تاثیر ضد باکتریایی اسانس سیر و رزماری بر برخی از پاتوژن‏های اصلی ورم پستان در گاو شیری

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسنده

دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، کدپستی 8349-8-38156

-

چکیده

هدف: در این پژوهش خواص ضد باکتریایی اسانس 2 گیاه رزماری و سیر بر روی باکتری‏های استافیلوکوکوس آرئوس، اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس آگالاکتیه در درصد غلظت‏های مختلف  مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: اسانس‏ها از گروه گیاهان دارویی و معطر دانشگاه اراک تهیه گردید. با غلظت‏های 10، 30 و 50 درصد از اسانس‏های سیر و رزماری خاصیت ضد باکتریایی به‏روش انتشار در آگار به‏کمک دیسک بررسی شد. حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی نیز با استفاده از درصد غلظت‏های مختلف اسانس‏ها تعیین شد. برای تعیین فعالیت ضد باکتریایی آنتی بیوتیک‏های پنی‏سیلین، باسیتراسین و اریترومایسین از دیسک‏های آماده که آغشته با این آنتی بیوتیک‏ها بودند بر روی محیط کشت باکتری‏ها استفاده شد.
نتایج: تمام غلظت‏های این اسانس‏ها (10، 30 و 50 درصد) دارای اثر ضد میکروبی بودند و تاثیر اسانس‏ها با کم شدن غلظت آن‏ها در دیسک کم شد. حداقل غلظت مهاری و کشندگی بین دو اسانس سیر و رزماری تفاوت چشمگیری وجود نداشت. همچنین مقایسه میانگین هاله عدم رشد بین آنتی بیوتیک‏های مورد بررسی (پنی‏سیلین، باسیتراسین و استرپتومایسین) و اسانس‏ها در غلظت 10 درصد نشان داد بین آنتی بیوتیک‏ها و اسانس‏ها تفاوت معنی‏دار وجود داشت.
نتیجه‏گیری: اسانس‏های سیر و رزماری با توجه به دارا بودن اثرات آنتی باکتریایی بر علیه باکتری‏های اصلی مولد ورم پستان می‏توانند کاندیداهای مناسبی به‏منظور جایگزین آنتی بیوتیک‏ها در درمان ورم پستان در گاو باشند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

هر ساله درصد کشورهائی که در مبارزه با عوامل باکتریایی بیماری ورم پستان به مشکل مقاومت آنتی بیوتیکی برخورد می‏کنند رو به افزایش است. استفاده نادرست و پیوسته از آنتی‏بیوتیک‏ها در بحث پیشگیری و درمان این بیماری منجر به باقی ماندن پسماند دارو در شیر تولیدی شده است (1). تقریبا 80 درصد باقی مانده‏های آنتی‏بیوتیک موجود در شیر، مربوط به درمان‏های ورم پستان، چه در طی دور‏ه‏ی شیردهی و چه در دوره‏ی خشکی است (2). مقاومت داروئی و انتقال آن به انسان (3) از بعد غیر اقتصادی و کاهش تولید شیر (4)، حذف و هزینه‏های جایگزین (5)، مشکلات تولید مثلی (6)، دور ریختن شیر (7)، افزایش نیروی کار (8)، مستعد شدن دام برای ابتلا به سایر بیماری‏ها (9) از بعد اقتصادی عواملی هستند که باعث شده محققین به‏دنبال یافتن ترکیباتی باشند که بتوانند از آن‏ها به‏جای آنتی‏بیوتیک‏ها در درمان ورم پستان استفاده کنند. مواد موثر موجود در گیاهان دارویی به‏دلیل همراه بودن با مواد دیگر پیوسته از یک حالت تعادل بیولوژیک برخوردار هستند و بنابراین در بدن انباشته نشده و اثرات جانبی به بار نمی‏آورند (10) و از این‏رو امتیاز و برتری قابل توجهی نسبت به داروهای شیمیایی دارند و می‏توانند به‏عنوان کاندیدای مناسب جهت جایگزینی آنتی‏بیوتیک‏ها معرفی شوند. اسانس رزماری از ترکیباتی است که خواص ضد میکروبی و آنتی اکسیدانتی آن در بسیاری از موارد به اثبات رسیده است و ترکیبات ضد میکروبی همانند ترکیبات فنولی به‏وفور در آن یافت می‏شود. رزماری دارای ترکیبات فنولی و از جمله کارنوزول، اسید رزمارینیک، اسید کافئیک، فلاوونوئیدها شامل دیوسمین، لوتئولین، ژنکوانین و مونوترپن‏ها مثل کامفور، سینئول و بورنئول می‏باشد (11). ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﻣﻮﺟﻮد در ﺳﻴﺮ ﺑﻪ دو ﮔﺮوه ﻋﻤﺪه ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺳﻮﻟﻔﻮره و ﻏﻴﺮ ﺳﻮﻟﻔﻮره ﺗﻘﺴﻴﻢ ﻣﻲ‏شوند. ﺧﻮاص داروﻳﻲ ﺳﻴﺮ ﻋﻤﺪتا ﺑﻪ‏دﻟﻴﻞ ﺣﻀﻮر ﺗﺮﻛﻴﺐ ﺳﻮﻟﻔﻮرهای ﺑﻪ ﻧﺎم آﻟﻴﺴﻴﻦ ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ (12). حضور ترکیبات آنتی باکتریال در این دو گیاه شرایط لازم برای استفاده از آن‏ها، به‏منظور جایگزین آنتی بیوتیک را فراهم می‏کند. از آنجائی که در بررسی قدرت آنتی باکتریال دو گیاه اسانس قالب بهتری جهت مقایسه می‏باشد (13) و با توجه ضرورت یافتن ترکیبات جایگزین برای آنتی بیوتیک‏ها در درمان ورم پستان به‏منظور مقابله با مقاومت داروئی، این مطالعه با هدف بررسی و مقایسه خاصیت آنتی باکتریایی اسانس دو گیاه سیر و رزماری و برخی آنتی بیوتیک‏ها بر روی باکتری‏های مولد ورم پستان در گاو به انجام رسید.

 

مواد و روش‏ها

تهیه اسانس: اسانس‏ها از گروه گیاهان دارویی و معطر دانشگاه اراک تهیه گردید. غلظت‏های 10، 30 و 50 درصد از اسانس‏های سیر و رزماری مورد بررسی قرار گرفت.

باکتری‏های مورد بررسی: در این مطالعه از سویه‏های باکتریایی استاندارد و بالینی شامل استافیلوکوکوس اورئوسPTCC) 1113), اشریشیاکلی(PTCC 1399) و استرپتوکوکوس آگالاکتیه (PTCC 1768) تهیه شده از مرکز تحقیقات و پژوهش‏های علمی و صنعتی ایران استفاده گردید.

تعیین خاصیت ضد میکروبی اسانس‏های گیاهی و آنتی‏بیوتیک‏ها

روش انتشار در آگار به شیوه بائرکربی(Kirby bauer): از آنجائی‏که در این تکنیک تعداد باکتری تلقیح شده یکی از مهم‏ترین متغیرهایی است که بر نتیجه تحقیق تاثیر می‏گذارد، برای انجام هر آزمون جهت بررسی اثرات ضد باکتری، کشت تازه 24 ساعته تهیه گردید. 24 ساعت قبل از انجام آزمایش از کشت ذخیره به محیط کشت آگار مغذی تلقیح گردید و به‏مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. سپس کلنی‏های سطح محیط کشت با محلول نرمال سالین شسته شده و سوسپانسیون میکروبی با 5 میلی‏لیتر محلول نرمال سالین رقیق شد تا سوسپانسیون یکنواختی از باکتری‏ها مورد نظر به‏دست آمد. لوله‏ها به‏مدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند تا کدورتی مشابه لوله استاندارد نیم مک فارلند ((MacFarLand ایجاد نمایند. به‏نحوی‏که در این حالت غلظت باکتری‏ها درحدود CFU/ml108×1 بود (14). سپس از سوسپانسیون‏های مزبور با استفاده ازسوآب استریل پس از آغشته کردن آن به سوسپانسیون میکروبی، تمام سطح مولر هینتون آگار به‏صورت خطوط موازی در سه جهت (عمودی، افقی، مورب) برهم کشت داده به گونه‏ای که تمام سطح پلیت از یک لایه میکروبی یکنواخت پوشیده شد. دیسک‏های بلانک استریل به‏کمک dispenser روی محیط‏های کشت یافته به فواصل مناسب  و در 3 تکرار قرارداده شد. سپس توسط حلال دی متیل سولفوکساید غلظت‏های 10 درصد، 30 درصد و 50 درصد از اسانس‏ها تهیه و به‏میزان 10 میکرولیتر بر روی دیسک‏های استریل ریخته شد سپس پلیت را برگردانده، کشت‏های باکتریایی در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 24 ساعت در شرایط هوازی انکوبه و پس از گذشت مدت زمان لازم، پلیت‏ها را روی یک سطح تیره که نور را منعکس نمی‏کند قرار داده و در حضور نور مناسب قطر هاله‏های ایجاد شده توسط کولیس اندازه گیری و نتایج قطر هاله عدم رشد برحسب میلی‏متر ثبت گردید (15). به‏منظور تعیین فعالیت ضد باکتریایی آنتی بیوتیک‏های پنی‏سیلین،  باسیتراسین و استرپتومایسین از دیسک های آماده که آغشته با این آنتی بیوتیک‏ها (شرکت پایادارو) بودند بر روی محیط کشت باکتری‏ها استفاده شد و بقیه مراحل کار مشابه با اسانس‏ها بود.

تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC): جهت انجام آزمایشات کمی برای تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC=Minimal Inhibitory Concentration) و حداقل غلظت کشندگی (MBC=Minimal Bacteriocidal Concentration) اسانس‏ها غلظت‏های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 درصد درمحیط مولر هینتون براث تهیه گردید. سپس به‏هرکدام از غلظت‏‏ها به‏ازای هر میلی‏لیتر محیط مایع،CFU/ml 106×1 باکتری فعال اضافه گردید. علاوه بر این، ازکنترل مثبت (محیط کشت حاوی باکتری بدون عصاره) وکنترل منفی (محیط کشت بدون باکتری) استفاده گردید. در نهایت لوله‏ها به‏مدت 24 ساعت در 37 درجه  سانتی‏گراد انکوبه و سپس نتایج قرائت گردید. برای هرکدام از اسانس‏ها آخرین رقتی که در آن هیچ‏گونه کدورتی مشاهده نگردید (عدم رشد) به‏عنوان MIC در نظرگرفته شد و از تمام لوله‏های بدون کدورت بر روی محیط مولر- هینتون آگار کشت داده شد. پس از گذشت  24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‏گراد آخرین غلظتی از اسانس‏ها که قادر به مرگ 99 درصد از باکتری‏های زنده اولیه بود به‏عنوان  MBCدر نظرگرفته شد (15).

تجزیه و تحلیل داده‏ها: به‏منظور تجزیه و تحلیل داده‏ها از رویه آنالیز واریانس با در نظر گرفتن اثر تیمار به‏عنوان اثر ثابت استفاده شد. طرح مورد استفاده طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار در هر تیمار بود. مدل مورد استفاده

Yij= µ+ TI+ eij

Yij: قطر هاله عدم رشد برای تیمار i ام در تکرار  jام

µ: میانگین کلی قطر هاله عدم رشد

TI: اثر تیمار iام (اسانس یا آنتی بیوتیک)

eij: خطای آزمایشی

مقایسات میانگین در این مطالعه شامل بررسی تفاوت میانگین قطر هاله عدم رشد برای غلظت‏های مختلف هر اسانس بود که با روش توکی مورد محاسبه قرار گرفت و نیز تفاوت میانگین قطر هاله عدم رشد برای غلظت های مختلف بین اسانس‏های مختلف با آزمون t انجام شد.

 

نتایج

مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری‏های مورد بررسی در غلظت‏های مختلف اسانس، برای هر اسانس به‏طور جداگانه و بین اسانس‏ها در هر باکتری، میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری‏ها در آنتی بیوتیک‏های مختلف و نیز مقادیر MIC و MBC برای دو اسانس مورد بررسی در باکتری‏های مد نظردر جداول مربوط به‏هرکدام آورده شده است.  

اثر اسانس بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس (Staphylococcus aureus)

در غلظت 50 درصد بین دو اسانس سیر و رزماری تفاوت معنی‏دار وجود نداشت و اسانس سیر کمترین میزان تاثیر را نشان داد. در 10 درصد (002/0p<) و درصد30 (007/0p<) تفاوت معنی‏دار بین دو اسانس مشاهده شد که در این بین رزماری در هر دو حالت اثر آنتی باکتریال قوی‏تری نشان داد (جدول 1). از طرفی نتایج تجزیه واریانس میانگین قطر هاله عدم رشد برای غلظت‏های مختلف هر اسانس نشان داد که برای اسانس رزماری تنها تفاوت معنی‏دار بین غلظت10 با غلظت 50 درصد قابل مشاهده بود (01/0p<). در مورد سیر بین هر 3 غلظت مورد بررسی  تفاوت معنی‏دار وجود داشت (01/0p<). در هر دو اسانس مورد بررسی با افزایش غلظت اسانس اثر آنتی‏باکتریایی افزایش یافت (جدول 2).

 

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد استافیلوکوکوس آرئوس بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف بین اسانس‏های مورد بررسی

استافیلوکوکوس آرئوس

غلظت (درصد)

 10 درصد

30 درصد

50 درصد

رزماری

a33/0±66/9

a33/0±66/10

a33/0±33/11

سیر

b16/0±16/7

b16/0±83/8

a5/0±5/10

*آزمون مورد استفاده: آزمون t         * داده‏ها به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند        * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند

 

جدول 2: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری‏های مورد بررسی بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف اسانس‏ها

رزماری

سیر

غلظت (درصد)

باکتری

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

 

استافیلوکوکوس اورئوس

نسبتا فعال

6/9±57/0a

10

9

نسبتا فعال

16/7±28/0a

5/7

7

10 درصد

نسبتا فعال

66/10±57/0b

11

10

نسبتا فعال

83/8±28/0b

9

5/8

30 درصد

فعال

33/11±33/0b

12

11

نسبتا فعال

5/10±86/0c

11.5

10

50 درصد

*آزمون مورد استفاده: آنالیز واریانس  * داده‏های قطر عدم هاله رشد به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند  * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند

 


اثر اسانس بر روی باکتری اشرشیاکلی (Escherichia coli)

به‏جز غلظت 10 درصد بین دو غلظت دیگر تفاوت معنی‏دار بین اسانس سیر و رزماری مشاهده شد (003/0p<). در هر دو حالت رزماری اثر آنتی باکتریال قوی‏تری از خود نشان داد (جدول 3). مقایسه میانگین، میانگین غلظت‏های مختلف هر اسانس نشان داد در غلظت 10 درصد، اسانس رزماری با هر کدام از غلظت‏های 30 درصد (001/0p<) و 50 درصد (001/0p<) تفاوت معنی‏دار داشت ولی بین غلظت‏های 30 و 50 درصد تفاوت معنی‏دار مشاهده نشد. در مورد اسانس سیر بین هر 3 غلظت مورد بررسی تفاوت معنی‏دار مشاهده شد (0001/0p<) (جدول 4).


 

جدول 3: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد اشرشیاکلی بر حسب میلی متر در غلظت‏های (درصد) مختلف بین اسانس‏های مورد بررسی

اشرشیاکلی

غلظت (درصد)

10 درصد

30 درصد

50 درصد

رزماری

a28/0±5/7

a16/0±66/12

a28/0±14

سیر

a16/0±66/7

b16/0±83/9

b16/0±66/11

 *آزمون مورد استفاده: آزمون t        * داده‏ها به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند          * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند

 

جدول 4: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری های مورد بررسی بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف اسانس‏ها

رزماری

سیر

غلظت (درصد)

باکتری

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

 

اشرشیاکلی

نسبتا فعال

5/7±5/0a

8

7

نسبتا فعال

66/7±28/0a

8

5/7

 0درصد

فعال

66/12±28/0b

13

12.5

نسبتا فعال

83/9±28/0b

10

5/9

30 درصد

فعال

14±5/0b

14.5

13.5

فعال

66/11±28/0c

12

5/11

 50 درصد

*آزمون مورد استفاده: آنالیز واریانس  * داده‏های قطر عدم هاله رشد به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند  * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند


اثر اسانس بر روی باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه (streptococcus agalactie)

در غلظت‏های 10 درصد و 30 درصد اسانس‏های رزماری و سیر تفاوت معنی‏داری با یکدیگر نداشتند. در غلظت 50 درصد بین هر دو اسانس تفاوت معنی‏دار مشاهده گردید (009/0p<)  و در این میان قدرت آنتی باکتریایی به‏ترتیب متعلق به رزماری و سیر بود (جدول 5). نتایج تجزیه واریانس میانگین قطر هاله عدم رشد برای غلظت‏های مختلف هر اسانس نشان داد که در هر دو اسانس بین 3 غلظت مورد بررسی تفاوت معنی‏دار وجود داشت (05/0p<) و با افزایش غلظت قدرت آنتی باکتریایی افزایش یافت (جدول 6).

 

جدول 5: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد استرپتوکوکوس آگالاکتیه بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف بین اسانس‏های مورد بررسی

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

غلظت (درصد)

10 درصد

30 درصد

50 درصد

رزماری

a16/0±83/7

a33/0±33/9

a44/0±1/15

سیر

a33/0±66/7

a16/0±16/10

b5/0±12

*آزمون مورد استفاده: آزمون t                 * داده‏ها به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند      * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند

 

جدول 6: مقایسه میانگین، میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری‏های مورد بررسی بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف اسانس‏ها

رزماری

سیر

غلظت (درصد)

باکتری

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

میزان تاثیر

قطر عدم هاله

حداکثر

حداقل

 

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

نسبتا فعال

83/7±28/0a

8

5/7

نسبتا فعال

66/7±57/0a

8

7

10 درصد

نسبتا فعال

33/9±57/0b

10

9

نسبتا فعال

16/10±28/0b

5/10

10

30 درصد

فعال

16/15±76/.0c

16

5/14

فعال

12±0.86c

12.5

11

50 درصد

*آزمون مورد استفاده: آنالیز واریانس  * داده‏های قطر عدم هاله رشد به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند  * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند


 


حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی

بین MIC و MBC باکتری‏ها در اسانس‏های مورد بررسی تفاوت برجسته‏ای مشاهده نشد و در هر سه باکتری شاخص‏های فوق تقریبا مشابه بود (جدول 7). بررسی اثر آنتی بیوتیک‏های رایج در درمان ورم پستان بر روی باکتری‏های مورد بررسی بیانگر عدم تاثیر پنی‏سیلین و باسیتراسین بر روی استرپتوکوکوس آگالاکتیه بود. اثر آنتی باکتریایی پنی‏سیلین بر روی استافیلوکوکوس آرئوس و اشرشیا کلی در مقایسه با دو اسانس دیگر قوی‏تر بود به‏طوری‏که میانگین قطر هاله عدم رشد در این مورد از دو آنتی‏بیوتیک دیگر بیشتر بود. همچنین مقایسه میانگین هاله عدم رشد بین آنتی بیوتیک‏ها و اسانس‏ها در غلظت 10 درصد نشان داد بین آنتی‏بیوتیک‏ها و اسانس‏ها تفاوت معنی‏دار وجود دارد (05/0p<) (جدول 8). به‏طوری‏که در بعضی باکتری‏ها برخی آنتی بیوتیک‏ها اثر مهار کنندگی بیشتر و در مواقعی اسانس‏ها اثر مهار کنندگی بیشتر داشتند. نتایج در جدول 9 آورده شده است.


جدول 7: حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس‏های مورد بررسی بر روی باکتری‏های استافیلوکوکوس آرئوس، اشرشیاکلی، استرپتوکوکوس آگالاکتیه

 

 

رزماری

سیر

استافیلوکوکوس آرئوس

غلظت  MIC (درصد)

8 درصد

7 درصد

غلظت  MBC(درصد)

9 درصد

9 درصد

اشرشیاکلی

غلظت  MIC (درصد)

9 درصد

7 درصد

غلظت  MBC(درصد)

9 درصد

8 درصد

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

غلظت  MIC (درصد)

8 درصد

7 درصد

غلظت  MBC(درصد)

10 درصد

9 درصد

جدول 8: مقایسه غلظت 10 درصد بین اسانس‏ها و آنتی بیوتیک‏ها در باکتری‏های مورد بررسی

 

 

سیر

رزماری

پنی‏سیلین

باسیتراسین

استرپتومایسین

غلظت 10درصد

استافیلوکوکوس اورئوس

16/7±28/0b

6/9±57/0c

48e

0a

19d

اشرشیاکلی

6/7±28/0a

5/7±5/0a

46d

19c

11b

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

66/7±57/0b

83/7±28/0b

0a

0a

22c

*آزمون مورد استفاده: آنالیز واریانس  * داده‏های قطر عدم هاله رشد به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند  * حروف غیر مشابه معنی‏دار می‏باشند

 

جدول 9: جدول آنالیز واریانس میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری‏های مورد بررسی بر حسب میلی‏متر در غلظت‏های (درصد) مختلف اسانس‏ها

 

 

میانگین غلظت  10 درصد

میانگین غلظت 30 درصد

میانگین غلظت 50 درصد

p-Value

استافیلوکوکوس اورئوس

سیر

16/7±28/0

83/8±28/0

5/10±86/0

001/0

رزماری

6/9±57/0

66/10±57/0

33/11±33/0

03/0

اشرشیاکلی

سیر

66/7±28/0

83/9±28/0

66/11±28/0

0001/0

رزماری

5/7±5/0

66/12±28/0

14±5/0

0001/0

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

سیر

66/7±57/0

16/10±28/0

12±86/0

0004/0

رزماری

83/7±28/0

33/9±57/0

16/15±76/0

0001/0

 * داده‏های قطر عدم هاله رشد به‏صورت انحراف معیار± میانگین می‏باشند 

 

بحث

نتایج به‏دست آمده از میانگین قطر هاله عدم رشد اسانس‏های مورد بررسی نشان از تفاوت اثر آنتی باکتریایی آن‏ها داشت. علاوه بر این نتایج مقایسه میانگین غلظت‏های مختلف هر اسانس نشان داد در کل با افزایش غلظت اسانس خاصیت آنتی باکتریایی افزایش می‏یابد. در هر 3 باکتری مورد بررسی اسانس رزماری بالاترین اثر آنتی باکتریایی را دارا بود. از مقایسه نتایج این‏گونه برداشت می‏شود که اسانس رزماری ذاتا خاصیت آنتی‏باکتریایی بالاتری دارد. تفاوت مشاهده شده می‏تواند به‏دلیل نوع و میزان ترکیبات موثره موجود در این اسانس در مقایسه با اسانس سیر باشد. ترکیبات موثره موجود در اسانس سیر بنا برگزارشات آلیسین با نام شیمیائی sulfoxide s-methyl-l-cystein و مواد موثره غالب رزماری تری‏سیکلن و سینئول و کامفور می‏باشند (16). نتایج آنالیز واریانس برای اسانس رزماری نشان داد تنها تفاوت معنی‏دار بین غلظت 10 با غلظت 50 درصد مشاهده شد. در مطالعه سوکووایس و همکاران میانگین قطر هاله عدم رشد برای سینئول و کامفور به ترتیب برابر 18 و 18 میلی‏متر به‏دست آمد (17). تحقیقاتی که توسط Angioni و همکارانش بر روی اثرات روغن های ضروری یک نمونه رزماری (Sardinian rosmary) انجام شد نشان داد که این نوع رزماری اثرات بازدارندگی قابل توجهی بر روی باکتری‏های بیماری‏زای مهم نظیر استافیلوکوکوس آرئوس و اشرشیاکلی ندارد در صورتی‏که محققین دیگر اثرات بازدارنده نمونه دیگری از رزماری (Argentinian rosmary) را بر روی قارچ‏ها گزارش کردند (18). همچنین Okoh و همکاران (18) آزمایشی را بر روی اثرات ضد باکتریایی رزماری انجام دادند که نتیجه آن نشان داد اسانس روغنی گیاه رزماری در محدوده غلظتی معین دارای اثر آنتی باکتریایی است. در مورد سیر بین هر 3 غلظت مورد بررسی تفاوت معنی‏دار وجود داشت. نتایج این آنالیز نشان می‏دهد که با افزایش غلظت اسانس اثر آنتی‏باکتریایی هم افزایش یافته است. این امر به دلیل افزایش میزان غلظت مواد موثره است که با افزایش غلظت اسانس میزان آن‏ها افزایش می‏یابد. نتایج این بررسی نشان داد از میان گیاهان مورد بررسی پاسخ اسانس سیر به افزایش غلظت اسانس بیشتر از اسانس رزماری می‏باشد. علی‏رغم اینکه آلیسین دارای اثرات آنتی باکتریایی هم بر علیه باکتری‏های گرم مثبت و منفی می‏باشد دلایل احتمالی این امر می‏تواند یکی کم بودن مواد موثره تاثیر گذار بر روی باکتری‏های مورد بررسی و دیگری اثر پذیری کم ترکیبات موثره اسانس سیر در مقایسه با اسانس رزماری باشد. آلیسین ماده موثره اصلی سیر می باشد و سایر ترکیبات موثره آن dialildisulphide و dialiltrisulphide می‏باشند. در یک بررسی صورت گرفته بر روی خاصیت ضد میکروبی آلیسین میانگین قطر هاله عدم رشد در غلظت 250 میکروگرم در میلی‏لیتر حدودا 25 میلی‏متر بود. در غلظت 1000 میکروگرم در میلی‏لیتر میانگین قطر 38 میلی‏متر به‏دست آمد (19). در مطالعه صورت گرفته توسط Benkeblia (20) میانگین قطر هاله عدم رشد برای غلظت‏های 50، 100، 200، 300 و 500 میلی‏لیتر در لیتر اسانس سیر بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس بعد از 48 ساعت برابر 3/6، 6/7، 9/7، 5/8 و 3/9 میلی‏متر بود که با افزایش غلظت اثر آنتی‏باکتریایی افزایش نشان داد. در مطالعه حاضر نیز با افزایش غلظت اسانس اثر آنتی‏باکتریایی افزایش یافت با این وجود میانگین قطر هاله عدم رشد در مطالعه حاضر بیشتر از مطالعه فوق به‏دست آمد. در مطالعه Durairaj و همکاران (21) که به بررسی اثرات آنتی باکتریایی عصاره سیر در غلظت های 10، 25، 50 و 100 درصد پرداخته شد مشاهده شد غلظت 10 درصد فاقد تاثیر بر روی باکتری‏های اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس آرئوس بود. میانگین قطر هاله عدم رشد برای باکتری استافیلوکوکوس آرئوس و اشرشیاکلی در غلظت های 25، 50 و 100 درصد به ترتیب برابر 8، 16، 33 و 10، 16، 33 بود که در مقایسه با نتایج  مطالعه حاضر اثر آنتی‏باکتریایی بیشتر بود. در مطالعه‏ای به‏منظور بررسی اثر آنتی‏باکتریایی عصاره آبی و الکلی سیر بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس و اشرشیاکلی هیچکدام از عصاره‏ها دارای اثر بر روی رشد باکتری‏ها نبودند (22). اختلاف موجود بین نتایج این مطالعه و سایر مطالعات می‏تواند به‏دلیل تفاوت ژنوتیپ گیاه سیر مورد استفاده جهت اسانس‏گیری، اکوسیستم محیط رشد گیاه (اقلیم، دما، ارتفاع از سطح دریا)، شرایط محیطی انجام آزمایش از قبیل PH و دما باشد. رشد و عملکرد گیاهان در اکوسیستم‏ها، تحت تاثیر عوامل مختلفی نظیر نوع گونه، اقلیم منطقه، محیط خاک، ارتفاع از سطح دریا و موقعیت جغرافیائی قرار دارد. هر یک از این عوامل می‏توانند تاثیر بسزائی بر کمیت و کیفیت محصول و مواد استحصالی از آن‏ها داشته باشند (23). بر طبق گزارش حبیبی و همکاران (23) بر روی آویشن وحشی منطقه طالقان مقادیر مختلف کربنات با بعضی از مواد موثره رابطه مثبت و بعضی از ترکیبات روغنی با عوامل محیطی همبستگی معنی‏داری داشت. همچنین همبستگی معنی‏داری بین میزان درصد اسانس با مواد ارگانیک خاک وجود داشت. محل رویش بر روی ترکیبات موثره آویشن تاثیر معنی‏دار دارد به‏طوری‏که در مطالعه جاوید نیا در روغن فرار آویشن ماده موثره اصلی کارواکرول و در مرتبه بعد تیمول گزارش شد در حالی‏که در مطالعه خانوی تیمول ماده موثره اصلی و کارواکرول در جایگاه دوم قرار داشت. همچنین غلظت ممانعت از رشد مناسب، روش و حلال مورد استفاده جهت عصاره‏گیری، محیط کشت مورد استفاده جهت کشت‏های میکروبی نوع پاسخ دریافتی را تحت تاثیر قرار می‏دهد (24). در کنار این عوامل فاکتورهای ژنتیکی نیز می‏توانند بر روی مواد موثره تاثیر معنی‏داری داشته باشند. مشاهده شده است که در اسانس پونه ایرانی میزان ترکیب آلفا ترپینه ال 10 الی 20 برابر بیشتر می‏باشد. همچنین مقدار پوله گون در اسانس ایرانی در مقایسه با اسانس پونه در ترکیه 4 برابر کمتر گزارش شده است (25). بخشی از تفاوت موجود بین نتایج مطالعه حاضر با سایر مطالعات علاوه بر ژنوتیپ گیاه مورد استفاده، شرایط اقلیمی رشد گیاه و روش و شرایط محیط کار می‏تواند به‏دلیل نوع قالب به‏کارگیری مواد موثره باشد. در مطالعه‏ای که توسط سکمن و همکاران (26) صورت گرفت با مقایسه خواص ضد باکتریایی عصاره و اسانس گیاه بومادران نشان دادند که خاصیت بازدارندگی اسانس این گیاه بیشتر از عصاره آن می باشد به‏طوری‏که 8 میکرولیتر از اسانس در هر دیسک کلیه پاتوژن‏های مورد بررسی را کاملا کنترل نمود در حالی‏که 84 میکروگرم از عصاره اتانولی در هر دیسک نتوانست کلیه پاتوژن‏ها را کنترل نماید، همچنین خاصیت ضد میکروبی اسانس و عصاره‏های آبی و متانولی گونه sintenisii با هم مقایسه شد. این تحقیق بر روی 12 سویه باکتری انجام گرفت. در پژوهش مذکور هیچ فعالیت ضد میکروبی در عصاره آبی مشاهده نشد در حالی‏که در عصاره الکلی و اسانس این گونه از بومادران دارای میزان قابل قبولی از خاصیت ضد میکروبی بودند. در مطالعه حاضر مواد موثره در قالب اسانس به‏کار برده شدند در حالی‏که در برخی مطالعات این قالب به‏صورت عصاره آبی، عصاره الکلی، عصاره سرد و گرم بود. Muhamed Mubarak و همکاران (27) در مطالعه‏ای که بر روی اثر آنتی‏باکتریایی عصاره آبی و متانولی چند گیاه داروئی بومی تایلند بر روی باکتری‏های مولد ورم پستان منجمله اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه داشتند تفاوت اثر آنتی باکتریایی عصاره آبی با متانولی را گزارش نمودند به‏طوری‏که اثر آنتی‏باکتریایی عصاره متانولی بیشتر از عصاره آبی بود و بعضا عصاره آبی برخی گیاهان فاقد اثر آنتی‏باکتریایی بود. در مطالعه ای دیگر توسط این محققین (28) نتیجه مشابه با دسته‏ی دیگر از گیاهان داروئی منطقه تایلند به‏دست آمد و در آن خاصیت آنتی‏باکتریایی عصاره متانولی بیشتر از عصاره آبی بود. همچنین در هر عصاره بین غلظت‏های مختلف تفوت معنی‏دار مشاهده گردید. در مطالعه Chukwu (29) عصاره های اتانولی و عصاره‏های سرد و گرم آبی سیر بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس و اشرشیاکلی بررسی شد. عصاره الکلی باعث مهار هر دو باکتری شد. عصاره گرم آبی بر روی هیچکدام از باکتری‏ها اثر نداشت در حالی‏که عصاره سرد آبی بر روی باکتری استافیلوکوکوس دارای اثر ولی بر روی اشرشیاکلی فاقد اثر بود. در مطالعه‏ای که به‏منظور بررسی اثرات آنتی‏باکتریایی سیر بر روی باکتری‏های مولد ورم پستان در گاو توسط Safi thria (3) انجام شد نتایج نشان داد که در غلظت‏های بالاتر عصاره‏های آبی سیر اثرات مهاری بر روی باکتری‏های اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه بیشتر است. فعالیت ضد باکتریایی غلظت 10 درصد عصاره آبی سیر بر روی باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه بیشتر از اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس آرئوس بود. هیچ اثر مهاری از عصاره اتانولی سیر بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس مشاهده نشد.  فعالیت ضد میکروبی 10 درصد عصاره اتانولی سیر بر علیه استرپتوکوکوس آگالاکتیه بیشتر از اشرشیاکلی بود.

نتایج به‏دست آمده از MIC و MBC در این مطالعه مشابه با نتایج میانگین قطر هاله عدم رشد تفاوت هائی با نتایج سایر مطالعات گزارش شده داشت. علت تفاوت‏های موجود مشابه با مواردی می‏باشد که در مورد میانگین قطر هاله عدم رشد پیشتر توضیح داده شد. در مطالعه Deresse Daka (30)، MIC عصاره سیر بر روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس  5/7 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد. اثر اسانس آویشن شهر موروکو بر روی باکتری گرم منفی اشرشیاکلی با MIC، 33/0 میلی‏گرم در میلی‏لیتر بیشتر از باکتری های گرم مثبت استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس و استافیلوکوکوس اپی‏درمیس با MIC، به ترتیب  33/1، 67/2 و 33/1 میلی‏گرم در میلی‏لیتر بود (31). بر اساس گزارش  Safi thria(3) عصاره آبی سیر بر روی باکتری‏های گرم منفی دارای حداقل غطلقت مهاری 6 تا 11 میلی‏گرم در میلی لیتر و برای باکتری‏های گرم مثبت دارای حداقل غلظت مهاری 7 تا 21 میلی‏گرم در میلی‏لیتر در انسان می‏باشد. در مطالعه Durairaj (21)، MIC عصاره آبی سیر بر روی باکتری‏های اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیا، پروتئوس میرابلیس و استافلوکوکوس آرئوس به ترتیب   7، 8، 9 و 18 میلی‏گرم در میلی‏لیتر گزارش شد.. Jabar (32) در مطالعه‏ای که  بر روی 3 سویه از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس انجام داد میانگین مقدار MIC عصاره خالص و عصاره حل شده در آب سیر را 37/23 و 23/16 گزارش نمود این مقدار برای 2 سویه باکتری اشرشیاکلی 53/19 و 06/31 میلی‏گرم در میلی‏لیتر به‏دست آمد. این نتایج نشان داد که در سویه‏های مختلف یک باکتری مقدار MIC و MBC متفاوت خواهد بود که بخشی از تفاوت نتایج مطالعه حاضر با سایر مطالعات به این دلیل می‏تواند باشد همچنین نوع قالبی که مواد موثره در آن‏ها به‏کار گرفته شدند نیز در نتایج موثر خواهد بود. 

 

نتیجه‏گیری

با توجه به اینکه ورم پستان به‏عنوان یکی از مشکلات بهداشتی بسیار مهم، عامل بیشترین ضرر اقتصادی و مصرف وسیع آنتی‏بیوتیک‏ها در گاوداری‏های شیری است و استفاده از آنتی‏بیوتیک‏ها اگرچه باعث بهبود عملکرد در دام می شود ولیکن در دراز مدت منجر به بروز مشکلات جدی از قبیل پیدایش گونه‏های میکروبی مقاوم در مقابل آنتی بیوتیک‏ها و امکان انتقال این مقاومت به سایر گونه‏ها به‏ویژه در سویه‏های مشترک بین انسان و حیوان‏، باقی ماندن بقایای آن‏ها در محصولات نهائی (شیر و گوشت) و اثرات سوء این مواد بر مصرف کنندگان از جمله برهم زدن تعادل جمعیت میکروبی دستگاه گوارش، خواهد شد نتایج فوق به‏خصوص غلظت‏های بالای اسانس برای حل این مشکل می‏تواند در درمان این بیماری مفید واقع شود. نکته مهمی که از این مطالعه به‏دست می‏آید این است که استفاده از اسانس در بررسی خواص آنتی‏باکتریایی بهتر از فرم عصاره می‏تواند گویای توان بالقوه گیاهان داروئی مختلف در بحث خواص آنتی‏باکتریایی آن‏ها باشد که از این نکته می‏توان در شناخت و گزینش بهتر گیاهان به‏عنوان جایگزین داروهای بی اثر و کم اثر فعلی استفاده کرد.

تشکر و قدردانی

از همکار گرامی جناب آقای حسینی که در تهیه اسانس با اینجانب همکاری کردند، تشکر می نمایم.

  1. Mahzoniye MR, Zahraei salehi MT, Karimi A, Shams N, et al. comparative consideration of herbal cream containing essential oils of peppermint (Mentha spicata) with phenyl Bvtazvn ointment and
 

emollient cream in the treatment of bovine mastitis strength. Journal of Medicinal Plants. 2007; 15: 22-25.

  1. Anderson, BB. Genetic studies on growth, development of conformation, and food utilization in Cattle. Report, national institute of animal science. Copenhagen. 1977; 448:134.
  2. Safi thria M, Bintanga M, Poeloenganb M. Antibacterial Activity of Garlic Extract Against some Pathogenic Animal Bacteria. Media Peternakan. 2011; 155-158.
  3. Zamani F, Babaei M, Fazeli MH, Sharifzade A, et al. Economic Evaluation of subclinical mastitis in dairy herds in esfahan Proceedings of the First Congress on Animal and Aquatic Sciences. 31 August-2 September, Tehran, Iran. 2004:  PP: 1022-1024.
  4. Seegers H, Fourichon C, Beaudeau F. Production effects related to mastitis and mastitis economics in dairy cattle herds. Veterinary research. 2003; 34: 475-491.
  5. Shams M, Farhodimoghadam M, Naseri D, Babaei G, et al. considering of clinical mastitis on reproductive performance of Holstein dairy cows. Journal of Clinical Veterinary Medicine. 2012; 2:104-115.
  6. Østerås O. The cost of mastitis- an opportunity to gain more money. Proceedings of British Mastitis Conference. 2000 (Shepton Mallet); 67-77.
  7. Blosser TH. Economic Losses from and the National Research Program on Mastitis in the United States. Journal of Dairy Science. 1979; 62: 119-127.
  8. Kremer WDJ, Noordhuizen-Stassen EN, Grommers, FJ, Schukken YH, et al. Severity of Experimental Escherichia coli Mastitis in Ketonemic and nonketonemic Dairy Cows.  Journal of Dairy Science. 1993; 76: 3428-3436.
10. Velag, J, Studlla, G. The Medicinal Plants. Persian Translation by Zaman S. 6th Ed. Tehran; Naghsh Iran publication; 2005.

11. Peng Y, Yuan J, Liu F, Ye J. Determination of active components in rosemary by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005; 39: 431-437.

12. Hansel R, Tayler VE. Rational phytotherapy.A physicians` guide to herba medicine. 3 rd ed. Springer, Berlin. 1998; 107-125.

13. Orojalian F, Kasra kermanshahi R. Study of Phytochemical and antibacterial properties of the Achillea eriophora essential oil with Microdilution Method. Journal of Horticultural Science. 2001; 24: 109-115.

14. Soltani nejad SH, Satani mokhtari T, Rahbarian P. The study of antibacterial effect of the essential oil and methanol extracts of ziziphora cliniopodiodes on some pathogenic bacteria. Journal of Microbial Biotechnology. 2010; 2: 1-6.

15. Khosravi A, Malekan MA. Determination of Alcoholic and aqueous extract of Lavender Astvkas on Staphylococcus aureus and other Gram-negative bacteria. The Journal of Qazvin University of Medical Science. 2004; 29: 3-9.

16. Ghanadi AR, Karimzade H, Tavakoli N, Derafsh M, et al. Efficacy of a Combined of Rosmarinus and Lavanda essence in order to Treatment of patients with knee osteoarthritis. Zahedan Journal of Research in Medical Sciences. 2013; 15(6): 29-33

17. Sokovic M, Marin PD, Brkić D, van Griensven LJLD. Chemical Composition and Antibacterial Activity of Essential Oils of Ten Aromatic Plants against Human Pathogenic Bacteria. Global Science Books. 2007.

18. Okoh OO, Sadimenko AP, Afolayan AJ. Comparative evaluation of the antibacterial activities of the essential oils of Rosmarinus officinalis L. obtained by hydrodistillation and solvent free microwave extraction methods. Food Chemistry 2010; 120:308-12.

19. Cutler RR, Wilson P. Antibacterial activity of a new, stable, aqueous extract of allicin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. British journal of biomedical science. 2004; 61(2):71-4.

20. Benkeblia N. Antimicrobial activityof essential oil extracts of various onions (Allium cepa) and garlic (Allium sativum). LWT - Food Science and Technology. 2004; 37: 263–268.

21. Durairaj S, Srinivasan S, Lakshmanaperumalsamy P. in vitro Antibacterial Activity and Stability of Garlic Extract at Different pH and Temperature. Electronic Journal of Biology. 2009; 5. 5-10.

22. Onyeagba RA, Ugbogu OC, Okeke CU, Iroakasi O. Studies on the antimicrobial effects of garlic (Allium sativum Linn), ginger (Zingiber officinale Roscoe) and lime (Citrus aurantifolia Linn). African Journal of Biotechnology: 2004; 3: 552-554.

23. Habibi H, Mazaheri D, Majnoon Hosseini N, Chaeechi MR, et al. Effect of altitude on essential oil and components in wild thyme (Thymus kotschyanus Boiss) Taleghan region. Pajouhesh & Sazandegi. 2006; 73: 2-10.

24. Falahi j, Ebadi MT, Rezvani moghada P, Hedayati M, et al. Comparison of the inhibitory effect of 6 medial plant essential oils with stereptomycin antibiotic on Salmonella. Iranian journal of veterinary. 2010; 6:25-33.

25. Kamkar A. The study of antioxidant activity of essential oil and extract of Iranian Anethum graveloens. The horizon of medical science. 2009; 15: 11-17.

26. Sokmen A, Vardar-Unlu G., Polissiou M, Daferera D, et al. Antimicrobial activity of essential oil and methanol extracts of Achillea sintenisii Hub. Phytoterapy Research. 2003: 17(9):1005-1025.

27. Muhamed Mubarack H, doss A, Dhanabalan R, Venkataswamy R. Activity of some selected medicinal plant extracts against boving mastitis pathogens. Journal of animal and veterinary advance. 2011; 10: 738-741.

28. Muhamed Mubarack H, doss A, Dhanabalan R, Venkataswamy R. In-Vitro Antimicrobial Effects of Some Selected Plants against Bovine Mastitis Pathogens.  Hygeia. Journal for drugs and medicines. 2011; 3: 71 – 75.

29. Chukwu OC, Odu CE, Chukwu ID, Chidozie VN, et al. Carrot (Daucus carrota), garlic (Allium sativum) and ginger (Zingiber officinale) extracts as bacteria selective agents in culture media. African Journal of Microbiology Research. 2012; 6: 219-224.

30. Deresse D. Antibacterial Effect of Garlic (Allium sativum) on Staphylococcu aureus: An in vitro Study. Asian Journal of Medical Sciences. 2010; 2: 62-65.

31. Imelouane B, amhamdi A, wathelet JP, ankit M, et al. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of thyme (thymus vulgaris) from eastern morocco. International Journal Of Agriculture And  Biology 2009: 11 (2), 205-208

32. Jabar MA, Al-Mossawi A. Susceptibility of some multiple resistant bacteria to garlic extract. African Journal of Biotechnology. 2007; 6: 771-776.