اثر مایع مغزی-نخاعی جنینی بر توانایی تکثیر و حفظ حالت بنیادی پروژنیتورهای عصبی رت نژاد ویستار

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: در سال‏های اخیر شواهد چندی، نقش تکوینی برای مایع مغزی-نخاعی قایل شده‌اند. در این مطالعه تاثیر مایع مغزی-نخاعی جنینی بر توانایی تکثیر و ویژگی‌های بنیادی بودن سلول‏های پروژنیتور عصبی بررسی شده ‌است.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه کورتکس جنین‏های 5/15 روزه رت نژاد ویستار در شرایط استریل جدا و به‏روش آنزیمی به سوسپانسیون سلولی تبدیل گشت. سپس سلول‏ها با تراکم 50 الی 100 سلول در هر میکرولیتر محیط کشت DMEM/F12 حاوی مکمل N2 و فاکتور رشد EGF وFGF-2 کشت داده ‌شد. در گروه کنترل فقط از محیط کشت استاندارد استفاده شد در حالی‏که گروه‏های آزمایشی با مایع مغزی-نخاعی روزهای مختلف جنینی (16، 18 و 20) به نسبت 10 به 100 (حجمی-حجمی) تیمار‌شدند. شمارش تعداد نوروسفیرها و بیان مارکر ویمنتین جهت بررسی توانایی تکثیر و حالت بنیادی مورد استفاده قرار گرفت. میزان بقای سلولی با استفاده از تست MTT سنجیده شد. نتایج بدست آمده از طریق آزمون آنالیز واریانس یک طرفه بررسی شد.
نتایج : مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای 16 و18 تعداد نووروسفیرها و همچنین میزان بقای سلولی را افزایش داد.
نتیجه گیری: مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای مختلف جنینی به صورت وابسته به زمان تاثیرات متفاوتی بر تکثیر و بقای سلول‏های پروژنیتور عصبی می‌گذارند. همچنین این مایع حالت بنیادی سلولهای پروژنیتور عصبی را در حالت بنیادی تثبیت می‌کند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

در طی فرآیند نورولاسیون با جوش خوردن چین­های عصبی، مایع آمنیوتی درون لوله عصبی شکل گرفته، محبوس می­شود و از این مقطع زمانی به بعد به این مایع عنوان مایع مغزی-نخاعی اطلاق می­شود (1). در مراحل بعدی رشد و نمو جنینی سلول‏هایی که سطح داخلی لوله عصبی را پوشش می­دهند شروع به ترشح مایع مغزی-نخاعی می­کنند و در مراحل بعدی با پیشرفت تکوین جنین گروهی از سلول‏های اپی­تلیالی تخصص­ یافته در موقعیت سقف بطن­های مغز جنین شروع به شکل­گیری می­کنند که این سازمان بافتی، شبکه کوروئیدی نامیده می­شود و در ادامه حیات جانور نقش اصلی ترشح مایع مغزی نخاعی را بر عهده می­گیرد (2). در دهه­های گذشته مطالعات دانشمندان اغلب بر روی عمل‏کردهای فیزیولوژیکی این مایع استوار بود. لذا وظایفی شامل حذف سموم متابولیکی، ممانعت از تاثیرات مخرب ضربات فیزیکی به‏واسطه نقش هیدروستاتیکی که این مایع با پخش کردن نیروهای وارده ایفا می­کند و همچنین ایجاد حالت بافری در برابر ضربان‏های سرخرگی و بسیاری اعمال دیگر که با ویژگی‏های هیدروستاتیکی مایع مغزی نخاعی مرتبط می­باشد (3 و4).

در سال‏های اخیر نقش تکوینی مایع مغزی نخاعی مورد توجه قرار گرفت. Miyan و همکاران (3) نشان دادند که مایع مغزی نخاعی نقش حیاتی در تکوین سیستم عصبی مرکزی بر عهده دارد.

مطالعات نشان داد که در بسیاری از بیماری­های تحلیل­برنده عصبی شامل مالتیپل اسکلروزیس و آلزایمر میزان فاکتورها و مورفوژن‏های حاضر در مایع مغزی نخاعی تفاوت فاحشی نسبت به‏حالت طبیعی را به نمایش می­گذارد (5، 6 و 7). همچنین در گروهی دیگر از بیماری‏های عصبی شامل هیدروسفالی و اسپینا بیفیدا به‏علت اختلال در جریان مایع مغزی-نخاعی آسیب­های شدید و غیرقابل برگشتی به تکوین طبیعی مغز جنین و نوزاد بعد از تولد وارد می­شود (8 و 9).

مطالعات پروتئومیکی مایع مغزی-نخاعی جنینی تفاوت معنی‏داری را از لحاظ محتوای پروتئینی و همچنین میـــزان فاکتورهای رشد و سیتوکین­های موجود در آن، نسبت به مایع مغزی نخاعی جانور بالغ نشان می­دهد. همچنین مطالعات نشان داده است که این ویژگی (تفاوت محتوی پروتئینی مایع مغزی-نخاعی جنین به بالغ) در اکثر گونه­های مهره­داران شامل پرندگان، جوندگان و پستانداران مشاهده می‏شود (10 و 11).

شواهد نشان داده است که ظهور نخستین نورون‌ها در قشر مخ جنین انسان در مرحله کارنگی 21 (CS 21) صورت می‌گیرد که از لحاظ زمانی تقریبا با شروع شکل‌گیری شبکه کوروئیدی و تولید CSF مقارن است (12). این تقارن زمانی در رابطه با شکل‌گیری شبکه کوروئیدی و آغاز کورتیکوژنسیس، در سایر گونه‌های جانوری نظیر موش و رت نیز صدق می‌کند (12).

در این مطالعه سعی بر آن شده است که تاثیر مایع مغزی نخاعی جنین­های روزهای مختلف رت نژاد ویستار بر روی پروژنیتورهای عصبی برگرفته از جنین رت مورد سنجش و ارزیابی قرار گیرد و تغییرات رفتار سلول‏های تیمارشده از نظر رشد و تکثیر و همچنین ویژگی‏های فنوتیپی به‏طور مقایسه­ای ارزیابی قرار شود.

 

مواد و روشها

حیوانات: رت­های نژاد ویستار مورد آزمایش در این مطالعه از مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی فراهم شد.  تمامی آزمایش‏ها بر اساس قوانین اخلاقی مورد تایید دانشگاه خوارزمی صورت گرفت. در این مطالعه جنین­های رت نژاد ویستار جهت جداسازی سلولهای پروژنیتور عصبی و همچنین جمع آوری مایع مغزی نخاعی مورد استفاده قرار گرفتند، به‏طوری‏که از جنین­های روزهای 16، 18 و 20 جهت جمع­آوری مایع مغزی-نخاعی و از جنین­های 5/15 روزه برای انجام کشت سلولی استفاده شد. روز مشاهده پلاک واژنی به‏عنوان روز صفر جنینی تلقی شد.

جمع آوری مایع مغزی-نخاعی: رت‏های حامله با تزریق فنوباربیتورات سدیم کشته شدند و جنین­های روزهای 16، 18 و 20 از رحم رت حامله در شرایط کاملا استریل خارج و به پتریهای حاوی PBS سرد منتقل شدند. در ادامه با استفاده از لوله موئین استریل مایع مغزی نخاعی جنین­های روزهای مختلف از محل cisterna magna و با استفاده از خاصیت مویینگی، جمع شد. لوله‏های حاوی مایع مغزی-نخاعی در طی مراحل جمع آوری در محیط 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری‏شدند. بعد از اتمام کار جمع آوری مایع مغزی- نخاعی، میکروتیوب‏های حاوی این مایع، در 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند تا هرگونه بقایای سلول‏های مرده و سلول‏های خونی احتمالی موجود در آن ته ­نشین شود. سپس مایع شفاف رویی به لوله‏های استریل جدید منتقل شد. تجربه نشان داده است که از هر جنین به‏طور متوسط 10 الی 50 میکرولیتر مایع مغزی- نخاعی می­توان گردآوری نمود. پس از اتمام کار جمع­آوری، نمونه­های جمع­آوری­شده به فریزر 80- درجه سانتی­گراد منتقل شدند تا در مراحل بعدی مورد استفاده قرار گیرند.

کشت سلولی: رت­های باردار در روز حاملگی 5/15 با استفاده از تزریق درون صفاقی دوز بالای فنوباربیتورات سدیم کشته شدند. سپس رحم­ها در شرایط کاملا استریل خارج شده و به پتری‏های حاوی PBS سرد منتقل شدند. در ادامه کورتکس‏های جدا شده از مغز جنین با استفاده از آنزیم تریپسین-EDTA (Invitrogen) به‏حالت سوسپانسیون سلولی در آمد. سوسپانسیون سلولی در ظرف 24 خانه­ای (Nunc) حاوی محیط کشت DMEM/ F12 و مکمل N2 (هر دو از Invitrogen) و یک درصد آنتی­بیوتیک (Invitrogen) و همچنین فاکتورهای رشد FGF2، (20 ng/ml) و EGF (20 ng/ml) کشت داده شدند (هر دو ازInvitrogen).

تعداد نوروسفیرها: پس از گذشت 4 روز از شروع کشت پروژنیتورها در گروه کنترل و گروههای تیمار شده با مایع مغزی-نخاعی روزهای مختلف جنینی، از کشتها با ابژکتیو 10x عکسبرداری بعمل آمد. سپس با استفاده از نرم افزار تحلیل تصاویر تحت عنوان image j تعداد نوروسفیرها در تصاویر مختلف شمارش شد و در ادامه مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار گرفت.

تست MTT: رشد و بقای سلولی با استفاده از روش بیوشیمیایی MTT سنجیده ­شد. در این روش، کاهیدگی (Sigma) MTTبه کریستال‏های فومارازان (در نتیجه تاثیر آنزیم‏های دهیدروژناز میتوکندری‏های سلول­های زنده) صورت می­گیرد و بدین ترتیب به‏عنوان یک شاخص بقای سلولی مورد استفاده قرار می­گیرد. کریستال‏های فومارازان ایجاد شده سپس در ایزوپروپانول اسیدی حل و میزان جذب نوری این محلول با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موج 570 نانومتر خوانده شد.

ایمونوسیتوشیمی: جهت بررسی بیان مارکر سلول‏های بنیادی عصبی (Vimentin) نوروسفیرهای گروه‏های کنترل و تیمار شده با مایع مغزی-نخاعی روزهای مختلف جنینی جمع­آوری می­شود و به‏حالت سوسپانسیون سلولی درآورده شد. سپس سوسپانسیون سلولی به ظرف‏های اندودشده با poly-L-lysine  (  (Sigma منتقل شد. بعد از گذشت 24 ساعت و چسبیدن سلول‏ها به کف ظرف، محیط کشت رویی سلول‏ها خارج  و بعد از شستشوی سلول‏ها با PBS، با پارافرمالدهید 4 درصد فیکس شدند.

در ادامه سلول‏ها با تریتون 100) X-  (Sigma-USAنفوذپذیر  و با BSA آنتی­ژن‏های غیراختصاصی بلوکه شدند. در نهایت سلول‏ها با آنتی­بادی اولیه ویمنتین (Vimentin) (Abcam-UK)با غلظت 500/1 به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. سلول‏ها بعد از شستشو به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد، باآنتی­بادی ثانویه کونژوگه شده با(Abcam-UK) Cy3 با غلظت 300/1 انکوبه گردیدند. سپس هسته سلول‏ها با پروپیدیوم یدید (Propidium Iodide=PI)15000/1Sigma-USA) ) رنگ­آمیزی و با میکروسکوپ فلورسانس ((Olympus, Tokyo, Japan عکسبرداری شدند.

گروه­بندی کشت‏های سلولی: کشت‏های سلولی به گروه‏های مختلف تقسیم شد. در گروه کنترل فقط از محیط کشت استاندارد جهت کشت نوروسفیرها استفاده شد. و در گروه‏های آزمایشی از CSF های روزهای جنینی مختلف جهت تیمار کشت‏های سلولی استفاده شد. غلظت مورد استفاده CSF در تمامی گروه‏های آزمایشی 10 درصد حجمی/حجمی بود.

آنالیزهای آماری: جهت آنالیزهای آماری از آزمون One-way ANOVA و Tukey’s  استفـــاده شد. داده­ها به شکل میانگین SEM ± بیان شدند و معنی­داری میانگین‏ها با     05/0P < نشان داده شدند.

 

نتایج

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که مایع مغزی-نخاعی جنینی جمع­آوری شده از روزهای مختلف جنینی، تاثیرات متفاوتی را بر رفتار تکثیری سلول‏های پروژنیتور جنینی برجای می­گذارند. آزمایشات نشان داد که تعداد نوروسفیرهای موجود در گروه‏های تیمار شده با مایع مغزی نخاعی جنینی در روز 16 و 18 به طور معنی­داری نسبت به نوروسفیرهای گروه کنترل که تنها با عوامل میتوژنیک تیمار شده بودند، افزایش پیدا کرده است. همچنین یافته­ها حاکی از آن است که تعداد نوروسفیرهای  موجود در گروه‏های تیمارشده با مایع مغزی-نخاعی جنینی روز 20 ام جنینی نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی­داری را نشان نداد (شکل1 و نمودار1). مشاهدات نشان داده است که تعداد نوروسفیرها رابطه مستقیمی با توانایی تکثیر سلول‏های تشکیل دهنده آن داشت و همچنین نشانگر حفظ حالت بنیادی این سلول‏ها بود.

 

 

شکل 1: تاثیر مایع مغزی-نخاعی روزهای مختلف جنینی بر تعداد نوروسفیرها (a  نوروسفیرهای کشت داده در گروه کنترل که به مدت 4 روز فقط در حظور عوامل رشد (شامل EGF و FGF-2) رشد داده شده اند.b ، c وd  ) به‏ترتیب نوروسفیر های کشت داده شده در حضور مایع مغزی-نخاعی روزهای 16 ،18 و20 جنینی.

 

 

نمودار 1: تاثیر مایع مغزی-نخاعی جنینی بر تعداد نوروسفیرها را تحت شرایط ذکر شده نمایش می دهد(E16،E18وE20 شرایط کشت تحت تاثیر مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای 16، 18و20 جنینی وcontrol  شرایط کشت فقط در حضور عوامل رشد را نشان می‏دهد.


یافته­های ایمونوسیتوشیمی نشان داد که مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای مختلف جنینی در حفظ حالت بنیادی پروژنیتورهای عصبی موثر­است. مارکر سلول‏های بنیادی عصبی که در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت ویمنتین بود که به‏عنوان یک مارکر فنوتیپی شاخص برای بنیادی بودن سلول‏های پروژنیتور و عصبی مورد استفاده قرار می­گیرد. نتایج نشان داد که سلـول‏هـای تیمار شـده با مـایع مغزی- نخاعی جنینی روزهـای مختلف جنینی توانایی بیان این مارکر را دارا می­باشند (شکل 2).

 

 

شکل 2: تاثیر مایع مغزی-نخاعی جنینی بر بیان پروتئین ویمنتین (به‏عنوان مارکر سلول‏های بنیادی عصبی).a  ) سلول‏های مشتق از نوروسفیرهای گروه کنترل که فقط تحت تاثیر عوامل رشد (شامل  EGF و FGF-2) قرار گرفته اند.b ،c وd به‏ترتیب سلول‏های مشتق از نوروسفیرهای متاثر از مایع مغزی-نخاعی روزهای 16 ،18 و20 جنینی را نمایش می دهد. ویمنتین با رنگ سبز و هسته‏ها به رنگ قرمز که توسط پروپیدیوم یدید (PI) رنگ‏آمیزی شده‏اند دیده می‏شوند.

 

نمودار2: قدرت رشد و بقای پروژنیتورهای عصبی سنجش شده با تست MTT . E16،E18 و E20  شرایط کشت تحت تاثیر مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای 16،18و20 جنینی وcontrol  شرایط کشت فقط در حضور عوامل رشد را نشان می‏دهد.

 


نتایج بررسی بقای سلولی که بوسیله تست MTT مورد بررسی قرار گرفت نیز نشان داد که میزان بقای سلولی سلول‏های پروژنیتور عصبی تیمار شده با مایع مغزی-نخاعی جنینی 16 و 18 به‏طور معنی­داری نسبت به سلول‏های گروه کنترل افزایش پیدا کرده است (نمودار 2).

 

بحث

نتایج ارائه شده در این مطالعه نشان داد که مایع مغزی-نخاعی جنینی توانایی تنظیم تکثیر و بقای پروژنیتورهای عصبی را دارا می­باشد. همچنین نتایج حاکی از آن است که مایع مغزی-نخاعی جنینی دارای الگوی تغییر وابسته به زمان می­باشد و لذا مایع استخراج شده از روزهای مختلف جنینی، تاثیرات متفاوتی را بر رفتار پروژنیتورهای عصبی به‏جا می­گذارد.

این یافته­ها، نتایج تحقیقات قبلی که به‏صورت in vivo و in vitro انجام گرفته است را تأیید می­نماید. در واقع شواهد فراوانی در سال‏های اخیر به‏دست آمد که نشان­دهنده نقش انکار ناپذیر مایع مغزی-نخاعی در شرایط طبیعی همچنین حالت‏های مختلف پاتولوژیکی مغز، می­باشد (13و14).

در این مطالعه از سلول‏هایی پروژنیتور عصبی که به‏حالت نوروسفیر کشت داده می­شوند به‏عنوان مدلی برای بررسی تاثیرات مایع مغزی نخاعی جنینی بر آن‏ها استفاده شد. در این روش برخلاف سایر روش‏های گذشته، سلول‏های تشکیل­دهنده نوروسفیرها تقریبا جمعیت همگنی را از نظر سرنوشت سلولی تشکیل می­دهند (15). روش‏های قبلی اکثرا از روش‏هایی استفاده شده بود که در آن‏ها مجموعه ناهمگنی از سلول‏ها حضور داشتند. (13 و 16)

داده­های این مطالعه نشان­دهنده افزایش معنی­داری در تعداد نوروسفیرهای کشت­های تیمارشده­ با مایع مغزی-نخاعی جنینی روزهای 16 و 18، در مقایسه با گروه کنترل بود. مطالعات نشان داده که تعداد نوروسفیرها رابطه مستقیمی با توانایی بنیادی بودن سلول‏های عصبی و قدرت تکثیر آن‏ها دارد (17). لذا این نتایج قویا پیشنهاد می­کند که مایع مغزی-نخاعی نقش مهمی در تنظیم توانایی تکثیر و self-renewal پروژنیتورهای عصبی دارا می­باشد.

همچنین داده­های ایمونوسیتوشیمیایی نشان داد که در گروه‏های تیمارشده با مایع مغزی-نخاعی جنینی تفاوت معنی­داری با گروه­های کنترل از لحاظ بیان ویمنتین (بعنوان مارکر سلول‏های بنیادی عصبی) دیده نمی­شود (18). یکی از ویژگی‏های محتوایی CSF مغز در حال تکوین، غلظت بالای پروتئین ها در آن می‏باشد (19). در ابتدا برخی محققان حضور غلظت بالای پروتئین CSF جنینی را شاهدی برای نارس بودن سد مغزی می‏دانستند (20). در مغز در حال تکوین مکانیسمی در سلول‏های اپی‏تلیالی شبکه کوروئیدی وجود دارد که گذر پروتئینی‏ها از پلاسما به CSF را میسر می‏سازد که به دو روش صورت می‏گیرد.  اولی به‏روش انتشار غیر فعال و دیگری روش اختصاصی که در مورد پروتئین‏های مختلف و در گونه‏های مختلف به شکل‏های مختلف انجام می‏گیرد (مانند آلبومین). این نوع پروتئین‏ها به صورت تکوینی تنظیم می‏شوند و با نهایی شدن تکوین به سرعت افت می‏کنند (21).

پیوندهای محکم  بین سلولی که در سلول‏های نورواپی‏تلیال وجود دارد باعث ایجاد سد مغزی می‏گردد و مانع از انتشار پروتئین‏های درون مایع مغزی-نخاعی به‏داخل فضای بین سلولی بافت مغز می‏گردد که تنظیم این امر نیز حالت وابسته به زمان می‏باشد (22). این نوع پیوند با پیشرفت تکوین مغز و نزدیک شدن به زمان تولد ناپدید می‏شود و به موازات آن غلظت پروتئین داخل CSF نیز افت می‏کند. شواهد حاکی از آن است که بیشترین غلظت محتوای پروتئینی CSF مقارن  با بیشترین مقدار نورون زایی (تکثیر) و تشکیل صفحه قشری (cortical plate) در مغز جلویی می باشد (21).

نتایج حاصل از تست MTT نیز نشان داد که پروژنیتورهای عصبی تیمار شده با مایع مغزی نخاعی قدرت تکثیر و بقای بیشتری را نسبت به گروه کنترل دارا می­باشند.

با توجه به عمل‏کردی که مایع مغزی-نخاعی جنینی در حفظ حالت بنیادی پروژنیتورهای عصبی دارا می­باشد، لذا نیاز به تحقیقات دامنه­دارتری احساس می­شود که میزان دقیق فاکتورهای موثر بر تکثیر و بقای سلول‏های بنیادی عصبی، حاضر در مایع مغزی نخاعی را مشخص سازند. با توجه به اینکه در بیماری‏های تحلیل­برنده عصبی و همچنین ناهنجاری‏های جنینی که در تکوین سیستم عصبی مرکزی اختلال ایجاد می­کنند. اختلالاتی درمحتویات مایع مغزی نخاعی نیز ایجاد می‏شود. از این رو مطالعه بر روی عوامل موثر حاضر در مایع مغزی نخاعی و اثرات سینرژیتیک آن‏ها بر همدیگر می­تواند به‏عنوان یک روش درمانی جایگزین پیشنهاد شود.

نتیجه­گیری

مایع مغزی- نخاعی جنینی به‏طور وابسته به سن جنینی بر تکثیر و بقای سلولی نوروپروژنیتورهای عصبی تاثیر می­کند. همچنین مایع مغزی-نخاعی جنینی باعث حفظ حالت بنیادی نوروپروژنیتورهای عصبی می­گردد.

 

تشکر و قدردانی

این مطالعه در آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی انجام گرفته است.

  1. Sadler, T.W. Langman’s Medical Embryology, 8th Ed; Lippincott Williams & Wilkins: Baltimore, MD; 2000.
  2. Dziegielewska KM, Ek J, Habgood MD. Development of the Choroid Plexus. Microsc Res Tech. 2001; 52(1): 5-20.
  3. Miyan JA, Nabiyouni M, Zendah M. Development of the brain: a vital role for cerebrospinal fluid. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2003; 81 (4), 317-28.
  4. Segal MB. Extracellular and cerebrospinal fluid. J Inherit Metabol Dis. 1993; 16: 617-38.
  5. Palmert MR, Podlisny MB, Witker DS, Oltersdorf T, et al. The beta-amyloid protein precursor of Alzheimer disease has soluble derivatives found in human brain and cerebrospinal fluid. Proc Natl Acad Sci. 1989; 86(16): 6338–6342.
  6. Hayashi Y, Kashiwagi K, Ohta J, Nakajima M, et al. Alzheimer Amyloid Protein Precursor Enhances Proliferation of Neural Stem Cells from Fetal Rat Brain.Bichem Biophys Res Commun. 1994; 201(1): 936-943.
  7. Cid C, Alcazar A, Regidor I, Masjuan J, et al. Neuronal apoptosis induced by cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients correlates with hypointense lesions on T1 magnetic resonance imaging. J Neurol Sci. 2002; 193(2): 103-109.
  8. Cains S, Shepherd A, Nabiuni M, Owen-Lynch PJ, et al. Addressing a folate imbalance in fetal cerebrospinalfluid can decrease the incidence of congenital hydrocephalus. J Neuropathol Exp Neurol.  2009; 68: 404-16 .
  9. Mashayekhi F, Draper CE, Pourghasem M, Bannister CM, et al. Deficient cortical development in the hydrocephalic Texas (H-Tx) rat: a role for cerebrospinal fluid. Brain 2002; 125: 1859-74.
10. Parada C, Gato A, Aparicio M, Bueno D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 2006; 6(1): 312-20.

11. Zappaterra MD, Lisgo SN, Lindsay S, Gygi SP, et al. A Comparative Proteomic Analysis of Human and Rat Embryonic Cerebrospinal Fluid. J. Proteome Res. 2007; 6(9): 3537 – 3548.

12. O’Rahilly R, Muller F. The Embryonic Human Brain: An Atlas of Developmental Stages. New York: Wiley-Liss; 1994.

13. Gato A, Moro Ja, Alonso MI, Bueno D, et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat Rec Discov Mol Cell Evol Biol. 2005; 284(1): 475-84.

14. Owen-Lynch PJ, Draper CE, Mashayekhi F, Bannister CM, et al. Defective cell cycle control underlies abnormal cortical development in the hydrocephalic Texas rat. Brain .2003; 126(3): 623-31.

15. Reynolds B, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 1992; 255(5052): 1707-10.

16. Mashayekhi F, Salehi Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur J Neurol. 2006; 13(3): 266-72.

17. Gritti A, Galli R, Vescovi A.L. Cultures of stem cells of the central nervous system. In:Federoff, S and Richardson, A (eds.) Protocols for Neural Cell Culture. Marcel Dekker,New York; 2001; 173–97.

18. Dahl D, Rueger DC, Bignami A, Weber K, et al. Vimentin, the 57.000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeleton component in immature glia. Eur J Cell Biol. 1981; 24:191–196.

19. Dziegielewska KM, Saunders NR. The development of the blood–brain barrier: proteins in fetal and neonatal CSF, their nature and origins. In: Meisami E, Timiras PS, editors. Handbook of human growth and developmental biology. Boca Raton: CRC. 1988; 1(A): 169–91.

20. Adinolfi M, Haddad SA. Levels of plasma proteins in human and rat fetal CSF and the development of the blood–CSF barrier. Neuropadiatrie. 1977; 8(4): 345–53.

21. Dziegielewska KM, Habgood MD, Mollgard K, Stagaard M, et al. Speciesspecific transfer of plasma albumin from blood into different cerebrospinal fluid compartments in the fetal sheep. J Physiol. 1991; 439: 215–37.

22. Møllgard K, Balslev Y, Lauritzen B, Saunders NR. Cell junctions and membrane specializations in the ventricular zone (germinal matrix) of the developing sheep brain: a CSF–brain barrier. J Neurocyto.l. 1987; 16: 433–44.