بررسی تاثیر تکثیری عصاره متانولی برگ گیاه گزنه بر سلول های بنیادی عصبی در محیط اکسیداتیو

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد علوم تشریح، کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران

2 دانشگاه علوم پزشکی مازندران، دانشکده پزشکی، مرکز تحقیقات ایمنوژنتیک، گروه آناتومی و بیولوژی سلولی، ساری، ایران

3 متخصص شیمی داروئی، مرکز تحقیقات علوم داروئی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران

4 دانشجوی پزشکی دکترای حرفه ای، کمیته تحقیقات دانشجویی، واحد ساری، دانشگاه آزاد اسلامی، ساری، ایران

5 دانشگاه علوم پزشکی مازندران، مرکز تحقیقات ایمنوژنتیک، دانشکده پزشکی، گروه آناتومی و بیولوژی سلولی، ، ساری، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش ایجاد شرایط اکسیداتیو در محیط کشت سلول‏های بنیادی عصبی و تیمار این سلول‏ها با عصاره متانولی برگ گیاه گزنه است.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی استخراج سلول‏های بنیادی عصبی از ناحیه هیپوکامپ نوزاد یک روزه موش صحرایی نر انجام شد. شرایط اکسیداتیو در محیط کشت سلولی، با افزودن هیدروژن پراکسید ایجاد شد. پس از تایید هویت سلول‏های عصبی به‏مدت 24 ساعت در شرایط اکسیداتیو و سپس در معرض دوزهای مختلف 5/2،20،10 ،5 و 40 میکرو گرم در میلی‫لیتر عصاره متانولی برگ گزنه قرار گرفتند. بررسی نهایی مقدار تکثیر سلول‏ها با استقاده از تست زنده مانیMTT انجام شد. گروه‏های تحقیق شامل گروه تجربی: شرایط اکسیداتیو ودریافت عصاره گزنه و گروه کنترل: شرایط اکسیداتیو بدون عصاره بود.
نتایج: سلول‏های بنیادی عصبی دارای مورفولوژی عصبی و بیان کننده‏ی نشانگر نستین بودند. درصد تکثیر سلول‏های بنیادی عصبی در گروه‏های تیمار نسبت به گروه کنترل بیشتر بود به‏طوری‏که تکثیر سلول‏های بنیادی عصبی در غلظت 20 میکروگرم در میلی‫لیتر  به‏طور قابل توجهی افزایش یافته بود 05/0>p.
نتیجه گیری: عصاره متانولی برگ گیاه گزنه دارای اثرات محافظتی و نورروپروتکتیو بوده و می‏تواند  شرایط آسیب اکسیداتیو اعمال شده در شرایط آزمایشگاهی را تعدیل و اختلال عملکرد سیستم عصبی به‫دنبال تولید رادیکال‏های آزاد را بهبود بخشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

به‏طورکلی در بیماری‏های نورودژنراتیو از دست رفتن پیشرونده نورون‏ها رخ می‏دهد که علت دقیق آن هنوز در دست بررسی است اما استرس اکسیداتیو (حاصل تولید رادیکال آزاد) به‏عنوان یکی ازعلل اصلی بروز انواع این بیماری‏ها مطرح شده است. رادیکال‫های آزاد و دیگر انواع اکسیژن باز فعال به‫طور مداوم در طی فرآیندهای فیزیولوژیک طبیعی و همچنین در وضعیت‏های پاتولوژیک تولید می‏شوند که توسط سیستم آنتی اکسیدانت ذاتی بدن با مکانیسم‏های آنزیمی و غیر آنزیمی به‏شکل غیر فعال در می‏آیند اما در شرایطی مانند آن‫چه در هنگام بیماری‏های نورودژنراتیو اتفاق می‏افتد تعادل بین رادیکال‫های آزاد و مکانیسم‏های آنتی اکسیدانت بدن به‫هم می‏خورد. لذا استفاده از آنتی اکسیدانت‏های کمکی به‏ویژه انواع طبیعی آن‫ها می‏تواند به بهبود یا توقف روند بیماری کمک کنند. یکی از ماکرومولکول‏هایی که در اثر استرس اکسیداتیو آسیب می‏بیند داکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) است که متعاقب این آسیب القای آپوپتوزیس و جلوگیری از تقسیم سلولی رخ می‏دهد (1-4).

به‏منظور ترمیم آندوژنوس اعصاب، تکثیر و تمایز سلول‏های بنیادی عصبی از طریق محرک‏هایی مانند هورمون‏ها، نوروترنسمیترها و عوامل رشدی صورت می‏گیرد. همچنین عناصر گیاهی هم به‏علت داشتن موادی مانند آنتی اکسیدانت‏ها در این میان دارای نقش موثری دارند و به لحاظ مقرون به‏صرفه بودن و مقبولیت عامه آن‫ها مورد توجه بوده اند (5 ,6)

گیاه گزنه با نام علمی UrticaDioica به‏فراوانی در شمال کشور یافت می‏‫شود و از جمله گیاهان پرمصرف در طب سنتی محسوب می‏شود. در طب گیاهی از برگ این گیاه جهت درمان برخی بیماری‏های پوست و مو مانند اگزما و بیماری‫های التهابی استفاده می‏شود. همچنین پایین آورنده قندخون، اسید اوریک است. برگ گیاه گزنه دارای ترکیبات بیولوژیک فراوانی از جمله آلکالوئیدها است که برای درمان انواع بیماری‏ها از جمله فشارخون، سرطان و بیماری‏های التهابی کاربرد دارد. در برگ و میوه آن ترکیبات  تانن، فلاونوئید و آنتوسیانین شناخته شده است. ریزوم این گیاه نیز حاوی آلکالوئید، فلاونوئید، تانن، گلیگوزید قلبی، ترپنوئیدها، آنتراکینون و ساپونین می‏باشد  و در درمان هیپرتیروئیدی، روماتیسم و آلرژی به‫کار می‏رود. به‏علاوه عصاره متانولی میوه، برگ و ریزوم این گیاه (پس از استخراج با هگزان و اتیل استات) و همچنین عصاره هگزانی اندام هوائی آن اثر ضد التهابی مناسبی از خود نشان داده‏اند.  فعالیت آنتی اکسیدانتی عصاره‏های آبی و متانولی میوه و گل این گیاه نیز اخیرا به چاپ رسیده است. ترکیبات گیاهی با ویژگی‏های مختلفی از جمله خاصیت آنتی اکسیدانتی خود با اثر بر روی سلول‏های بنیادی عصبی می‏توانند روند اکسیداسیون را به تاخیر انداخته یا مهار کند و نقش به‏سزایی در روند ترمیمی بیماری‏های نورودژنراتیو ایفا نماید (7-11)

سلول‏های بنیادی عصبی( Neural Stem Cells,NSCs )دارای توانایی تمایز به تمامی رده‏های نورواکتودرمال از جمله نورون، آستروگلیا و الیگودندروگلیا است و می‏توانند با مهاجرت به نواحی آسیب دیده مغزی باعث بهبود شرایط بیماری شوند. به‏علاوه سلول‫های بنیادی عصبی تحت تاثیر عوامل محیطی نظیر شرایط اکسیداتیو حاصل از بیماری‏های تحلیل عصبی رفتار متفاوتی از خود بروز می‏دهند و دچار نقص عملکردی می‏شوند. به‏عنوان مثال در بیماری آلزایمر افزایش یون آهن و مس در مغز، تشکیل رادیکال‏های آزاد را تحریک می‏کند و سطح استرس اکسیداتیو افزایش یافته و علایم بیماری نمایان می‏شود. درنتیجه تعدیل یا خنثی سازی محیط بیولوژیک این سلول‏ها در شرایط بیماری می‏تواند در روند بهبود اختلالات عصبی مفید واقع شود (5, 6, 12-14).

در قرن اخیر بررسی خواص آنتی اکسیدانتی مواد گوناگون از جمله ترکیبات گیاهی به‏عنوان عامل موثر بر سلامت انسان مورد توجه قرار گرفته است. تاکنون بیش از 30 درصد داروهای مصرفی در بیمارستان‏ها و کلینیک‏های درمانی را داروهای گیاهی تشکیل می‏دهد  و عصاره‏های گیاهی به‏عنوان مکمل طب مدرن به‏طور وسیع استفاده می شود. علی‫رغم وجود داروهای استروئیدی و غیر استروئیدی فراوان برای درمان بیماری‫های التهابی، تمایل به‏سمت داروهای طبیعی به‏علت ارزش استراتژیک و اقتصادی و به‏ویژه عوارض کمتر و دسترسی آسان‫تر وجود دارد (10, 15).

با این‫که مطالعات زیادی بر روی خواص آنتی اکسیدانتی گیاه گزنه انجام شده است، اطلاعات در مورد خواص و پتانسیل آن در جلوگیری یا مدیریت بیماری‏های نورودژنراتیو مربوط به استرس اکسیداتیو محدود است (16). لذا هدف از این مطالعه تاثیر آنتی اکسیدانتی عصاره متانولی برگ گیاه گزنه بر سلول‏های بنیادی عصبی در شرایط آزمایشگاهی مملو از رادیکال‏های آزاد می‏باشد.

 

مواد و روش‌ها

تهیه عصاره متانولی برگ گیاه گزنه: برگ‏های گیاه گزنه از 10 کیلومتری جاده سری-قائم‫شهر جمع آوری و به آزمایشگاه شیمی دارویی دانشگاه علوم پزشکی مازندران منتقل شد. پس از خشک کردن آن، قطعات خشک شده برگ گیاه به‏مدت 24 ساعت در متانول خیسانده شده و سپس محلول‏های جمع آوری شده با دستگاه تبخیر در خلا مورد تبخیر قرار گرفته و به‏روش خشک کردن در خلا توسط انجماد آماده شد (17).

استخراج و کشت سلول‏های بنیادی عصبی: مطالعات حیوانی این تحقیق پس از تصویب کد اخلاق به‏شماره 1603 در دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مازندران انجام شد. جداسازی سلول‏های بنیادی عصبی از نوزاد موش یک روزه صحرایی نر نژاد اسپراگو داولی صورت گرفت. بدین‫ترتیب که ابتدا بخش هیپوکامپ از دو نیمکره در شرایط استریل جدا شد. سپس با استفاده از هضم آنزیمی و مکانیکی به‫ترتیب با آنزیم(Gibco, Canada)Trypsin-EDTA و له کردن بافت توسط سرسوزن سرنگ انسولین سوپ سلولی حاصل شد. در ادامه با سانتریفیوژ، رسوب سلولی حاصل جهت کشت سلولی به فلاسکی که حاوی محیط کشت پایه (DMEM/F12 (Gibco, Canada)،FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, Canada)وPen/Strep (Penicillin 100 unit/ml & Streptomycin 100 unit/ml)) است منتقل و محیط کشت سلول‏های مورد نظر پس از 24 ساعت تعویض شد و در ادامه روند کشت سلول، قبل از این‫که سلول‫ها کف فلاسک را به‫طور کامل بپوشانند تریپسینه شده و به فلاسک دیگری منتقل شد. در پژوهش مذکور سعی بر این بود که از پاساژ سوم سلولی استفاده شود (18). گروه‏های تحقیق شامل گروه تجربی: شرایط اکسیداتیو و دریافت عصاره گزنه و گروه کنترل: شرایط اکسیداتیو بدون عصاره بود.

بررسی مورفولوژی: مورفولوژی سلول‏ها در گروه‏های مختلف، توسط میکروسکوپ معکوس  (Nikon,Eclipse-TS100) به‏صورت روزانه مشاهده و بررسی شد. همچنین جهت رنگ‫آمیزی گیمسا ابتدا  105× 2 سلول به‏هر یک از چاهک‏های پلیت 6 خانه‏ای حاوی لامل استریل اضافه و پس از گذشت یک شبانه روز، لامل 3 بار با PBS  شستشو و به‏وسیله محلول پارافرمالدئید 4 درصد (Paraformaldehyde, PFA, Sigma-Aldrich) به‏مدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس شد. پس از شستشو با محلول بافر فسفات (Phosphate-buffered Saline, PBS)، رنگ گیمسا به‏مدت 3 تا 5 دقیقه بر روی سلول‫ها ریخته و رنگ اضافی با کمک PBS از محیط سلولی خارج و سلول‏ها با میکروسکوپ بررسی شدند (19).

ارزیابی ایمونوسیتوشیمی: جهت تایید هویت ﺳﻠﻮل‏ﻫﺎی ﺑﻨﯿﺎدی  ﻋﺼـﺒﯽ از روش اﯾﻤﻮﻧﻮﺳﯿﺘﻮﺷﯿﻤﯽ اﺳﺘﻔﺎده شد. بدین ترتیب که ابتدا ﺳﻠﻮل‏ﻫﺎی ﺑﻨﯿﺎدی  ﻋﺼـﺒﯽ در محلول PBS سه مرتبه شستشو و سپس به‏منظور ثبوت (Fixation)  سلول‏ها به‏مدت 30 دقیقه در پارافرمالدئید 4 درصد قرار داده شدند. جهت جلوگیری از واکنش‏های غیر اختصاصی سلول‏ها به‏وسیله محلول مهار کننده سرم به‏مدت 60 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. سپس سلول‏ها با آنتی بادی‏های اولیه Nestin (abcam)  انکوبه و در ادامه آنتی بادی ثانویه مناسب اضافه شد. سرانجام با میکروسکوپ فلورسانس (Leica, Wetzlar, Germany) مورد ارزیابی قرار گرفتند (18).

تیمار ﺳﻠﻮل‏ﻫﺎی ﺑﻨﯿﺎدی ﻋﺼـﺒﯽ توسط عصاره گیاهی: این ارزیابی در دو مرحله مجزا صورت گرفت. در مرحله اول به‏منظور به‏دست آوردن مولاریته مناسب برای ایجاد شرایط اکسیداتیو در محیط کشت سلولی، 104×5 سلول را به‏هر یک از چاهک‏های پلیت 96 خانه منتقل و پس از اطمینان از چسبیدن سلول‏ها به کف پلیت، غلظت‏های 25، 50، 100، 200 و 400 میکرومولار از هیدروژن پراکسید را به ‏همه گروه‏ها به‏جز گروه کنترل اضافه شد. بعد از 24 ساعت تست زنده مانی بر روی پلیت 96 خانه انجام و توسط دستگاه Eliza plate reader (Synergy H11, Bio Tek, USA) با طول موج 570 نانومتر مقدار جذب هر گروه برآورد شد. در ادامه با استفاده از نرم افزار calcusyn میزان تجمع مهارکننده (IC50)  پراکسید هیدروژن محاسبه شد. همچنین درصد سمیت پراکسید هیدروژن با استفاده از فرمول زیر بررسی شد.

100 ×(میانگین جذب گروه کنترل / میانگین جذب هر گروه) -1

در مرحله دوم 104×5 سلول به‏هر یک از چاهک‏های پلیت 96 خانه منتقل شد. پس از چسبیدن سلول‏ها به کف پلیت، به‏تمامی گروه‏ها مقدار 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن با غلظت 50 میکرومولار برای ایجاد شرایط اکسیداتیو اضافه شد. پس از 24 ساعت عصاره متانولی برگ گیاه گزنه به‏صورت جداگانه با دوزهای 5/2، 5، 10، 20 و 40 میکروگرم بر میلی‫لیتر به‫میزان 50 میکرولیتر به همه گروه ها به‏جز گروه کنترل منفی اضافه شد. این مرحله نیز 24 ساعت به‏طول انجامید. سپس کمیت سلول‏ها توسط روش رنگ سنجی MTT ارزیابی شد. در هر مرحله قبل و بعد از تیمار ﺑـﺮای ﻣﻘﺎﻳـﺴﻪﻣورﻓﻮﻟـﻮژی ﺳــﻠﻮلﻫــﺎ از پلیت‫های ﺣﺎوی سلول ﺑﺎ دورﺑﻴﻦ دﻳﺠﻴﺘﺎل و ﻣﻴﻜﺮوﺳﻜﻮپ ﻣﻌﻜﻮس عکس ﮔﺮﻓﺘﻪ شد.

ﺳﻨﺠﺶ ﻛﻤﻴﺖ ﺳـﻠﻮلﻫـﺎ ﺑـﻪ‏روش رﻧـﮓ ﺳـﻨﺠﻲ  MTT (تست زنده مانی):به‏منظور ارزیابی مقدار تکثیر سلول‏ها 5 میلی‫گرم از پودردی متیل تیازول دی فنیل تترازولیوم (Dimethylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide ,MTT ,Sigma-Aldrich) در یک میلی لیتر PBS استریل حل شده و 20 میکرون از محلول زرد رنگ حاصل به‏ازای 200 میکرون محیط کشت در هر یک از چاهک‏ها ریخته شد. ﭘﺲ از ﭼﻬﺎر ﺳﺎﻋﺖ انکوباسیون، به‏منظور حل کردن بلورهای نامحلول فورمازون در کف پلیت سلولی به‏ﻫﺮ یک از چاهک‏ها حدود 200 میکرونDimethyl Sulfoxide, Sigma))DMSO  اضافه شد. سرانجام ﺟﺬب ﻧﻮری در ﻃﻮل ﻣﻮج 570 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ توسط دستگاه Eliza plate reader  محاسبه گردید. لازم به‏ذکر است که تست MTT  با سه بار تکرار انجام شد (17, 18).

روش تجزیه و تحلیل آماری: روش محاسبه، تجزیه و تحلیل داده‏ها بر مبنای مقایسه میانگین متغیرهای کمی و کیفی بین گروه‏ها از آزمون ANOVA و کی اسکوا استفاده شد. محاسبات آماری توسط نرم افزار SPSS 16 صورت گرفت. علاوه بر این سطح معنی‏داری 05/0 p≥در نظر گرفته شد.

 

نتایج

کشت سلول‏های بنیادی عصبی و بررسی مورفولوژی

در روز اول پس از استخراج سلول‏های بنیادی عصبی به‏صورت کلنی با زوائد طویل به کف پلیت سلولی چسبیده بودند (شکل 1 الف) و به‏مرور زمان از هم جدا شدند و ظاهر سلول عصبی با قدرت تقسیم را به‏خود گرفتند. 7 روز بعد از استخراج، سلول‏ها کف فلاسک را به‏طور کامل پر کردند و‏ به‏طور کامل به دیش چسبیدند (شکل 1 ب). پس از پاساژ اول سلول‏ها دارای ظاهری یک‏دست، کشیده و دوقطبی و چندقطبی به‏همراه تشکیل شبکه‏های گسترده و منظم سلولی بودند (شکل 1 ج). اما مورفولوژی NSCs به‏طور اختصاصی با رنگ آمیزی گیمسا انجام شد که تاییدکننده واکنش مثبت و موید ظاهر عصبی این سلول‏ها بود (شکل 1 د).

 

 

 

شکل1: مورفولوژی سلول‫های بنیادی عصبی مشتق از هیپوکامپ نوزاد موش صحرایی. الف) 24 ساعت پس از استخراج. ب) 7 روز پس از استخراج. ج) پس از اولین پاساژ، د) رنگ آمیزی گیمسا، (مقیاس 100 میکرومتر)

 

 

نتایج رنگ امیزی فلورسنت برای مارکر عصبی Nestin موید بیان واکنش مثبت این مارکر و تایید ماهیت عصبی

و خلوص این سلول‏ها بود (شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: ایمنوسیتوشیمی سلول‫های بنیادی عصبی ( مارکر عصبی به رنگ قرمز و هسته به رنگ آبی دیده می‫شود). (مقیاس 10 میکرومتر).

 

 

تست زنده مانیMTT

نتایج این تست نشان داد که میزان زنده مانی سلول‏ها در غلظت‏های مختلف  H2O2کاهش می‏یابد (جدول 1). همچنین با استفاده از میانگین جذب گروه‏های تیمار، مقدار تجمع مهارکننده (IC50) پراکسید هیدروژن 120 به‏دست آمد که با توجه به‏مقدار IC50 و مطالعات گذشته (13) غلظت 50 میکرومولار H2O2 جهت اعمال استرس اکسیداتیو مطلوب به‏نظر رسید. درصد سمیت پراکسید هیدروژن نیز درجدول 1 نشان داده شده است که گویای اثرات مخرب این ماده بر روی سلول‏های بنیادی عصبی در محیط کشت است.

 

 

جدول 1: میانگین و انحراف معیار پراکسید هیدروژن در گروه‫های مختلف 05/0‫>p

گروه (میکروگرم بر میلی لیتر)

میانگین جذب

کنترل

0132/0±98/1

غلظت 25

0186/0±89/1

غلظت50

0402/0±72/1

غلظت100

0314/0±48/1

غلظت200

0291/0±84/0

غلظت400

0011/0±18/0

 

 

شکل 3 الف نیز نتایج تست زنده مانی را در مرحله دوم یعنی بررسی غلظت‏های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه گزنه را نشان می‏دهد. در تمامی گروه‏ها میزان جذب نسبت به گروه کنترل مثبت افزایش یافت و همچنین بیشترین میزان تکثیر سلول‏ها در حضور عصاره برگ گیاه در غلظت 20 میکروگرم بر میلی لیتر اتفاق افتاد. شکل 3: ب مورفولوژی سلول‫های بنیادی عصبی در گروه فاقد H2O2و عصاره گیاهی شکل 3 ج مورفولوژیسلول‫های بنیادی عصبی در گروه H2O2و بدون عصاره گیاهی و شکل 3 د مورفولوژی سلول‫های بنیادی عصبی در گروه تحت تیمار با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‫لیتر نشان می‫دهد. لازم به‏ذکر است که کم‫ترین میزان زنده‫مانی سلول‏های بنیادی عصبی در گروه فاقد عصاره گیاهی یعنی گروه کنترل مثبت مشاهده شد (جدول 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: ارزیابی سلول‫های بنیادی عصبی تحت تیمار با غلظت‫های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه گزنه. الف) نمودار تست زنده‫مانی سلول‫های بنیادی عصبی در حضور غلظت‫های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه گزنه (a: وجود اختلاف معنی‫دار بین گروه‫های تیمار نسبت به گروه‫های کنترل (05/0>p). ب) سلول‫های بنیادی عصبی در گروه فاقد H2O2و عصاره گیاهی. ج) سلول‫های بنیادی عصبی در گروه H2O2و بدون عصاره گیاهی. د) سلول‫های بنیادی عصبی در گروه تحت تیمار با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‫لیتر (مقیاس 10 میکرومتر).

 

 

 

جدول 2: میانگین و انحراف معیار عصاره برگ گیاه گزنه در گروه‫های مختلف (05/0>p).

گروه (میکروگرم بر میلی لیتر)

میانگین جذب

کنترل

0006/0±16/0

غلظت 5/2

0046/0±26/0

غلظت5

0033/0±30/0

غلظت10

0053/0±32/0

غلظت20

0042/0±39/0

غلظت40

0013/0±28/0

 

 

بحث

نتایج تحقیق حاضرنشان دهنده افزایش میزان تکثیر و بقای سلول‏های بنیادی عصبی در حضورعصاره متانولی گزنه در شرایط استرس اکسیداتیو در محیط آزمایشگاهی می‏باشد و این نتیجه موید قابلیت بالقوه این گیاه در روند ترمیم عصبی می‏باشد.

از دیرباز استفاده از گیاهان دارویی در اکثر مناطق جهان مرسوم بوده و تاکنون توانسته گام‏های مهمی در درمان انواع مختلف بیماری‏ها در طب سنتی بردارد. امروزه پتانسیل فارماکولوژیک و محبوبیت و مقبولیت عام گیاهان دارویی و بسیاری ویژگی برجسته دیگر موجب  نفوذ طب سنتی در علم نوین پزشکی شده است (2, 20). از طرفی اکسید شدن مولکول‏های بیولوژیک در بسیاری از بیماری‏ها باعث تولید رادیکال‫های آزاد شده و مشکلاتی را در نواحی مختلف بدن ایجاد می‫کند. آنتی اکسیدانت‏های صناعی (Synthetic) مانند گروه فنول‏های سنتتیک که به‏طور گسترده استفاده می‏شود از نقطه نظر ایمنی این ترکیبات اختلاف نظر وجود دارد. لذا در سال‏های اخیر استفاده از آنتی اکسیدانت‏های گیاهی یا پلی فنول‏ها (polyphenol) در صدر تحقیقات دانشمندان قرار گرفته است. لازم به‏ذکر است که با تجویز آنتی اکسیدانت‏های گیاهی، سیستم آنتی اکسیدانت ذاتی بدن تحت تاثیر آنتی اکسیدانت‏های طبیعی قرار گرفته و موجب هم افزایی یکدیگر در محیط داخلی بدن می‏شوند. در همین راستا مطالعه‏ای در سال 2009 بر روی اثر آنتی اکسیدانتی عصاره اتانولی گیاه زنجبیل انجام شد و نشان داد این گیاه از طریق تقویت احیای ذاتی رادیکال‏های آزاد، باعث حفاظت بدن در برابر استرس اکسیداتیو حاصل از سمیت کبدی القا شده در موش می‏شود (16, 20-23)

در طب سنتی برگ گیاه گزنه به‏عنوان بخش دارویی گیاه محسوب می‫شود که از طرق مختلف فعالیت آنتی اکسیدانتی خود را اعمال می‏کند. یکی از مکانیسم‏های مولکولی ضد التهابی عصاره برگ گیاه گزنه در درون سلول، مهار رونویسی فاکتور NF-KB است. این فاکتور در بیماری‏های التهابی مزمن افزایش می‏یابد و از طریق بیان بسیاری از ژن‏های دخیل در پاسخ‏های التهابی باعث تشدید التهاب می‫شود (24, 25).

در بیماری نورودژنراتیو نکروز و دژنره شدن عصبی رخ می‫دهد و سیستم عصبی مرکزی قادر به تولید نورون جدید نمی‏باشد. بنابراین سلول‏های بنیادی عصبی با قابلیت‏های خود می‏توانند نقش حائز اهمیتی در درمان این بیماری‏ها ایفا کنند (26-28).NSCs  در نواحی ساب گرانولار (sub granular zone)و ساب ونتریکولار (sub ventricular zone)CNS ، هیپوکامپ (hippocampus) و استریاتوم (striatum) و مجرای مرکزی نخاع تجمع دارند. در این پژوهش سلول‏های مذکور از ناحیه هیپوکامپ استخراج شدند و مورفولوژی و ماهیت عصبی آن‏ها به اثبات رسید (29-33).

در مطالعه حاضر به‏منظور القای سایتوتوکسیسیتی در سلول‏ها و ایجاد شرایط اکسیداتیو در محیط کشت سلولی از پراکسید هیدروژن (H2O2) استفاده شد. زیرا که در سیستم عصبی مرکزی (CNS) هم شرایطی مشابه موجب آسیب و بروز اختلالات نورولوژیکال می‏شود. مطالعه‏ای جامع توسط Goen Ha Kim و همکارانش بر روی نقش استرس اکسیداتیو بر روی بیماری‏های نورودژنراتیو صورت گرفت که موید تاثیر سوء انواع رادیکال‏های آزاد تولید شده در سیستم عصبی بر روی عملکرد نورونی است (5 و 32).

در همین زمینه نتایج حاصل از تست MTT نیز نشان داد که عصاره متانولی برگ گیاه گزنه بر روی NSCs دارای اثرات مثبتی می‏باشد. به‏طوری‏که دوز موثره عصاره مذکور 20 میکروگرم در میلی‫لیتر در محیط کشت این سلول‏ها بود زیرا که بیشترین میزان تکثیر سلول‏ها در این دوز مشاهده شد. اما همان‏طور که قابل مشاهده است دوز µg/ml40 میزان تکثیر سلول‏ها کاهش یافته است. در همین راستا مطالعه‏ای بر روی عصاره آبی گیاه Musk (She Xiang) نشان داد که عصاره این گیاه باعث تکثیر و تمایز NSCs در شرایط آزمایشگاهی می‫شود و در غلظت بالای 3 درصد منجر به سمیت محیط کشت سلول‏ها شد (29).

ترکیبات بیولوژیک گیاه گزنه شامل پلی ساکارید (polysaccharide)، لکتین (lectin)، استروئید(steroid) ، تریپنوئید (Terpenoid)، Phenylpropanoid و Coumarin می‏شود که مهم‫ترین آن‏ها فلاونوئیدها هستند که با تعدیل برخی آنزیم‏های مشخص و فعالیت آنتی اکسیدانتی قوی، مولکول‏های فعالی مثل نیتریت پراکسید و رادیکال هیدروکسید را غیرفعال می‏کند. علاوه ‏بر این تحقیقات بر روی حیوانات آزمایشگاهی نشان می‏دهد ریشه این گیاه با افزایش اکسید نیتریک باعث اتساع عروق و خون رسانی بهتر و بهبود وضعیت پاتولوژیک سلول‏های عصبی می‏شود (30 ,32). اگرچه برخی تحقیقات نقش آنتی اکسیدانتی عصاره گزنه را اثبات کرده‏اند ولی نقش محافظتی این گیاه بر بقا و تکثیر سلول‏های بنیادی عصبی در شرایط اسیب اکسیداتیو تا کنون بررسی نشده که خود یک جنبه نوآوری تحقیق حاضر بوده و به‏کارگیری گیاه گزنه می‏تواند چشم انداز جدیدی در ترمیم اعصاب و حتی درمان ضایعات نورودژنراتیو باشد.

 

نتیجه­گیری

گیاه گزنه علاوه بر توانایی تعدیل شرایط اکسیداتیو در محیط کشت سلول‏های بنیادی عصبی،  قادر است روند تکثیر و زنده مانیNSCs را بهبود ببخشد و می‏تواند در آینده‏ی نزدیک به‏عنوان داروی گیاهی موثر در پیشگیری و درمان اختلالات عصبی ایفای نقش کند.

 

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر حاصل پروژه مصوب معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی مازندران به‏ کد 1603 است که نویسندگان بدین‏وسیله از کارشناسان محترم آزمایشگاه دانشکده داروسازی و گروه علوم تشریحی دانشگاه علوم پزشکی مازندران تقدیر و تشکر می‏نمایند.

1. Shahram S, Maryam K. Effect of hydroalcoholic extract of Salvia officinalis L. on the activity of catalase and superoxide dismutase in an oxidative stress model created by intracerebroventricular STZ injection in male rats. Physiology and Pharmacology. 2013; 17: 176-84.

2. Auddy B, Ferreira M, Blasina F, Lafon L, et al. Screening of antioxidant activity of

 

three Indian medicinal plants, traditionally used for the management of neurodegenerative diseases. Journal of Ethnopharmacology. 2003; 84(2-3): 131-8.

3. Hassan W, Noreen H, Rehman S, Gul S, et al. Oxidative stress and antioxidant potential of one hundred medicinal plants. Current topics in medicinal chemistry. 2017; 17(12): 1336-70.

4. Patel SS, Ray R, Sharma A, Mehta V, et al. Antidepressant and anxiolytic like effects of Urtica dioica leaves in streptozotocin induced diabetic mice. Metabolic brain disease. 2018: 33(4): 1-12.

5. Bojnordi MN, Movahedin M, Tiraihi T, Javan M. A simple co-culture system for generation of embryonic stemlike cells from testis. Iran Red Crescent Med J. 2012;
14(12): 811-815.

6. Soltanian A, Ghorbanian MT, Lashkarbolouki T. Comparison of the proliferation potential and neurotrophic factors expression in the adherent neural stem cells culture of the Subgranular, Subventricular zone and the central canal of the spinal cord of the adult rats. Journal of Gorgan University of Medical Sciences. 2013; 15(3).

7. Bisht R, Joshi BC, Kalia AN, Prakash A. Antioxidant-Rich Fraction of Urtica dioica Mediated Rescue of Striatal Mito-Oxidative Damage in MPTP-Induced Behavioral, Cellular, and Neurochemical Alterations in Rats. Molecular neurobiology. 2017; 54(7): 5632-45.

8. Hadizadeh I, Peivastegan B, Kolahi M. Antifungal activity of nettle (Urtica dioica L.), colocynth (Citrullus colocynthis L. Schrad), oleander (Nerium oleander L.) and konar (Ziziphus spina-christi L.) extracts on plants pathogenic fungi. Pakistan journal of biological sciences: PJBS. 2009; 12(1): 58-63.

9. Ahangarpour A, Mohammadian M, Dianat M. Antidiabetic effect of hydroalcholic Urtica dioica leaf extract in male rats with fructose-induced insulin resistance. Iranian journal of medical sciences. 2012; 37(3): 181.

10. Shokrzadeh M, Saravi SS. The chemistry, pharmacology and clinical properties of Sambucus ebulus: A review. Journal of medicinal plants research. 2010; 4(2): 095-103.

11. Daci-Ajvazi M, Zeneli L, Daci N, Krasniqi A, et al. CHEMICAL EFFECTS AND ANTIOXIDANT RESPONSES OF URTICA DIOICA L. EXTRACTS GROWING ALONG HIGHWAY. 2018.

12. Bojnordi MN, Azizi H, Skutella T, Movahedin M, et al. Differentiation of spermatogonia stem cells into functional mature neurons characterized with differential gene expression. Molecular neurobiology. 2017; 54(7): 5676-82.

13. Buddensiek J, Dressel A, Kowalski M, Runge U, et al. Cerebrospinal fluid promotes survival and astroglial differentiation of adult human neural progenitor cells but inhibits proliferation and neuronal differentiation. BMC neuroscience. 2010; 11(1): 48.

14. Ghasemi N, Razavi S. Transdifferentiation potential of adipose-derived stem cells into neural lineage and their application. Journal of Histology & Histopathology. 2014; 1(1):12.

15. Hamedi A, Zarshenas MM, Sohrabpour M, Zargaran A. Herbal medicinal oils in traditional Persian medicine. Pharmaceutical biology. 2013; 51(9): 1208-18.

16. Oboh G, Akinyemi AJ, Ademiluyi AO. Antioxidant and inhibitory effect of red ginger (Zingiber officinale var. Rubra) and white ginger (Zingiber officinale Roscoe) on Fe2+ induced lipid peroxidation in rat brain in vitro. Experimental and Toxicologic Pathology. 2012; 64(1-2): 31-6.

17. Ebrahimzadeh M, Nabavi S, Nabavi S. Antioxidant activities of methanol extract of Sambucus ebulus L. flower. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2009; 12(5): 447.

18. Abdanipour A, Khatami SM, Tiraihi T, Satari MJ. Effect of hydro-ethanolic extract of Chamaemelum nobile on cell proliferation and apoptosis of rat hipocample neural stem cells in the oxitative stress condition. Journal of Gorgan University of Medical Sciences. 2015; 16(4): 14-9.

19. Wachs FP, Couillard-Despres S, Engelhardt M, Wilhelm D, et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation. 2003; 83(7): 949.

20. El-Sharaky A, Newairy A, Kamel M, Eweda S. Protective effect of ginger extract against bromobenzene-induced hepatotoxicity in male rats. Food and Chemical Toxicology. 2009; 47(7): 1584-90.

21. M. Nazm Bojnordi M, Movahedin T. Tiraihi, M. Javan, Alteration in genes expressionpatterns during in vitro differentiation of mouse spermatogonial cells into neuroepithelial-likecells, Cytotechnology. 2013; 65(1): 97–104.

22. Stoilova I, Krastanov A, Stoyanova A, Denev P, et al. Antioxidant activity of a ginger extract (Zingiber officinale). Food chemistry. 2007; 102(3): 764-70.

23. Golalipour M, Mohammad Gharravi A, Ghafari S, Azarhoush R. Protective Effect of URTICA DIOICA on renal morphometric and histologic alterations in streptozotocin diabetic Rats. Journal of Babol University of Medical Sciences. 2009; 10(6): 14-22.

24. Nobakht A, Rahimzadeh M, Safamehr A. Effects of different levels of mixed medicinal plants of Urtica dioica L., Mentha pulegium L. and Ziziphora tenuior L. on performance, carcass traits, hematological and blood biochemical parameters of broilers. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants. 2013; 29(1).

25. Babashpour-Asl M, Baleghi M, Sajadi P, Golalipour MJ. Different Aspects and Results of Modern Studies of Urtica Dioica: A Review. Babol University of medical Sciences. 2014; 16(1): 47-54.

26. Nazm Bojnordi M, Ghasemi HH, Akbari E. Remyelination after lysophosphatidyl choline-induced demyelination is stimulated by bone marrow stromal cell-derived oligoprogenitor cell transplantation. Cells Tissues Organs. 2015; 200(5): 300–306.

27. Haratizadeh S, Nazm Bojnordi M, Niapour A, Bakhtiari M, et al. Improvement of neuroglial differentiation from human dental pulp stem cells using CSF. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2016; 26(140): 1-14.

28. Nazm Bojnordi M, Movahedin M, Tiraihi T, Javan M. Alteration in genes expression patterns during in vitro differentiation of mouse spermatogonial cells into neuroepithelial-like cells, Cytotechnology. 2013; 65(1): 97–104.

29. Haratizadeh S, Nazm Bojnordi M, Darabi S, Karimi N, et al. Condition medium of cerebrospinal fluid and retinoic acid induces the transdifferentiation of human dental pulp stem cells into neuroglia and neural like cells. Anatomy & cell biology. 2017; 50(2): 107-114.

30. Nazm Bojnordi M, Movahedin M, Tiraihi T, Javan M. Ghasemi Hamidabadi H.Oligoprogenitor cells derived from spermatogonia stem cells improve remyelination in demyelination model.Mol Biotechnol. 2014; 56(5): 387-93.

31. JM C, E T-C. Culturing and cryobanking human neural stem cells. Stem Cell Banking: Concepts and Protocols. 2017: 199-206.

33. Cebrián-Silla A, Alfaro-Cervelló C, Herranz-Pérez V, Kaneko N, et al. Unique organization of the nuclear envelope in the post-natal quiescent neural stem cells. Stem Cell Reports. 2017; 9(1): 203-16.

32.       Si Y-c, Li Q, Xie C-e, Niu X, et al. Chinese herbs and their active ingredients for activating xue (blood) promote the proliferation and differentiation of neural stem cells and mesenchymal stem cells. Chinese medicine. 2014; 9(1): 13.

33. Nazm Bojnordi M, Movahedin M, Tiraihi T. Genetic changes during differentiation of spermatogonial stem cells into oligoprogenitor cells. Babol Univ Med Sci. 2017; 19(10): 35-41.