بررسی مقایسه‏ای ویژگی‏ها و توانایی تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلول‏های فیبر عدسی چشم

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران

2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست‏شناسی سلولی و مولکولی، تهران، ایران

-

چکیده

هدف: در این مطالعه، اثر تمایزی مایع زجاجیه بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلول‏های شبه فیبر عدسی چشم مورد بررسی قرار گرفته است .
موادو روش‏ها: در این کار تجربی سلول‏های بنیادی از مغز استخوان ران و چربی از ناحیه کشاله ران موش های بالغ NMRI و مایع آمنیوتیک از جنین‏های 13 روزه موش‏های NMRI جدا شده و کشت داده شد. مزانشیمی بودن سلول‏ها با مارکرهای سطحیCD31 وCD90  به روش فلوسیتومتری بررسی شد. سپس سلول‏ها تحت القای زجاجیه چشم گاو به ‏مدت ۱٤ روز با درصدهای مختلف 10، 30،20،15 ، 40 و 50 قرار گرفتند. بیان مارکرهای آلفا کریستالین در نمونه‌های تجربی و کنترل با روش ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفت .
نتایج: آنالیز فلوسایتومتری مارکرهای سطحی نشان داد که سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک و بافت چربی مارکر CD90را (به‏ترتیب 29/29 درصد، 57/0 درصد،82 درصد) بیان می‏کنند. به‏علاوه سلول بنیادی مزانشیمی از هر سه منبع مارکر  CD31  (به‏ترتیب 44/3 درصد، 53/1 درصد، 1/0 درصد) بیان می‏کنند. بررسی‏های ایمونوسیتوشیمی نشان داد که غلظت٤۰  درصد از مایع زجاجیه بر روی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی و مایع آمنیوتیک و غلظت ١٥ درصد از مایع زجاجیه بر روی سلول‏های مغز استخوان نسبت به سایر غلظت‏ها اثر القایی بیشتری دارد.
نتیجه‏گیری: بر اساس یافته‏های این مطالعه، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از هر سه منبع در اثر عمل القایی مایع زجاجیه می‏توانند به سلول‏های فیبر عدسی چشم تمایز یابند.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سلول‏های بنیادی سلول‏های تمایز نیافته‏ای هستند که توانایی تبدیل و تمایز به انواع مختلف سلول‏ها را دارند. سلول‏های بنیادی دارای دو ویژگی مهم هستند که سلول‏های بنیادی را از سایر سلول‏ها متمایز می‏کنند. این سلول‏ها، توانایی تکثیر نامحدود دارند و در حالت متمایز نشده باقی می‏مانند. علاوه بر این، سلول‏های بنیادی چنانچه در شرایط محیطی مناسب قرار بگیرند، قادرند به سلول‏های مورد نظر تبدیل شوند. سلول‏های بنیادی می‏توانند تحت تاثیر بعضی شرایط فیزیولوژیک یا آزمایشگاهی به سلول‏هایی با عمل‏کردهای اختصاصی مانند سلول‏های عضلانی قلب یا سلول‏های تولیدکننده انسولین در پانکراس تبدیل شوند (1). سلول‏های بنیادی از لحاظ منشا به دو دسته عمده، سلول‏های بنیادی جنینی و سلول‏های بنیادی بالغ تقسیم می‏شوند (2). سلول‏های بنیادی بالغ در بسیاری از بافت­ها و اندام‏ها شامل مغز، مغز­استخوان ، ماهیچه­اسکلتی، شبکیه، قرنیه چشم، پالپ دندان، مغز، طناب عصبی، کبد، بافت چربی، پوست و روده وجود دارند (3). از مهم‏ترین سلول‏های بنیادی بالغ، سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏باشند؛ سلول‏های بنیادی مزانشیمی برای اولین بار در مغز استخوان در سال 1966 شناسایی شدند (4). در سال‏های اخیر، مهم‏ترین منبع سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بوده است، اما سلول‏های بنیادی مزانشیمی را از منابع دیگر مثل بافت چربی، خون بند ناف‏، غشای آمنیوتیک، پولپ دندان، خون محیطی، بافت پریوست و ماهیچه اسکلتی نیز جدا کرده‏اند (5 و6). مغز استخوان منبع اصلی دو نوع از سلول‏های بنیادی به‏نام سلول‏های بنیادی خون‏ساز و سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏باشد (7).

مایع زجاجیه مایعی شفاف است که از جام بینایی منشا می‏گیرد و فضای پشت عدسی چشم را پر کرده است و در مسیر تمایزی عدسی چشم نقش ویژه دارد. در زجاجیه کندروایتین سولفات، هپاران سولفات و اسیدهیالورونیک وجود دارند. اسید هیالورونیک تمایل بالایی برای جذب آب داشته ودر نتیجه 99 درصد وزن زجاجیه را آب تشکیل می‏دهد و بدین سبب اسید هیالورونیک یک حالت ژله‏ای به زجاجیه می‏دهد (8). مهم‏ترین فاکتورهای موجود در مایع زجاجیه فاکتورهای رشد فیبروبلاستی( FGF) FGF-1 و 2 FGF-می‏باشد (9). مطالعات تجربی نشان داده است که این فاکتور‏ها در محیط کشت باعث القا و تمایز سلول‏های بنیادی به‏ سلول‏های عدسی می‏شود و همچنین باعث بیان ژن‏های کریستالین، طویل شدن و تخصص یابی ساختاری در سلول‏های فیبری می‏گردند (10). شواهد نشان می‏دهد که سلول‏های بافت پوششی عدسی تحت القاء FGF در محیط کشت تمایز پیدا کرده و ساختار مولکولی و مورفولوژی فیبرهای عدسی را کسب کرده‏اند (11).

عمده‏ترین پروتئین‏های سلول‏های فیبر عدسی، کریستالین‏ها می‏باشند (12) که به دوگروه عمده α وβ تقسیم‏‏ می‏شوند (13). با افزایش سن مشکلات و بیماری‏های چشمی به‏ویژه پیر‏چشمی و آب مروارید در جوامع مختلف رو به افزایش است. بنابراین امروزه استفاده از سلول‏های بنیادی بعنوان یک راهکار برای ترمیم و یا جایگزینی سلول‏های عدسی و شبکیه ضروری به‏نظر می‫رسد (14). در این میان، سلول‏های بنیادی مزانشیمی به‏دلیل دارا بودن خاصیت خودتجدیدی و توان تمایز به سایر سلول‏های دیگر به‏عنوان یک منبع مناسب و یک استراتژی برای جایگزینی ضایعات سلولی و ژن درمانی محسوب می‏شود (15).

 

مواد و روش‌ها

جداسازی و کشت سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان: در این تحقیق تجربی موش‏های نژاد NMRI با سن تقریبی 4 تا 6 هفته با روش جابه‏جای مهره‏های گردنی(cervical dislocation) بر اساس پروتوکل صادره از کمیته‏ی اخلاقی دانشگاه خوارزمی کشته شدند. در شرایط کاملا استریل استخوان‏های ران و درشت نی جدا، داخل محیط DMEM قرار داده و به زیر هود منتقل شدند. دو سر استخوان با یک قیچی کاملا استریل بریده شده و مغز استخوان از داخل کانال استخوان با استفاده از سرنگ حاوی محیط DMEM و عمل Flushing  خارج شد. مغز استخوان در فالکون ۱۵ میلی‏لیتری ریخته و سانتریفیوژ شد تا رسوب سلولی تشکیل شود. سپس محیط رویی تخلیه و سلول‏ها در۲ میلی‏لیتر محیط کشت تازه معلق شدند. محیط مورد استفاده DMEM (Dubleco,s modified eagles medium; Gibco Germany) حاوی ۱۵ درصد  FBS(Fetal Bovine Serum;Gibco,Germany) و100 واحد بین‏المللی پنی‏سیلین (Gibco,Germany) و100 واحد بین المللی استرپتومایسین (Gibco,Germany) بود. سلول‏ها حاصل در فلاسک ۲۵  سانتی متری کشت داده شدند. محیط سلول‏ها هر۳ روز یک‏بار به مدت دو هفته تعویض شد.

 

جداسازی و کشت سلول‏های مزانشیمی بافت چربی: در این تحقیق تجربی، موش‏های نژاد NMRI با سن تقریبی 4 تا 6 هفته با روش جابه‏جای مهره‏های گردنی  کشته و سپس با استفاده از الکل 70 درصد ضدعفونی شدند. بافت چربی از ناحیه پشت کشاله ران موش‏ها جدا شده و در محلول استریل phosphate-buffered saline (PBS) تحت شستشو قرار گرفت. سپس قطعات چربی به صورت مکانیکی با قیچی از هم جدا شدند و به قطعات دو میلی‏متری درآمدند. تمامی مراحل بالا بر روی یخ انجام گرفت. سپس تمامی PBS محیط کشیده شد و تکه‏های چربی تحت تاثیر۰٧٥/۰کلاژناز نوع I (Merck) در PBS به‏مدت چهل و پنج دقیقه در انکوباتور با دمای ٣٧ درجه سانتی‏گراد و 2Co، ٥ درصد قرار گرفتند، با این توصیف که هر پنج دقیقه یک‏بار مواد داخل فالکون پیپتاژ شد. سپس کلاژناز با PBS خنثی گردید (با اضافه کردن 5/1 میلی‏لیتر PBS ، رقت کلاژناز آن‏قدر زیاد شد که فعالیت اولیه‏ی خود را از دست داد وخنثی گردید) و سپس فالکون در داخل سانتریفیوژ به‏مدت ۱۰ دقیقه با دور g1200 قرار گرفت. پس از اتمام سانتریفیوژ مایع رویی که حاوی تکه­های چربی بود دور ریخته شد و رسوب سلولی  با PBS شستشو داده شد و دوباره در سانتریفیوژ با دور rpm ‏1500 به‏مدت ٥ دقیقه قرار گرفت. پس از این‏که دوباره مایع رویی حذف شد، محیط کشت DMEM  به‏همراه FBS ۱٥ درصد و آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سیلین و استرپتومایسین به نسبت ۱ به ۱۰۰ به رسوب سلولی اضافه شد و در فلاسک 25 سانتی‏متر مربع بدون پوشش با درب فیلتردار کشت داده شد و هر ۲ روز یکبار تعویض محیط صورت گرفت.

جداسازی و کشت سلول‏های مزانشیمی مایع آمنیوتیک: موش‏های  NMRI در هفته دوم بارداری به‏روش جابه‏جای مهره‏های گردنی ‏کشته شدند و جنین آن‏ها خارج و در ظرف حاوی HBSS قرار داده شد. سپس مایع آمنیوتیک احاطه کننده جنین به‏کمک پیپت پاستور کشیده شد. کلیه این مراحل در محیط استریل انجام شد. این مایع به‏همراه 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM‏، FBS20 درصد و آنتی‏بیوتیک پنی‏سیلین و استرپتومایسین در فلاسک 25 سانتی‏متر مکعب در شرایط عادی کشت سلولی در داخل انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و فشار 2Co، 5 درصد کشت داده شد. اولین تعویض محیط در روز 2 و پس از آن تعویض محیط هر سه روز یکبار انجام شد.

نحـوه گرفتن مایع زجاجیه: در ایـن پـژوهش چشم‏هـای گـاو

گرفته شده ازکشتارگاه کرج در PBS به آزمایشگاه منتقل شد و با آنتی‏بیوتیک پنی‏سیلین و استرپتومایسین همراه با PBS استریل گردید. با فروکردن سر سرنگ 16 گرم از ناحیه پشتی چشم، مایع زجاجیه بیرون کشیده شد و در دستگاه سانتریفیوژ با دورrpm  ۱٤۰۰۰ به‏مدت ۲۰ دقیقه در دمای ٤ درجه سانتی‏گراد  قرار گرفت. مایع رویی فیلتر گردید و در فریزر ٤۰- درجه سانتی­گراد نگه‏داری شد.

بررسی بیان مارکرهای سطحی به روش فلوسیتومتری: سلول‏های حاصل بعد از تریپسینه و سانتریفیوژ کردن در اپندورف ریخته و با PBS شسته شدند. سپس به‏مدت 10 دقیقه با دور 2000 rpm  سانتریفیوژ شدند. آنتی‏بادی‏های اولیه CD90 کونژوگه با PE (فیکواریترین) وکونژوگهCD31  با FITC (فلورسنس ایزوتیوسیانات) اضافه شد و به‏مدت 30 دقیقه در یخچال قرار گرفت و برای کنترل منفی از آنتی‏بادی‏هایIgG2b  PE-IgG2a, FITC-  استفاده شد. در مرحله بعد سلول‏ها پس از شستشو با PBS به مدت 10 دقیقه با       دور 2000 rpm  سانتریفیوژ شدند. سپس به سلول‏ها بافر فیکس کننده فرمالین 1 درصد اضافه شد و با دستگاه فلوسیتومتری (,Germany Beckton Dickinson) آنالیز شدند.

تیمار سلول‏های جداشده با مایع زجاجیه: پس از پاساژ سوم سلول‏ها بعد از شمارش سلولی، به تعداد 104×4 سلول در 7 خانه‏ی پلیت  ۲٤ خانه­ای کشت داده شدند و پس از چسبیدن سلول‏ها به کف ظرف، گروه‏های تجربی با درصدهای مختلف 10، 30،20،15 ، 40 و 50 از مایع زجاجیه در محیط کشت تیمار شدند و گروه کنترل بدون تیمار با مایع زجاجیه و صرفا با DMEM و  FBS ۱٥ درصد و آنتی­بیوتیک­ها کشت داده شدند. این خانه­ها به‏مدت ۱٤ روز تحت تیمار و کشت قرار گرفتند.

رنگ­آمیزی سلول‏ها با مارکر کریستالین: در انتهای روز١٤، نمونه­های تجربی و نمونه­های کنترل، با آنتی­بادی اولیه کریستالینalpha A+ alpha B crystalline antibody (ab28163) و آنتی‏بادی ثانویه AF8035) (anti-rabbit- IgG-fitc رنگ­آمیزی شدند. به‏منظور انجام ارزیابی ایمونوسیتوشیمی، سلول‏های مزانشیمی تیمار شده به‏مدت ۱۵ ‏دقیقه با پارافرمالدئید ۴ درصد در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس با PBS شستشو و از بافر بلاک کننده حاوی Triton X-100 جهت نفوذ پذیری سلول‏ها برای ورود آنتی‏بادی استفاده شد. سپس Goat serum اضافه شد و پس از خارج کردن Goat serum، آنتی‏بادی اولیه alpha A+ alpha B crystalline antibody  رقیق شده در BSA/PBST (Phosphate Buffered Saline Tween-20 /Bovine serum albumin)  2/0 درصد  اضافه شد و سلول‏ها در این محلول به مدت ۴۵ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. نمونه‏ها ۲ بار با PBS/Tween 1/0 درصد شستشو داده شدند. آنتی‏بادی ثانویهرقیق شده در BSA/PBST  2/0 درصد‏، به‏مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق اضافه شد. از میکروسکوپ معکوس فلورسانس جهت ارزیابی سلول‏ها استفاده شد.

 

نتایج

مورفولوژی  سلول‏های کشت شده

در کشت اولیه، سلول‏های گرفته شده از مغز استخوان موش‏های NMRI به شکل گروه‏های سلولی ناهمگن و هتروژن دیده شدند (شکل A1)‏. در روز هفتم‏، سلول‏ها با مورفولوژی متفاوت نظیر پهن، دوکی و چند وجهی مشاهده شدند (شکل B1). در پاساژهای بعدی تعداد سلول‏های دوکی شکل بیشتر شدند، به‏طوری‏که در پاساژ سوم اکثریت سلول‏ها دوکی شکل بودند. در ادامه پاساژهای بعدی سلول‏های بنیادی مزانشیمی به‏صورت خالص در آمده بودند و سلول‏های مزانشیمی از لحاظ مورفولوژیکی بیشتر  شبیه به سلول‏های فیبروبلاست (دوکی شکل) بودند. سلول‏های بنیادی بافت چربی  بعد از کشت اولیه در زیر میکروسکوپ معکوس به‏صورت سلول‏های شبه فیبروبلاستی همراه با زوائد کوچکی در اطراف روئیت شدند که به ظرف کشت چسبیده­ بودند و سلول‏های مرده به‏صورت اجسام شفاف در سطح کشت نمایان بودند (شکل A2). بعد از یک هفته‏، تعداد سلول‏های مزانشیمی بافت چربی که دوکی شده بودند افزایش یافت (شکل B2). سلول‏های مایع آمنیوتیک در روز اول کشت شامل جمعیت هتروژنی از سلول‏ها بودند. در روز دوم، محیط کشت شامل جمعیتی از سلول‏های بنیادی مزانشیمی چسبیده به کف ظرف با مورفولوژی فیبروبلاستی به‏همراه گروهی از سلول‏های غیر مزانشیمی شناور بودند (شکل A3). سلول‏های بنیادی مزانشیمی چسبیده به کف ظرف به‏سرعت تکثیر شدند و ظرف یک هفته به صورت یک تک لایه کف ظرف را پر کردند (شکل B3).

 

B

B

A

A

شکل ۱: کشت سلو‏ل‏های مغز استخوان گرفته شده از موش. (A) در روز اول کشت، سلول‏های مزانشیمی و غیر مزانشیمی به شکل ناهمگن دیده شدند. (B) در روز هفتم، سلول‏های مزانشیمی بیشتر به‏صورت دوکی شکل مشاهده شدند. (میکروسکوپ فاز کنتراست معکوس با بزرگنمایی  ×۴٠۰).

 

B

A

        شکل 2: کشت اولیه سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی(A) و کشت سلول‏ها بعد از یک هفته (B). (بزرگنمایی ×٤۰۰).

 

B

A

شکل 3‏: جمعیت هتروژن سلول‏های کشت داده شده مایع آمنیوتیک در روز دوم (A) و سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک در روز هفتم(B). (بزرگنمایی ×٤۰۰).


نتایج به‏دست آمده از بررسی بیان  مارکرهای سطحی به‏روش فلوسیتومتری

جهت اثبات ماهیت مزانشیمی بودن این سلول‏ها علاوه بر خاصیت چسبندگی آن‏ها به ظرف کشت، یکی دیگر از راه‏های شناسایی آن‏ها استفاده از مارکر سطحی می‏باشد که بعد از پاساژ اول و جداشدن سلول‏های بنیادی مزانشیمی از سایر سلول‏ها به‏روش فلوسیتومتری بررسی شد. در این بررسی سلول‏های بنیادی مزانشیمی هر سه منبع با دو مارکر CD90 و  CD31 بررسی شدند. نتایج در مورد مارکر CD90بر روی  سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک به‏ترتیب 29/29  درصد و 57/0 درصد بوده است (شکل 4)، در حالی‏که سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی این مارکر را به‏میزان 82  درصد ‏ بیان کردند (شکل 4). در مورد  مارکر  CD31 هر سه منبع سلول‏های بنیادی آن را به‏میزان کم بیان کردند. همان‏طور که در شکل4 دیده می‏شود بافت‏های چربی، مغز استخوان و مایع آمنیوتیک مارکر CD31 را به‏ترتیب ۱/۰ درصد، ۴۴/۳‏ درصد‏، ۵۳/۱ درصد بیان می‏کنند.

 

نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی سلول‏ها در طی تمایز

پس از پاساژ سوم سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان‏، بافت چربی و مایع آمنیوتیک تحت القا درصدهای مختلف 10، 15 ،20،30، 40 و 50 از مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت، به‏مدت ١٤ روز قرار گرفتند. گروه‏های تجربی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در غلظت 10‏ درصد شباهت بسیاری به گروه کنترل (بدون مایع زجاجیه‏) ‏داشتند در حالی‏که در غلظت 15  درصد سلول‏ها کشیده تر و به صورت موضعی به‏موازات هم آرایش یافته بودند و پس از آن در غلظت‏های 20 ، 30، 40و 50 درصد میزان مرگ و میر سلول‏ها بسیار زیاد گردید و آرایش سلولی از بین رفت. گروه‏های تجربی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک در غلظت  10،  15 ، 20 و 30  درصد شباهت بسیاری به گروه کنترل داشتند در حالی‏که در غلظت 40 درصد سلول‏ها کشیده‏تر و به‏‏موازات هم آرایش یافته  و دارای‏ هستک‏های بیشتری در داخل هسته بودند و پس از آن در غلظت 50 درصد میزان مرگ و میر سلول‏ها بسیار زیاد گردید و آرایش سلولی از بین رفت. روند اخیر در مورد سلول‏های مزانشیمی چربی نیز دقیقا به‏همین صورت بوده و افزایش تعداد هستک‏های داخل هسته و موازی بودن سلول‏ها به‏صورت موضعی در غلظت 40 درصد حاکی از تاثیر زجاجیه بر سلول‏های بنیادی و القا هدفمند آن داشته است (شکل5).

 

 

 

 

 

 

 


 

B


A

D

C

F

E

شکل 4: نتایج فلوسیتومتری برای A: سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطحی CD31 را 44/3  درصد بیان کردند. B: سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطحی CD90را 29/29‏ درصد بیان کردند. C: سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک که مارکر سطحی  CD31 را 53/1 ‏درصد بیان کردند. D: سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک که مارکر سطحی   CD90 را 57/0  ‏درصد بیان کردند. E: سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی که مارکر سطحی CD31 را 1/0 درصد بیان کردند. F: سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی که مارکر سطحی  CD90 را 82  درصد  بیان کردند.

B

A

D

C

شکل5: (A): سلول‏های بنیادی مزانشیمی در گروه کنترل است که  پس از ۱۴ روز کشت  بدون مجاورت با مایع زجاجیه  علائمی از کشیدگی سلولی در آن‏ها دیده نمی‏شود. (B): سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی پس از ۱۴ روز کشت  با غلظت ۴۰ درصد مایع زجاجیه که سلول‏ها نسبت به گروه کنترل کشیده‏تر شده‏اند. (C) سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک پس از ۱۴ روز کشت  با غلظت ۴۰ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت که سلول‏ها نسبت به گروه کنترل کشیده‏تر شده‏اند. (D) سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان پس از ۱۴ روز کشت  با غلظت ۱۵ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت که سلول‏ها نسبت به گروه کنترل کشیده‏تر شده‏اند. در هر سه نمونه B,C و D سلول‏های تیمار شده کشیده‏تر و فیبری شکل شده اند و به‏سمت آرایش موازی پیش می‏روند. (بزرگنمایی x٤٠٠)

 


نتایج بررسی بیان مارکرهای آلفا کریستالین به‏روش ایمونوسیتوشیمی

نتایج بررسی‏های ایمونوسیتوشیمی سلول‏های گروه تجربی و گروه کنترل با آنتی‏بادی پلی‏کلونال alpha A+ alpha B crystalline antibody پس از 14 روز نشان داد که در سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان میزان بیان کریستالین در سلول‏های تیمار شده با غلظت 15 درصد مایع زجاجیه نسبت به سایر غلظت‏های مایع زجاجیه بیشتر بود، چنانچه در غلظت 10 درصد فقط تعداد کمی از سلول‏ها رنگ پذیرفته بودند و در غلظت‏های دیگر مرگ و میر سلولی مانع رنگ گیری شده و اثری بر صفحه مشاهده نشد. در سلول‏های تیمار شده، بافت چربی و مایع آمنیوتیک با غلظت 40 درصد نسبت به سایر غلظت‏های مایع زجاجیه میزان بیان کریستالین بیشتر بوده و در غلظت 50 درصد صفحه سیاه بود و اثری از رنگ‏پذیری سلول‏ها دیده نشد. در حالی‏که در غلظت‏های زیر 40 درصد اندک رنگی در نواحی روئیت شده بود ( شکل6).

 

B

A

D

C

شکل 6: بررسی ایمنوسیتوشیمی بیان آلفا کریستالین­ها در سلول‏های گروه کنترل (A) پس از ۱۴ روز کشت  بدون مجاورت با مایع زجاجیه که هیچگونه سیگنالی مبنی بر بیان کریستالین­ها را نشان نمی­دهد. در سلول‏های بنیادی گروه تجربی مایع آمنیوتیک (B) و بافت چربی (C) که تحت  القای ۴۰ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت پس از 14 روز بوده اند  و بیان آلفا کریستالین‏ها با رنگ سبز مشاهده می‏شود و همچنین‏ سلول‏های بنیادی مغز استخوان (D) که تحت القا 15 ‏درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت به مدت 14 روز قرار گرفتند و بیان آلفا کریستالین‏ها با رنگ سبز قابل روئیت است. (بزرگنمایی ×200)

 

 

بحث

جداسازی و خلوص سلول‏های بنیادی مزانشیمی موش به‏علت تعداد کم سلول‏های مزانشیمی در مغز استخوان و رشد ناخواسته سلول‏های غیرمزانشیمی به‏مراتب مشکل تر از دیگر گونه­های جانوری است (16). سلول‏های مغز استخوان شامل فیبروبلاست‏ها، سلول‏های اجدادی خونی (17)، ماکروفاژها، سلول‏های اندوتلیالی و چربی می‏باشند (18). مطالعات قبلی نشان دادند این سلول‏ها در کشت باقی مانده و باعث آلوده­سازی سلول‏های فیبروبلاستی می­شوند (19 و20). اما تعویض محیط کشت مانع از چسبیدن سلول‏های غیر مزانشیمی و خونی به پلیت پلاستیکی کشت می­شود. در این مطالعه بدون کمترین استرس برسلول‏ها و با بهبود روش چسبیدن به ظرف کشت پلاستیک از طریق تعویض سریع محیط کشت در ساعات اولیه از کشت سلول‏های مغز استخوان موش، از چسبیدن سلول‏های غیر مزانشیمی به ظرف کشت جلوگیری گردید. سلول‏های بنیادی مشتق شده از بافت چربی، سلول‏هایی هستند که چند توان بوده و از نوع بنیادین بالغ می­باشند (21). این سلول‏ها همانند سلول‏های بنیادی مغز استخوان به کف ظرف پلاستیکی کشت می­چسبند و از لحاظ بررسی مارکرها حدودا مشابه عمل می‫کنند. این سلول‏ها نسبت به مارکرهای سطحی سلول‏های خون‏ساز منفی عمل کرده و نسبت به مارکرهای سلول‏های بنیادی مزانشیمی مثبت هستند (22). در تحقیقات گذشته نشان داده شد که سلول‏های بنیادی مایع آمنیوتیک در مقایسه با سلول‏های بنیادی مغز استخوان، قدرت تکثیر و خودنوزایی بالاتری دارند (23 و24). در این مطالعه نیز تکثیر بالای سلول‏های بنیادی مایع آمنیوتیک در مقایسه با سایر سلول‏ها موید مطالعات محققین قبلی بود.

یکی دیگر از روش‏های شناسایی این سلول‏ها استفاده از مارکر سطحی است. Baddoo و همکارانش (25) مارکرهای سطحی،CD106 ،CD81 ،CD11b ،CD34 ،CD105 ، CD48 و CD31 را در سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش بررسی کردند که نتایج این بررسی نشان داد که این سلول‏ها مارکرهای CD105،CD106  و CD81 را به میزان بالایی بیان کردند، در حالی‏که مارکرهایCD11b،CD34 ، CD45 CD48 و CD31 به میزان کمی بیان شدند. مطالعات انجام شده نشان می‏دهد که سلول‏های بنیادی مزانشیمی  مشتق شده از بافت چربی مارکرهای سطحی متفاوتی مانند,‏CD29, CD44,CD54, CD73 (SH3), CD90, CD105 (SH2), CD106, CD146, CD166 را بیان می‏کنند، ولی فاقد مارکرهای دیگری مانند CD14, CD31, CD34, CD45, CD133, CD144, HLA-DR, STRO-1 می‏باشند. آنالیز فلوسایتومتری از مارکرهای سطحی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان و بافت چربی نشان داده است که این سلول‏ها مارکرهایی مانند CD13, CD29, CD44, CD90, CD105 (SH2), CD73 (SH3), را بیان می کنند در حالی‏که این سلول‏ها بیان متفاوتی از CD49d, CD54, CD34 دارند (26). You و همکارانش (27) بر روی سلول‏های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی مارکرهای سطحی CD29  و CD31 و CD45 را بررسی کردند که نتایج این بررسی نشان داد که این سلول‏ها مارکرهای CD29 را بیان می­کنند اما CD31 و CD45 به‏میزان خیلی کم بیان می‏کنند. Liu و همکارانش (28) مطالعه‏ای بر روی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک موشی انجام دادند که مشخص شد که این سلول‏ها فیبروبلاستی شکل مارکر CD44 را بیان می­کنند اما مارکرهای CD90، CD31 و CD45 را بیان نمی­کنند.

در این مطالعه بیان برخی مارکرهای سطحی نظیر CD31 و CD90 در سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان‏، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به روش فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت که نتایج این تحقیق نشان داد که سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک مارکر CD90را به‏میزان کم به‏ترتیب 29/29 ‏درصد و 57/0 درصد بیان کردند، اما سلول‏های بنیادی مزانشیمی بافت چربی این مارکر را به‏میزان بالا به‏مقدار دقیق 82‏ درصد بیان کردند. بیان مارکر CD31 در بافت‏های چربی، مغزاستخوان و مایع آمنیوتیک به ترتیب ۱/۰ درصد، ۴۴/۳ درصد‏، ۵۳/۱ درصد  می‏باشد که نشانگر بیان اندک این مارکر در سلول‏های بنیادی هر سه منبع است.

 بیان CD90 و CD31 در سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک آن‏قدر اندک است که عملا موید عدم بیان این مارکرهاست. این نتایج در راستای مطالعات محققین قبلی است که سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک را فاقد مارکرهای CD90 و CD31 می‏دانند.

در این تحقیق، توانایی تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلول‏های فیبر عدسی چشم بررسی گردید. به این منظور سلول‏های مزانشیمی از مغز استخوان‏، بافت چربی و مایع آمنیوتیک موش جدا شد و به‏مدت 14 روز با مایع زجاجیه چشم گاو تیمار شد. Eleanor و همکارانش (29) بر روی رشد و تمایز سلول‏های اپی‏تلیومی عدسی انسان مطالعه کردند. آن‏ها این سلول‏های اپی‏تلیومی را جدا کرده و به‏مدت ۱٥ روز در محیط دارای FGF-2 کشت دادند. در نهایت مشاهده کردند که مورفولوژی آن‏ها تغییر یافته و اجسام لنتوئیدی (lentoid) (مجموعه دستجات چند سلولی گرد و دارای خاصیت انکسار بالا) ظاهر شدند. آن‏ها برای اثبات ادعای خود در مورد تمایز این سلول‏ها به عدسی چشم از مارکر آلفا کریستالین‏ها با روش RT-PCR استفاده کردند. در تحقیق حاضر سلول‏های بنیادی مزانشیمی که به‏مدت ۱٤ روز تحت القای مایع زجاجیه چشم قرار داشتند از نظر بیان آلفا کریستالین­ توسط روش ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند که پاسخ مثبت این سلول‏ها بیانگر تمایز آن‏ها به‏سمت ایجاد سلول‏های فیبر عدسی و بیان ژن­های خاص عدسی می­باشد.

Michael و همکارانش (30) دو بافت اپی‏تلیومی از دو عدسی مجزا را بر روی هم در محیط کشت مخلوط با زجاجیه گاوی (1:1) کشت دادند و علاوه بر بررسی‏های میکروسکوپی و تعیین میزان توانایی این ساختار عدسی مانند‏، نشان دادند که در این شرایط این سلول‏ها بعد از ٣۰ روز کشت شکلی مشابه سلول‏های فیبر عدسی پیدا کرده و شفاف شده اند و قادر به متمرکز کردن نور گردیده­اند. در نتیجه مایع زجاجیه گاوی فاکتورهای مناسب برای تمایز به سمت سلول‏های عدسی را داراست.

در تحقیق حاضر از مایع زجاجیه چشم گاو با دوزهای متفاوت استفاده شد. بررسی‏های مورفولوژیکی نشان داد که در سلول‏های گروه تجربی، می­توان تغییرات قابل مقایسه­ای را نسبت به گروه‏های کنترل مشاهده کرد. تغییرات مورفولوژیکی مشاهده شده در این تحقیق عبارتند از کشیدگی زیاد سلول‏ها، به‏موازات هم قرارگیری آن‏ها، افزایش تعداد هستک­ها و از دست دادن هسته سلولی که همه این نتایج مورفولوژیکی بیانگر شروع تمایز این سلول‏ها به‏سمت ساختارهای شبه فیبر عدسی بوده و با نتایج Michael و همکارانش مطابقت دارد.

ملکی و همکارانش (31) سلول‏های بنیادی بند ناف موش سوری را جدا کرده و در مجاورت مایع زجاجیه چشم گاو کشت دادند و بیان پروتئین‏های کریستالین A α و B α را بعد از ۱٤ روز کشت در دوز 25 درصد با استفاده از روش Western blot analysis مشاهده نمودند.

در مطالعه‏ی حاضر، دوزهای مختلفی از مایع زجاجیه با محیط کشت آماده گردید تا روند تاثیرگذاری میزان زجاجیه بر القا سلولی مشخص گردد. این دوزها در ابتدا از 50 درصد شروع شد اما چون نتیجه‏ی مطلوب حاصل نشد و مرگ و میر سلولی بسیار بالا بود در نتیجه میزان دوز از 10 درصد آغاز گردید که در این روند با بررسی کامل سلول‏های تحت القا سلول‏های بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک و بافت چربی مارکر کریستالین‏ها را در دوز 40 درصد و سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در دوز 15 درصد بیان کردند. در این بررسی دیده شد که در دوز 50 درصد ، مرگ میر سلولی بسیار بالا بود. این مطلب نشان دهنده‏ی کشنده بودن مایع زجاجیه در غلظت‏های بالا برای سلول‏ها می‏باشد. این نتایج همانند  کار ملکی و همکارانش (31) ‏نشان دادند که  تحت القا فاکتورهای رشد موجود در مایع زجاجیه چشم، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیون می‏توانند به ساختاری مشابه به فیبر عدسی تمایز یابند که در هر دو تحقیق مارکر تمایزی آلفا کریستالین بیان شدند. بیان آلفا کریستالین‏ها در انواع مختلف سلول‏های بنیادی تحت القا دوزهـای متفـاوت مایع

 زجاجیه حاکی از توان تمایزی متفاوت سلول‏های بنیادی گرفته شده از منابع متفاوت می‏باشد.

 

نتیجه گیری

در کل از یافته­های این تحقیق می توان نتیجه گرفت که بر اساس تغییرات مورفولوژیکی و بیان مارکرهای خاص عدسی، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک در اثر تیمار با زجاجیه توان تمایز در جهت تشکیل سلول‏های فیبری عدسی را دارند. تخلیص سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان‏ به‏علت هتروژن بودن نسبت به بافت چربی و مایع آمنیوتیک  از مزیت کمتری برای کشت برخوردار است و از طرف دیگر تکثیر سلول‏های مایع آمنیوتیک بسیار بالاتر از دو بافت دیگر است، اما با توجه به این‏که سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان در دوز پایین‏تری نسبت به دو بافت دیگر القا شدند بافت مناسب‏تری می‏باشند. با توجه به ویژگی‏های مشابه سلول‏های موش و انسانی می‏توان امیدوار بود که سلول‏های بنیادی انسانی نیز این قابلیت را داشته باشند که در این‏صورت می‏توان از این سلول‏ها در درمان بیماری‏های چشمی استفاده کرد. تخلیص سلول‏هایی با منشاهای متفاوت موجب می‏شود تا دست محققان و پزشکان در امر درمان بازتر باشد تا اگر تهیه سلول از یک بافت با مشکل مواجه شد امکان جایگزینی با روش مناسب تر را داسته باشند.

 

تشکر و قدردانی

از همکاری آقای دکتر امیر آتشی مدیر گروه سلولی شرکت بن یاخته و همچنین مساعدت نمودن دانشگاه علوم پزشکی ایران و انستیتو پاستور ایران جهت انجام آنالیز فلوسایتومتری صمیمانه سپاسگزاری می‏نماییم

1. Baksh D, Davis JE, Zandstra PW. Adult human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells are capable of adhesion-independent survival and expansion. J ISEH. 2003; 31: 723-732.

2. Ulloa-Montoya F, Catherine M.Verfaillie and Wei-shou Hu. Culture systems for Pluripotent Stem Cells. JBioscience and bioengineering. 2005; 100: 12-27.

 

3. Musina RA, Eqorov EE, Beliavski AV. Stem cells:properties and perspectives of therapeutic use. J Mol Biol(mosk). 2004; 38: 563-77.

4. Friedenstein AJ, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J.Embryol.  J exp. Morph. 1966; 16(3): 581 -390.

5. Baghaban Eslaminejad MR, Taghiya L. Mesenchymal Stem Cell Purification from the Articular Cartilage cell culture. J Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2007; 10: 146-153.         

6. Alexanian Arshak R. Neural stem cells induce bone- marrow-derived  mesenchymal  stem cells to generate neural stem-like cells via juxtacrine and paracrine interactions.J xperimental Cell Research. 2005; 310(2): 383-391.

7. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, et al. Multilineage  potential of adult human mesenchymal stem cells. J Science. 1999; 284(5411): 143-7.

8.Oyser Clyde W. The human eye: structure and function. Published by Sinauer Associates,Inc. 1999; 530 -531.

9. Majima K. Presence of growth factor in human vitreous. J Ophthalmologica. 1997; 211(4): 226–228.

10. McAvoy JW. Beta- and gamma-crystallin synthesis in rat lens epithelium explanted with neural retinal. J Differentiation. 1980; 17 (2):85–91.

11. Zhao H, Rossant J, Ornitz DM, Beebe DC, et al. Different FGFR genes play an essential but redundant role in postinduction lens development. Invest Ophthalmol Visual Sci. 2003; 44: 954-963.

12.   Bloemendal H, de Jong W, J aenickeR, Lubsen NH, et al. Ageing and vision :structure ,stability and function of lens crystallines. J Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004; 86(3): 407-485 

13.  Horwitz J. Alpha -Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc.Natl.Acad.Sci. USA.1992; 89(21): 10449-1045.

14. BehfarA, Yamada S, Crespo-Diaz R, NesbittJJ, et al. Guided Cardiopoiesis Enhances Therapeutic Benefit of Bone Marrow Human Mesenchymal Stem Cells in Chronic Myocardial Infarction. Am Coll Cardiol. 2010; 56: 721-734.

15. Pitchford SC, Hahnel MJ, Jones CP, Rankin SM. Troubleshooting: Quantification of mobilization of progenitor cell subsets from bone marrow in vivo. J Pharmacological and Toxicological Methods. 2010; 61(2): 113–121.

16. Eslaminejad MB, Nikmahzar A, Taghiyar L, Nadri S, et al. Murine  mesenchymal  stem  cells  isolated  by  low  density  primary culture system. Dev Growth Differ. 2006; 48: 361-70.

17. Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, Prockop DJ. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation.. J Cell Biochem. 1999; 72(4): 570-85.

18. Zuckerman KS, Wicha MS. Extracellular matrix production by the adherent  cells  of  long-term  murine  bone  marrow  cultures. J Blood. 1983; 61(3): 540-7.

19. Meirelles Lda S, Nardi NB. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 2003; 123(4): 702-11.

20. Xu CX, Hendry JH, Testa NG, Allen TD. Stromal colonies from mouse marrow: characterization of cell types, optimization of plating efficiency and its effect on radiosensitivity. J Cell Sci.1983; 61: 453-66.

21. Ian Freshney R, Stacey Glyn N, Auerbach Jonathan M. Culture of human stem cells. chapter 13: Tissue culture of adipose derived stem cells. J Wiley-Interscience. 2007; 304-305.

22. Lidong G,  Shaoqing LI, Yunfang W, Huimin Y, et al. In vitro differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells into endothelial-like cells. Chinese Science Bulletin. 2006 ; 51(15): 1863—1868.

23. Zheng YB, Gao ZL, Xie C, Zhu HP, et al. Characterization and hepatogenic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic fluid and human bone marrow: a comparative study. Cell Biol Int. 2008; 32: 1439-1448.

24. Nadri s, Soleimani M. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from murine bone marrow and amniotic fluid.cytotherapy 2007; 9(8): 729-737.

25. Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, Gaupp D, et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 2003; 89(6): 1235-49.

26. De Ugarte DA, Alfonso Z, Zuk PA, Elbarbary A, et al. Differential expression of stem cell mobilizationassociated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett. 2003; 89(2-3): 267-270.

27. You Q, Cai L, Zheng J, et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid.Int J Gynaecol Obstet. 2008 ; 103: 149-152.

28. Liu ZSh, Xu YF, Feng ShW, Li Y, et al. Baculovirus transduced mouse amniotic fluid-derived stem cells maintain differentiation potential. Ann. Hematol.2009; 88: 565-572.

29. Eleanor AB, Kathleen AB, Polly YC, McNamara Morgan P, et al. Growth and differentiation of human lens epithelial cells in vitro on matrix. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000; 41(12): 3893-3907.

30. Connor O,  Michael D, W.Acavoy  J. In vitro generation of function lens-like structures with relevance To age-related nuclear cataract. Invest ophthalmol Vis Sci. 2007; 48 (3):1245-1252.

31. Maleki M,  Kazem P, Nabiyouni  M,                   Parichehr Y, et al. Induction of Alpha-Crystallins Expression in Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells. Iranian Journal of Ophthalmology. 2010; 22(2): 67-71.