مطالعه بیومارکرهای هیستوپاتولوژیکی و روند زمانی ظهور آن‏ها در اندام¬های آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفه-ای آب شیرین Anodonta cygnea در معرض با غلظت¬ تحت¬کشنده فلز سنگین کروم (Cr)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک و روند زمانی وقوع آن‏ها در معرض با فلز سنگین کروم در اندامهای آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفه ای آب شیرین Anodonta cygnea بود.
مواد و روش‏ها: 24 عدد دوکفه ای با دامنه طولی (7/12 تا 3/13سانتی‏متر) از منطقه سمسکنده ساری برداشت گردید. در آزمایشگاه دوکفه ایها با غلظتµg l-1  125 برای مدت 18 روز در معرض فلز کروم قرار گرفتند. در روزهای 4، 9 و 18 از دوکفه‏ایها جهت بهدست آوردن توده‏های بافتی از اندام‏های مورد مطالعه، نمونه‏برداری شد. برش‏های بافتی از نمونه‏های در معرض فلز و شاهد تهیه گردید و با روش هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند.
نتایج: وضعیت هیستولوژیک در هر سه اندام مورد مطالعه در مقایسه با نمونه‏های شاهد، تغییرات قابل توجهی را نشان داد. در آبشش هیپوپلازی، تغییرات شکلی و اندازه‏ای تیغه‏های آبششی، گرانولوما، هیپرپلازی و آتروفی کانال‏های همولنفی مشاهده گردید. در غده هاضمه آتروفی توبول‏های گوارشی، ریزش سلول‏های گوارشی و بازوفیل به درون توبول‏ها و همچنین تجمع هموسیت‏ها و گرانولوما در بافت پیوندی مشاهده گردید. در پا هیپوپلازی اپی‏تلیوم بیرونی، افزایش تعداد سلول‏های موکوسی و تورم و گسستگی بافتی در ساختار دسته های میوسیت مشاهده گردید. اولین علائم تغییر در روز چهارم ثبت و با افزایش مدت زمان معرض، ظهور علائم جدیدتر و افزایش گستره تغییرات هیستوپاتولوژیک در هر سه اندام دیده شد.
نتیجه‌گیری: تغییرات هیستوپاتولوژیکی در اندام‏های دوکفه‏ای A. cygnea به عنوان بیومارکرهای هیستوپاتولوژیکی بسیار مناسبی جهت پایش اثرات این فلز در محیط آبی پیشنهاد می‏شود و روند زمانی ظهور تغییرات، دقت این شاخص‏ها را افزایش می‏دهد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

فلزات سنگین یک اصطلاح عام برای گروهی از عناصر فلزی است که چگالی آن‏ها بیش از gr cm-3 3 است که در غلظت­های کم دارای اثرات بیولوژیکی تعریف شده بوده و زمانی که در غلظت‏های بالاتر از سطوح فیزیولوژیکی قابل تحمل در سلول­ها وجود داشته باشند، می­توانند اثرات سمی اعمال نمایند (1). این عناصر از آلاینده­های بسیار مهم محیط­های آبی هستند که پیامدهای نامطلوبی بر جوامع زنده­ این زیستگاه­ها دارند (2 و 3). فعالیت­های انسانی یکی از منشاهای اصلی ورود این آلاینده­ها به پیکره­های آبی است (4).

در دهه­های اخیر گروه­های مختلف موجودات زنده به‏‏طور گسترده جهت بررسی وقوع آلودگی­های شیمیایی در محیط­های طبیعی مورد استفاده قرار گرفته­اند. دوکفه­ای­ها، گروهی از نرم­تنان هستند که مطلوبیت بسیار بالایی جهت استفاده به‏عنوان بیواندیکاتورهای آلودگی در محیط­های آبی دارند (5). با توجه به این که این موجودات در تماس مستقیم با بخش­های آلوده شده زیستگاه­های آبی (رسوبات و آب) هستند و می­توانند سطوح بالایی از فلزات سنگین را در بافت­های نرم خود ذخیره کنند، شواهد مناسبی را در رابطه با وقوع آلودگی­های محیطی با مقیاس زمانی از طریق بررسی پاسخ­های سلولی و فیزیولوژیکی فراهم می­سازند (6).

در میان طیف گسترده­ شاخص­های زیستی مورد استفاده در ارزیابی اثرات آلاینده­ها، تغییرات هیستوسیتولوژیکی به‏عنوان ابزارهایی مناسب جهت پایش آلودگی پیشنهاد شده­اند (7). سلول­ها نخستین محل­های برهم­کنش مواد شیمیایی و سیستم‏های بیولوژیکی هستند (8). تفاوت­های موجود در فرایندهای بیوشیمیایی در اندامک­های مختلف سلول، محل اثر مواد سمی را تعیین می­کند و تفکیک مکانی انواع سلول­ها در بافت­های مختلف مشخص می­سازد که چه بافتی بیشتر تحت تاثیر یک عامل سمی قرار گرفته یا این که بیشترین پاسخ­دهی را به آسیب عامل سمیت­زا داشته است. تعیین پاسخ­های هیستوسیتولوژیکی نسبتا آسان بوده و می­توان آن­ها را به سلامت و شایستگی افراد در جوامع اکولوژیک نسبت داد (6). در معرض قرارگیری بلندمدت با فلزات سنگین میزان مستعد بودن نسبت به استرس­های محیطی را افزایش داده و گسترش ناهنجاری­های هیستوپاتولوژیک را در موجودات زنده در پی دارد (9). مطالعات انجام شده در این زمینه بیانگر بروز تغییرات پاتولوژیکی انحطاطی (degenerative)، تخریبی (destructive) و التهابی (inflammatory) در ارزیابی وضعیت شکلی- عمل‏کردی بافت‏ها و اندام­های مختلف دوکفه­ای­ها در معرض قرارگیری با فلزات سنگین بوده است (7، 10-13 ).

در این مطالعه، اثرات هیستوپاتولوژیکی معرض قرارگیری با فلزات سنگین و الگوی زمانی پیدایش آن‏ها در سه اندام آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفه­ای آب شیرین Anodonta cygnea مورد بررسی قرار گرفت. این دوکفه­ای از بی­مهرگان ساکن در رودخانه­ها و تالاب­های شمال کشور است که پراکنش گسترده­ای در خارج از ایران نیز دارد. از آنجا که در منابع متعدد اثرات اختصاصی هیستوپاتولوژیک برای عناصر سنگین مختلف ذکر نشده است (7)، همچنین با توجه به این‏که، در میان فلزات سنگین، فلز کروم سطوح آلایندگی بالاتری را در آب­های شیرین به‏وجود آورده است (14)، لذا در این مطالعه فلز کروم به‏عنوان عامل آلاینده انتخاب گردید.

 

مواد و روشها

جمع­آوری نمونه­های دوکفه­ای و شرایط نگهداری در آزمایشگاه: در آذرماه 1390، 30 نمونه از دوکفه­ای              A. cygnea با دامنه­ی طولی (7/12 تا 3/13 سانتی‏متر) از مصب رودخانه تجن، منطقه­ سمسکنده ساری در استان مازندران (36°48΄46΄΄N, 53°6΄57΄΄E) برداشت شد. این نمونه­ها پس از انتقال به آزمایشگاه بیولوژی آبزیان گروه شیلات دانشکده منابع طبیعی دانشگاه تهران، جهت تطابق با شرایط آزمایشگاهی به مدت 2 هفته در تانک­های فایبرگلاس نگه‏داری شدند. شرایط مخازن آزمایشی در طول دوره مطالعه ثابت نگه داشته شد به‏طوری که دامنه­ی تغییرات دما و pH به‏ترتیب عبارت بود از 15 تا  17 درجه‏سانتی‏گراد و 8/6 تا 4/7.

پلان مواجهه با فلز کروم: پس از دوره تطابق، 24 نمونه از دوکفه­ای­ها در 4 تانک تقسیم شدند (سه مخزن آزمایشی و یک مخزن شاهد). با توجه به غلظت­های طبیعی فلز کروم و غلظتهای مورد استفاده آن در مطالعات پیشین (15)، در این مطالعه غلظت µg l-1 125 جهت معرض قرارگیری استفاده شد. در روزهای 4، 9 و 18 پس از معرض قرارگیری دوکفه­ای­ها با فلز کروم، از مخازن نمونه­گیری شد به طوری که در مجموع در هر بار نمونه­برداری حداقل 3 نمونه از دوکفه­ای­ها جهت استفاده توده­های بافتی برداشت ­شد.

بافت­شناسی: پوسته­های دوکفه­ای با استفاده­ی از یک اسکالپل جهت بریدن عضلات جمع­کننده قدامی و خلفی، باز شده و از بخش احشایی جدا گردید. سپس توده­ی بافتی با حجم تقریبی  5/0 سانتی‏متر مکعب از اندام­های آبشش، غده­ هاضمه و پا بریده شده و به‏منظور فیکس شدن به مدت 48 ساعت در محلول بوئن (پیکریک اسید اشباع: 75 بخش؛ فرمالدهید 40 درصد: 25 بخش؛ استیک اسید گلاسیال: 5 بخش) و به‏دنبال آن در اتانول 70 درصد نگهداری گردید. مراحل آماده­سازی و رنگ­آمیزی هماتوکسیلین ائوزین نمونه­های بافتی بر اساس پروتکل Hewitson and Darby  (16) انجام شد.

 

نتایج

وضعیت هیستولوژیک اندام­های مورد مطالعه در نمونه­های شاهد:

وضعیت هیستولوژیک اندام­های مورد مطالعه در بافت­های به‏دست آمده از نمونه­های شاهد در شکل 1 نشان داده شده است. در آبشش ساختارهای تیغه­های آبششی با اندازه­ و شکل یکسان با فواصل نسبتا برابر از هم مشاهده گردید (شکل 1- A).


 

شکل 1: برش­های بافتی 5 تا 7 میکرونی از نمونه­های شاهد اندام­های آبشش (A, B, C)، غده هاضمه (D, E, F) و پا (G, H, I). hch: کانال همولنف؛ ct: بافت پیوندی؛ gl: تیغه آبششی؛ ci: مژه؛ ep: اپی‏تلیوم؛ pt: توبول گوارشی اولیه؛ st: توبول ثانویه؛ dc: سلول­ گوارشی؛ bc: سلول­ بازوفیل؛ ha: هموسیت؛ cc: سلول­ پیوندی؛ mc: سلول موکوسی؛ mb: دسته­ میوسیت؛ t-mb: مقطع عرضی دسته میوست؛ l-mb: مقطع طولی دسته­ میوست.  رنگ‏آمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین.  

 


ساختارهای مژه­ای در اپی‏تلیوم یکپارچه­ تیغه­های آبششی به‏صورت کاملا واضح دیده شد (شکل 1- B) و در بخش­های درونی این اندام، کانال­های همولنفی در یک الگوی ردیفی مشاهده گردید به‏طوری که فواصل بینابینی آن‏ها را بافت پیوندی پر کرده بود (شکل 1- C). در غده­ی هاضمه، مقاطع عرضی توبول­های گوارشی اولیه و انشعابات چندگانه­ی آن به وضوح مشاهده گردید (شکل 1- D) به طوری که سلول­های گوارشی و بازوفیل تشکیل­دهنده ساختار توبول­ها قابل تشخیص بود (شکل 1- E). فضای بینابین توبول­ها نیز متشکل از سلولهای بافت پیوندی بود که در میان آن‏ها هموسیت­ها با پراکنش نامنظم و تعداد کم وجود داشتند (شکل 1- F). بخش عمده­ی بافت پا از دسته­های متراکم و یکپارچه­ی میوسیت تشکیل­ شده بود به طوری که در جهت­های مختلف توزیع شده­ بودند و مقاطع عرضی و طولی آن‏ها در برش­های بافتی مشاهده گردید (شکل 1- G و I). اپی‏تلیوم مژه­دار بیرونی این اندام نیز به‏طور کاملا مشخص دیده شد که ساختاری چین خورده را نشان می­داد (شکل 1- H). همچنین در بخش­های زیراپی‏تلیال پا، سلول­های بافت پیوندی فضای بینابین دسته­های میوسیت را پر کرده بودند و در قسمت­های نزدیک به اپی‏تلیوم سلول­های موکوسی نیز وجود داشتند (شکل 1- G).   

انواع تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده در اندام­ها: در آبشش تغییرات قابل توجهی در وضعیت هیستولوژیک تیغه­ها مشاهده شد. پوسته­پوسته­ شدن (lifting) و همچنین هیپوپلازی (تخریب ساختارهای مژه­ای) در اپی‏تلیوم تیغه­ها رخ داده بود (شکل 2-A و C) و در نتیجه آن گرزی شکل شدن تیغه­ها و کاهش فضای بینابینی آن‏ها و همچنین تخریب دیواره تیغه­ها و اتصال تیغه­های مجاور در محل­های تخریب مشاهده گردید (شکل 2- B، C و F). دیواره­ کانال­های همولنفی دچار هیپرپلازی شده و ضخامت آن افزایش یافته بود (شکل 2- D) و با گذشت زمان تخریب­های گسسته و آتروفی ساختار کانال دیده شد (شکل 2- E). گرانولوما (ظهور سلول­های دارای رنگدانه­های لیپیدی به رنگ زرد تا قهوه­ای روشن) در بافت­های پیوندی بینابین کانال­ها و همچنین در ناحیه­ی پایه­ی تیغه­های آبششی رخ داده بود (شکل 2- A و E). گسستگی­های بافتی شدید در نواحی قشری (محل تیغه­ها) و درونی (محل کانا­ل­های همولنفی) دیده شد (شکل 2- F).

 

 

شکل 2. برش­های بافتی 5 تا 7 میکرونی آبشش در نمونه­های معرض با فلز کروم. A: گرانولوما (gr) و پوسته­پوسته شدن (li) در ناحیه تیغه­های آبششی؛ B: گرزی شکل شدن تیغه­های آبششی و گسستگی دیواره تیغه­ها (tr) و اتصال تیغه­های مجاور (gl-cC: هیپوپلازی و کاهش ضخامت اپی‏تلیوم تیغه‏های آبششی؛ D: هیپرپلازی (hyp) و افزایش ضخامت اپی‏تلیوم کانال­های همولنفی؛ E: وقوع گرانولوما (gr) در بافت پیوندی بینابین کانال­ها و همچنین آتروفی کانال­های همولنفی؛ F: تغییرات نامنظم در طول و شکل تیغه­های آبششی و اتصال تیغه­های مجاور (gl-c) و گسستگی بافتی در تیغه­های آبششی و کانال­های همولنفی. رنگ‏آمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین. 

 

 

آشکارترین تغییر مشاهده شده در غده­ هاضمه، تخریب و گسستگی دیواره­ و آتروفی توبول­های گوارشی بود (شکل 3- A). در بافت­ پیوندی فضای بینابین توبول­ها، گسستگی بافتی و تجمع متراکم و تقریبا متمرکز هموسیت­ها به‏همراه گرانولوما مشاهده شد (شکل 3- B و C). در انشعابات چندگانه­ی توبول­های گوارشی، ریزش سلول­های بازوفیل و گوارشی به‏درون فضای توبول­ها نیز به‏طور گسترده رخ داده بود (شکل 3- B). هیپرپلازی شدید در دیواره­ی توبول­های گوارشی (شکل 3- D) هم دیده شد.

مشابه آبشش، هیپوپلازی و تخریب اپی‏تلیوم بیرونی در پا نیز اتفاق افتاد (شکل 4- A و B). در موارد بسیاری افزایش تعداد سلول­های موکوسی در محل­های اپی‏تلیوم تخریب شده مشاهده گردید (شکل 4- B). در بخش­های درونی­تر گسستگی و اضمحلال دسته­های میوسیت پراکنده شده در این اندام در مقایسه با وضعیت شاهد دیده شد (شکل 4- C و D). همچنین تورم ابری میوسیت­ها نیز رخ داده بود (شکل 4- D).   

 

 

شکل 3: برش­های بافتی 5 تا 7 میکرونی از غده هاضمه در نمونه­های در معرض با فلز کروم. A و B: آتروفی و تغییرشکل در ساختار دیواره­ی توبول­های گوارشی و گسستگی بافتی (tr) در بافت­ پیوندی بینابین توبول­ها؛ C: گسستگی بافتی (tr) در بافت پیوندی و تجمع متراکم هموسیت­ها (ha) و وقوع گرانولوما (grD: هیپرپلازی (hyp) سلول­های گوارشی در دیواره­ی توبول­های گوارشی. رنگ‏آمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین. 

 

 

شکل 4: برش­های بافتی 5 تا 7 میکرونی پا در نمونه­های در معرض با فلز کروم. A: هیپوپلازی (hpo) و گسستگی (tr) در ساختار اپی‏تلیوم بیرونی؛ B: هیپوپلازی (hpo) و افزایش تعداد سلول­های موکوسی (mc) در اپی‏تلیوم بیرونی؛ C: گسستگی بافتی (tr) در ساختار بافت عضلانی بخش زیراپی‏تلیال؛ D: تورم (sw) میوسیت­ها و گسستگی­ بافتی (tr) در ساختار دسته­های میوسیت در بخش­های داخلی پا. رنگ‏آمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین. 

 

روند زمانی وقوع تغییرات هیستوپاتولوژیک:

روند زمانی ظهور انواع تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده در اندام‏های مورد مطالعه در جدول 1 آمده است. در روز چهارم، تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از مواجهه با فلز کروم در هر سه اندام مشاهده شد به‏طوری که بخش­های سطحی اندام­ها را تحت تاثیر قرار داده بودند. در روز نهم تغییرات شدیدتری مشاهده گردید که بدشکلی­های ساختاری قابل توجهی را در هر سه اندام­ منجر شده بود. در روز هجدهم نیز علائم جدیدتری در دو اندام آبشش و پا دیده شد که باز هم پیشرفت گستره تاثیر فلز کروم را نشان داد به‏طوری که بخش­های درونی­تر را درگیر کرده بود.

 


 

جدول 1:  ترتیب زمانی وقوع انواع مختلف تغییرات هیستوپاتولوژیک در اندام­های مختلف در طول دوره­ی مطالعه­ی 18 روزی.

اندام

زمان

روز چهارم

روز نهم

روز هجدهم

آبشش

هیپوپلازی اپی‏تلیوم تیغه­های آبششی

پوسته­پوسته شدن اپیتلیوم تیغه­ها

 

گرزی شکل شدن و تغییر طول تیغه­ها

کاهش فواصل بین تیغه­ها

هیپرپلازی دیواره کانال­های همولنفی

گرانولوما

گسستگی کانال­ها و آتروفی آنها

به هم چسبیدگی تیغه­های مجاور در نقاط تخریب دیواره‏تیغه ها

غده هاضمه

ریزش سلول­های گوارشی و بازوفیل به فضای درونی توبول­ها

آتروفی توبول­های گوارشی

تجمع هموسیت­ها در بافت­ پیوندی بینابین توبول­ها

گرانولومای گسترده

 

پا

هیپوپلازی اپی‏تلیوم

افزایش تعداد سلول­های موکوسی در لایه زیراپی‏تلیال

گسستگی بافتی در اپی‏تلیوم و بخش­های زیراپی‏تلیال

تورم و گسستگی در ساختار دسته­های میوسیت

 


بحث

مطالعات متعدد انجام شده تغییرات هیستوپاتولوژیکی ناشی در معرض قرارگیری با فلزات سنگین را به‏عنوان شاخص­هایی مناسب جهت پایش اثرات آلودگی­ این عناصر بر موجودات زنده پیشنهاد کرده­اند (3، 7، 9، 17). نتایج به‏دست آمده در این تحقیق نشان داد که در معرض قرار گیری با غلظت تحت کشنده­ی فلز سنگین کروم در مدت 18 روز تغییرات هیستوپاتولوژیکی قابل توجهی را در سه اندام آبشش، غده­ی هاضمه و پا به دنبال دارد. هر چند این سه اندام عمل‏کردهای متفاوتی دارند (آبشش: عمل‏کرد فیلتراسیونی؛ غده­ هاضمه: عمل‏کرد تغذیه­ای و پا: عمل‏کرد حرکتی) (18) و مسیرهای معرض قرارگیری با فلز در آن‏ها متفاوت است، اما در روز چهارم پس از معرض قرارگیری با فلز کروم تغییرات بافتی در هر سه اندام مشاهده گردید.

نتایج مطالعات پیشین در موارد زیادی همسو با نتایج به‏دست آمده در این پژوهش است. وقوع گرانولوما ناشی از جذب فلزات سنگین دانسته شده است (19،20 و 21). همچنین نفوذ و تجمع هموسیت­ها، به‏عنوان یک پاسخ دفاعی در محل­های آسیب­ دیده در بافت­های مختلف بی­مهرگان گزارش شده است (22) که در مطالعه­ی حاضر نیز چنین علائمی در آبشش و غده هاضمه مشاهده شد. افزایش سلول­­های موکوسی در پا به احتمال زیاد در پاسخ به تخریب مژه­های اپی‏تلیوم و نقص فرآیند حرکتی این اندام رخ داده است. افزایش تعداد سلول­های موکوسی پوششی در اویسترها در معرض با آلاینده­های شیمیایی گزارش شده است (23). تغییرات عمده­ی هیستولوژیکی ناشی از حضور آلاینده­ها در دوکفه­ای­ها به صورت فرم نامنظم سلول­های گوارشی و بازوفیل و واکوئل­ها ذکر گردیده است (24). تغییر در اندازه میوسیت­های موجود در گروه­های میوسیت و همچنین تخریب ساختار گروهی میوسیت­ها در بلوک­های عضلانی عضلات جمع‏کننده­ در ماسل­ها در نتیجه مواجهه با فلز مس مشاهده شده است (25). در این مطالعه چنین تغییراتی در ساختارهای عضلانی پا مشاهده شد. ناهنجاری‏­های شکلی در آبشش و غده­ی هاضمه نیز که در این مطالعه رخ داده بود، در مطالعات پیشین (20، 25، 26، 27 و 28) گزارش شده است. وقوع گسستگی بافتی در بافت­های مختلف نیز در نتیجه در معرض قرارگیری با فلزات سنگین گزارش شده است (25).

بررسی الگوی زمانی تغییرات هیستوپاتولوژیک در اندام­های مختلف می­تواند یک روی‏کرد مناسب را جهت تعیین دقیق زمان‏های وقوع آلودگی در محیط­های آبی ارائه دهد. در این مطالعه در هر سه اندام در روز چهارم علائم تغییر مشاهده شد و به تدریج با افزایش دوره معرض گذاری، علائم مشاهده شده نشان دهنده­ افزایش گستره و شدت آسیب­ها در اندام­های مورد مطالعه بود. در مطالعات پیشین (24، 26 و 27) دوره­های زمانی مواجهه با فلزات سنگین و سایر آلاینده­ها بیش از 10 روز بوده است و تغییرات هیستوپاتولوژیک پس از اتمام دوره مورد بررسی قرار گرفته­اند، اما در این مطالعه زمان­های ظهور علائم به‏صورت مشخص در دفعات مختلف در طول دوره مطالعه­ی 18 روزی پس از معرض قرارگیری تعیین گردید و اولین زمان روز چهارم بود. این الگوی به‏دست آمده می­تواند در پایش­های محیطی بسیار مفید باشد. 

 

نتیجه­گیری

در مجموع با توجه به نتایج به‏دست آمده در این مطالعه احتمالا می­توان تغییرات هیستوپاتولوژیکی در سه اندام آبشش، غده­ هاضمه و پا در دوکفه­ای آب شیرین Anodonta cygnea را به‏عنوان بیومارکرهایی در رابطه با در معرض قرار گیری با فلز سنگین کروم به‏عنوان نمونه­ای از آلاینده­های فلزی سنگین مورد استفاده قرار داد. همچنین روند زمانی مشاهده شده در ظهور این بیومارکرهای هیستوپاتولوژیک، سودمندی آن‏ها را جهت تعیین دقیق­تر اثرات آلودگی دوچندان می­سازد. 

1. Banfalvi, G. Cellular effects of heavy metals. 1th Ed. London, U.K. Springer. 2011.
2. Forstner, U, Wittman, G.T. Marine pollution in the aquatic environment. 2th Ed. Berlin. Springer; 1983.
3. Rainbow PS. Trace metal concentrations in aquatic invertebrates: why and so what? Environ. Pollut. 2002; 120(3): 497-507.
4. Buhl KJ, Hamilton SJ. Comparative toxicity of inorganic contaminants related by placer mining to early life stages of salmonids. Ecotox. Environ. Safe. 1990; 20(3): 325-342.
5. Livingstone DR, Chipman JK, Lowe DM, Minier C, et al. Development of biomarkers to detect the effects of organic pollution on aquatic invertebrates: recent immunological studies on the common mussel (Mytilus edulis L.) and other mytilids. Int. j. Environ. Pollut. 2000; 13: 1-6.
6. Van Duren LA, Herman PMJ, Sandee AJJ, Heip CHR. Effects of muscle filtering activity on boundary layer structure. J. Sea Res. 2006; 55: 3-14.
7. Au DWT. The application of histo-cytopathological biomarkers in marine pollution monitoring: a review. Mar. Pollut. Bull. 2004; 18: 817-834.
8. Senger H, Braunbeck T. Cellular response profile to chemical stress. In: Schurmann, G., Braunbeck, T. (eds.). Ecotoxicology. New York. John Wiley & Sons. 1998; 521-569.
9. Zorita I, Ortiz-Zarragoitia M, Soto M, Cajaraville MP. Biomarkers in mussels from a copper site gradient (Visnes, Norway): An integrated biochemical, histochemical and histological study. Aquat. Toxicol. 2006; 78: 109-116.
10. Lowe FM. Alterations in cellular structure of Mytilus edulis resulting from exposure to environmental contaminants under field and experimental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser. 1988; 46: 91-100.
11. Cajaraville MP, Marigomez I, Diez G, Angulo E. Comparative effects of the water accommodated fractions (WAF) of tree oils and mussels. 2. Quantitative alterations in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem. Physiol. 1992; 102: 113-123.
12. Yevich P.P, Yevich C.A. Use of histopathology in biomonitoring marine invertebrates. In: Kramer, K.J.M. (eds.). Coastal waters and estuaries. 2th Ed. New York. CRC Press; 1994; 179-192.
13. Syasina IG, Vaschenko MA, Zhadan PM. Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia: Pectinidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 1997; 44(1): 85-98.
14. WHO/IPCS. Environmental health criteria 221 for Zinc. World Health Organization, International Programme on Chemical Safety, Geneva. 2001; 123.
15. Naimo, TJ. A review of the effects of heavy metals on freshwater mussels. Ecotox. 1995; 4(6): 341-362.
16. Hewitson, T.D., Darby, I.A. Histology protocols. 1th Ed. New York. Humana Press Inc. 2010.
17. Golovanova, I.L. Effects of heavy metals on the physiological and biochemical status of fishes and aquatic invertebrates. Aquat. Toxicol. 2008; 1: 93-101.
18. Gosling, E. Bivalve molluscs: biology, ecology and culture. Fishing new books. 1th Ed. New Jersey, Hoboken. Blackwell Science. 2003.
19. Johansson MW, Soderhäll K. Cellular defense and cell adhesion in crustaceans. Anim. Biol. 1992; 1: 97-107.
 
20. Usheva LN, Vaschenko VB, Durkina VB. Histopathology of digestive gland of bivalve mollusc Crenomytilus graganus (Dunker, 1853) rom southwestern Peter the Great Bay, Sea of Japan. Russ. j. mar. boil. 2006; 32(3): 166-172.
21. Chakraborty S, Ray M, Ray S. Arsenic toxicity: A heart-breaking saga of a freshwater mollusc. Tissue Cell. 2012; 44(3): 151-155.
22. Oliver, LM, Fisher WS. Appraisal of prospective bivalve immunomarkers. Biomarkers. 1999; 4(6): 510-530.
23. Watterman B, Thomsen A, Kolodzy H, Daehne B, et al. Histopathological lesions of molluscs in the harbor of Norderney, Lower Saxony, North Sea (Germany). Helgol.  Mar. Res. 2008; 62: 167-175.
24. Tripp M.R, Fries C.R. histopathology and histochemistry. In: Giam, C.S., Ray, L.E. (eds.). Pollutant studies in marine animals. 3th Ed. Boca Raton. CRC Press Inc; 1987; 337-324.
25. Al-Subiai Sh N, Moody AJ, Mustafa SA, Jha AN. A multiple biomarker approach to investigate the effects of copper on the marine bivalve mollusc, Mytilus edulis. Ecotox. Environ. Safe. 2011; 74: 1913-1920.
26. Chakraborty S, Ray M, Ray S. Toxicity of sodium arsenite in the gill of an economically important mollusc of India. Fish. Shellfish. Immune. 2010; 29(1): 136-146.
27. Sheir SK, Handy RD. Tissue injury and cellular immune responses to cadmium chloride exposure in the common mussel Mytilus edulis: modulation by lipopolysaccharide. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2010; 59: 602-813.
28. Sheir SK, Handy RD, Galloway TS. Tissue injury and cellular immune responses to mercuric chloride exposure in the common mussel Mytilus edulis: modulation by lipopolysaccharide. Ecotox.