تعیین غلظت آپوپتوزی زهر زنبورعسل بر روی سلول های سرطانی پرومیلوسیتی انسانی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: اخیرا محققین گزارش کردند زهر زنبورعسل دارای اثر قوی ضد التهابی، ضد توموری و ضد سرطانی است. از طرفی از اهداف مهم درمان سرطان، راه اندازی آپوپتوزیس است. هدف این پژوهش، تعیین غلظت آپوپتوزی القا شونده توسط زهر زنبور (پاییزه، از منطقه سمنان) بر سلول های HL-60 می باشد. مواد و روش ها: در این پژوهش تجربی رده سلولی HL-60 از انستیتو پاستور تهیه و در محیط RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین- استرپتومایسین کشت شد. 2 ساعت بعد کشت، سلول ها تحت تاثیر غلظت های مختلف زهر 2.5، 5، 7.5، 12 و 15 میکروگرم بر میلی لیتر به مدت 72، 48، 24 ساعت قرار گرفتند. سپس مورفولوژی سلول ها توسط میکروسکوپ معکوس، درصد بقا توسط سنجش MTT و مرگ سلولی توسط رنگ آمیزی هوخست و فلوسیتومتری بررسی شدند. نتایج: آنالیز مورفولوژیکی و نتایج حاصل از رنگ آمیزی هوخست و داده های فلوسیتومتری آنتی بادی آنکسین 5 نشان داد مرگ القا شده توسط زهر آپوپتوزیس بوده و دوز 12 میکروگرم بر میلی لیتر موجب القا 50 درصد آپوپتوزیس می شود. نتیجه گیری: داده های این تحقیق نشان داد به کارگیری غلظت های پایین زهر زنبور طی دوره تیمار 48 ساعت اثر مهار تکثیر وابسته به دوز و زمان داشته و دوزهای بالاتر از 15 میکروگرم بر میلی لیتر باعث لیز شدن سلول ها و نکروزیس می شود. نتایج این پژوهش نشان داد که دوز 12 میکروگرم بر میلی لیتر القا کننده آپوپتوزیس بر سلول های HL-60 است.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

زهر زنبور عسل، در طب سنتی در درمان بیماری هایی مثل آرتریت، روماتیسم، تومورهای سرطانی، بیماری های پوستی و تسکین درد مورد استفاده قرار گرفته است. زهر زنبور حداقل حاوی 18 نوع ترکیب فعال شامل انواع پپتیدها (ملیتین، آپامین، آدولاپین، پپتید (MCD، آنزیم هایی مثل فسفولیپاز A2 ، آمین های فعال بیولوژیکی (مثل هیستامین، اپی نفرین) و اجزا غیر پپتیدی است که دارای تنوعی از خاصیت دارویی می باشند. زهر زنبور دارای خاصیت ضد التهابی بوده که یکی از ویژگی‏های داروهای ضد التهابی غیر استروئیدی است (2و1).

ملیتین یک پروتئین کوچک، حاوی 26 اسید آمینه و سم اصلی در زهر زنبور است که فعالیت فسفولیپاز A2  را افزایش داده و با دارا بودن خاصیت همولیتیک موجب از هم گسیختگی غشای سلول می‏شود. در سلول‏های سرطانی نیز، غشای سلولی پتانسیل غشایی بیشتری از سلول‏های سالم داشته و اکثر پپتیدهای لیز کننده، موجب گسیختن غشای این سلول‏ها می‏شوند. همچنین گزارش شده که ملیتین القا کننده آپوپتوزیس بوده و دارای اثرات ضد توموری است (4و3). این ترکیب می‏تواند به عنوان یکی از قوی ترین  بازدارنده‏های کالمودولینی عمل کرده و با غیر فعال کردن  NFkB(nuclear factor kappaB) اثر ضد التهابی داشته باشد. گزارش شده که اثر ضد التهابی زهر زنبور با آزاد سازی کاتکول آمین‏ها از مدولای فوق کلیه  همراه است (5).Chen  و همکاران (6) پیشنهاد کردند که اثرات سمی زهر زنبور از طریق فعالیت ملیتین بر روی فسفولیپاز A2 صورت گرفته و الحاق پپتید لیز کننده سلولی ملیتین با گیرنده‏های هورمونی و ژن درمانی می‏تواند نوعی درمان هدفمند و مفید جهت درمان انواع سرطان ها باشد. انواع سلول‏های سرطانی مثل کلیه، ریه، کبد، پروستات، مثانه و سینه همانند سلول‏های لوکمیایی می‏توانند هدف ملیتین باشند. پیشروی مرگ سلولی آپوپتوزیس از طریق چند مکانیسم مرگ سلولی همانند فعالیت کاسپاز3 و متالوپروتئینازهای ماتریکس در القا اثرات ضد سرطان توسط زهر زنبور و ملیتین حیاتی است (8و7).

 آپامین، یکی از ترکیبات موجود در زهر زنبور، کوچکترین نوروتوکسین موجود در زهر زنبور بوده که به عنوان یک بلوکر انتخابی کانال پتاسیم فعال شده توسط کلسیم، استراحت القا شده توسط اسید نیتریک در فعالیت انقباضی خودکار روی میومتر رحم در خانمها را مهار می‏کند. این خصوصیت ساختاری و دارویی آپامین ممکن است نقش مهمی در اثرات سمی بر روی سلول‏های سرطانی داشته باشد (9).

فسفولیپاز A2 دیگر سم موجود در زهر زنبور بوده که توسط ملیتیین فعال شده، هیدرولیز باندهای اسید چرب غشا فسفولیپیدی را کاتالیز کرده و موجب عدم یکپارچگی غشا و رهایی اسیدچرب شده و اثر سمی از طریق فعالیت این ترکیب  و خانواده کاسپاز خاصیت از بین برنده سلول های سرطانی است (10).

بیماریی‏های با قدرت نامحدود تکثیر، مثل سرطان در نتیجه تغییر در ژنوم ایجاد می‏شوند. مطالعات نشان می‏دهند که حداقل شش تغییر در فیزیولوژی سلولی موجب رشد بدخیمی می‏شود که شامل خود کفا بودن در تکثیر سلولی، مقاوم بودن به سیگنال‏های باز دارنده تکثیر سلولی، طفره رفتن از آپوپتوزیس، عدم محدودیت در پتانسیل تکثیر، تقویت آنژیوژنز و حمله به سایر بافت‏ها هستند. یکی از این تغییرات گریز از آپوپتوزیس است. بنابراین یکی از اهداف در درمان سرطان، برگرداندن دوباره مکانیسم آپوپتوزیس در سلول‏های سرطانی است (11).

آپوپتوزیس (مرگ برنامه ریزی شده سلولی)، فرایندی است که اهمیت اساسی در جلوگیری از تکوین تومور دارد. این نوع از مرگ سلولی عملکرد هومئوستاتیک دارد. آپوپتوزیس فرایندی است که توسط ویژگی‏های مورفولوژیک و بیوشیمیایی خاصی مشخص می‏شود که شامل حباب دار شدن سیتوپلاسم، انقباض هسته، تراکم کروماتین و .... است. یکی از این تغییرات جابجایی فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی غشا به سطح خارجی آن است که در سلول‏های سالم و به طور طبیعی در سمت داخلی غشا به سمت سیتوزول قرار دارد. در معرض قرار گرفتن فسفاتیدیل سرین راه انداز شناسایی سلول‏های آپوپتوزی توسط ماکروفاژها است. شواهد نشان می‏دهند که تنظیم آپوپتوزیس نقش عمده‏ای در پیشرفت تومور و درمان ضد توموری دارد (12).

سرطان حاد پرومیلوسیت، نوعی سرطان خون و مغز استخوان بوده که در نتیجه تجمع غیر طبیعی پرومیلوسیت ها به وجود می‏آید این بیماری در اثر یک جابجایی کروموزومی بین ژن گیرنده آلفا ترانس رتینوئیک اسید (RARα) روی کروموزوم شماره 17 به ژن PML (Promyelocyte Leukemia)، روی کروموزوم شماره ١٥ به صورت t(15:17) (q22;q12-21) به وجود آمده و پروتئین مرکبی تحت عنوان PML-RARα به وجود می‏آورد (13). رده سلولی HL60 یک دودمان سرطان حاد پرومیلوسیتی بوده که در آزمایشگاه‏های تحقیقاتی جهت انجام مطالعات روی سلول‏های خونی کاربرد وسیعی دارد. این رده سلولی منبع مداومی از سلول‏های انسانی را برای بررسی رویدادهای مولکولی که منجر به تمایز و آپوپتوزیس می‏شود، ارائه می‏دهد (14).

Liu و همکاران (15) بیان کردند که زهر زنبور تکثیر سلول‏های ملانومای موش را در شرایط in vitro و رشد سلول‏های ملانومای B16 را در شرایط  in vivoمهار می‏کند. Hu و همکاران (16) نشان دادند که پلی پپتیدهای موجود در زهر زنبور مهار چشمگیری در رشد سلول‏های هپاتوما ایجاد کردند. آنالیز مکانیسم مرگ سلولی در این سلول‏ها نشان داد که زمانی که این سلول ها تحت تاثیر زهر زنبور قرار گرفتند، در غلظت 10 میکرو گرم و دچار  آپوپتوزیس شدند. همدانی و همکاران (17) اثرات زهر زنبور از  ایران و استرالیا را بر روی میزان فعالیت متالوپروتئیناز ماتریکس بر روی دو رده سلولی K-562 و WEHI-164 بررسی کرده و دریافتند که زهر زنبور از دو منطقه متفاوت بر روی یک رده سلولی تفاوت چشمگیری نداشته، در حالی که واکنش رده های سلولی مختلف متفاوت خواهد بود. از آنجا که نوع منطقه توانسته بر روی نتایج به دست آمده تاثیر گذار باشد، هدف از این پژوهش،  تعیین دوز کشنده زهر زنبور (پاییزه، از منطقه سمنان) و نوع مرگ سلولی القا شده توسط این منبع زهر بر روی رده سلولی HL60 می باشد.

 

مواد و روش‌ها

برای انجام این پژوهش تجربی که در آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی صورت گرفت. زهر زنبور عسل (پاییزه و از منطقه سمنان) از گروه حشره شناسی دانشگاه آزاد واحد علوم تحقیقات- دکتر ایمانی و با استفاده از روش شوک الکتریکی تهیه شد. استوک زهر زنبور با غلظت 1 میلی گرم بر میلی‏لیتر (رقیق شده با PBS:Phosphate Buffer Saline) آماده و در غلظت های مختلف 5/2، 5، 5/7، 12 و 15 میکرو گرم بر میلی‏لیتر در مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت بر سلول‏های سرطانیHL60  اثر داده شد.

کشت سلولی: رده‏ی سلولی سرطان حاد پرومیلوسیتی HL60 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد و در محیط کشت  RPMI 1640 (SIGMA غنی شده با10 درصد (Gibco) FBS (Fetal Bovine Serum) و 1 درصد پنی سیلین-  استرپتو مایسین  (Gibco) کشت داده شدند. زمانی که تراکم سلول ها به 70 درصد رسید، سلول‏ها به تعداد 104×4 درون پلیت 24 خانه ای کشت داده شده و درون انکوباتور (Binder) در دمای 37 درجه  سانتی‏گراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. 2 ساعت پس از کشت، سلول‏ها با زهر زنبور با غلظت های 5/2، 5، 5/7، 12 و 15 میکرو گرم بر میلی لیتر رقیق شده با PBS تیمار شده و  24، 48 و 72 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند.

آزمون MTT(3-(4,5dimethyl thiazol2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) جهت ارزیابی بقا سلولی: بعد از گذشت زمان مورد نظر، 100 میکرو لیتر از معرف MTT (دی متیل تیازول دی فنیل تترازولیوم بروماید) (سیگما) رقیق شده با PBS با غلظت 5/0 میکرو گرم بر میلی لیتر به هر خانه از پلیت افزوده شده و سلول ها برای مدت 4 ساعت درون انکوباتور و در تاریکی قرار گرفتند. سلول های زنده، MTT  را توسط آنزیم دهیدروژناز میتوکندریایی  به کریستالهای فرمازان تبدیل می کنند. پس از 4 ساعت، به هر خانه از پلیت  900 میکرو لیتر ایزوپروپیل الکل اضافه شده و پلیت 12 ساعت در محیط آزمایشگاه در تاریکی قرار گرفت. سپس جذب سلول های زنده(optical density)  در 570 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. میزان درصد سلول های زنده از فرمول زیر محاسبه شد (18):                                     

Optical density test/optical density control×100 

 

آنالیز مورفولوژی سلولها توسط میکروسکوپ معکوس و فلورسنت: سلول‏های HL60 به تعداد 104×4 درون  پلیت 24 خانه‏ای کشت داده شدند. پس از گذشت 24 و 48 ساعت از تیمار با دوزهای مختلف زهر زنبور، سلول های گروه کنترل و گروه‏های تحت تیماری مختلف به دقت در زیر میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفتند. جهت بررسی مورفولوژی با میکروسکوپ فلورسنت، پس از انجام تیمار با غلظت‏ها و زمان‏های مختلف Ic50 (غلظت 50 درصد کشنده سلولی- Inhibitory Concentration) تعیین و این گروه و گروه کنترل جهت مشاهده مورفولوژی سلول (مخصوصا هسته سلول) توسط رنگ فلورسنت هوخست 33432 (سیگما) با غلظت 5/0 میکرو گرم بر میلی لیتر رنگ آمیزی شدند. به طور خلاصه، بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول های گروه کنترل و تیمار با PBS شستشو شده، بر روی لامل کوت شده با پلی دی لیزین قرار گرفته و برای مدت زمان 15 دقیقه در فرمالین سرد 4 درصد تثبیت شدند. پس از این مرحله سلول‏ها 20 دقیقه در تاریکی در معرض رنگ هوخست قرار گرفته و در زیر میکروسکوپ فلورسانس بررسی شدند.

 

آنالیز آپوپتوزیس با استفاده از آزمون فلوسیتومتری: سلول‏های گروه کنترل و گروه تیمار با زهر زنبور با غلظت  12 میکرو گرم بر میلی لیتر از زهر زنبور (IC50) برای مدت زمان 24 و 48 ساعت، با PBS  سرد با 2/7pH= درrpm 2000 سانتریفیوژ شد. سپس محیط رویی را دور ریخته و سلول‏ها با 100 میکرو لیتر آنتی بادی annexin V(abcam) رقیق شده با 3 درصد BSA-PBS به مدت 1 ساعت در 4 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از زمان انکوباسیون، حجم سلول‏ها  با PBS به 1000 میکرو لیتر رسانده و درrpm 2000 سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ، محیط رویی دور ریخته شد و به سلول‏ها    20 میکرو لیتر از آنتی بادی ثانویه(anti-rabbit IgG)  کونژوگه با رنگ فلورسنت FITC  رقیق شده با 3 درصدBSA-PBS  افزوده و به مدت 30 تا 45 دقیقه در تاریکی درون یخچال قرار گرفته شد. سپس به سلول‏ها 300 میکرو لیتر فرمالین            1 درصد اضافه شده و با دستگاه FACS Calibur                      (Beckton Dickinson,USA) با استفاده از نرم افزار       cell quess آنالیز شد (19).

آنالیز آماری: جهت  تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها از نرم افزار INSTAT و آزمون آنالیز واریانس یکطرفه استفاده شده و  نمودارها از طریق برنامه EXCEL رسم گردیدند. 05/0P<     (P value کمتر از 5 درصد) مرز معنی‏دار بودن داده‏ها تلقی گردیده و هر آزمایش حداقل 3 مرتبه تکرار شد.

 

نتایج

اثر مهار کنندگی زهر زنبور بر روی میزان تکثیر سلول ها

همانطور که در نمودار شماره 1 نشان داده شده، یافته‏های به دست آمده از سنجش MTT نشان داد که درصد زنده بودن سلول های تحت تیمار با زهر زنبور در غلظت های 5/2، 5، 5/7، 12 و 15 میکرو گرم بر میلی لیتر در مدت زمان 24 ساعت نسبت به گروه کنترل به ترتیب 37، 51، 5/73، 5/81، 88، در 48 ساعت5/33، 46، 5/67، 81، 5/84 و در 72 ساعت 59، 5/56، 76، 81، 5/83 بود. این نتایج نشان داد که اثر کشندگی سلولی زهر در 24 ساعت و 48 ساعت وابسته به دوز و زمان بوده و به طور تقریبی با غلظت 12 میکرو گرم بر میلی لیتر از  زهر زنبور موجب القای 50 درصد مرگ سلولی می شود. این در حالی است که در 72 ساعت تیمار با دوزهای بالاتر از 12 میکرو گرم بر میلی لیتر وابسته به دوز نمی باشد.


 

 

 

نمودار1: مقایسه ی اثرغلظت های مختلف زهر زنبور بر درصد بقا (%Viability) سلول های HL-60  پس از طی ٢٤،٤٨ و ٧٢ ساعت تیمار بر اساس سنجش MTT  0.05.>P*،0.01>P **،0.001 >P *** Mean±S.E)

 

 

 

آنالیز مورفولوژیک سلول‏ها قبل و بعد از تیمار با زهر زنبور

جهت بررسی مورفولوژی سلولی، سلول‏ها قبل و بعد از تیمار با زهر زنبور به دقت توسط میکروسکوپ اینورت مورد بررسی قرار گرفتند. سلول‏ها قبل از تیمار با زهر زنبور  به صورت سالم و یکپارچه با هسته کاملا طبیعی ظاهر شدند. در این سلول‏ها پس از تیمار با غلظت‏های بالاتر، سیتوپلاسم به صورت حباب دار شده و هسته به صورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده شد (شکل 1).


 

 

شکل1: تغییرات مورفولوژیکی سلول‏های HL-60 )رنگ آمیزی شده با هوخست) گروه کنترل و گروه‏های تیماری مختلف در زمان انکوباسیون  24 ساعت که تحت تاثیر غلظت‏های مختلف زهر قرار گرفته اند. همانطور که در شکل مشاهده می‏شود، در سلول‏های گروه تیمار (غلظت 12میکرو گرم بر میلی لیتر) هسته سلول‏ها به صورت قطعه قطعه در آمده و سیتوپلاسم نیز حالت طبیعی ندارد، در حالی که در گروه کنترل هسته و سیتوپلاسم سلول‏ها به صورت طبیعی دیده می‏شود.

 

 

 

شکل 2: آنالیز فلوسیتومتری اثر زهر زنبور بر روی سلول‏های HL-60. نتایج به دست آمده از این آزمون نشان می‏دهد که با گذشت 24 ساعت تیمار با غلظت های پایین تر زهر زنبور اثر زیادی روی القای مرگ آپوپتوزیس روی سلولها نداشته اما در غلظت 12 میکرو گرم بر میلی لیتر از زهر زنبور با بکارگیری annexin V ، سلول‏ها حدود 50 درصد مرگ آپوپتوزیس را نشان دادند. در منحنی، جمعیت سلول های زنده در سمت چپ پایین، سلول های در مراحل اولیه آپوپتوزیس در سمت راست پایین، سلول های در مراحل انتهایی آپوپتوزیس در سمت راست بالا و سلول های نکروزه در سمت چپ بالا قرار دارند.

 

آنالیز مرگ سلولی آپوپتوزیس توسط آزمون فلوسیتومتری

به منظور تعیین مقدار IC50 (Inhibitory Concentration) سلول‏ها تحت تاثیر زهر زنبور با دوزهای 5/2، 5، 5/7، 12 و 15 میکرو گرم بر میلی‏لیتر به مدت 24 و 48 ساعت قرار گرفتند. پس از تیمار، سلول‏ها با آنتی بادی اولیه annexinV و آنتی‏بادی ثانویه نشاندار به رنگ فلورسنت انکوبه شدند. در شکل 2، سلول‏های زنده در سمت چپ و پایین، سلول‏های در مرحله اولیه آپوپتوزیس در سمت راست پایین، سلول‏های در مرحله انتهایی آپوپتوزیس در سمت راست بالا و سلول‏های نکروز شده در سمت چپ بالای منحنی دیده می‏شوند. داده‏های منحنی فلوسیتومتری نشان داد که زهر زنبور در دوز 12 میکرو گرم بر میلی‏لیتر موجب القای 50 درصد مرگ آپوپتوزی شده است.

 

بحث

اثرات زهر زنبور عسل در درمان بیماری‏های التهابی، تسکین درد و مهار تکثیر سلول‏های سرطانی در چندین دودمان سلولی مورد تایید قرار گرفته است. در این آزمایش اثرات سمی زهر زنبور بر روی میزان تکثیر، مورفولوژی و نوع مرگ القا شده در رده سلولی HL60 بررسی شد. نتایج حاصل از آزمون MTT در این آزمایش نشان داد که با افزایش دوز در زمان  24 و 48 ساعت میزان بقا سلولی کاهش یافت. این بدان معنی است که افزایش دوز اثر قوی‏تری در مهار تکثیر سلول‏های HL60 داشته است. اما در 72 ساعت با افزایش دوز زهر، اثر مهارکنندگی تکثیر زهر زنبور،  به دلیل پایین بودن نیمه عمر زهر و غیر فعال شدن اجزا سازنده آن در محیط کشت رو به افزایش دارد. اثر مهار تکثیر زهر زنبور توسط محققینی که زهر زنبور را بر تعدادی رده‏های سرطانی بررسی کردند، نیز مشاهده شده است. Liu  و همکارانش (16) گزارش کردند که زهر زنبور تکثیر سلول‏های ملانومای موشی را در شرایط in vitro, in vivo مهار می‏کند. Chu و همکاران (20) گزارش کردند که زهر زنبور عسل موجب مهار رشد سلول‏های کارسینومای کبدی و سلول‏های اوستئوسارکومای MG63 می‏شود.Chen  و همکاران (6) نیز اثبات کردند که زهر زنبور در سلول‏های اوستئوسارکوما موجب مرگ آپتوزی سلول‏های U2 OS از طریق بیانFas  می‏شود.

در این پژوهش به منطور نشان دادن مرگ آپوپتوزی سلول‏های تیمار شده با زهر زنبور از رنگ آمیزی با هوخست و آزمون فلوسیتومتری با annexin V و آنتی بادی ثانویه نشاندار با FITC استفاده شد. مکانیسم عمل annexin V به این صورت است که این ترکیب نوعی پروتئین اتصال یابنده فسفولیپیدی با وزن مولکولی 36 کیلو دالتون بوده و گرایش زیادی برای اتصال به فسفاتیدیل سرین در غلظت‏های فیزیولوژیک کلسیم دارد.

در تائید داده‏های به دست آمده از این آزمایش، نوع مرگ القا شده توسط زهر زنبور در سلول های سرطانی در شرایطin vitro, in vivo در پژوهش هایی توسط سایر محققین گزارش شده است. Jang و همکاران (21) در یافتند که زهر زنبور موجب القا آپوپتوزیس در سلول های سرطان ریه NCI-H1299 شده و این عمل  از طریق مهار بیان  COX2صورت می‏گیرد.

Moon و همکارانش (22) نشان دادند که تیمار سلول‏های لوکمیاییu937  با زهر زنبور،  باعث القا آپوپتوزیس از طریق کاهش بیان چرخه سیگنالینگ AKt,ERK می‏شود. علاوه بر این آپوپتوزیس القا شده با زهر زنبور همراه با کاهش بیان Bcl2، افزایش فعالیت کاسپاز 3 و کلیواژ پلی ADP ریبوز پلیمراز بود. این مطالعات هم چنین نشان داد که زهر زنبور فعالیت       P38-MAPK را  راه اندازی کرده و باعث کاهش بیان AKt,ERK شده و القا آپوپتوزیس نقش مهمی در فعالیت ضد توموری زهر زنبور دارد. Orsolic و همکارانش (23) زهر زنبور را بر روی سلول‏های کارسینومای پستانی در شرایط in vitro اثر داده و با استفاده از آزمون MTT دریافتند که زهر زنبور در زمان 24،48،72 ساعت در دوزهای 15/2 و 43/1 میکرو گرم بر میلی گرم موجب 50 درصد مرگ و میر سلول‏ها می‏شود. همچنین آنالیز فلوسیتومتری annexin نشاندار با فلورسئین و پروپودیوم یداید تکثیر این سلول‏ها را 3 ساعت بعد از تیمار این سلول‏ها با دوز 85/2 میکرو گرم بر میلی‏لیتر حدود 50 درصد آپوپتوزیس نشان داد .Hong و همکاران (24) نیز زهر زنبور را بر روی سلول‏های فیبروبلاست سینوویال اثر داده و نشان دادند که زهر زنبور در دوز 10 میکرو گرم بر میلی لیتر به صورت وابسته به دوز و زمان موجب القا اثرات سمی و فعال کردن چرخه مرگ آپوپتوزیس با کاهش بیان Bcl2، افزایش بیان bax و کاسپاز 3 در این سلول‏ها می شود.

Putz  و همکارانش (25) اثبات کردند که همکاری بین اثر هم افزایی زهر زنبور بر روی فسفولیپاز  A2 و فسفاتیدیل اینوزیتول 3و4 بیس فسفات در مهار تکثیر تومور کاراتر از تاثیر هر یک به تنهایی است. Cho و همکاران (26) سلول های MCF-7 القا شده توسط PMA را در معرض زهر زنبور قرار داده و دریافتند که زهر زنبور با غلظت 5 -3 میکرو گرم بر میلی‏لیتر، تهاجم و مهاجرت سلول‏ها را مهار و بیان متالوپروتئیناز 9 را که مرتبط با متاستاز است از طریق مهار چرخه های سیگنال رسانی p38MAPK,JNK سرکوب نموده است. محسنی کوچصفهانی و همکاران (27) اثر القا کننده تمایز توام زهر زنبور و 1و 25 دی هیدروکسی ویتامین D3 را بر روی سلول‏های HL60 بررسی کرده و نشان دادند که زهر زنبور به تنهایی و با غلظت  5/2 میکرو گرم بر میلی لیتر مهار کننده تکثیر بوده اما در ترکیب با 1و 25 دی هیدروکسی ویتامین D3 تمایز به سمت مونوسیت را در این سلول‏ها القا خواهد کرد. پریور و همکاران (28) نیز  اثر هم افزایی زهر زنبور و ال ترانس رتینوئیک اسید را بر روی مهار تکثیر و القای تمایز سلول های HL60 بررسی کرده و دریافتند که زهر زنبور به صورت وابسته به غلظت و زمان در غلظت‏های بالاتر از 5 میکرو گرم بر میلی‏لیتر موجب القا مرگ سلولی می‏شود اما نوع مرگ سلولی را در این سلول‏ها مشخص نکردند.

داده‏های حاصل از فلوسیتومتری با استفاده از annexinV  به عنوان یک مارکر آپوپتوزیس در این آزمایش نشان داد که نوع مرگ سلولی القا شده توسط زهر زنبور بر روی سلول‏های HL60   آپوپتوزیس بوده و50 درصد این سلول‏ها در دوز 12 میکرو گرم بر میلی‏لیتر از زهر زنبور در زمان 24 ساعت دچار مرگ سلولی آپوپتوزیس شدند. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که زهر پاییزه سمنان در غلظت های بالاتر اثر مهار تکثیر بر روی سلول‏های HL60 داشت. رنگ آمیزی هوخست نیز تغییر مورفولوژیک آپوپتوزیس (اجسام آپوپتوزی) را در گروه تیماری با دوزهای بالاتر نشان داد.

 

نتیجه گیری

بر اساس نتایج این آزمایش، زهر زنبوری که در فصل پاییز و از منطقه سمنان تهیه شده است، در غلظت‏های پایین تر از 12 میکرو گرم بر میلی‏لیتر در طی 24 و 48 ساعت تیمار اثر مهارکننده تکثیر وابسته به غلظت و زمان داشته و در غلظت 12 میکرو گرم بر میلی‏لیتر (24 و 48 ساعت تیمار) موجب 50 درصد مهار تکثیر سلول‏های سرطانیHL60 و القای مرگ از نوع آپوپتوزیس در این سلول‏ها می‏شود. در نتیجه اثر القا کنندگی آپوپتوزی زهر زنبور بر روی این رده سلولی می‏تواند نوید دهنده باشد که از آن به عنوان دارو در درمان سرطان استفاده شود. لذا پیشنهاد می شود که با شناسایی مسیر راه اندازی آپوپتوزیس تحت تاثیر زهر زنبور بتوان آن را به تنهایی یا در کنار سایر داروها در درمان سرطان به کار برد.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد و در مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی و آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی به انجام رسیده است. از این رو از ریاست محترم دانشکده علوم زیستی ، مدیر محترم گروه زیست شناسی دانشگاه خوارزمی، معاونت محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد جهت تحقق این طرح و از همکاری جناب آقای دکتر ایمانی جهت تامین زهر زنبور عسل و از مرکز سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی تهران جهت مساعدت در انجام فلوسیتومتری  صمیمانه سپاسگزاری می‏گردد.

1. Peiren N, Vanrobaeys F, Graf DC, Devreese B, et al. The protein composition of honey bee venom reconsidered by a proteomic approach. Biochemical Biophysical. 2005; 1752:1-5.

2. Park HJ, Lee SH, Son DJ, Oh KW, et al. Antiarthritic effect of bee venom:inhibition of inflammation mediator generation by suppression of NF-kappaB through interaction with the p50 subunit. Arthiritis and Rheumatism. 2004; 50: 3504-3515.  

3. Holle L, Song W, Holle E, Wen Y, et al. Amatrix metalloproteinase 2 cleavable melittin/avidin conjugates specifically targets tumor cells in vitro and in vivo. International Journal of Oncology. 2003; 22(1): 93-98.

4. Terra RM, Guimaraes JA, Verli H. Structural and functional behavior of biologically active monomeric melittin. Molecular graphics and modeling. 2007; 25(6): 767-72.

5. Son DJ, Ha SJ, Song HS, Lim Y, et al. Melittin inhibits vascular smooth muscle cell proliferation through induction of apoptosis via suppression of nuclear factor-κB and Akt activation and enhancement of apoptotic protein expression. Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2006; 317(2): 627-34.

6. Chen YQ, Zhu ZA, Hao YQ, Dai KR, et al. Effect of melittin on apoptosis and necrosis of U2 OS cells.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2004; 2(3): 208-209.

7. Rahman KM, Sarkar FH, Banerjee S, Wang Z, et al. Therapeutic intervention of experimental breast cancer bone metastasis by indole-3-carbinolin SCID-

 

human mouse model. Molecular Cancer Therapeutics. 2006; 5:2747-2756.

8. Bhupathi P, Chetty C, Kunigal S, Vanamala SK, et al. Blockade of tumor growth due to matrix metalloproteinase-9 inhibition is mediated by sequential activation of beta-1 integrin,ERK and NF-kappaB. Journal of Biological Chemistry. 2008; 283: 1545-1552.

9. Russell PJ, Hewish D, Carter T, Sterling LK, et al. Cytotoxic properties of immunoconjugates containing melitin-like peptide aganst prostat cancer:in vitro and in vivo studies.Cancer Immunology. 2004; 53(5): 411-421.

10. Son DJ, Leea JW, Leea YH, Songb HS, et al. Therapeutic application of anti-arthritis, pain-releasing, and anti-cancer effects of bee venom and its constituent compounds. Pharmacology and Therapeutics. 2007; 115 (2): 246-70.

11. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer.Cell. 2000; 100: 57-70.

12. Gerl R, Vaux DL. Apoptosis in yhe development and treatment of cancer. Oxford journal carcinogenesis. 2004; 26(2): 263-270.

13. Zelent A, Guidez F, Melnick A, Waxman S, et al. Translocations of the RARa gene in acute promyelocytic leukemia. Oncogene.  2001; 20: 7186 –7203.

14. Ratanachoo K, Gascoyne PRC,  Ruchirawat M. Detection of cellular responses to toxicants by dielectrophoresis. . Biochim Biophys Acta. 2002; 1564 (2): 449–458.

15. Liu X, Chen D, Xie L, Zhang R. Effect of honey bee venom on proliferation of K1735M2 mouse melanoma cells in vitro. Pharm Pharmacological. 2002; 54 (8): 1083-1089.

16. Hu H, Chen D, Li Y, Zhang X. Effect of polypeptides in bee venom on growth inhibition and apoptosis induction of the human hepatoma cell line SMMC-7721 in-vitro and Balb/c nude mice in-vivo. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2006; 58 (1): 83-89.

17. Hamedani M, MirshafieyA, Vatanpour H, Khorramizadeh MR, et al. In vitro assessment of Bee Venom effects on Matrix Metelloproteinase Activity and Interferon Production. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology. 2005; 4:1-6.

18. Romijn JC, Verkoelen CF, Schroeder FH. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines invitro. The prostate. 2006; 5;12(1): 99-110.

19. Wilkins RC, Kutzner BC, Troung M, Sanchez-Dardon J, et al. Analysis of radiation –induced apoptosis in human lymphocyte:Flowcytometery using Annexin V and propodium iodide versus the neutral commet assay. Cytometery. 2002; 48(1):14-19.

20. Chu ST, Cheng HH, Huang CJ, Chang HC, et al. Phospholipase A2-independent Ca entry and subsequent apoptosis induced by melittin in human MG63 osteosarcoma cells. Life Science. 2007; 80: 364-369.

21. Jang MH, Shin MC, Sabina LS, Han SM, et al. Bee venom induces apoptosis and inhibits expression of cyclooxygenase-2 mRNA in human lung cancer cell line NCI-H1299. Pharmacology  Science. 2003; 91: 95 –104.

22. Moon DO, Park SY, Heo MS, Kim KC, et al. Key regulators in bee venom-induced apoptosis are Bcl-2 and caspase-3 in human leukemic U937 cells through downregulation of ERK and Akt. Immunopharmacology. 2006; 6(12): 1796–1807.

23. Orsolić N, Sver L, Verstovsek S, Terzić S, et al. Inhibition of mammary carcinoma cell proliferation in vitro and tumor growth in vivo by bee venom. Toxicon. 2003; 41(7): 861-70.

24. Hong SJ, Rim GS,Yang HI,Yin CS, et al. Bee venom induces apoptosis through caspase3 activation in synovial fibroblast of patient with rheumatoid arthritis.Toxicon. 2005; 46(1): 39-45.

25. Putz T, Ramoner R, Gander H, Rahm A, et al. Antitumor action and immune activation through cooperation of bee venom secretory phosoholipase A2 and phosphatidylinositol (3,4) bisphosphate. Cancer Immunological Immunotherapy. 2006; 55(11): 1374-1383.

26. Cho HJ, Jeong YJ, Park KK,ParkYY, et al. Bee Venom suppressPMA-mediated MMP-9 gene activation via JNK/p38 and NF-kB dependent mechanism. Journal of Ethnopharmacology. 2010; 127: 662-668.

27. Mohseni Kouchesfehani H, Parivar K, Nabiuni M, Rahimi M. Effect of Honey Bee Venom and 1,25 di hidroxy D3 on Differentiation induction of promyelocytic HL-60 Cell Line. Hamedan medical science. 2009; 16(4):5-12.[Persian]

28. Parivar K, Nabiuni M, Jalali H, Nadali F. Effect of Honey Bee Venom and All-trans Retinoic Acid on   Proliferation and Differentiation of HL-60 Cell Line. Rafsanjan Medical Science, 2010; 10(2): 112-126. [Persian]