجرت کروموزوم‫ها به قطبین به‫صورت ریز ‌هسته‫ها‫یی  (میکرونوکلئوس) در کنار ‌هسته‫ها‫ی اصلی مشاهده می شوند. افزایش در فراوانی میکرونوکلئوس‫ها بیانگر افزایش صدمات کروموزومی است. استفاده از مهار کننده سیتوکینز (cytochalasin-b) باعث ایجاد سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ در پایان تقسیم می‫شود. جهت اطمینان از بررسی صدمات کروموزومی در سلول‫هایی که در طول آزمایش تیمار و تقسیم شده‫اند، شمارش میکرونوکلئوس‫ها در سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ انجام می‫شود (18).

با توجه به نقش دوگانه آرسنیک در درمان و القای سرطان و همچنین ارتباط نزدیک آنیوپلوئیدی و سرطان، مناسب است که توانایی القا یا زمینه سازی ایجاد آنیوپلوئیدی توسط این فلز بررسی شود. در مطالعه حاضر تاثیر افزایش آسیب پذیری سلولی به وین بلاستین پس از تیمار با غلظت‫های مختلف آرسنیک مورد بررسی قرار گرفت. جهت بررسی صدمات کروموزمی القایی از آزمون میکرونوکلئوس در سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ استفاده شد.

 

2- مواد و روش­ها:

پژوهش حاضر تحت نظارت کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه فردوسی مشهد و با کد IR.UM.REC.1400.070 صورت پذیرفت.

رده سلولی: در مطالعه حاضر از رده سلولی فیبروبلاستی طبیعی انسان  (HDF )که از بانک سلولی آزمایشگاه کشت سلول گروه زیست شناسی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شده بود، استفاده شد. محیط کشت مورد استفاده high glucose DMEM کامل شده با 15 درصد FBS بود. سلول‫ها در این محیط در انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد با میزان 5 درصد CO2 قرار داده شدند. پاساژ سلولی هر 72 ساعت و با رسیدن سلول‫ها به 90  درصد هم‫پوشی انجام شد.

بررسی زنده مانی: جهت بررسی زنده مانی سلول‫ها از روش MTT استفاده شد.

سلول‫ها با تراکم 8000 در ‌چاهک‫ها‫ی ظرف 96 خانه با میزان 200 میکرولیتر از محیط کشت، کشت شدند. پس از 24 ساعت چهار غلظت 100، 500، 1000 و 1500 ng/ml از آرسنیک و چهار غلظت 5/0، 00/1، 50/1 و 00/2 ng/ml از وین بلاستین به ‌چاهک‫ها‫ اضافه شد. همچنین سلول‫ها تحت تاثیر تیمار هم‫زمان این دو ماده قرار گرفتند. برای این منظور، به ‌چاهک‫ها‫ چهار غلظت آرسنیک و چهار غلظت وین بلاستین به‫طور هم‫زمان افزوده شد. برای هر غلظت/زمان سه تکرار در نظر گرفته شد. پس از گذشت 24، 48 و 72 ساعت از تیمار، محیط کشت حاوی 10 درصد رنگ MTT جایگزین محیط قبلی شد. پس از گذشت 4 ساعت محلول DMSO به ‌چاهک‫ها‫ اضافه و در نهایت توسط دستگاه ELISA reader (Awareness) در طول موج nm545 خوانش میزان رنگ انجام شد.

آزمون میکرونوکلئوس: سلول‫ها در فلاسک‫های کشت T25 با میزان هم‫پوشی 60 درصد تحت تیمار چهار غلظت20، 100، 200 و 300 ng/ml آرسنیک و چهار غلظت 75/0، 00/1، 50/1 و 00/2 ng/ml از وین بلاستین قرار گرفتند. جهت تیمار هم‫زمان ابتدا در فلاسک‫های جداگانه غلظت‫های 100، 200 و 300 ng/ml از آرسنیک اضافه و پس از گذشت 2 ساعت غلظت‫های 75/0، 50/1 و 00/2 ng/ml از وین بلاستین به‫طور مجزا افزوده شد. هر تیمار در دو محیط کشت موازی انجام شد.

آزمون میکرونوکلئوس بر اساس روش پیشنهادی Fenech با کمی تغییر صورت پذیرفت (18). بدین شکل که، پس از گذشت 24 ساعت از تیمار ها cyto-b با غلظت نهایی 4 µg/ml به محیط‫های کشت اضافه شد. سلول‫های تیمار شده با cyto-b پس از گذشت 24 ساعت با کمک تریپسین برداشت شده و به لوله‫ی سانتریفوژ منتقل شدند. پس از سانتریفوژ در دور 1000 و زمان 10 دقیقه و دور ریختن محلول رویی سلول‫ها توسط محلول هایپوتونیک KCl  (075/0 مولار) به‫مدت 10 دقیقه مجاورشدند. دو بار شستشو با محلول فیکساتور متانول: اسید استیک  (1:3) و سپس معلق سازی سلول‫ها در مقدار اندکی از فیکساتور مراحل بعدی کار بودند. از سوسپانسیون سلولی تعداد 5-6 قطره بر روی لام‫های میکروسکوپی تمیز و سرد ریخته و گسترش داده شد. پس از خشک شدن لام‫ها در محیط، رنگ آمیزی آن‫ها با کمک گیمسا 10 درصد به‫مدت 18 دقیقه انجام شد.

شمارش سلولی: شمارش سلولی بر روی سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫  (Binucleated cells)  (Bi) انجام شد. بر روی هر لام حداقل 400 سلول دو ‌هسته‫ای‫ بررسی و تعداد سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ دارای میکرونوکلئوس  (Micronucleated Binucleated cells)  (BiMn) شمارش شدند. فراوانی BiMn از فرمول زیر به‫دست آمد:

 of BiMn= (BiMn)/ (Total Bi scored) x 100 %

3- آنالیز آماری

آنالیز آماری نتایج MTT با کمک نرم افزار Graph Pad Prism6 انجام شد. نتایج حاصل از این بررسی با کمک نرم افزار Sigmaplot به‫صورت نمودار ترسیم شد.

آنالیز آماری داده‫های آزمون میکرونوکلئوس توسط نرم افزار MINITAB نسخه ۱۹ صورت پذیرفت. در بررسی این داده‫ها از آزمون واریانس یک‫طرفه و آزمون t با سطح معنی‫داری p<0.05 استفاده شد. نمودارها با کمک نرم افزار GraphPad Prism 8 و Excel رسم شد.

4- نتایج:

بررسی زیستایی سلول‫ها پس از تیمار با آرسنیک

 نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‫های مختلف آرسنیک  (ng/ml 100- 1500) بر زیستایی سلول‫های HDF  نشان داد که آرسنیک به‫صورت وابسته به غلظت موجب کاهش درصد زیستایی در آن‫ها می‫شود  (نمودار1). مقادیر IC50 در زمان‫های ۲۴، ۴۸ و ۷۲  ساعت بعد از تیمار با آرسنیک ، به‫ترتیب 604/3، 379/3 و 228/6  ng/ml به‫دست آمد.

 

 

 

 

 

 

نمودار1: تاثیر تیمار با غلظت‫های مختلف آرسنیک بر توان زیستی سلول‫های HDF

 

 

 

بررسی زیستایی سلول‫ها پس از تیمار با وین بلاستین

 بررسی زیستایی سلول‫ها پس از تیمار با  غلظت‫های مختلف وین بلاستین ( ng/ml 2- 5/0) در مدت زمان ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بیانگر کاهش زیستایی آن‫ها است  (نمودار2). مقادیر IC50 محاسبه شده در مدت زمان ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت ، به‫ترتیب 6/3، 0/3 و 3/2 ng/ml می­باشد.

 

 

نمودار2: تاثیر تیمار با غلظت‫های مختلف وین بلاستین بر توان زیستی سلول‫های HDF

 

تیمار هم‫زمان با وین بلاستین و آرسنیک

 نتایج حاصل از بررسی اثر توامان غلظت‫های مختلف آرسنیک  (ng/ml 100- 1500) و غلظت‫های مختلف وین بلاستین (ng/ml 2- 5/0) در مدت زمان ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بر زیستایی سلول‫های HDF  نشان داد که تیمارتوام آرسنیک و وین بلاستین  به‫صورت وابسته به غلظت موجب کاهش معنی‫داری در درصد زیستایی سلول‫ها تا 60 درصد می‫شود  (نمودار 3).

 

 

 

 

 

نمودار3: تاثیر تیمار هم‫زمان غلظت‫های مختلف وین بلاستین و a) غلظت ng/ml 100 آرسنیک، b) غلظت n g/ml 500  آرسنیک، c) غلظت ng/ml 1000  آرسنیک و d) غلظت ng/ml 1500 آرسنیک بر توان زیستی سلول‫های HDF

 

بررسی صدمات کروموزومی با استفاده از آزمون میکرونوکلئوس

با توجه به کشنده بودن آرسنیک در غلظت‫های بالای 300 ng/ml و نیاز به سلول‫های زنده در حال تقسیم برای انجام آزمون میکرونوکلئوس، در بخش دوم کار و برای بررسی صدمات کروموزومی ناشی از تیمار با آرسنیک، از غلظت‫های زیر 300 ng/ml استفاده شد.

تیمار آرسنیک

 تیمار سلول‫ها با غلظت‫های 20، 100، 200 و 300 ng/ml آرسنیک منجر به افزایش معنی‫دار و وابسته به غلظت در فروانی سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ دارای میکرونوکلئوس شد ( p<0.05). نتایج این تیمار و تاثیر آن در افزایش فراوانی BiMn در نمودار 4 آمده است.

 

 

نمودار4: فراوانی سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ دارای میکرونوکلئوس ( BiMn) در نتیجه تیمار با غلظت‫های مختلف آرسنیک ( ng/ml). * p<0.05، ** p<0.01، *** p<0.001

 

تیمار با وین بلاستین

 نمودار 5 نتیجه تیمار سلول‫های HDF با چهار غلظت 75/0، 00/1، 50/1 و 00/2 ng/ml وین بلاستین را نشان می‫دهد. تیمار سلول‫ها با غلظت‫های مختلف وین بلاستین باعث افزایش معنی‫دار فراوانی BiMn در همه غلظت‫ها شده است ( p<0.01).

 

نمودار 5: فراوانی سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ دارای میکرونوکلئوس ( BiMn) در نتیجه تیمار با غلظت‫های مختلف وین بلاستین. ** p<0.01

 

تیمار هم‫زمان آرسنیک و وین بلاستین

 نمودار 6 نتایج حاصل از تیمار سلول‫ها با سه غلظت 75/0، 00/1 و 00/2 ng/ml وین بلاستین را پس از تمیار با سه غلظت 100، 200 و 300 ng/ml آرسنیک نشان می‫دهد. در تمام موارد، تیمار هم‫زمان سلول‫ها با آرسنیک و وین بلاستین باعث افزایش معنی‫دار در فراوانی BiMn در مقایسه با کنترل شده است (p<0.01). افزایش فراوانی BiMn وابسته به افزایش غلظت آرسنیک در تیمارهای مختلف با وین بلاستین است.

 

نمودار 6: فراوانی سلول‫های دو ‌هسته‫ای‫ دارای میکرونوکلئوس ( BiMn) در نتیجه تیمار با غلظت‫های مختلف آرسنیک پس از تیمار با 75/0 ng/ml، 00/1 ng/ml و 00/2 ng/ml وین بلاستین. ** p<0.01، *** p<0.001

 

همچنین در این نمودار فراوانی BiMn در سلول‫های تیمار شده با وین بلاستین به‫تنهایی با سلول‫های تیمار شده به‫شکل هم‫زمان با غلظت‫های مختلف آرسنیک و وین بلاستین مقایسه شده است. چنان‫که مشخص است، تیمار با آرسنیک سبب افزایش معنی‫دار در فراوانی BiMn در مقایسه با غلظت‫های نظیر از وین بلاستین بدون آرسنیک شده است ( p<0.01). بیشترین تفاوت مربوط به غلظت‫های بالای آرسنیک استفاده شده در این آزمایش بوده است.

5- بحث

در مطالعه حاضر تاثیر کشندگی آرسنیک بر سلول‫های HDF مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات انجام شده بر روی آرسنیک طیف وسیعی از غلظت را مورد بررسی قرار داده اند (19-21). بسته به نوع و شرایط آزمایش غلظت کشنده آرسنیک از مقادیر پایین معادل 100 تا غلظت‫های بالای حدود 1000 ng/ml متغیر بوده است. جهت پوشش این طیف وسیع غلظتی  جهت یافتن غلظت کشنده در این آزمایش، چهار غلظت 100، 500، 1000 و 1500 ng/ml از آرسنیک مورد استفاده قرار گرفت. تیمار سلول‫ها با آرسنیک در غلظت‫ها و زمان‫های مختلف باعث کاهش قدرت زیستایی سلول‫ها شد. این کاهش در تیمار هم‫زمان با وین بلاستین نیز مشاهده شد. به‫طور کلی با افزایش زمان تیمار، قدرت زیستایی نیز کاهش بیشتری را نشان داد. سایر مطالعات نیز تاثیر کشنده بودن تیمار با غلظت‫های مختلف آرسنیک را در دوره‫های زمانی مختلف نشان داده اند (19-21). آرسنیک با افزایش سطح گونه‫های فعال اکسیژن، کاهش پتانسیل غشای میتوکندری و فعال کردن مسیرهای متعدد استرس و مرگ سلولی باعث کاهش توانایی زنده ماندن سلول‫های تیمار شده می‫شود (7). سلول‫های تیمار شده با آرسنیک و ترکیبات معدنی آن به‫طور قابل ملاحظه‫ای کاهش بیان پروتئین سکیورین را نشان دادند. کاهش سکیورین به‫نوبه خود باعث القای آپوپتوزیس از مسیر غیر P53 می‫شود (22).

بررسی صدمات کروموزومی القایی توسط آرسنیک و وین بلاستین توسط آزمون میکرونوکلئوس انجام پذیرفت. از آن‫جایی‫که انجام این آزمون بر اساس توانایی تقسیم سلولی است، غلظت‫های انتخاب شده در این بخش زیر غلظت کشنده آرسنیک و وین بلاستین بود. تیمار سلول‫ها با غلظت‫های مختلف آرسنیک باعث افزایش فراوانی میکرونوکلئوس شد. تشکیل میکرونوکلئوس بیانگر شکستگی یا جاماندن ‌کروموزوم‫ها‫ در حین تقسیم سلولی ست. لذا افزایش فراوانی میکرونوکلئوس نشان دهنده افزایش صدمات کروموزومی است. تاثیر آرسنیک بر افزایش فراوانی میکرونوکلئوس در سایر مطالعات برون و درون تنی نیز گزارش شده است (23, 24). آرسنیک با افزایش سطح رادیکال‫های آزاد در سلول‫های تیمار شده می‫تواند آسیب‫های کروموزومی را افزایش دهد. شواهد نشان می‫دهند که اگرچه آرسنیک با مولکول DNA  ارتباط مستقیم برقرار نمی‫کند اما با افزایش سطح رادیکال‫های آزاد باعث القای شکستگی‫های تک و دو رشته‫ای در DNA می‫شود (25). سلول‫های تیمار شده با آرسنیک میزان بیان و فعالیت کم‫تری در پروتئین های OGG1 و APE1 که در تعمیر BER نقش کلیدی دارند را نشان داده اند. آرسنیک همچنین می‫تواند با کاهش یا توقف بیان پروتئین‫های موثر در تعمیر از نوع NER مانند ERCC1، XPB و XPF باعث توقف این نوع تعمیر نیز شود (26). لذا سلول‫هایی که در معرض این فلز قرار گرفته اند هم از طریق حمله رادیکال‫های آزاد به مولکول DNA و هم توقف سیستم های تعمیر DNA آسیب پذیری بالایی را به شکستگی‫های کروموزومی نشان خواهند داد.

بررسی‫ها نشان می‫دهد که آرسنیک نه تنها باعث افزایش صدمات کروموزومی می‫شود، بلکه می‫تواند زمینه ساز تاثیر سایر عوامل صدمه زننده به سیستم ژنتیکی و کروموزومی سلول‫ها نیز باشد. استرس اکسیداتیو ناشی از تیمار با آرسنیک سبب تشکیل باز آلی تغییر شکل یافته 8-oxoguanine می‫شود. تشکیل این باز تغییر شکل یافته احتمال جهش G:C به A:T را افزایش می‫دهد. لذا افزایش آسیب پذیری سلول‫های تیمار شده با آرسنیک به سایر عوامل صدمه زننده ژنتیکی می‫تواند نتیجه جهش‫های متعدد ژنومی و از کار افتادن یا کاهش کارایی سیستم‫های کنترلی و تعمیری سلول باشد (27, 28).

وین بلاستین به‫عنوان یک آنیوژن شناخته شده می‫تواند فراوانی میکرونوکلئوس را در سلول‫های تیمار شده افزایش دهد (29). با توجه به ماهیت این ماده انتظار می‫رود این افزایش به‫دلیل اختلالات تعدادی کروموزومی و به‫طور خاص جاماندن ‌کروموزوم‫ها‫ در تقسیم سلولی باشد (30). در مطالعه حاضر تیمار با وین بلاستین باعث افزایش فراوانی میکرونوکلئوس شد که این افزایش مرتبط با توانایی آنیوژنیک وین بلاستین تفسیر می‫شود.

قابل توجه است که وین بلاستین در سلول‫هایی که با غلظت‫های مختلف آرسنیک تیمار شده بودند باعث افزایش بیشتری در فراوانی میکرونوکلئوس در مقایسه با تیمار با وین بلاستین به تنهایی شد. مطالعات نشان داده اند که آرسنیک و ترکیبات مختلف آن می‫توانند باعث تاخیر میتوزی و اختلال در تشکیل دوک تقسیم که منجر به ناپایداری های کروموزومی شوند (20, 31). همچنین تیمار سلول‫ها با آرسنیک باعث اختلال در چرخه سلول و عملکرد نقاط کنترلی در تقسیم سلول می‫شود (26). سلول‫های تیمار شده با آرسنیک در چرخه سلولی پاسخ درستی به صدمات کروموزومی و DNA نمی‫دهند. به‫طوری‫که سلول‫های صدمه دیده از نقاط کنترلی عبور کرده و در مسیر چرخه سلولی بدون توقف به پیش می‫روند. آرسنیک باعث افزایش بیان cyclin D و cyclin E شده و در همین حال کاهش بیان cyclin F را به‫دنبال دارد. نتیجه این تغییرات در سطوح cyclinهای مختلف فشار به سلول جهت عبور از G1/S به G2/M خواهد بود (26). لذا سلول‫های تیمار شده با آرسنیک بسیار مستعد اختلالات کروموزومی ناشی از خطا در تقسیم سلولی خواهند بود. تیمار هم‫زمان سلول‫ها با آرسنیک و وین بلاستین که القای آنیوپلوئیدی می‫کند، باعث افزایش چشم‫گیر فراوانی میکرونوکلئوس شده است. با توجه به نحوه عمل وین بلاستین و این افزایش در فراوانی میکرونوکلئوس در تیمار هم‫زمان با وین بلاستین و آرسنیک در مقایسه با تیمار وین بلاستین به‫تنهایی، می‫توان نتیجه گرفت که آرسنیک زمینه ساز موثری در افزایش نابسامانی میتوزی و به طبع آن فراوانی اختلالات تعدادی کروموزومی در هنگام تقسیم است.

آرسنیک در بحث سرطان دارای نقشی دوگانه است. این فلز سنگین نه تنها به‫عنوان داروی درمان سرطان استفاده می‫شود بلکه خود می‫تواند یک عامل سرطان‫زا نیز باشد. در نتیجه مطالعه حاضر تا حدودی می‫توان این نقش دوگانه را توضیح داد.

آرسنیک نقش ضد سرطانی خود را از طریق تجمع رادیکال‫های آزاد در سلول‫های سرطانی و در نتیجه مرگ سلولی ایفا می‫کند (32). از طرفی با توجه به نقش تاثیرگذار و مهم آنیوپلوئیدی در القای سرطان می‫توان قدرت آرسنیک در القای سرطان را نه تنها در توان اکسیدانی و اختلال در فرآیند تعمیر DNA دانست، بلکه در ارتباط به توان این ماده در ایجاد نابهنجاری در مهاجرت کروموزومی در میتوز مرتبط نمود (20, 31).

6- نتیجه­گیری

آرسنیک به‫عنوان یک فلز سنگین که به‫طور گسترده در زندگی بشر حاضر است، قادر به ایجاد صدمات کروموزومی و ژنتیکی مستقیم از طریق ایجاد رادیکال‫های آزاد است. مطالعه حاضر نشان می‫دهد که این فلز همچنین با زمینه سازی مناسب می‫تواند عامل اصلی در القای آنیوپلوئیدی از طریق سایر عوامل صدمه زننده نیز باشد. این موضوع می‫تواند به‫عنوان پاسخ مناسبی در خصوص تاثیر مثبت این فلز در القای سرطان مورد توجه قرار گیرد.

 7- تشکر و قدردانی

این کار پژوهشی در قالب پایان نامه دانشجویی به شماره 55235/3  در دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد. نویسندگان تشکر
و قدردانی خود را نسبت به دانشگاه فردوسی مشهد و معاونت پژوهشی آن دانشگاه اعلام می‫دارند. همچنین از همکاری و
راهنمایی‫های ارزنده جناب آقای ابراهیم ملکی در روند انجام این پژوهش، تقدیر و تشکر می‫شود.

-

  1. Stankovic S KP, Stankovic AR. Biota as toxic metal indicators. Environ Chem Lett. 2014; 12:21.
  2. Ganie SY, Javaid D, Hajam YA, Reshi MS. Arsenic toxicity: sources, pathophysiology and mechanism. Toxicol Res (Camb). 2024; 13(1): tfad111.
  3. Humans IWGotEoCRt. Arsenic, metals, fibres, and dusts. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 2012; 100 (PT C):454.
  4. Zhou Q, Xi S. A review on arsenic carcinogenesis: Epidemiology, metabolism, genotoxicity and epigenetic changes. Regul Toxicol Pharmacol. 2018; 99: 78-88.
  5. Milton AH, Hussain S, Akter S, Rahman M, Mouly TA, Mitchell K. A Review of the Effects of Chronic Arsenic Exposure on Adverse Pregnancy Outcomes. Int J Environ Res Public Health. 2017; 14.
  6. Ahmad SA, Khan MH, Haque M. Arsenic contamination in groundwater in Bangladesh: implications and challenges for healthcare policy. Risk Manag Healthc Policy. 2018; 11: 251-61.
  7. Vineetha VP, Raghu KG. An Overview on Arsenic Trioxide-Induced Cardiotoxicity. Cardiovasc Toxicol. 2019; 19(2): 105-19.
  8. 8. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015; 136(5): E359-86.
  9. Zasadil LM, Britigan EM, Weaver BA. 2n or not 2n: Aneuploidy, polyploidy and chromosomal instability in primary and tumor cells. Semin Cell Dev Biol. 2013; 24 (4): 370-9.
  10. Duesberg P, Li R, Fabarius A, Hehlmann R. Aneuploidy and cancer: from correlation to causation. Contrib Microbiol. 2006; 13:16-44.
  11. Holland AJ, Cleveland DW. Losing balance: the origin and impact of aneuploidy in cancer. EMBO Rep. 2012; 13(6): 501-14.
  12. Siegel JJ, Amon A. New insights into the troubles of aneuploidy. Annu Rev Cell Dev Biol. 2012; 28: 189-214.
  13. Dhamodharan R, Jordan MA, Thrower D, Wilson L, Wadsworth P. Vinblastine suppresses dynamics of individual microtubules in living interphase cells. Mol Biol Cell. 1995; 6(9): 1215-29.
  14. Krishan A. Fine structure of the kinetochores in vinblastine sulfate-treated cells. J Ultrastruct Res. 1968; 23(1): 134-43.
  15. Cammerer Z, Schumacher MM, Kirsch-Volders M, Suter W, Elhajouji A. Flow cytometry peripheral blood micronucleus test in vivo: determination of potential thresholds for aneuploidy induced by spindle poisons. Environ Mol Mutagen. 2010; 51(4): 278-84.
  16. Leopardi P, Marcon F, Dobrowolny G, Zijno A, Crebelli R. Influence of donor age on vinblastine-induced chromosome malsegregation in cultured peripheral lymphocytes. Mutagenesis. 2002; 17(1): 83-8.
  17. Kuo B, Beal MA, Wills JW, White PA, Marchetti F, Nong A, et al. Comprehensive interpretation of in vitro micronucleus test results for 292 chemicals: from hazard identification to risk assessment application. Arch Toxicol. 2022; 96(7): 2067-85.
  18. Fenech M, Morley AA. Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutat Res. 1986; 161(2):193-8.

 

  1. Zhong G, Wan F, Ning Z, Wu S, Jiang X, Tang Z, et al. The protective role of autophagy against arsenic trioxide-induced cytotoxicity and ROS-dependent pyroptosis in NCTC-1469 cells. J Inorg Biochem. 2021; 217: 111396.
  2. Zhao Y, Toselli P, Li W. Microtubules as a critical target for arsenic toxicity in lung cells in vitro and in vivo. Int J Environ Res Public Health. 2012; 9(2): 474-95.
  3. Shafiee F, Safaeian L, Gorbani F. Protective effects of protocatechuic acid against doxorubicin- and arsenic trioxide-induced toxicity in cardiomyocytes. Res Pharm Sci. 2023; 18 (2): 149-58.
  4. Chao JI, Hsu SH, Tsou TC. Depletion of securin increases arsenite-induced chromosome instability and apoptosis via a p53-independent pathway. Toxicol Sci. 2006;90(1): 73-86.
  5. Dong J, Wang JQ, Qian Q, Li GC, Yang DQ, Jiang C. Micronucleus assay for monitoring the genotoxic effects of arsenic in human populations: A systematic review of the literature and meta-analysis. Mutat Res Rev Mutat Res. 2019; 780: 1-10.
  6. Navasumrit P, Chaisatra K, Promvijit J, Parnlob V, Waraprasit S, Chompoobut C, et al. Exposure to arsenic in utero is associated with various types of DNA damage and micronuclei in newborns: a birth cohort study. Environ Health. 2019; 18(1): 51.
  7. Kumar M, Lalit M, Thakur R. Natural Antioxidants Against Arsenic-Induced Genotoxicity. Biol Trace Elem Res. 2016; 170(1): 84-93.
  8. Tam LM, Price NE, Wang Y. Molecular Mechanisms of Arsenic-Induced Disruption of DNA Repair. Chem Res Toxicol. 2020; 33(3): 709-26.
  9. Das S, Upadhaya P, Barhoi D, Nath Barbhuiya S, Langthasa P, Giri S. GCMS analysis of sadagura (smokeless tobacco), its enhanced genomic instability causing potential due to arsenic co-exposure, and vitamin-C supplementation as a possible remedial measure: a study involving multiple model test systems. Drug Chem Toxicol. 2022; 45(1): 185-96.
  10. Faita F, Cori L, Bianchi F, Andreassi MG. Arsenic-induced genotoxicity and genetic susceptibility to arsenic-related pathologies. Int J Environ Res Public Health. 2013; 10(4): 1527-46.
  11. Mohammadi Z, Haddad F, M MM, Soleymanifard S. Investigating the Vinblastine Induced-Chromosomal Abnormality in the Already Gamma Irradiated L929 Cell Line Using Micronucleus Assay in Cytokinesis Blocked Binucleated Cells. Asian Pac J Cancer Prev. 2019; 20(4): 1045-50.
  12. Gonzalez-Cid M, Cuello MT, Larripa I. Comparison of the aneugenic effect of vinorelbine and vincristine in cultured human lymphocytes. Mutagenesis. 1999; 14(1): 63-6.
  13. Ganapathy S, Liu J, Xiong R, Yu T, Makriyannis A, Chen C. Chronic low dose arsenic exposure preferentially perturbs mitotic phase of the cell cycle. Genes Cancer. 2019; 10(1-2): 39-51.
  14. Skoczynska A, Skoczynska M. Breast Cancer and Arsenic Anticancer Effects: Systematic Review of the Experimental Data from In Vitro Studies. Biomed Res Int. 2022; 2022: 8030931.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 2
تابستان 1404
صفحه 156-169

  • تاریخ دریافت 11 شهریور 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما