ساخت بسترهایی از پلیمر PLGA با دو روش الکتروریسی و انجماد- خشک کن به منظور مهندسی بافت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: دراین پژوهش اهمیت روش ساخت بستری از پلیمر PLGA با ساختار نانو به روش الکتروریسی و روش انجماد-خشک‏کن مورد مقایسه و ارزیابی قرار گرفت. به‏همین منظور اثر نانوتوپوگرافی بر تکثیر سلولی بر روی نانوفیبرهای تهیه شده در سه سرعت جمع کننده با یکدیگر مقایسه شد.
مواد و روش‏ها: بسترهایی از PLGA با روش انجماد خشک‏کن و الکتروریسی تهیه گردید. مورفولوژی ساختارها توسط میکروسکوپ الکترونی، بررسی شد. جهت سنجش فعالیت سلولی، سلول‏های فیبروبلاست موشی بر روی ساختارها کشت داده شد و با  آزمون MTT بررسی گردید.
نتایج :تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان داد، با افزایش سرعت چرخش جمع کننده، میزان نظم فیبرها افزایش یافت. تستMTT  (05/0p< )، در 24 ساعت مشخص کرد که بسترهایPLGA  تهیه شده به روش انجماد-خشک‏کن با ایجاد ساختاری متخلخل، چسبندگی مناسبی برای سلول فراهم کرده است. با ادامه کشت  به‏مدت 48 و 72 ساعت به طور معناداری قابلیت زنده ماندن سلول بر روی نانوفیبرهای PLGA متناسب با افزایش نظم آنها افزایش یافت. این قابلیت بر روی ساختار PLGA  انجماد-خشک‏کن تغییر چندانی نداشت.
نتیجه گیری: نتایج حاصل بیانگر عمل‏کرد بهتر سلول برروی نانوفیبر ساخته شده از PLGA به روش الکتروریسی شده نسبت به‏روش انجماد-خشک‏کن بود. علاوه بر این، نانوفیبر منظم به‏عنوان یک فاکتور مثبت در حمایت از رشد سلول عمل می‏کند به نظر می رسد ساختار آن به ماتریکس خارج سلولی طبیعی بسیار نزدیک است.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از مشکلات بزرگ که علم پزشکی از دیرباز با آن درگیر بوده است، ارائه درمانی قطعی برای بازسازی بافت‏های از کار افتاده و یا معیوب می‏باشد. در حال حاضر تکنیک‏های مهندسی بافت بر اساس کشت سلول بر روی داربست توسعه یافته است. مهندسی بافت با طراحی و ساخت یک داربست با ساختار فیزیکی مناسب به‏دنبال ایجاد شرایطی است که امکان چسبندگی سلول‏ها به داربست، مهاجرت سلولی، تکثیر سلولی، تمایز سلولی، و در نهایت رشد و جایگزینی بافت جدید را ایجاد کند (1، 2 و3). در یک بافت، سلول‏ها با ماتریکس خارج سلولی احاطه شده‏اند که با یک شبکه طبیعی از نانو فیبرهای منظم تعریف شده است. این نانو‏ساختار سه بعدی دارای مولکول‏های متفاوتی است که با گیرنده‏های موثر در چسبندگی سلول از جمله اینتگرین‏ها بر هم‏کنش می‏دهند و با پشتیبانی از سلول، رفتارهای سلولی را هدایت می‏کند. این رفتارها نتیجه  واکنش سلول- ماتریکس خارج سلولی و به دنبال آن واکنش  سلول- سلول و سلول با فاکتورهای حمایت کننده از رشد سلول است (4 و 5). تحقیقات انجام شده در زمینه شناسایی فاکتورهایی که در سرنوشت سلولی نقش دارند، حاکی از آن است که بیان مولکول‏های دخیل در چسبندگی سلولی و نیز اجزای ماتریکس خارج سلولی، در ایجاد یک محیط منحصر به فرد که قادر به تولید سیگنال‏های تنظیمی–القایی باشد، ضروری است (6).  اینتگرین‏ها از اصلی‏ترین گیرنده‏های سطح سلول می‏باشد که از اهمیت ویژه‏ای برخوردارند و در اتصالات سلول- ماتریکس خارج سلولی نقش اساسی دارند (6، 7، 8 و 9). اتصال و چسبندگی اولین و ضروری‏ترین رفتار یک سلول در مواجه با ریزمحیط قرار گرفته در آن می‏باشد. یافته‏های حاصل از مطالعه ماتریکس خارج سلولی طبیعی در بافت، یک نقشه برداری (توپوگرافی) با جهت‏گیری منظم و مشخص را برای نانوفیبرهای موجود در آن نشان می‏دهند که هم‏راستا با عمل‏کرد آن بافت است (8). در این میان وجود بستر‏هایی که نقشی مشابه ماتریکس خارج سلولی را ایفا می‏کنند اهمیت زیادی دارد، چرا که وظیفه نگه‏داری سلول‏ها و شکل‏دهی به رفتار آ‏ن‏ها را بر عهده دارد (9). بنابراین برای آن‏که یک بستر مهندسی شده دقیقا همان عمل ماتریکس خارج سلولی طبیعی را انجام دهد، باید همان ساختار نانوفیبری (نانوتوپوگرافی) و سه بعدی را داشته باشد. اولین بار در سال 1911 هاریسون تاثیر توپوگرافی در رفتار سلول را مطرح کرد. بسترهای نانوتوپوگراف با فراهم آوردن ساختار قابل تنظیمی، خصوصا در کنترل تمایز سلول‏های بنیادی مناسب عمل می‏کنند (10). پیشرفت فناوری نانو در سال‏های اخیر امکان طراحی و مهندسی مواد زیستی جدید را فراهم کرده است. نانو‏تکنولوژی با ورود خود به عرصه‏های مختلف علمی تحول شگرفی را در شاخه‏های مختلف زیستی از جمله مهندسی بافت بوجود آورده است (11).

در این میان نانو‏فیبرها پتانسیل بالایی در ترمیم بافت نشان داده‏اند (12).  روش‏های مختلفی برای ساخت نانو‏فیبر وجود دارد که در سال‏های اخیر روش الکترو‏ریسندگی جایگاه ویژه‏ای را به خود اختصاص داده است. روش الکترو‏ریسندگی با داشتن سرعت زیاد، ایجاد سطح مخصوص بالا، تخلخل مناسب برای تکثیر و چسبندگی سلول‏ها، کنترل پذیری بالای فرآیند، تنوع در شکل و مواد پلیمری قابل مصرف، توجه محققین را به خود جلب کرده است (12، 13، 14، 15 و16). فرآیند الکتروریسی در ساده‏ترین شکل شامل یک نازل برای خروج محلول پلیمری، دو الکترود، یک منبع تغذیه DC با تامین ولتاژ در دامنه کیلو ولت و یک جمع کننده الیاف است. اغلب نانوفیبرهای تولید شده توسط الکتروریسی به‏فرم یک شبکه بافته نشده جمع‏آوری می‏شوند که معمولا فیبرهایی با جهت گیری تصادفی و ویژگی مکانیکی ضعیف حاصل می‏شود. ماتریکس خارج سلولی شبکه‏ای از نانوفیبرهای پیچیده منظم و مشخص است. با توجه به  تاثیر توپوگرافی محیط بر القای مسیرهای پیام رسانی دخیل در فنوتیپ سلول، نانوفیبرها، قادرند محیطی مشابه با بدن را فراهم آورند (17، 18 و 19).PLGA (کوپلیمرلاکتیک اسید و گلیکولیک اسید) از پلیمرهای زیستی متعلق به خانواده پلی آلفا هیدروکسی استرها می‏باشند (20) که برای ساخت داربست‏های سنتزی در مهندسی بافت از آن استفاده می‏گردد. رفتار و میزان تخریب پذیری کوپلیمر PLGA قابل کنترل است. همچنین می‏توان ویژگی‏های مکانیکی آن را بر اساس بافت مورد نظر تنظیم نمود. این ویژگی مزیت اصلی این پلیمر و دلیل کاربرد آن در پزشکی است. غیرسمی بودن و تخلخل از دیگر ویژگی‏های این پلیمر می‏باشد که از دلایل کاربرد آن در مهندسی بافت است (21، 22، 23 و 24). در این پژوهش PLGA به‏عنوان پلیمر سازنده بسترها انتخاب شد و دو بستر، شامل نانوفیبر PLGA با روش الکتروریسی و دیگری بستر PLGA، با روش انجماد–خشک کن (freeze-drying) (25 و 26)، تهیه گردید. برای سنجش اثر جهت‏گیری و چرخش الیاف‏ها نسبت به یکدیگر و اثر آن بر قابلیت زنده ماندن سلول، نانوفیبر‏های الکتروریسی در سه سرعت چرخش متفاوت جمع کننده، تهیه شد. تغییر سرعت چرخش جمع کننده یکی از عوامل موثر در فرآیند الکتروریسی است که برای به‏دست آوردن فیبرهایی با جهت‏گیری‏های مختلف اعمال می‏شود (27، 28 و 29). این پژوهش با هدف بررسی اهمیت شیوه ساخت بسترهای مناسب مهندسی بافت و نقش آن‏ها در تکثیر سلول انجام شد. برای تهیه بسترها از پلیمر PLGA به روشهای الکتروریسی و انجماد-خشک‏کن انجام شد.

مواد و روشها

ساخت بستر          

تهیه نانوفیبرهای الکتروریسی: نانوفیبرهای PLGA با روش الکتروریسی تهیه شدند. جهت ساخت، از دستگاه الکتروریسی مدل CO881007NYI ساخت شرکت نانو ساختار آسیا کشور ایران که در پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران موجود است، استفاده شد. محلول PLGA با نسبت 1:1 گلیکولیک اسید به لاکتیک اسید (mol wt 30,000-60,000, Sigma) با غلظت20 درصد در حلال ترکیبی دی متیل فرمامید/ کلروفرم با نسبت 1 به 3 تهیه شد. ولتاژ دستگاه20 کیلوولت، فاصله بین سوزن (آند) تا جمع کننده لیف (کاتد)، 15سانتی‏متر و سرعت پمپ شدن محلول پلیمر به نوک سوزن 1 میلی‏لیتر بر ساعت تعبیه شد. برای تهیه فیبرهای منظم و تصادفی از یک جمع کننده استوانه‏ای پوشیده شده با ورقه آلومینیومی با ضخامت 50 سانتی متر با سرعت چرخش قابل تنظیم استفاده گردید. بنابراین فرآیند الکتروریسی در سه شرایط متفاوت انجام شد که در هر سه مورد، تمام متغیرهای ذکر شده ثابت بود به‏جز، سرعت چرخش جمع کننده که در سه میزان250، 1375 و 2500 دور بر دقیقه تنظیم شد. سرعت چرخش جمع کننده مستقیما بر اندازه و مورفولوژی فیبرها موثر است.

تهیه بستر با روش انجماد خشک‏کن: محلول 12 درصد PLGA در حلال تترافلوئوراتانول (TFE) تهیه شد سپس محلول حاصل به یک پلیت که کف آن با یک ورقه آلومینیومی پوشیده شده بود انتقال یافت. پلیت به فریزر با دمای30- درجه سانتی‏گراد منتقل شد و پس از انجماد کامل محلول، به مدت 2 تا 3 روز در محیط خلا قرار گرفت. ساختار تهیه شده در یخچال با دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد.

بررسی با میکروسکوپ الکترونی: نانوفیبرها می‏توانند با فراهم کردن محیطی سه بعدی در تقلید از ماتریکس خارج سلولی طبیعی، نقش اساسی در مهندسی بافت ایفا کنند. بر همین اساس دراین پژوهش اهمیت روش ساخت بستری از پلیمر PLGA با ساختار نانو به روش الکتروریسی و روش انجماد-خشک‏کن مورد مقایسه و ارزیابی قرار گرفت. به همین منظور اثر نانوتوپوگرافی بر تکثیر سلولی بر روی نانوفیبرهای تهیه شده در سه سرعت جمع کننده با یکدیگر مقایسه شد.

مقایسه مورفولوژی ساختارها و نیز جهت‏گیری الیاف‏ها نسبت به‏یکدیگر در بسترهای الکتروریسی شده، پس از پوشش آنها با لایه‏ای از طلا، با میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ (Hitachi S3000N) در ولتاژ 15 کیلو ولت انجام شد.

کشت سلول: فلاسک های25 سانتی‏متر مربعی حاوی سلول فیبروبلاستی L929 از انستیتو پاستور ایران خریداری شد. این سلول‏ها در محیط  RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium)( Gibco) حاوی10 درصد سرم حیوانی (Gibco) و محلول آنتی‏بیوتیک آنتی‏مایکوتیک x100((Sigma، 10000 واحد پنی‏سیلین، 10 میلی‏گرم استرپتومایسین و 25 میکروگرم آمفوتریسین در هر میلی لیتر)، در انکوباتور CO2 با رطوبت 95 درصد  دمای 37 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد و محیط کشت سلول هر 48 ساعت تعویض شد.

بررسی زیست سازگاری بسترها: به منظور بررسی زیست سازگاری بسترها زمانی‏که تراکم سلول‏های فیبربلاست L929 در فلاسک کشت سلول به حد قابل قبول رسید، با استفاده از محلول تریپسین 25/0 درصد (Gibco)، پس از 1 تا 5 دقیقه سلول‏ها از ظرف کشت سلول جدا شده و  پس از شمارش با لام نئوبار، تعداد104سلول به هر چاهک، در پلیت 24 خانه که از قبل نمونه‏های استریل 1 سانتی متر مربع در آن قرار داشت، منتقل شد. برای استریل کردن، نمونه‏ها در اندازه‏های یک در یک سانتی‏متر بریده شد و درون ظرف‏های استریل قرار داده شد و سپس هر دو سمت نمونه‏ها به مدت 20 دقیقه در معرض اشعه UV قرار گرفت. روند رشد و تکثیر سلولی بر روی نمونه‏های مورد آزمایش با میکروسکوپ معکوس (Bell: INV-100 FL ) مشاهده و عکسبرداری شد.

بررسی قابلیت زنده ماندن سلول: میزان سلول‏های زنده و فعال روی بسترها با سنجش میزان فعالیت آنزیم میتوکندریایی، توسط سنجشMTT تعیین شد. پس از جدا کردن سلول‏ها از کف فلاسک با محلول تریپسین 25/0 درصد ، شمارش انجام شد و تعداد104سلول به هر چاهک، در پلیت 24 خانه محتوی بسترهای استریل منتقل شد. کشت سلول تا 72 ساعت ادامه یافت و هر 24 ساعت میزان تکثیر سلول‏ها بر‏روی بسترها با استفاده از تست MTT سنجیده شد. بدین‏صورت که پس از خارج کردن محیط کشت، 100 میکرولیتر محلول MTT (Sigma)، (5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر در PBS) (یا محلول بافر فسفات نمکی x1 و 900 میکرولیتر محیط کشت تازه  محتوی10 درصد سرم به هر چاهک از پلیت 24 خانه اضافه شد و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. سپس محیط کشت حاوی محلول MTT با دقت خارج شد و جهت حل کردن کریستال‏های فورمازان 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) به هر چاهک اضافه گردید و به‏مدت 15 دقیقه در تاریکی نگه‏داری شد. میزان جذب نوری در طول موج  nm570 nm) 630 λ Ref:) توسط دستگاه ELISA reader (BioTek ELx800) خوانده شد. قابلیت زنده ماندن سلول‏ها به صورت درصد نسبت نمونه به کنترل محاسبه گردید. نتایج توسط نرم افزارSPSS ، آنالیز واریانس (ANOVA) در سطح معنی‏داری p<0.05   تحلیل شد.

نتایج

میکروسکوپ الکترونی

به‏منظور بررسی تاثیر روش ساخت بسترها بر ساختار آن‏ها و تاثیر تغییر سرعت جمع کننده الیاف در فرآیند الکتروریسی بر مورفولوژی نانوفیبر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی تصاویری تهیه گردید. نتایج نشان داد که با افزایش سرعت چرخش جمع کننده، میزان نظم فیبرها نیز افزایش یافته است (شکل1). همچنین ساختار متخلخل بستر تهیه شده به روش انجماد-خشک‏کن در شکل 2 دیده می‏شود.

زیست سازگاری بسترها

نتایج حاصل از کشت سلول بر روی نانوفیبرهای الکتروریسی شده و بسترهای تهیه شده به روش انجماد- خشک‏کن با میکروسکوپ معکوس معمولی مشاهده و مورد بررسی قرار گرفت. (شکل3). در مورد هر چهار نمونه جهت‏گیری و تمایل سلول‏ها به سمت آن‏ها مشاهده گردید که بیانگر زیست سازگار خوب ساختارها می‏باشد.

 

 

شکل 1: میکروگراف الکترونی از نانوفیبر الکتروریسی شده PLGA : تاثیر سرعت چرخش جمع کننده در نظم و جهت‏گیری نانوفیبرهای الکتروریسی در این شکل قابل مشاهده است. به ترتیب با افزایش سرعت چرخش جمع کننده از mrp 250(a)   به 1375  (b)و  2500 (c) نظم فیبرها افزایش یافته است. نانوفیبر (a) در مقایسه با نانوفیبر (c) دارای جهت‏گیری تصادفی و نامنظمی است (bar: 10μm).

 

 

 

شکل 2: میکروگراف الکترونی از بستر تهیه شده به روش انجماد– خشک کن  سلول (bar: 50 μm)

 

 

 

شکل 3: تصاویر تهیه شده از رشد سلول در کنار بسترها پس از گذشت 24 ساعت 1) نانوفیبرهای الکتروریسیrpm  250 ، 2)  rpm 1375 ، 3) rpm 2500، 4) بستر انجماد –خشک‏کن ، 5) کنترل مثبت (‏بدون بستر) مناطق تیره رنگ در تصاویر بسترها هستند. این تصاویر به منظور تایید زیست سازگاری بستر‏های ساخته شده از پلیمر PLGA تهیه شد.


افزایش میزان رشد سلول بر روی بسترها در 72 ساعت پس از کشت در شکل 4 نشان داده شده است. با توجه به تصاویر به‏دست آمده از میکروسکوپ معکوس، در 24 ساعت پس از انتقال سلول بر روی بستر‏ها، تمایل و رشد سلول‏ها به سمت بستر‏ها دیده شد که این میزان برای بسترهای انجماد-خشک‏کن بیشتر بود. پس از 48 ساعت، در مقایسه با روز اول، جهت‏گیری و تکثیر سلول‏ها در نانوفیبرها به طور چشم‏گیری افزایش یافت. در مقایسه نمونه‏ها با‏یکدیگر، بیشترین میزان رشد سلول و جهت‏گیری به سمت نانوفیبرهای الکتروریسی تهیه شده در 1375 و 2500 دور در دقیقه مشاهده شد، در مقابل نانو فیبر الکتروریسی rpm 250 و پس از آن بستر انجماد- خشک‏کن، کاهش رشد و جهت گیری را نشان دادند. در 72 ساعت پس از کشت، در مقایسه با روز دوم، سلول‏ها بر روی تمام بسترها بجز  بستر انجماد-خشک‏کن  افزایش تکثیر را نشان دادند. نتایج مقایسه بسترها با یکدیگر در روز سوم مشابه روز دوم بود.

 

 

شکل4: تصاویر تهیه شده از رشد سلول بر روی بسترها پس از کشت 72 ساعت. 1)  نانوفیبرهای  الکتروریسیrpm  250، 2)  rpm 1375، 3) rpm 2500، 4) بستر انجماد –خشک کن ، 4) کنترل مثبت ( بدون بستر) مناطق تیره رنگ در تصاویر بسترها هستند.


نتایج سنجش MTT

نتایج حاصل از تست MTT تائید کننده تصاویر به‏دست آمده از میکروسکوپ معکوس بود. همانطور که در نمودار یک مشخص است، در مقایسه بستر‏ها با یکدیگر بیشترین درصد زنده ماندن سلول برروی بستر مربوط به نانو فیبرهای rpm 1375 و 2500 بود (نمودار1).

 


 

نمودار1: نتایج حاصل از سنجشMTT: میزان رشد سلول‏ها بر روی بستر‏ها در مقایسه با یکدیگر: 1) نانوفیبر الکتروریسی  rpm  250 ، 2)  rpm 1375 ، 3) rpm 2500  ، 4) بستر انجماد –خشک‏کن ، 5) کنترل مثبت ( بدون بستر ). این آزمون در سطح معناداری 05/0 p < با آنالیز ANOVA انجام شد.


بحث

رفتار سلولی در یک بافت، پاسخ به مولکول‏های پیام می‏باشد که بر سطح سلول وارد می‏شوند و گیرنده‏های اختصاصی سطح سلول آن‏ها را دریافت می‏کنند و به دنبال آن آبشارهای پیامی ایجاد می‏شود. سه عامل مهم در ایجاد رفتار مناسب سلولی نقش دارد که عبارت است بر هم‏کنش سلول‏های مجاور با یکدیگر، مولکول‏های محلول همچون فاکتورهای رشد و با ماتریکس خارج سلولی. آگاهی از این پاسخ‏ها که اغلب توسط محیط نانوفیبری ایجاد می‏شود در طراحی بسترهای جدید در تقلید از ماتریکس خارج سلولی طبیعی اهمیت به‏سزایی دارد. ترکیب پیچیده از مولکول‏های مختلف  ماتریکس خارج سلولی که سلول و بافت را احاطه کرده‏اند در تعیین میزان رشد سلول، تمایز سلول و مهاجرت سلول نقش دارند (9و10). به‏منظور راه‏اندازی مسیرهای پیام‏رسانی موثر برای بروز رفتار سلولی، طراحی داربست‏های زیستی و همچنین روش ساخت آنها، از اصلی‏ترین وظایف مهندسی بافت است (29). اهمیت استفاده از داربست در بهینه سازی، بازسازی و ترمیم بافت هدف است به‏طوری که سلول‏های اولیه کاشته شده روی داربست شروع به تقسیم کرده و ناحیه لانه گزینی را پر می‏کنند. فاکتورهای اتصالی که داخل محیط داربست تجمع پیدا می‏کند، اتصال و مهاجرت سلول‏ها را افزایش داده و در نتیجه مدت زمان بازسازی و طول دوره ترمیم را کاهش می‏دهد (30و 31). هرچقدر توپوگرافی یک داربست به شبکه نانوفیبری ماتریکس خارج سلولی طبیعی نزدیک‏تر باشد، در ایجاد رفتار مناسب از سلول موفق‏تر عمل می‏کند. پس از مطالعات هاریسون در سال 1911 که تاثیر شکل و ساختار محیط بر سرنوشت سلول بنیادی جنینی را نشان داد،Curtis  و همکاران، نقش توپوگرافی بر روی سلول‏های اندوتلیال، اپی‏تلیال  و فیبروبلاستی را برای اولین بار مطرح کردند (32). تحقیقات بعدی در این زمینه نیز حاکی از آن بود که انواع سلول‏ها از جمله، فیبروبلاست‏ها، استئوبلاست ها، نورون‏ها و سلول‏های بنیادی مزانشیمی، اساسا به نانوتوپوگرافی پاسخ می‏دهند (33). در تمامی این مطالعات آنچه حائز اهمیت است این است که، پاسخ‏های سلول تحت تاثیر توپوگرافی است و اخیرا نقش نانوتوپوگرافی در مقایسه با میکروتوپوگرافی به‏عنوان یک فاکتور اساسی دخیل در رفتار سلول محسوب می‏گردد (34). امروزه در میان بیومواد مورد بحث، نانوفیبر الکتروریسی مورد توجه ویژه قرار گرفته‏اند. اجزای مختلف بافت‏های بدن به شکل نانوساختارهای منظم هستند و تاثیر آن بر فنوتیپ سلول به نظر می رسد که نانوفیبر منظم و مرتب شده می‏باشد. این مورد علاوه بر سازگاری بیشتر با بافت‏های بدن، در ایجاد مسیر‏های پیام‏رسانی سلولی مهم تر می‏باشند (35و36). برای مثال، مطالعه انجام شده در زمینه نقش نانوفیبر‏های منظم بر عمل‏کرد سلول توسط  Zi و همکاران ، تمایز بیشتر سلول های بنیادی تاندون انسانی را بر روی  نانوفیبر های منظم PLA ( پلی لاکتیک اسید) نشان داد (37). همچنین مطالعاتی با هدف بررسی تاثیر توپوگرافی با استفاده از سلول های استئوبلاستی و فیبروبلاستی انجام شده است (38، 39 و 40).  Xie  و همکاران (41) نشان دادند که سلول‏های فیبروبلاست تاندون بر روی نانوفیبر PLGA به فرم تصادفی یک مورفولوژی نامنظم و بدون جهت‏گیری مشخصی را نشان می‏دهد. این در حالی است که سلول‏ها بر روی نانوفیبر PLGA تهیه شده در فرم منظم، مورفولوژی با جهت‏گیری مشخصی را در امتداد فیبرها نشان دادند. در مطالعه دیگری که توسط Lee و همکارانش (42) انجام شد، نتایج مشابهی از رشد و تمایز سلول‏های PC12 بر روی فیبرهای منظم PLGA-PPY (Poly PYrrole) در مقایسه با فرم نامنظم آن بدست آمد. در این مطالعات آنچه حائز اهمیت است این است که پاسخ‏های سلول تحت تاثیر توپوگرافی است و اخیرا نقش نانوتوپوگرافی در مقایسه با میکروتوپوگرافی به‏عنوان یک فاکتور اساسی دخیل در رفتار سلول محسوب می‏گردد (43). نتایج حاصل از رشد سلول‏ها بر روی نانوفیبرهای PLGA در این پژوهش نیز، در جهت تایید پژوهش‏های انجام شده بود. یافته‏های حاصل از میکروسکوپ معکوس و نتایج تست MTT در این تحقیق نشان داد که بسترهایPLGA  تهیه شده به‏روش انجماد-خشک‏کن به دلیل میزان تخلخل بالا، چسبندگی مناسبی برای سلول فراهم کرد به نحوی که در 24 ساعت پس از کشت، در مقایسه با نانوفیبرهای PLGA  الکتروریسی، قابلیت زنده ماندن سلول بیشتر بود، اما با ادامه کشت در 48 و 72 ساعت، به‏طور معنی‏داری درصد زنده ماندن سلول بر روی نانوفیبر PLGA الکتروریسی شده افزایش یافت، در حالی که این درصد بر روی نمونه‏های PLGA انجماد-خشک‏کن در طی این 2 روز تغییر چندانی نکرد. نتایج به‏خوبی بیانگر این مسئله است که نانوفیبر PLGA در ایجاد رفتار سلولی مناسب عمل‏کرد بهتری داشت و با توجه به شباهت ساختاری  آن به ماتریکس خارج سلولی طبیعی این انتظار هم وجود داشت. جهت بررسی محیط نانو فیبری بر‏روی رشد سلول روش انجماد-خشک‏کن هم استفاده شد. نتایج این مطالعه پیشنهاد می‏کند که نانوفیبرهای PLGA در مقایسه با PLGA انجماد- خشک‏کن می‏توانند در جهت ایجاد پاسخ سلولی مناسب به‏منظور مهندسی بافت عمل‏کرد بهتری داشته باشند. همچنین از میان نانوفیبرهای الکتروریسی شده، فیبر تهیه شده به فرم منظم (2500 دور در دقیقه)، نتایج مطلوب‏تری را نشان داد. که تائید کننده نتایج حاصل از پژوهش Xie  و همکاران همچنین Lee و همکاران بود. آنان گزارش کردند نانو فیبرهای تهیه شده در فرم منظم نسبت به نامنظم باعث جهت‏گیری و رشد و تمایز سلول‏ها بر روی بستر بود.

این پژوهش در کنار مطالعاتی که در گذشته انجام شده است، همگی موید آن است که، با اینکه علوم قرار گرفته در پشت فرآیند الکتروریسی هیچ یک ساده نیستند اما این روش بسیار ساده‏ای است که فقط به آزمایشگاه مجهز جهت رساندن الیاف به مقیاس نانو نیاز دارد. فیبرهایی با مورفولوژی‏های متفاوت و از مواد متفاوت می‏تواند به‏طور مستقیم و یا غیر مستقیم از الکتروریسی حاصل شوند. تنوع مواد قابل استفاده در این روش، تولید بستری با سطح مخصوص بسیار بالا و آسانی اتصال به سلول‏های بدن به‏دلیل داشتن ابعاد کوچکتر از سلول، وجود تخلخل مناسب و قابل تغییر(44، 45 و 46)، محققین را بر آن داشته است که مطالعات خود را در زمینه کاربرد نانوفیبرهای الکتروریسی شده به‏منظور مهندسی بافت ادامه دهند.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از کشت سلول بر روی نانوفیبرهای PLGA و فیبرهای PLGA تهیه شده به روش انجماد-خشک‏کن نشان داد که در 24 ساعت اول کشت با توجه به ایجاد تخلخل بالا توسط روش انجماد-خشک‏کن چسبندگی بهتری نسبت به نانوفیبر داشت اما با ادامه کشت تا 72 ساعت در مقابل نانوفیبر PLGA با توجه به نزدیکی ساختار آن به ماتریکس خارج سلولی طبیعی در ایجاد تکثیر سلولی عمل‏کرد بهتری را ارائه نمود.

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق با حمایت مرکز تحقیقات مهندسی زیست فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران انجام شد که بدین‏وسیله از زحمات آنان تقدیر و تشکر به‏عمل می‏آید.

  1. DM Y, Fisher JP. Polymeric Scaffolds for Tissue Engineering Applications. In: Tissue Engineering. (Bronzino, ed.) CRC Press, Boca Raton, FL. 2007; 8-1 - 8-18.
  2.  Belle. Tissue engineering, an overview. In: Belle, editor. Tissue Engineering: Current Perspectives: Birkhauser Verlag AG. 1993; 3- 15.
  3. Yusop AH, Bakir AA, Shaharom NA, Abdul Kadir MR, et al. Porous biodegradable metals for hard tissue scaffolds. A review. Int J Biomater. 2012; 2012: 641430. 10 pages
  4. Langer R, Vacanti J. Tissue engineering. Science. 1993; 260(5110): 920-926.
  5. Chen SS, Fitzgerald W, Zimmerberg J, Kleinman HK. Cell-cell and cell-extracellular matrix interaction regulate embryonic stem cell differentiation. Stem Cells. 2007; 25(3): 553–561.
  6. Yarwood SJ, Woodgett JR. Extracellular matrix composition determines the transcriptional response to epidermal growth factor receptor activation.  PNAS. 2001; 98(8): 4472–4477.
  7. Andressen C, Adrian S, Fassler R .The contribution beta1 integrins to neuronal migration and differentiation depends on extracellular matrix molecules. Eur J Cell Biol. 2005; 84(12): 973–982.
  8. Mruthyunjaya S, Manchanda R, Godbole R, Pujari R, et al. Laminin-1 induces neurite outgrowth in human mesenchymal stem cells in serum/differentiation factors-free conditions through activation of FAK-MEK/ERK signaling pathways. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 391(1): 43–48.
  9. Hynes R. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 2002; 110(6): 673–687.
 

10. Larsen M, Artym VV, Green JA, Yamada KM. The matrix reorganized: extracellular matrix remodeling and integrin  ignaling. Curr Op Cell Biol. 2006; 18(5): 463–471.

11. Shi J, Votruba AR, Farokhzad OC, Langer R. Nanotechnology in Drug Delivery and Tissue Engineering: From Discovery to Applications. Nano Lett. 2010; 10(9): 3223-30.

12. Cunha C, Panseri S, Antonini S. Emerging nanotechnology approaches in tissue engineering for peripheral nerve regeneration. Nanomedicine. 2011; 7(1): 50-59.

13. Venugopal J, Ramakrishna S. Applications of Polymer Nanofibers in Biomedicine and Biotechnology. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2005; 125(3): 147-156.

14. Frey MW. Electrospinning Cellulose and Cellulose Derivatives. Polymer Reviews. 2008; 48(2): 378–391.

15. Bjorge D, Daels N, De Vrieze S, Dejans P, et al. Performance assessment of electrospun nanofibers for filter applications. Desalination. 2009; 249(3): 942–948.

  1. 16.  Liang D, Hsiao BS, Chu B. Functional electrospun nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 2007; 59:1392–1412.
17. Tungprapa S, Puangparn T, Weerasombut M, Jangchud I, et al. Electrospun cellulose acetate fibers: effect of solvent system on morphology and fiber diameter. Cellulose. 2007; 14(6): 563–575.

18. Shaoping Z, Wee ET, Xiao Z, Beuerman RW, et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 2006; 79(3): 456–63.

19. Shaoping Z, Wee ET, Xiao Z, Roger B, et al. Formation of collagen–glycosaminoglycan blended nanofibrous scaffolds and their biological properties. Biomacromolecules. 2005; 6: 2998–3004.

20. Theron A, Zussman E, Yarin AL. Electrostatic field-assisted alignment of electrospun nanofibres. Nanotechnology. 2001; 12(3): 384.

21. Gunatillake P, Adhikari R. Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering. Eur Cell Mater. 2003; 5: 1-16.

  1. 22.  Shi G, Cai Q, Wang C, Lu N, et al. Fabrication and biocompatibility of cell scaffolds of poly (L-lactic acid) and poly (L-lactic-co-glycolic acid). Polymers for advanced technologies. 2002; 13(3-4): 227-232.
23. Baier Leach J, Bivens K, Patrick Cw, Jr, Schmidt C. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnol Bioengin. 2003; 82: 578-89.

24. Athanasiou KA, Niederauer GG, M Agrawal. Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterial. 1996; 17(2): 93-102.

25. Xin X, Mohammad H, Mao Jeremy J. Continuing differentiation of human mesenchymal stem cells and induced chondrogenic and osteogenic lineages in electrospun PLGA nanofiber scaffold. Biomaterials. 2007; 28: 316-325.

  1. 26.  Haugh MG, Murphy CM, O'Brien FJ. Novel freeze-drying methods to produce a range of collagen-glycosaminoglycan scaffolds with tailored mean pore sizes. Tissue Eng Part C Methods. 2010; 16(5): 887-94.
27. Schoof H, Apel J, Heschel I, Rau G. Control of pore structure and size in freeze-dried collagen sponges. J. Biomed Mater Res. 2001; 58(4): 352–7.

28. Katta P, Alessandro M, Ramsier RD, Chase GG. Continuous electrospinning of aligned polymer nanofibers onto a wire drum collector. Nano. 2004; 4: 2215.

29. Sundaray B, Subramanian V, Natarajan TS, Xiang RZ, et al. Electrospinning of continuous aligned polymer fibers. Appl. Phys. Lett. 2004; 84(7): id. 1222.

30. Kwangsok Kim, Meiki Yu, Xinhua Z, Jonathan Ch, et al. Control of degradation rate and hydrophilicity in electrospunnon-woven poly (d, l-

 

lactide) nanofiber scaffolds for biomedical applications. Biomaterials. 2003; 24(27): 4977–4985.

31. Ushida T, Tateishi T. Scaffold Design for Tissue Engineering. Macromolecular Biosciece. 2002; 2: 67-77.

32. Curtis A, Wilkinson C. Topographical control of cells. Biomaterials. 1997;18 ( 24): 1573-1583.

33. Curtis ASG, Gadegaard N, et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Transactions on Nanobioscience. 2004; 3(1): 61-65.

34. Dalby MJ, Riehle MO, Johnstone H, Affrossman S, et al. In vitro reaction of endothelial cells to polymer demixed nanotopography. Biomaterials. 2002; 23: 2945–2954.

35. Young Y, Seung JL, Byung-Moo M, Won Ho P. Effect of Solution Properties on Nanofibrous Structure of Electrospun Poly (lactic- co-glycolic acid). Journal of Applied Polymer Science. 2006; 99(3): 1214–1221.

36. Buckley CT, O’Kelly KU. Regular  scaffold fabrication  techniques  for  investigations  in  tissue  engineering In: Topics  in  Biomechanical Engineering, TCD (Eds Prendergast PJ, McHugh PE). 2004; 147-166.

37. Zi Y, Xiao Ch, Jia Lin Ch, Wei Liang Sh, et al. The regulation of tendon stem cell differentiation by the alignment of nanofibers. Biomaterials. 2010; 31: 2163–2175.

38. Biggs MJP, Richards RG, Gadegaard N, et al. Interactions with nanoscale topography: adhesion quantification and signal transduction in cells of osteogenic and multipo-tent lineage. Journal of Biomedical Materials Research A. 2009; 91(1): 195–208.

  1. 39.  Dalby MJ, Gadegaard N, Wilkinson CDW. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research A. 2008; 84(4): 973–979.
40. Li WJ, Laurencin CT, Caterson EJ, Tuan RS, et al. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res 2002; 60(4): 613–621.

41. Xie J, Li X, Lipner J, Manning CN, et al. Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2010; 2(6): 923-6.

42. Lee JY, Bashur CA, Goldstein AS, Schmidt CE. Polypyrrole-coated electrospun PLGA nanofibers for neural tissue applications. Biomaterials. 2009; 30(26): 4325-4335.

43. Geblinger D, Addadi L, Geiger B. Nano-topography sensing by osteoclasts. Journal of Cell ScIence. 2010; 123(9): 1503–1510.

44. Lee MR, Kwon KW, Jung H, et al. Direct differentiatio of human embryonic stem cells into selective neurons on nanoscal ridge/groove pattern arrays. Biomaterials. 2010; 31: 4360–4366.

45. Sumit P. Belinda Pingguan-Murphy Noor Azuan Abu Osman. Progress of key strategies in development of electrospun scaffolds: bone tissue.  Sci. Technol. Adv. Mater. 2012; 13(4): 043002 (13pp).

46. Chung S, Ingle NP, Montero GA, Kimc SH, et al. Bioresorbable elastomeric vascular tissue engineering scaffolds via melt spinning and electrospinning. Acta Biomaterialia. 2010. 6(6): 1958-67.