مطالعه اثرات پیشگیرانه و درمانی کاروتنوئید آستاگزانتین بر روی بیماری Multiple Sclerosis در موش‌های مدل C57BL/6

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم وتحقیقات تهران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

2 دانشگاه الزهرا، پژوهشکده زنان، گروه بیومدیکال، تهران، ایران

3 دانشگاه علوم پزشکی تهران، مرکز تحقیقات غدد درون ریز و متابولیسم، گروه مدل‌سازی مولکولی، تهران، ایران

4 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، دپارتمان ژنتیک پزشکی، تهران، ایران

چکیده

هدف: در مطالعه حاضر به بررسی امکان مفید بودن آستاگزانتین در مدل موشی بیماری MS، آنسفالومیلیت تجربی خود ایمن (EAE) پرداخته شده است.
مواد و روش­ها: بیماری EAE با استفاده از پپتید MOG35-55 و ادجوانت کامل فروند (CFU) در موش­های ماده C57BL/6 القا شد. موش­ها در گروه کنترل نرمال، گروه بیمار، گروه پیشگیری دریافت کننده آستاگزانتین 21 روز قبل از القا بیماری و گروه­ درمانی که پس از ایمونیزاسیون و با شروع علائم بیماری، آستاگزانتین را دریافت کردند، قرار گرفتند. هر گروه شامل 8 راس موش بود. مصرف آستاگزانتین تا 35 روز پس از ایمونیزاسیون ادامه یافت و هر روز به‫مقدار 4/0 درصد وزن پلت مورد مصرف (حدود 400 میلی­گرم) آستاگزانتین مصرف می­‫شد. سپس میزان تکثیر سلولی به‫وسیله آزمون MTT، میزان تولید اینترلوکین 6 و اینترلوکین یک بتا سرم خونی به وسیله ELISA سنجیده شد. علاوه بر این بافت های نخاع نیز به‫منظور ارزیابی­های ایمونوهیستوپاتولوژی مطالعه شدند.
نتایج: بر اساس نتایج به‫دست آمده مصرف آستاگزانتین منجر به بروز پیامدهای بالینی و آسیب شناختی مناسبی شده به‫طوری­که منجر به کاهش تولید سایتوکاین­های پیش التهابی IL1β ، IL6 شد (0001/0 (p<مطالعات ایمونوهیستوپاتولوژی نیز کاهش ارتشاح لکوسیت­ها را در بافت نخاع گروه­های تجربی نشان دادند.
نتیجه­گیری: در مجموع ممکن است که این ره‫یافت دارویی به‫عنوان یک استراتژی سودمند در پیشگیری و درمان بیماری مالتیپل اسکلروز مطرح شد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

انسفالومیلیت تجربی خودایمن (EAE) به‫عنوان مدل حیوانی بیماریMS  (Multiple Sclerosis) در تحقیقات مورد استفاده قرار می­گیرد. در بیماری MS و مدل تجربی آن (EAE)، پاسخ التهابی سلول‌های TCD4+ خود واکنش‫گر اختصاصی به آنتی ژن‌های میلین خودی عامل دمیلیناسیون سیستم اعصاب مرکزی و سبب ایجاد ناتوانی­های نورولوژیک در افراد محسوب می­شود (1و2).

نتایج مطالعات بر روی مدل حیوانی EAE نشان داده است با انتقال سلول­های Th1 فعال شده اختصاصی میلین به موش­های سالم، سبب ابتلا به  EAE می­شود و سلول­های TCD4+ نفوذ یافته در سیستم عصبی مرکزی سبب افزایش تولید سایتوکاین‫های سلول­های Th1 می‫شوند (3). سایتوکاین­های سلول­های Th1 نیز سبب فعال شدن ماکروفاژها، در نتیجه تخریب میلین و آسیب به الیگودندروسیت­ها می­شود. ماکروفاژها و سلول­های میکروگلیا فعال شده انواعی از سایتوکاین­ها از قبیل IL-6 و IL-1 را ترشح می­کنند که مقادیر بالای این سایتوکاین‫ها ممکن است باعث آسیب رساندن به سایر الیگودندروسیت‫ها و نورون‫ها شود (4).

درمان‫های رایج این بیماری عمدتا شامل یکسری داروهای سرکوب یا تعدیل کننده سیستم ایمنی می باشد که علاوه بر عوارض جانبی ناخواسته در دراز مدت با پیشرفت بیماری، کارایی درمانی خود را تا حدود زیادی از دست می­دهند. از میان استراتژی‫های درمانی که تا به حال برای بیماری MS معرفی شده­اند درمان­های غیرتهاجمی مانند استفاده از داروهای آنتی­اکسیدانت قدرتمند، جایگاه بزرگی را به‫خود اختصاص داده است. آستاگزانتین به‫عنوان یک ترکیب محلول در چربی می­تواند به‫طور موثر از سد خونی مغزی عبور کند. همچنین یک ماده مغذی سالم بدون اثر سمیت می­باشد (5). آستاگزانتین به‫علت خاصیت آنتی­اکسیدانتی قوی در حفاظت ترکیبات سلولی در مقابل آسیب اکسایشی و در تنظیم بیان ژن، القا ارتباطات سلول – سلول و سلامت سلول نقش دارند (6). آستاگزانتین به‫میزان بیشتری نسبت به سایر ترکیبات کاروتنوئیدی آزاد شدن فاکتورهای ایمنی مانند IL-10 و TNF-α و تولید آنتی­بادی­های IgM را افزایش می­دهد. دلیل اهمیت مطالعه درباره اثرات سودمند آستاگزانتین این است که این کاروتنوئید حتی در شرایط التهابی خفیف قادر است پاسخ ایمنی قابل توجهی ایجاد نماید (7). مطالعات پیشین نشان داد تنش­های اکسایشی آسیب زننده به سیستم عصبی، بیماری­های عصبی را ایجاد می­نماید و در مقابل تغذیه با آنتی­اکسیدانت­ها احتمال خطر این بیماری­ها را کاهش می­دهد اثرات محافظتی آستاگزانتین مرتبط با ساختار منحصر به فرد آستاگزانتین و نحوه قرار­گیری آن و تاثیر بر ساختار غشا سلول و عملکرد آن است، از طرفی دیگر خواص آنتی­اکسیداتیو و ضدالتهابی آن سبب شده است کاندیدای مناسبی برای کاهش آسیب‫های مزمن و حاد تخریب نورونی و درمان بیماری­های عصبی و محافظت از سلول­های عصبی محسوب شود. به‫خصوص که بطور گسترده و با صرف هزینه پائین از جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس، مخمر فافیا رودوزیما و ... می­توان آن را استخراج کرد (10-8).

گزارش‫ها نشان می­دهد در پاسخ به آسیب وارده به سیستم عصبی مرکزی، اینترلوکین 1 بتا (IL-1β) و اینترلوکین 6 (IL-6) افزایش میآبد. در مطالعه بر روی موش­های ماده تحت درمان با آستاگزانتین کاهش سطح سرمی IL-1β مشاهده شده است (11).

مطالعه حاضر با هدف ارزیابی اثر آنتی­اکسیدانتی آستاگزانتین در تعدیل پاسخ التهابی لنفوسیت­های T خود واکنش‫گر و بررسی اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین در مدل حیوانی بیماری MS (EAE) شکل گرفته است. در مطالعه پیش­رو القا دمیلیناسیون به‫روش EAE و تاثیرگذاری آستاگزانتین به‫صورت پیش درمان و درمان بر میزان سطوح سایتوکاین­های پیش التهابی IL-6 و IL-1β در سرم خون مورد بررسی قرار گرفت این تحقیق در آزمایشگاه تحقیقاتی بیومدیکال دانشگاه الزهرا و آزمایشگاه تحقیقاتی مجتمع زکریا رازی دانشگاه علوم تحقیقات تهران انجام گرفته ­است.

 

مواد و روش‌ها

تحقیق حاضر به‫روش تجربی و جامعه مورد بررسی شامل 32 سر موش ماده C57BL/6 در محدوده سنی6 الی 8 هفته­ای از انستیتو پاستور تهران با میانگین وزنی(mean±SD) 46/0.± 62/17 گرم تهیه شد و در شرایط نور و رطوبت و دمای اپتیموم و مناسب در حیوان‫خانه دانشگاه علوم تحقیقات تهران نگه‫داری شدند. پروتکل این تحقیق براساس قوانین بین المللی در مورد حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. جهت القا بیماری EAE 200 میکروگرم پپتید MOG35-55 (شرکت Peptron, South Korea) حل شده در 100 میکرولیتر بافر فسفات سدیم (PBS) و 100 میکرولیتر ادجوانت فروند کامل (شرکت Sigma، آمریکا) به‫صورت زیر جلدی در ناحیه پشتی - کمری به‫هر موش تزریق شد. سپس 400 نانوگرم پرتوسیس توکسین به‫منظور افزایش نفوذپذیری سد خونی-مغزی (شرکت Sigma، آمریکا) در حجم 300 میکرولیتر (PBS) حل شده و در روزهای صفر و 48 ساعت بعد از ایمونیزاسیون به‫صورت داخل صفاقی تجویز شد (12). آستاگزانتین مصرف شده توسط بخش بیومدیکال دانشگاه الزهرا از جلبک Haematococcus pluvialis  استخراج شده بود. به‫طور متوسط موش­های C57BL/6 روزانه حدود 4/0 درصد خوراک مصرفی (پلت) (حدود mg/kg 400) آستاگزانتین دریافت می‫کردند و پلت­ها در این مقدار آستاگزانتین غلطانیده می­شد (13و14).

مصرف آستاگزانتین مطابق با گروه­بندی زیر صورت پذیرفت و کلیه درمان‫ها تا 35 روز (5 هفته) پس از القا بیماری ادامه یافت: گروه کنترل سالم: گروهی که بیمار نشدند و آب و غذای معمولی دریافت کردند و هیچ دارویی دریافت نکردند، گروه بیمار (EAE): گروهی که بیمار شدند ولی دارو (آستاگزانتین) دریافت نکردند، گروه تجربی پیشگیری: 21 روز (سه هفته) قبل از القا بیماری و ایمونیزاسیون آستاگزانتین دریافت کردند و گروه تجربی درمانی: موش­ها بعد از القا بیماری و با ارائه اولین علائم بیماری، آستاگزانتین را همراه با پلت مصرفی روزانه دریافت کردند.

بررسی روند تغییرات وزن و شدت علائم کلینیکی به‫صورت روزانه صورت گرفت. جهت ارزیابی شدت بیماری از سیستم نمره­دهی هفتگانه مطابق جدول1 استفاده شد.

 

                                           

                                            جدول1: علائم کلینیکی و درجه شدت بیماری در موش مدل MS (EAE)

علائم و پی­آمدها

درجه شدت بیماری

عدم بروز بیماری

صفر

شلی دم

یک

فلج شدن دم

دو

اختلال در راه رفتن

سه

فلجی یک پا                      

چهار

فلجی دو پا

پنج

فلجی چهار دست و پا

شش

مرگ

هفت

 

 

پنج هفته بعد از القا بیماری (روز سی و پنجم پس از ایمونیزاسیون با پپتید MOG35-55) موش­ها تحت بیهوشی عمیق قرار گرفتند (کتامین ‫‪mg/Kg 100 و زایلازین ‪ mg/Kg10 داخل صفاقی ip). و از قلب آن‫ها خون گرفته شد. نمونه­های خونی گرفته شده در دستگاه سانتریفوژ یخچال­دار 10 دقیقه در g 200 قرار داده شد تا سرم آن برای تکنیک الایزا جدا شود. به‫منظور تعیین سطح سایتوکاین اینترلوکین 1 بتا (IL-1ß) و IL-6 در سرم به‫ترتیب از کیت الایزا (Abcam، آمریکا) و (eBioscience, Inc., USA). مطابق با پروتکل شرکت سازنده استفاده شد. برای هر نمونه دو خانه (کنترل سالم، گروه بیمار و گروه‫های تجربی) در نظر گرفته شد و یک جفت خانه به‫عنوان شاهد ‪ Blank و هفت جفت ‫خانه نیز برای نمونه استاندارد در نظر گرفته شد. نتایج در طول موج 450 نانومتر توسط ELISA Reader خوانده شد. داده­ها بعد از تهیه نمودار استاندارد، برای تعیین غلظت سایتوکاین مورد ارزیابی قرار گرفت

میزان تکثیر سلول‫های ایمنی با متد MTT ارزیابی شد. به‫همین منظور پنج هفته بعد از القا بیماری موش‫ها و پس از بی‫هوشی عمیق. بدون اتلاف وقت طحال موش‫ها تحت شرایط استریل خارج و ‫بعد از قطعه شدن در ml2 محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد، FBS له شده و جهت تهیه سوسپانسیون سلولی از توری سیمی به قطر 2/0 میلی متر عبور داده شدند. به‫مدت 10 دقیقه درg 200 سوسپانسیون سلولی سانتریفیوژ شد. به‫منظور حذف گویچه­‫های سرخ، به رسوب سلولی 5 میلی‫لیتر بافر لیز کننده افزوده شد. بعد از 5 دقیقه ضمن افزودن 10 میلی‫لیتر محیط کشت ‫نمونه­ها بار دیگر سانتریفیوژ تکرار شد. رسوب سلولی در محیط کشت ‪RPMI-1640 ‫حاوی 10 درصد ‪ FBS به‫صورت سوسپانسیون در آورده شد.‫ پس از فرآیند شمارش سلول­ها به‫وسیله روش رنگ­آمیزی با تریپان بلو، سوسپانسیونی حاوی cell/ml‫‪106×1 تهیه شد و ‪μl 100 از آن در هر یک از چاهک‫های پلیت 96 خانه­ای ته تخت ریخته شد. برای ‫هر نمونه سه تکرار بدون حضور پادگن و سه تکرار در حضور µg/ml 50 میکرولیتر بر میلی‫لیتر از پپتید 35-55 MOG در نظر گرفته ‫شد. به عنوان بلانک نیز در سه چاهک از محیط  کشت RPMI-1640 استفاده شد.بعد از 72 ساعت گرم خانه­گذاری در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 به‫هر چاهک ‪μl 25 محلول ‪MTT‫ (mg/ml 5 در PBS) افزوده شده، به مدت 4 ساعت دیگر گرم خانه­گذاری شد. در این مدت احیا ماده MTT توسط سلول‫های زنده و در حال تکثیر سبب تشکیل کریستال­های فورمازون گردید که با افزودن 100‫میکرولیتر ‪DMSO به صورت محلول در­آمد.‫ شدت رنگ در طول موج ‪ 490 نانومتر تعیین و شاخص تحریک به صورت زیر محاسبه ‫شد.

‫= شاخص تحریک                        

جهت مطالعات نوروپاتولوژیک با رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی نیز پس از بی‫هوشی موش­ها به‫صورت داخل صفاقی ip با کتامین و زایلازین به نسبت 3:1 اقدام به برداشتن نخاع کرده،  نخاع را وارد فالکون­های مناسب حجمی حاوی فرمالین 10 درصد نموده و سپس جهت آب­گیری و قالب­گیری با پارافین و برش­گیری آماده نموده، سپس به‫منظور پارافین­زدایی و آب‫گیری در گزیلن و بعد الکل قرار داده می­شود، لام‫ها به‫مدت 15 دقیقه در بافر سیترات و ماکروویو قرار گرفتند، سپس جهت بلاک فعالیت پراکسیداز اندوژنز از محلول H2O2 در متانول استفاده می­شود (سوبسترای اختصاصی). آنتی­بادی CD4 کنژوگه به‫عنوان Ab اولیه(Primary Ab) به اسلایدهای درون هر جار اضافه می­‫شود. سپس لام‫ها آب‫گیری و در الکل 95 و 100 درصد قرارگرفته و با گزیلن تمیز و لامل بر روی لام چسبانده می­شود. جهت بررسی ارتشاح التهابی، تعداد CD4 های ارتشاح یافته رنگ­آمیزی شده با آنتی­بادی CD4 در نخاع، در سه مقطع برای هر نمونه شمرده و میانگین هر یک محاسبه شد. تصاویر با میکروسکوپ Olympus BX51 و دوربین Olympus DP70 و نرم‫افزار Olysia Bioreport software version 3.2 مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت.

 

آنالیز آماری

بررسی­های آماری در محیط نرم افزاری SPSS ویراست 21 انجام شد، برای ترسیم نمودارها از نرم افزار Microsoft Excel نسخه 2010 استفاده شد. داده‫ها به‫صورت Mean±SEM  گزارش شد. جهت مقایسه میانگین شدت بیماری از روش غیرپارامتریک Mann Whitney-U و جهت مقایسه میانگین وزن، میزان تکثیر لنفوسیت‫ها، سطح سایتوکاین‫ها و تعداد سلول‫های لکوسیتی ارتشاح یافته در بافت نخاع از آزمون آنالیز واریانس یک‫طرفه و Tukey’s test استفاده شد. در تمام بررسی ها p<0.05  به‫عنوان سطح معنی‫دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

بررسی تغییرات میانگین وزن در بین گروه­های تحت مطالعه نشان داد که میانگین وزن گروه EAE  پس از ایمونیزاسیون نسبت به گروه‫های دریافت کننده آستاگزانتین کاهش چشمگیری داشته است. در گروه درمانی دریافت کننده آستاگزانتین پس از ایمونیزاسیون اندکی کاهش وزن مشاهده می­شود ولی پس از مدت کوتاهی افزایش وزن در موش­های گروه دریافت کننده آستاگزانتین مشاهده می­شود. این افزایش وزن در تمامی گرو­های دریافت کننده آستاگزانتین (هم پیشگیری و هم درمانی) مانند گروه سالم طبیعی نسبت به تغییرات میانگین وزن بدن در موش­های گروه EAE بدون درمان اختلاف معنی­داری در سطح 0001/0>p را نشان می­دهد (نمودار 1).

 

 

نمودار 1: تغییرات میانگین وزنی بدن: میانگین وزن بدن در گروه کنترل طبیعی و گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) آفزایش معنی­داری نسبت به گروه بیمار EAE نشان می­دهند (***P<0.0001, n=8)

 

 

نتایج میانگین شدت بیماری نشان می­دهد شدت علائم بالینی در طول مدت مطالعه در گروه­های دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه بیمار EAE کاهش معنی­داری داشته است (0001/0(p< میانگین شدت بیماری در گروه پیشگیری که سه هفته قبل از ایمونیزاسیون آستاگزانتین مصرف کرده بودند نسبت به گروه­ درمانی در سطح 001/0>p کاهش یافته بود (نمودار2).

 

 

 

نمودار2: تغییرات میانگین شدت علائم بیماری پس از القا EAE: میانگین شدت بیماری در تمامی گروه­های تجربی (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه موش­های بیمار (EAE) کاهش معنی­داری یافته است (***p<0.0001) . همچنین میانگین شدت علائم بیماری در گروه درمانی در مقایسه با گروه پیشگیری افزایش معنی­داری یافته است(††p<0.001) ( * ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه EAE و † نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه پیشگیری )

 

 میزان بروز و شیوع بیماری در گروه بیمار بدون درمان EAE و گروه درمانی از روز یازدهم پس از ایمونیزاسیون شروع شد. در گروه پیشگیری که از 3 هفته قبل از ایمونیزاسیون آستاگزانتین دریافت کرده بودند اولین علائم بالینی خفیف و از روز 32 ام پس از القای بیماری قابل مشاهده بود.

نتایج تست MTT حاکی از کاهش معنی­دار تکثیر لنفوسیتی در گروه­های پیشگیری و درمانی موش­های دریافت کننده آستاگزانتین در مقایسه با گروه EAE بدون درمان، در پی تحریک مجدد لنفوسیت­های طحال با پپتید MOG در محیط کشت می­باشد. این اختلاف معنی­دار در تمامی گروه­های تجربی پیشگیری و درمانی نسبت به گروه EAE در سطح 0001/0> p مشاهده شد. همچنین کاهش معنی­دار تکثیر لنفوسیتی در گروه پیشگیری در مقایسه با گروه درمانی در سطح 0001/0>p دیده شد. مقادیر تکثیر لنفوسیت­ها بوسیله شاخص تحریکی ارائه شده است (نمودار 3).

 

 

نمودار3: بررسی میزان تکثیر لنفوسیت­ها با روش ‪MTT 35 روز پس از القا EAE: میزان تکثیر لنفوسیت­ها که به‫وسیله Proliferation index ارائه می­شود در تمامی گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه موش­های بیمار (EAE) کاهش معنی‫داری در سطح p<0.0001 نشان دادند، همچنین این شاخص در گروه­ درمانی نسبت به گروه پیشگیری  افزایش معنی­داری ارائه داد (†††p<0.0001) ( * ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه EAE و † نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه پیشگیری ).

 

 

سطوح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروه­های پیشگیری و تحت درمان که آستاگزانتین دریافت کرده بودند در قیاس با سطح سرمی IL-1β در گروه EAE کاهش معنی­داری یافته است (0001/0>(p. سطح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروه­ درمانی در قیاس با گروه کنترل سالم افزایش

 

 

معنی­داری یافته )05/0(p<، همچنین سطح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروه درمانی نیز نسبت به گروه پیشگیری در سطح 001/0>p افزایش یافته است. و سطح سرمی IL-1β در گروه EAE نیز نسبت به گروه کنترل سالم افزایش معنی­داری را نشان می­دهد )0001/0(p< (نمودار4) .

 

 

نمودار 4: بررسی مقایسه­ای سطح سرمی سایتوکاین پیش التهابی IL-1β:در موش­های C57BL/6، 35 روز پس از القا EAE: سطح IL-1β در تمامی گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) در مقایسه با سطح IL-1β در گروه EAE کاهش معنی­داری را در سطح p<0.0001 ارائه می­دهد. سطح IL-1β در گروه­ درمانی نیز نسبت به گروه پیشگیری افزایش معنی­داری یافته است (††p<0.001) همچنین سطح سرمی سایتوکاین پیش التهابی IL-1β در گروه بیمار EAE و گروه درمانی نسبت به گروه کنترل طبیعی افزایش معنی­داری در سطح p<0.05, ###P<0.0001 # نشان می­دهد ( * ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه EAE و # نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه کنترل طبیعی، † نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه پیشگیری ، n=8).

 

سطوح سرمی سایتوکاین IL-6 در گروه­های پیشگیری و درمانی دریافت کننده آستاگزانتین کاهش معنی­داری نسبت به گروه EAE نشان می­دهد )0001/0(p<. درصورتی­که سطح سایتوکاین IL-6 گروه EAE در مقایسه با گروه کنترل سالم و همچنین سطوح IL-6 در گروه­ درمانی نسبت به گروه موش­های کنترل سالم افزایش معنی­داری یافته است )001/0 (p< و سطح سرمی IL-6 در گروه EAE نیز نسبت به گروه کنترل سالم افزایش معنی­داری را نشان می­دهد )0001/0 (p<. از سوی دیگر سطح سرمی IL-6 در گروه پیشگیری در مقایسه با گروه درمانی نیز اختلاف معنی­داری در سطح 001/0 p< ارائه می­دهد (نمودار 5).

 

 

 

نمودار 5:  بررسی مقایسه­ای سطح سرمی اینترلوکین پیش التهابی IL-6:در موش­های C57BL/6، 35 روز پس از القا EAE:  سطح اینترلوکین IL-6 در موش­های گروه پیشگیری و درمانی نسبت به گروه بیمار EAE کاهش معنی­دار یافته است (0.0001 (***p< سطح IL-6 در گروه­ درمانی نیز نسبت به گروه پیشگیری افزایش معنی­داری یافته است (††p<0.001) . سطح سایتوکاین IL-6 در گروه بیمار EAE و گروه درمانی نسبت به گروه موش­های سالم افزایش معنی­داری یافته اند (0.0001 (##P<0.001, ###p< ( * ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه بیمار EAE و # نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه کنترل سالم طبیعی، † نشان دهنده اختلاف معنی­دار با گروه پیشگیری، n=8).

 

میزان ارتشاح CD4 در مقاطع نخاع گروه پیشگیری در قیاس با گروه بیمار EAE کاهش چشمگیری یافته است (شکل1) (p<0.0001).

 

  

 

گروه­ها

مقاطع نخاع

بیمار (EAE)

                                                                          

پیشگیری

                   

درمانی

                                  

شکل 1: مطالعات ایمونوهیستوشیمی اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین بر بافت نخاعی موش ماده C57BL/6 مدل EAE: تصاویر بالا رنگ‫آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی بافت نخاع با آنتی­بادی CD4 بر علیه مولکول­های سطحی سلول CD4 را ارائه می­دهد. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی نشان داد که زیرمجموعه های لنفوسیتی به‫داخل نخاع موش القا شده EAE  نفوذ کرده اند ولی. مصرف آستاگزانتین در گروه‫های تجربی باعث کاهش دانسیته CD4 در نخاع موش­های گروه پیشگیری و درمانی (به‫خصوص موش­های گروه پیشگیری) در مقایسه با موش‫های بیمار EAE شده است. پیکان­ها سلول­های احتمالی CD4 رنگ آمیزی شده با آنتی­بادی CD4 را نشان می­دهند اطراف این سلول‫ها هاله قهوه­ای رنگ مشاهده می­شود (بزرگنمایی ×100)

 

 نفوذ CD4 در مقاطع بافت نخاعی گروه درمانی نیز در سطح p<0.05 نسبت به گروه EAE کاهش یافته و بین دو گروه پیشگیری و درمانی نیز اختلاف معنی­داری مشاهده می­شود به‫طوری­که اختلاف در مقادیر ارتشاح

CD4+ در مقاطع بافت نخاع گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی در سطح p<0.05 مشاهده می­شود (نمودار6).

 

 

نمودار 6.  تعداد CD4+ ارتشاح یافته در بافت نخاع موش­های گروه بیمار (EAE) و گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین: در تمامی گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین(پیشگیری و درمان) ارتشاح CD4+  کاهش چشمگیری نسبت به گروه EAE نشان می­دهند (*p<0.05,***p<0.0001)  و تعداد CD4+ در بافت نخاعی موش‫های گروه پیشگیری نیز نسبت به گروه درمانی کاهش معنی­داری در سطح P<0.05 ارائه داد ( * ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه EAE و † ارائه دهنده اختلاف معنی­دار با گروه پیشگیری ، n=8).


بحث

تاکنون مطالعات بالینی درک توسعه یافته­ای از پاتوفیزیولوژی MS ارائه داده است. پاسخ­ها و واکنش‫های التهابی متفاوتی در پاتوژنز این بیماری گزارش شده است، واکنش آنتی بادی­ها، دمیلینه شدن آکسون­ها و اثرات سلول­های CD4+ در خود ایمنی سیستم عصبی مرکزی مشاهده شده­اند. با استفاده از مدل­های تجربی ثابت شد سلول­های CD4+ موجب آسیب در سیستم عصبی مرکزی می‫شود و نقش سایتوکاین­های التهابی قابل مشاهده می­باشد (15).

در مطالعه پیش رو آستاگزانتین به‫عنوان یک آنتی‫اکسیدانت قدرتمند در نظر گرفته شده است که از گسترش بیماری EAE به‫عنوان مدل مورد مطالعه MS جلوگیری کرده است. طبق گزارشات ثبت شده کاروتنوئید آستاگزانتین دارای فعالیت آنتی­اکسیدانتی بسیار قوی می‫باشد (16) و بر روی سلامتی انسان تاثیر به‫سزایی داشته و از اهمیت ویژه‫ای برخوردار است، چرا‫که بر خلاف دیگر آنتی­اکسیدانت­ها، آستاگزانتین مواد اکسیدانتی مضر برای بدن تولید نمی­کند (5). با مطالعه ساختار آستاگزانتین می­توان فعالیت آنتی­اکسیدانتی، ضدالتهابی و مدولاتوری سیستم ایمنی این مولکول را توجیه کرد. آستاگزانتین می­تواند از سد خونی-مغزی عبور کرده و سبب استحکام غشا سلولی شود (17). مولکول آستاگزانتین دارای گروه کتونی و هیدروکسیلی بوده که در دو انتهای مولکول آستاگزانتین قرار دارد و به زنجیره پلی­ان (پیوند دوگانه) در مرکز مولکول مزدوج شده است. گروه­های هیدروکسیلی در بخش لیپیدی غشا دو لایه­ای نفوذ کرده و در ناحیه مجاور به بخش لیپیدی در فاز مایع قرار می‫گیرند، در نتیجه منجر به کاهش سیالیت غشا شده و یکپارچگی و تمامیت غشا و متعاقب آن، ساختار و عملکرد غشا حفظ می­‫شود. حضور آستاگزانتین و نفوذ آن در BBB به‫خصوص پیش از القا بیماری EAE، این استحکام و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا را تشدید نموده، در نتیجه نفوذ سلول­های ایمنی به داخل CNS کاهش می‫یابد (18و5).

در این مطالعه ما اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین را بر روی علائم نورولوژیکی و شدت بیماری و نقش حفاظتی آن در سطح مولکولی و ایمونوهیستوشیمی را بررسی شد. گروه‫های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) نسبت به گروه بیمار کاهش وزن اندکی را بعد از القا بیماری ارائه دادند. همچنین شدت بیماری در هر دو گروه تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) نسبت به گروه EAE کاهش معنی‫داری یافته بود. از طرفی مصرف آستاگزانتین در گروه‫های تجربی (پیشگیری و درمانی) سبب کاهش سطوح سایتوکاین­های پیش­التهابی اینترلوکین یک بتا (IL-1β) و اینترلوکین 6 (IL-6) در سرم خون موش­های القا شده EAE شده است. شدت بیماری و سطوح سایتوکاین­های پیش­التهابی IL-1β و IL-6 در سرم خون موش‫های گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی کاهش معنی­داری یافته بود. میزان تکثیر لنفوسیت­ها که به‫وسیله Proliferation index ارائه می‫شود نیز در گروه‫های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) در قیاس با گروه بیمار EAE کاهش یافته بود و مقادیر تکثیر لنفوسیت­ها در گروه پیشگیری نیز اختلاف معنی‫داری نسبت به گروه درمانی نشان داد. مطالعات ایمونوهیستوشیمی بافت نخاع نیز کاهش نفوذ سلول­های ایمنی و ارتشاح لنفوسیت TCD4 را در هر دو گروه  تجربی پیشگیری و درمانی نسبت به گروه EAE به نمایش گذاشت و این کاهش نفوذ CD4+ در بافت نخاعی گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی چشمگیر بوده است، در صورتی­که توقع می­رفت در طی روند التهـاب، نفوذپذیری سد خونی-مغزی افزایـش یافتـه باشد.

در واکنش‫های التهابی سطح سایتوکاین­های التهابی در سرم خون افزایش می­یابد مطالعات پیشین نقش IL-1β و IL-6 را در تشدید علائم و بروز ضایعات در بیماری MS به اثبات رسانیده‫اند (20و19). طی تحقیقاتی که بر روی موش مدل MS انجام شد، به نقش موثر IL-6 اشاره شد، به‫طوری‫که آنتی­بادی­های مخصوص IL-6 در کاهش اثرات EAE در موش موثر بوده و انتقال سیگنال از طریق باند شدن با گیرنده IL6 در غشا سلول امکان‫پذیر می‫باشد (19)‫.

نقش IL-1β به‫عنوان سایتوکاین پیش­التهابی که توسط مونوسیت و ماکروفاژ­ها و سلول­های B و T و در CNS در طول القا EAE، تنظیـم می­شـود ثابت شـده اسـت و همچنین سـبـب آپـوپتوزیـس سـلول­های عصبی می‫شـود (21). آستاگزانتین همچنین به‫وسیله اثر تنظیم کنندگی و کاهندگی بر سایتوکاین­های التهابی سبب حفظ یکپارچگی و تمامیت سد خونی مغزی می­شود و مانع نفوذ سلول­های ایمنی به CNS می­‫شود. از طرفی سایتوکاین­ها به مانند سایر پروتئین­های سیگنالی، نقش مهمی در تنظیم پاسخ ایمنی در مدل EAE بر عهده دارند (22). مشخص شده است سایتوکاین­های Th1 در پیشرفت بیماری نقش داشته است (23). نتایج مطالعه­ای در شرایط in vitro نشان می­دهد که آستاگزانتین پاسخ سلول­های ایمنی لنفوسیتی و تولید سایتوکاین­های Th1 را تنظیم و تعدیل می­کند (24).

گزارش‫های دیگری حاکی از افزایش تولید IL-6 در مرحله پیشرفت و گسترش بیماری MS بوده است (25) که به‫وسیله اثر تخریبی بر BBB ، باعث دمیلینه شدن و التهاب عصبی می­‫شود (26) .مطالعات Ying و همکاران (10) نشان می­دهد که آستاگزانتین به‫سهولت از سد خونی مغزی عبور کرده و این امر سبب می­شود این کاروتنوئید بتواند سیستم اعصاب مرکزی را در برابر آسیب­های مزمن و حاد تخریب نورونی محافظت کند. به‫نظر می­رسد فعالیت­های آنتی­اکسیدانتی و ضدالتهابی و سایر اثرات بیولوژیک بالقوه آستاگزانتین در محافظت نورونی نقش داشته باشند. در واکنش به آسیب­های وارد بر سیستم عصبی، سطح برخی از سایتوکاین­های التهابی در خون افزایش می­یابد و چندین واکنش دفاعی مانند فعال شدن محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال رخ می­دهد. Balietti و همکاران (27) اثر آستاگزانتین را در روند پیری وابسته به جنسیت بررسی کردند و گزارش کردند پس از مصرف آستاگزانتین، سایتوکاین­های ضد التهابی باعث توقف عملکرد عوامل التهابی می‫شود. این عوامل نقش مهمی در بروز پاسخ­های التهابی و ایمنی دارد به‫طوری‫که در موش‫های دریافت کننده آستاگزانتین میزان IL-1β در هر دو ناحیه مغزی و مخچه­ای کاهش معنی­داری یافته است.

گزارش‫های فوق­الذکر با یافته­های به‫دست آمده از این مطالعه مطابقت داشته بطوریکه سطوح سایتوکاین­های التهابی IL-1β و IL-6 در گروه EAE افزایش یافته و در گروه‫های دریافت کننده آستاگزانتین میزان سطح این سایتوکاین­های التهابی کاهش یافت. مشاهدات Zhou و همکاران (28)، تاثیر آستاگزانتین بر افسردگی ناشی از دیابت را در موش‫های مدل دیابت ارائه و گزارش کردند آستاگزانتین بیان IL-1β و IL-6 در هیپوکامپ را کاهش داده است. مکانیسم عمل آستاگزانتین بر روی مهار التهاب بوده و از این طریق می­توانند نورون‫های هیپوکامپ و آمیگدال و هیپوتالاموس را در برابر آسیب هایپرگلایسمیک محافظت نماید.

 در مطالعات ایمونوهیستوشیمی تحقیق پیش‫رو در گروه‫های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین میزان ارتشاح سلول‫های التهابی CD4+ به بافت نخاعی نسبت به گروه بیمار کاهش چشمگیری یافت. این امر به‫خصوص در گروه پیشگیری نمود واضحی داشت.

یکی از مکانیسم‫های پیشنهادی جهت تاثیر آستاگزانتین بر روی رشد و تمایز سلول­های عصبی و نوروژنز اشاره بر تنظیم سیگنال ERK می­باشد. سیگنال ERK بر MAPKs (Mitogen-activated protein kinase) (پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن) تاثیر گذاشته و از آن‫جا‫که MAPKs در واکنش­های سلولی نسبت به سایتوکاین­های التهابی مداخله کرده در نهـایت منجـر به تنـظیم عملکـرد سـلولی، بیان ژن، تکـثیر ، تمایز و بقـا سـلولی و آپوپتـوزیـس می­‫شود (29). آستاگزانتین همچنین با سرکوب گونه­های اکسیژن فعال (ROS)، القا کننده بیان هسته­ای NF-κB، سبب کاهش تولید سایتوکاین­های التهابی می­شود (30). مکانیسم مهم دیگر، نفوذ آستاگزانتین در سد خونی-مغزی و ایجاد استحکام و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا می­باشد در نتیجه منجر به کاهش نفوذ سلول­های ایمنی به‫داخل سیستم اعصاب مرکزی می­شود (18و5).

آستاگزانتین به سهولت از سد خونی-مغزی عبور کرده و سیستم اعصاب مرکزی را در برابر آسیب­های مزمن و حاد تخریب سلول‫های عصبی محافظت می­کند. همه این مکانیسم‫ها و فعالیت­های آنتی‫اکسیدانتی و ضدالتهابی آستاگزانتین در محافظت نورونی نقش به‫سزایی خواهد داشت (10).

در مطالعه کنونی نیز کاهش سطح IL-1β، IL-6 در گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (گروه­های پیشگیری و درمانی) در مقایسه با گروه موش­های EAE بدون درمان منعکس کننده اثرات آستاگزانتین بر حفظ یکپارچگی سد خونی-مغزی است که مانع پیشرفت التهاب و کاهش آن می­‫شود. تکثیر سلول­های لنفوسیتی که به‫وسیله شاخص تحریکی ارائه شده است در تمامی گروه­های تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (گروه­های پیشگیری و درمانی) در قیاس با گروه موش­های EAE بدون درمان کاهش یافته است.

اگرچه تاکنون مکانیسم عملکرد گیرنده‫های مداخله کننده در این زمینه به اثبات نرسیده است اما نقش تحریک سلول­های ایمنی لنفوسیتی در این زمینه کاملا مبرهن و واضح می­باشد. در واقع توانایی آستاگزانتین در تنظیم کاهشی، تکثیر لنفوسیت­های T تحریک شده با

در مطالعه مشابه دیگری ارزیابی و مقایسه سایتوکاین­های التهابی و ضدالتهابی به‫دست آمده از کشت سلول‫های طحال موش­های مدل MS پیش درمان شده با آستاگزانتین نشان داد که روند التهاب کاهش یافته است(31).

با توجه به مطالب فوق می­توان اثرات کاهش شدت التهاب ناشی از تجویز آستاگزانتین را در موش­های مدلEAE، در گروه­های پیشگیری و درمانی، به نحوه عملکرد آستاگزانتین به‫منظور حفظ تمامیت و یکپارچگی غشا در سد خونی مغزی سیستم عصبی مرکزی و اثرات آنتی‫اکسیدانتی و ضدالتهابی آن نسبت داد. تاثیر آستاگزانتین در ایجاد کاهش سیالیت غشا و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا و حفظ ساختار و عملکرد صحیح غشا و حضور آستاگزانتین و نفوذ آن در سد خونی-مغزی به‫خصوص پیش از القا بیماری EAE، سبب شده است علائم و شدت بیماری در گروه پیشگیری تخفیف یافته، در نتیجه نفوذ سلول­های التهابی به‫داخل سیستم اعصاب مرکزی در این گروه نسبت به گروه درمانی کاهش یافته و اثرات بهبود دهندگی به‫وضوح مشاهده می­شود.

با توجه به داده­های به‫دست آمده و مدارک می­توان امیدوار بود آستاگزانتین به‫عنوان یک مکمل خوراکی نقش موثری در پیشگیری، التیام و کاهش التهاب و تخریب نورونی ناشی از ابتلا به بیماری مالتیپل اسکلروزیس  داشته باشد.

 

نتیجه گیری

آستاگزانتین به‫عنوان یک فاکتور آنتی­اکسیدانتی، ضدالتهابی قوی، بدون اثر سمی و به‫عنوان یک ترکیب محلول در چربی قادر است به‫طور موثر از سد خونی مغزی عبور کند. سایتوکاین­ها مانند بعضی پروتئین­های

 

پروتئین MOG35-55 که یک فاکتور مهم در پاتوژنز بیماری است را کاهش می­دهد (24).

 

سیگنالی، نقش مهمی در تنظیم و تعدیل پاسخ ایمنی در مدل MS (EAE) بر عهده دارند.

آستاگزانتین با تاثیر تنظیم کنندگی و کاهندگی بر سطوح سایتوکاین­های التهابی سبب حفظ یکپارچگی و تمامیت سد خونی مغزی شده و مانع نفوذ سلول­های ایمنی به سیستم اعصاب مرکزی می­‫شود علیرغم مشاهده کاهش سطح سایتوکاین‫های التهابی و کاهش ارتشاح CD4+ در بافت نخاع موشهای دریافت کننده آستاگزانتین به‫خصوص در گروه پیشگیری، مصرف مکملی یا دارویی آستاگزانتین جهت پیشگیری و درمان بیماری MS و کاهش اثرات التهابی و تخریبی بر سیستم اعصاب مرکزی مطالعه کلینیکی بیشتری را می­طلبد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله بدین وسیله از جناب آقای دکتر توانگر پاتوبیولوژیست و عضو هیات علمی علوم پزشکی تهران که در مطالعات بخش هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوپاتولوژی صمیمانه راهنمایی و همراهی فرمودند و همچنین از بخش بیومدیکال دانشگاه الزهرا و مجتمع زکریای رازی دانشگاه علوم تحقیقات تهران قدردانی و سپاسگزاری می‫نمایند.

1. Lennart TM. Philippe Saikali; Roland S. Liblau, Nathalie Arbour Contribution of CD8+ Lymphocytes to the immune-pathogenesis of multiple sclerosis and its animal models. 2011; 1812: 151-161.

2. Garson JA, Huggett JF, Bustin SA, Pfaffl MW, Benes V, Vandesompele J, Shipley GL. Unreliable real-time PCR analysis of human endogenous retrovirus-W (HERV-W) RNA expression and DNA copy number in multiple sclerosis. AIDS Res Hum Retroviruses. 2009; 25: 377-378.

3. Raphael I, Nalawade S, Eagar TN, Forsthuber TG. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine, 2015; 74(1): 5-17.

4. Yadav SK, Mindur JE, Ito K, Dhib-Jalbut S. Advances in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Curr Opin Neurol. 2015; 28(3): 206-19.

5. Ranga Rao A, Phang SM, Ravi S, Aswathanarayana RG. Astaxanthin: Sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications–A review. Mar. Drugs. 2014; 12(1): 128–152.

6. Kistler A. Metabolism and CYP-inducer properties of astaxanthin in man and primary human hepatocytes, Arch. Toxicol. 2002; 75(11-12): 665-675.

7. Bennedsen M, Wang X, Willen R, Wadstrom T, Andersen LP. Treatment of H. pylori infected mice with antioxidant astaxanthin reduces gastric inflammation, bacterial load and modulates cytokine release by splenocytes. Immunol. Lett. 1999; 70(3): 185–189.

8. Tso MOM, Lam TT. Method of Retarding and Ameliorating Central Nervous System and Eye Damage. U.S. Patent. 1996; 5: 527-533.

9. Boussiba S, Bing W, Yuan J-P, Zarka A, et al. Changes in pigments profile in the green alga Haeamtococcus pluvialis exposed to environmental stresses. Biotechnol Lett. 1999; 21(7): 601-4.

10. Ying Cj, Zhang F, Zhou Xy, Hu Xt, et al. Anti-inflammatory Effect of Astaxanthin on the Sickness Behavior Induced by Diabetes Mellitus. Cell Mol Neurobiol. 2015; 35(7).

11. Balietti M, Giannubilo SR, Giorgetti B, Solazzi M, Turi A, et al. The effect of astaxanthin on the aging rat brain: gender‐related differences in modulating inflammation. J Sci Food Agric. 2016; 96(2): 615-8.

 

12. Mosayebi G, Moazzeni S M, Sanati M H.Effect of sex on susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis induced with MOG35-55 peptide in C57BL/6 Mice. Medical Journal of Tabriz Univ of Med Sci 2006; 27(4): 95-100[Persian].

13. Chew BP, Park JS. Carotenoid action on the immune response. J. Nutr. 2004; 134: 257S–261S.

14. Yuri T, Yoshizawa K, Emoto Y, Kinoshita Y, et al. Effects of Dietary Xanthophylls, Canthaxanthin and Astaxanthin on N-Methyl-N-nitrosourea-induced Rat Mammary Carcinogenesis. In Vivo. 2016; 11-12; 30(6): 795-800.

15. Stromnes IM, Goverman JM. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 2006; 1(4): 1952-60.

16. Guerin M, Mark E. Huntley and Miguel Olaizola, Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol. 2003; 21(5): 210-216

17. Sarada R, Vidhyavathi R, Usha  D, Ravishankar  GA. An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis. J. Agric. Food Chem. 2006; 54(20): 7585-7588.

18. Barros MP, Pinto E, Colepicolo P, Pedersen M. Astaxanthin and peridinin inhibit oxidative damage in Fe2+-loaded liposomes: scavenging oxyradicals or changing membrane permeability? Biochem Biophy Res Comm. 2001; 288(1): 225-32.

19. Gold R, Linington C, Lassmann H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain. 2006; 129(Pt 8): 1953-71.

20. Narender N, Musfiquidin K, Manjeet K. Paintlia, Md Nasrul Hoda, and Shailendra Giri. Metformin Attenuated the Autoimmune Disease of the Central Nervous System in Animal Models of Multiple Sclerosis. The Journal of Immunology. 2009; 182(12): 8005–8014.

21. Stoll G, Jander S, Schroeter M. Cytokines in CNS disorders: neurotoxicity versus neuroprotection J Neural Transm Suppl. 2000; 59: 81-9.

22. Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, et al. Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Na­ture. 1986; 324(6092):73–6.

23. Miller SD, Karpus WJ. The immunopathogenesis and regulation of Tcell-mediated demyelinating diseases. Immunology Today. 1994; 15(8): 356-361.

24. Kuan-Hung L, Kao-Chang L, Wan-Jung L, Philip-Aloysius T, et al. Astaxanthin, a Carotenoid, Stimulates Immune Responses by Enhancing IFN- and IL-2 Secretion in Primary Cultured Lymphocytes in Vitro and ex Vivo. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(1): 44;1-10.

25. Graber JJ, Dhib-Jalbut S. Protective autoimmunity in the nervous system. Pharmacol Ther. 2009; 121(2): 147-59.

26. Jadidi-Niaragh F, Mirshafiey A. Th17 cell, the new player of neuroinflammatory process in multiple sclerosis. Scand J Immunol. 2011; 74(1): 1-13.

27. Balietti M, Giannubilo SR, Giorgetti B, Solazzi M, et al. The effect of astaxanthin on the aging rat brain: gender‐related differences in modulating inflammation. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2016; 96(2): 615-618.

28. Zhou Xy, Zhang F, Hu Xt, Chen J, et al. Depression can be prevented by Astaxanthin through inhibition of hippocampal inflammation in diabetic mice. Brain Res. 2017; 1657: 262-8.

29. Kim YH, Koh HK, Kim DS. Down-regulation of IL-6 production by astaxanthin via ERK-, MSK-, and NFkappaB- mediated signals in activated microglia. Int Immunopharmacol. 2010b; 10(12): 1560–1572.

30. Speranza L, Pesce M, Patruno A, Franceschelli S, et al. Astaxanthin treatment reduced oxidative induced pro-inflammatory cytokines secretion in U937: SHP-1 as a novel biological target. Mar. Drugs. 2012; 10(4): 890–899.

31. Bidaran S, Ahmadi AR, Yaghmaei P, Sanati MH, et al. Astaxanthin effectiveness in preventing multiple sclerosis in animal model,Bratisl Med J. 2018; 119 (3);160 – 166