مقایسه تاثیر Substance P هموسیستئینه و طبیعی بر رشد سلول‌های PC12 در حضور سیستئین

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشکده علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران

چکیده

هدف: در این مطالعه تاثیر  Substance Pهموسیستئینه در حضور سیستئین بر میزان رشد سلول­های سرطانی PC12 بررسی و نتایج با نوع طبیعی آن مقایسه شد.
مواد و روش­ها: سلول­ها در محیط کشت RPMI-Glutamax حاوی FBS، 10 درصد کشت داده شدند و فعالیت متابولیکی آن­ها در حضور غلظت­های مختلف پپتید و سیستئین با استفاده از تست MTT ارزیابی شد. سپس تغییرات ریخت شناسی سلول­ها با استفاده از میکروسکوپ تمایز فازی مطالعه شد. به‫منظور بررسی تاثیر حفاظتی پپتید هموسیستئینه در برابر H2O2، سلول­ها به‫مدت 3 ساعت در حضور  H2O2 با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‫لیتر تیمار شد و میزان تولید نیتریک اکسید آن‫ها به‫روش رنگ سنجی گریس مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: نتایج نشان می­دهد که هر دو نوع Substance p، در همه غلظت­های انتخابی موجب افزایش رشد سلول­ها و کاهش میزان NO در برابر سمیت  H2O2شده است. به‫ویژه در غلظت 6 تا 10 مولار میزان رشد در حضور پپتید هموسیستئینه و طبیعی به‫ترتیب  65/78 درصد و 55/38 درصد افزایش داشته است که نشان می‫دهد نوع هموسیستئینه 1/40 درصد بیشتر از نوع طبیعی منجر به افزایش رشد شده است و میزان NO به‫ترتیب 36  درصد و 14 درصد کاهش داشته است. بنابراین Substance P هموسیستئینه توانسته 22 درصد بیشتر از نوع طبیعی سلول­های سرطانی  PC12 را در برابر سمیت پراکسید هیدروژن محافظت کند.
نتیجهگیری:SP-H  در شرایط پاتولوژیک می­تواند از طریق کاهش تولید نیتریک اکسید باعث افزایش رشد سلول­های سرطانی شده و روند پیشرفت بیماری را تسریع بخشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


در حال حاضر سرطان پس از بیماری­های قلبی-عروقی دومین عامل مرگ و میر در کشورهای پیشرفته می‫باشد (1, 2). عوامل مختلفی در افزایش رشد سلول­های سرطانی دخیل هستند که شناسایی آن‫ها می­تواند در جهت کنترل و ممانعت از پیشرفت بیماری موثر بوده و محققین را در راستای کشف اقدامات پیشگیرانه یاری دهد. پپتید Substance P(SP) به فرمول C63H98N18O13S یکی از اعضای خانواده‌ی نوروپپتیدهای Tachykinin است که متشکل از 11 باقی­مانده‌ی اسیدآمینه‌ای (RPKPQQFFGLM) Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met-NH2 می‌باشد.  SP عملکردهای فیزیولوژیکی متعددی در بدن داشته و در کنترل سیستم قلبی عروقی، انقباضات روده­ای و کاهش فشار خون نقش دارد و همچنین با احساس درد و پاسخ‌‌های عصبی در ارتباط است. این پپتید توان و اختصاصیت بالایی دارد به گونه‌ای که حتی با غلظت­های نانومولار به‫خوبی در سطح سلول­های حاوی NK1 (Neurokinin1) (گیرنده‫ی اختصاصی (SP جذب می­شود (3-5). NK1‫، بین غشایی بوده و دارای 407 آمینواسید، با وزن مولکولی 58 کیلودالتون می­باشد که 7 دمین بین غشایی هیدروفوب به‫همراه 3 لوپ خارج سلولی و 3 لوپ داخل سلولی را تشکیل می­دهند. لوپ­ها جایگاه­های عملکردی برای واکنش با G-پروتئین­ها دارند (3). فعال شدن NK1 توسط Substance P منجر به هیدرولیز فسفواینوزیتید هیدرولاز، تجمع کلسیم و فعال‫سازی MAPK (Phosphoinositide Hydrolysis) (6و7) شده و می­تواند باعث تکثیر سلول‫های توموری، رگزایی (Angiogenesis)،  مهاجرت و متاستاز ­شود. بنابراین مسیر انتقال پیامSP / NK1، نقش مهمی در پیشرفت سرطان ایفا ­می­کند به گونه­ای که تاکنون نقش SP به‫عنوان میتوژن از طریق گیرنده NK-1 در چندین نوع از سرطان‫های انسانی شامل آستروسیتوم، ملانوم، نوروبلاستوما، گلیوم، رتینوبلاستوما و همچنین پانکراس، حنجره، روده بزرگ، کارسینوم معده، لوسمی و سرطان سینه به اثبات رسیده است.  همچنین تحقیقات نشان داده­اند در سرطان سینه انتقال پیامSP / NK1 موجب فعال‫سازی گیرنده­های RTK (Receptor Tyrosine Kinases) مثل EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) شده و مقاومت دارویی را افزایش می­دهد. به‫علاوه میزان بیان این پپتید و گیرنده­اش NK1))، در سلول­های توموری نسبت به نمونه­های سالم آن‫ها و نیز برخی دیگر از بیماری­ها مثل افسردگی افزایش پیدا می‫کند. بنابراین امروزه طراحی آنتاگونیست مناسب که مانع از اتصال Substance Pبه NK1  شود در درمان سرطان بسیار مورد توجه قرار گرفته است (8-12). اما با این وجود هنوز نقاط مبهم زیادی در این رابطه وجود دارد و بسیاری از مکانیسم­ها ناشناخته هستند.

 هموسیستئین  (Hcy) با فرمول HSCH2CH2CH(NH2) CO2H مشتقی از اسیدآمینه‌ی سیستئین بوده که طی حذف گروه متیل، در یک فرآیند چند مرحله‌ای، از متیونین تولید می‌شود (13). هایپرهموسیستئینمی یا افزایش سطح پلاسمایی هموسیستئین، که در بسیاری از جوامع شیوع دارد، نقص ژنتیکی مرتبط با متابولیسم اسیدآمینه‌ی متیونین است که در برخی بیماری­ها مثل بعضی از سرطان­ها و افسردگی نیز دیده می­شود. یکی از مسیرهایی که عمدتا در اثر افزایش سطح Hcy و در اختلال‌‌ هایپرهموسیستئینمی اتفاق می‌افتد،  متابولیزه شدن Hcy توسط آنزیم متیونین-tRNA-سنتتاز (MetRS) و ایجاد هموسیستئین تیولاکتون  (tHcy)است که یک مشتق تیواستری می‌باشد (14). گروه­های ε-آمینوی زنجیره‌ی جانبی آمینواسید لیزین در ساختار پروتئین‌‌ها، تحت شرایط فیزیولوژیک و در حضورtHcy، و به‫دلیل فعالیت بالای باند تیواستری آن، می‌توانند به‫راحتی و به صورت غیر­­آنزیمی و غیر­اختصاصی با اتصالی آمیدی و ایجاد پیوندی ایزوپپتیدی، طی فرآیندی به نام N-هموسیستئینی شدن، هموسیستئینه شوند (15). در نتیجه با افزایش سطح Substance P و هموسیستئین تیولاکتون در بدن امکان تشکیل substance p(lys-homocysteine)  و بروز طبعات ناشی از آن وجود دارد.

هیپوکسی (Hypoxia ) شرایطی است که در آن سطح اکسیژن بافت کاهش می­یابد و به‫عنوان شرایط پاتوفیزیولوژیک ریزمحیط اطراف تومورهای جامد شناخته می­شود. تحقیقات نشان می­دهند که هیپوکسی یکی از دلایل پیشرفت سرطان است و می­تواند منجر به شکل‫گیری تومورهای بدخیم شود به گونه‫ای که امروزه توجه به این مسئله در درمان سرطان بسیار اهمیت پیدا کرده و اثرات آن در پاسخ به رادیوتراپی و شیمی­درمانی نیز مورد مطالعه قرار گرفته است. مکانیسم مرتبط با این اثرات مربوط به فاکتور القاکننده­ی هیپوکسی (HIF) (Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Family Of Transcription Factors ) است که از خانواده‫ی فاکتورهای رونویسی است و در شرایط هیپوکسی حاد یا مزمن می­تواند منجر به افزایش رونویسی ژن­های هدف شود. این فاکتور یک عامل تنظیم کننده­ی بسیاری از فرآیندهای مهم سلولی مثل آپوپتوزیس، تکثیر سلولی، رگزایی و متابولیسم گلوکز است. بنابراین، هیپوکسی، بی‫ثباتی ژنتیکی، تشکیل سلول­های خونی و متابولیسم بی­هوازی را افزایش می­دهد. فشار خون بالا، افزایش فشار مایع بینابینی (Interstitial Fluid Pressure)، گلوکز پایین و غلظت بالای لاکتات ناشی از غلبه­ی متابولیسم بی­هوازی، باعث کاهش pH خارج سلولی در بافت­های تومور( اسیدوز تومور) می­شود (16و17).

NO درون سلولی، ﺗﻮﺳــﻂ آﻧــﺰﻳﻢ­هایی ﻛــﻪ ﻧﻴﺘﺮﻳــﻚ اﻛﺴﻴﺪ ﺳﻨﺘﺎز (NOS) (Nitric Oxide Synthase) ﻧﺎﻣﻴﺪه ﻣﻲﺷﻮند ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﮔـﺮدد .ﺳـﻪ  ﻓــﺮم اﺻــﻠﻲ از اﻳــﻦ آﻧــﺰﻳﻢ وﺟــﻮد دارد. NOS ﻋﺼــﺒﻲnNOS) )،  NOS  اﻧـــﺪوﺗﻠﻴﺎل(eNOS) و NOS اﻟﻘﺎﻳﻲ (iNOS) که در ﭘﺎﺳﺦ ﺑﻪ ﻣﺤﺮک­ﻫﺎ ﺑﻴﺎن ﻣـﻲ‫شوند. هر سه ایزوفرم در ﺳﻴﺘﻮﭘﻼﺳﻢ وﺟﻮد دارند. ﺑﻪ ﺗﺎزﮔﻲ NOS ﻣﻴﺘﻮﻛﻨــﺪرﻳﺎﻳﻲ (mNOS) نیز ﻛﺸــﻒ ﺷــﺪه ﻛــﻪ ﻣﻨﺤﺼــرا درﻣﻴﺘﻮﻛﻨﺪری وﺟﻮد دارد. ﻫﻤﻪ آﻧﺰﻳﻢﻫﺎی NOS ﺑﻪ‫ﺻﻮرت ﻫﻤﻮداﻳﻤﺮ ﻋﻤﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. آنﻫﺎ ﻧﻴﺘﺮﻳﻚ اﻛﺴﻴﺪ را ﻃـﻲ دو مرحله اکسیداسیون آمینواسید L- آرژﻧﻴﻦ ﺑﻪ L- ﺳﻴﺘﺮوﻟﻴﻦ وNO ، از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺮﻛﻴﺐ واﺳﻂ N-ﻫﻴﺪروﻛﺴﻲ L- آرژﻧﻴﻦ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. عملکرد NO  عمدتا از طریق چرخه­ی وابسته به cGMP (Cyclic Guanosine Monophosphate) است و گزارش شده است که NO نیز در صورتی‫که به‫میزان کم در سلول تولید شود به‫عنوان یک مبدل پیام عمل کرده و بر بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مانند تنظیم جریان خون، هوموستاز آهن و انتقال نورونی تاثیر می­گذارد. اما در سطح بالا باعث تخریب DNA و آپوپتوزیس می­شود (18و19).

 رده­ی سلولی PC12 نوعی سلول سرطانی بوده که از فئوکروموسایتومای موش صحرایی جدا می­شود. این سلول در محیط کشت رشد نموده و می­تواند ویژگی­های سلول‫های عصبی را نشان دهد (20و21)، همچنین دارای گیرنده‫ی اختصاصی Substance P یعنی NK1 در سطح خود می­باشد (22).

در این تحقیق، به‫منظور شبیه سازی ریزمحیط احیا و هیپوکسی اطراف سلول­های سرطانی از سیستئین به‫عنوان یک ماده­ی احیاء کننده در غلظتی که برای سلول­ها سمی نیست(23)، استفاده شده است و تاثیر Substance P هموسیستئینه و طبیعی در حضور سیستئین بر میزان رشد سلول­های سرطانی PC12 بررسی شد. در ادامه تغییرات ریخت شناسی سلول PC12 تحت تاثیر هر دو نوع پپتید و میزان تولید NO در برابر سمیت پراکسید هیدروژن مورد مطالعه قرار گرفت.  H2O2 می­تواند به DNA هسته و DNA میتوکندری هر دو آسیب رسانده، موجب افزایش بیان مولکول­های چسبنده­ی سلولی شده، فعالیت P53 و دیگر فاکتور­های رونویسی که باعث مرگ سلول سرطانی می­شوند را افزایش ­دهد (24و25).

 

مواد و روش‌ها

سلول­های PC12 از انستیتو پاستور تهران تهیه شد. مواد مورد نیاز کشت سلولی (شامل پنی سیلین-استرپتومایسین، سرم جنین گاوی و گلوتامین) از شرکت Gibco، فلاسک­ها و میکروپلیت­ها از شرکت پارس آزمون، سیستئین از شرکت Sigma و مواد مورد نیاز برای واکنش گریس (Griess Reaction) از شرکت Promega خریداری شدند.

سلول­ها در محیط کشت RPMI(Gibco) 1640 حاوی NaHCO3 و HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid ) Mm) 10) به‫همراه سرم جنین گاوی FBS (Fetal Bovine Serum)) 10 درصد (W/V) که سیستم کمپلمان آن با گرما غیرفعال شده، گلوتامکس (Glutamax(dipeptide L-alanyl-L-glutamine))  1 درصد (V/V) و آنتی بیوتیک 1 درصد (V/V) درون فلاسک کشت سلول T-25 (NUNC) در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی­گراد حاوی  CO25 درصد، 95 درصد هوا و رطوبت کافی کشت داده شدند. پس از 48 ساعت محیط کشت قدیمی با محیط کشت تازه تعویض شد. هنگامی که سلول­ها، 70 تا 80 درصد از کف فلاسک را فرا گرفتند، پاساژ سلول­ها با استفاده از محلول Trypsin-EDTA (200 Unit/ml)، انجام گرفت و با پاساژ دادن سلول­ها در فاز لگاریتمی رشد نگهداری شدند (16).

 پپتید­های Substance P  با خلوص(HPLC)  84/96 درصد و وزن مولکولی 63/1347  gr/molو  substance p(lys-homocysteine)  با خلوص (HPLC)  92/95 درصد و وزن مولکولی 82/1463 gr/mol  توسط شرکت ProteoGenix SAS فرانسه تهیه شدند .

فعالیت متابولیکی سلول­های انکوبه شده در حضور غلظت‫های مختلف از پپتید و سیستئین با استفاده از تست MTT (MTT assay) مورد ارزیابی قرار گرفت.

در این روش مقداری از MTT (MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)) زرد رنگ که وارد سلول‫های زنده می­شود، توسط آنزیم دهیدروژناز این سلول­ها احیا  می­شود و رسوب بنفش رنگی ایجاد می­کند که به‫روش اسپکتروسکوپی قابل اندازه‫گیری است. برای تهیه­ی استوک MTT، 5 میلی­گرم از این ترکیب در 1 میلی‫لیتر بافر نمکی فسفات حل شد. به‫هر چاهک از ظروف کشت 96 خانه‫ای 10000 سلول در 200 میکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون سلول­ها به مدت 48 ساعت با غلظت­های مختلف پپتید (از غلظت 4-10  مولار تا 10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان 4-10×5 میکرومولار تیمار شدند. سپس محیط کشت رویی خارج و 5 میکرولیتر از استوکMTT به هر چاهک اضافه شد. پس از چهار ساعت نگه‫داری در انکوباتور 37 درجه به‫دنبال خروج محیط رویی واکنش، با اضافه کردن 100 میکرو لیتر DMSO متوقف شد. این محلول باعث حل شدن بلورهای فرمازان (Formazan) شده و درجات متفاتی از شدت رنگ بنفش تا سفید ایجاد می­کند که این شدت رنگ معیاری از تعداد سلول­های زنده در محیط است. سپس میزان جذب نوری خانه­ها به‫وسیله دستگاه الایزاریدر در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری شد و توان حیاتی سلول­های تیمار شده نسبت به سلول­های شاهد (کنترل) محاسبه شد. نتایج حاصل به‫صورت درصد مقادیر حاصل از کنترل بیان شد.

بررسی مورفولوژیکی سلول­ها: برای این‫منظور تصویر سلول­هایی که به‫مدت 48 ساعت با غلظت‫های مختلف از پپتیدهای SP-H و SP(از غلظت 4-10  مولار تا 10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان  4-10×5 میکرومولار تیمار شده اند، سلول­های شاهد که فاقد پپتید می­باشد و کنترل منفی که حاوی سلول و محیط کشت به‫همراه محلول تریتون (Triton-X100)  X-100 4 درصد است توسط میکروسکوپ تمایز فازی (26) (Zeiss آلمان) با بزرگنمایی200 برابر به‫دست آمد. لازم به‫ذکر است که به‫دلیل زیاد بودن تعداد تصاویر حاصله از بین سلول­هایی که با غلظت­های مختلف پپتیدی تیمار شده بودند، یک مورد (غلظتی که در آن بیشترین تاثیر دیده می­شود)  به‫عنوان نمونه گزارش شد.

سنجش سمیت القا شده با H2O2. سپس به‫منظور بررسی اثر حفاظتی پپتید هموسیستئینه در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از پراکسیدهیدروژن، از H2O2 به‫عنوان عامل القا کننده­ی مرگ سلولی استفاده شد تا میزان رشد سلول­ها درحضور و عدم حضور یک عامل القا کننده­ی مرگ سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور به‫هر چاهک از ظروف کشت 96 خانه ای حدود 7000 سلول در 200 ماکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، سلول­ها به‫مدت 24 ساعت نیز با غلظت­های مختلف از H2O2 تیمار شدند و IC50 (half maximal inhibitory concentration) با استفاده از تست MTT تعیین شد.

 اندازه‫گیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی. دراین آزمایش جهت تعیین میزان نیتریک اکسید تولید شده در سلول­، از محلول گریس (19و27) با حساسیتpmol) 125) mM 5/2 نیترات (در آب دیونیزه یا آب مقطر) (Sensitivity: 2.5mM (125pmol) nitrite (deionized, distilled water) and Catalog Number: G2930) استفاده شد. روش گریس مبتنی بر اندازه­گیری غیر مستقیم نیتریک اکسید است. نیتریک اکسید یک مولکول به‫شدت ناپایدار بوده و نیمه عمر کوتاهی دارد، به این‫دلیل اندازه‫گیری مستقیم آن نسبتا مشکل است اما این ماده سریعا به متابولیت­هایی همچون نیتریت و یا نیترات تبدیل می­شود که پایدار و قابل اندازه‫گیری بوده و سنجش آن‫ها یک تخمین قابل اطمینان از برون ده نیتریک اکساید در محیط in vivo  فراهم می­آورد.

به‫منظور انجام تست ابتدا منحنی استاندارد رسم شد سپس سلول­هایی که قبلا با پپتیدها به‫مدت 24 ساعت تیمار شده بودند به‫منظور القای آپوپتوزیس، در معرض H2O2 با غلظت150 ماکرومولار به‫مدت 3 ساعت قرار گرفتند. سپس 50 میکرولیتر از هر نمونه به‫صورت 3 بار تکرار در هر چاهک از پلیت 96 خانه‫ای ریخته شد و محلول گریس اضافه شد. برای اضافه کردن محلول گریس مراحل زیر انجام شد: ابتدا 50 میکرولیتـر محلول سـولفانیل آمید (Sulfanilamide Solution (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)) روی نمونه­ها ریخته شد و به‫مدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون انجام شد، سپس 50 میکرولیتر محلول اتیلین­دی­آمیـد دی هیدروکلریـد (NEDSolution (0.1% N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride in water))  اضـافه شد و مجددا به‫مدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون صورت گرفت و رنـگ حاصـل در طـول مـوج 540 نـانومتر خوانـده شد. آنگاه جـذب نمونـه­هـا بـا جـذب اسـتاندارد (0 تـا 100 میکرومولار نیترات سدیم) مقایسه و میزان نیتریک اکسید تولید شده در مایع رویی کشت سلولی اندازه گیری شد.

 

آنالیز آماری

در این مطالعه، تمام آزمایش­ها به‫صورت سه بار تکرار انجام شد. بــرای تجزیــه و تحلیــل آمــاری از برنامــه نــرم افــزاری) Statistical Package For Social  Science (SPSS Statistics (Version 23)استفاده شد و نتایج به‫صورت میانگین± انحراف معیار ) Mean ± (Standard Derivation (SD)  گزارش شد. اختلاف آماری بین گروه­های کنترل و تیمار شده با استفاده از آزمون t-test مورد ارزیابی قرار گرفت و 05/0p< از نظر آماری معنی‫دار تلقی شد (28).

 

نتایج

اثر غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) بر توان حیاتی سلول­های .PC12

بقای سلول­های  PC12بعد از 48 ساعت تیمار کردن با غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) توسط تست MTT سنجیده و نتایج حاصل در شکل 1 آورده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: اثر غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و  substance p(lys-homocysteine)در حضور سیستئین بر توان حیاتی سلول­های PC12 بعد از 48 ساعت تیمار کردن. نمونه­ها شامل سلول و محیط کشت به همراه غلظت­های مختلف پپتید (از غلظت 4-10 مولار  تا 10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان 4-10×5 میکرو مولار، شاهد (control) که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و فاقد پپتید می­باشد و چاهک حاوی سلول و محیط کشت که به‫همراه تریتون (tri) 4 درصد به‫مدت 2 ساعت تیمار شده است. تمام داده­ها به‫صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<*** در مقایسه با گروه شاهد.

 

میزان افزایش رشد سلول­های PC12 نسبت به گروه شاهد در جدول 1 آمده است. ضمناً از اینجا به بعد به‫منظور ساده تر شدن، ترکیبات Cys+Substance P ، Cys+ substance p(lys-homocysteine) به اختصار و به‫ترتیب به‫صورت  (SP-H)+C و S+C نشان داده می‫شوند.

 

 

 

جدول1: درصد افزایش رشد سلول­های PC12 در نمونه­های حاوی پپتید نسبت به گروه شاهد

 

غلظت نمونه­های مختلف از پپتید(مولار)

 

(SP-H)+C

 

S+C

4-10

9/39

75/28

5-10

67/46

32

6-10

65/78

55/38

7-10

42/53

65/33

8-10

175/47

5/27

9-10

5/27

25/26

10-10

25/25

07/25

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

همان‫طور که در جدول 1 دیده می­شود به‫طور کلی هر 2 ترکیب به‫طور معنی­داری (05/0p<) موجب افزایش رشد سلول­ها شده­اند اما روند این افزایش به گونه­ای می­باشد که از غلظت 4-10 مولار تا 6-10 مولار رشد سلول­ها به‫طور معنی­دار(05/0p<) بیشتر شده است به نحوی که میزان افزایش رشد با افزودن: (SP-H)+C از 9/39  درصد نسبت به گروه شاهد به 65/78 درصد، SP)+C ) از 75/28 درصد نسبت به گروه شاهد به 55/38 درصد رسیده است. اما از غلظت­های 6-10 مولار تا 10-10 مولار روند افزایش رشد به‫طور معنی‫داری (05/0p<) کمتر شده است به‫نحوی که میزان افزایش رشد در مجاورت: (SP-H)+C از 65/78 درصد نسبت به گروه شاهد به 25/25 درصد، SP)+C) از 55/38 درصد نسبت به گروه شاهد به 07/25 درصد رسیده است. حداکثر میزان افزایش رشد در هر یک از گروه­ها مربوط به غلظت 6-10 مولار می­باشد. کمترین میزان رشد نیز در چاهک محتوی تریتون دیده شد زیرا تریتون روی رشد اثر منفی داشته و باعث از بین بردن سلول­ها می­شود.

بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلول­های PC12 در اثر تاُثیر نمونه­های مختلف پپتیدی

به‫منظور بررسی کیفی تغییرات مورفولوژیکی در اثر تاثیر نمونه­های مختلف پپتیدی به‫عنوان نمونه غلظت 6-10 مولار از پپتیدها که در آن غلظت بیشترین تاثیر دیده می­شود انتخاب و تصویر سلول­های مواجه یافته با این غلظت از پپتیدهای  (SP-H)+C و SP)+C)، سلول­های شاهد که فاقد پپتید می­باشد و سلول­هایی که حاوی محلول تریتون (tri)4 درصد است در شکل 2 آورده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل2: تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها: A سلول­های شاهد ، B سلول­های حاوی (S+C)  6-10 مولار، C سلول­های حاوی (H+C)  6- 10مولار D سلول­های حاوی محلول تریتون

 

همان‫طور که در شکل 2 مشخص است سلول­های حاوی پپتید هیچ‫گونه تغییر مورفولوژیکی مشخصی نسبت به سلول­های شاهد نداشتند اما سلول­هایی که با تریتون مواجه داشتند تحت تاثیر تریتون تغییر شکل واضحی داشته اند به گونه‫ای که از فرم دوکی شکل و چسبنده خارج شده، پاهای کاذب خود را از دست داده و به فرم دایره­ا­­ی و تحلیل رفته تبدیل شده­ا­ند، محتوای سلولی برخی از آن­ها نیز به بیرون ریخته و روی سطح محیط کشت شناور باقی مانده­اند. 

 

سنجش سمیت القا شده با H2O2

سپس به‫­منظور القای استرس اکسیداتیو از H2O2 به‫عنوان اکسیدان استفاده شد تا اثر محافظتی نمونه­های پپتیدی فوق الذکر در برابر تغییر اعمال شده در ریز محیط مورد بررسی شود. ابتدا غلظتی از H2O2 که در آن نیمی از توان حیاتی سلول­های PC12 کاهش می­یابد توسط تست MTT تعیین شد و سپس به بررسی تست NO در غلظت به‫دست آمده پرداخته شد.

 

 

 

 

 

 

 

شکل3: اثر غلظت­های مختلف پراکسید­هیدروژن بر توان حیاتی سلول­های PC12 بعد از 24 ساعت تیمار کردن. نمونه­ها شامل سلول و محیط کشت به‫همراه غلظت­های مختلف پراکسید­هیدروژن (از غلظتg/ml µ400 تا g/ml µ1/3)، شاهد (control) که تنها حاوی سلول و محیط کشت است و فاقد H2O2  می­باشد. تمام داده­ها به‫صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<***، 000001 /0p<**** در مقایسه با گروه شاهد.

 

 

همان‫طور که از شکل 3 مشخص است غلظت g/ml µ 150 از  H2O2بر توان حیاتی سلول­های PC12  اثر مهاری داشته و می‫تواند نیمی از آن‫ها را بعد از 24 ساعت تیمار کردن از بین ببرد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

اندازه­گیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی

در نمودار زیر میزان نیتریک اکسید تولید شده توسط نمونه­های انتخابی از سلول­ها در حضور و عدم حضور H2O2 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

شکل4: تست :NO بررسی مقایسه­ای میزان نیتریک اکسید تولید شده از نمونه­های انتخابی در حضور و عدم حضور H2O2. چاهک­ها محتوی سلول و محیط کشت هستند به‫همراه غلظت­های 6-10 یا 7-10 مولار از نمونه­های مختلف پپتیدی که نیمی از چاهک­ها به‫مدت 3 ساعت با H2O2 (150 ماکرومولار) تیمار شدند، گروه شاهد  (CG)که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و کنترل منفی (NC) که حاوی سلول، سیستئین، محیط کشت و H2O2 است. تمام داده­ها به‫صورت  میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و001 /0p<*، 0001/0p<**  و  00001/0p<*** در مقایسه با گروه کنترل مثبت و 00001 /0 ,*p< 000001 /0 **p< و 0000001 /0***p< در مقایسه با گروه کنترل منفی.

جدول2: درصد کاهش تولید NO درون سلولیِ نمونه­های انتخابی (شامل سلول، سیستئین و محیط کشت به همراه غلظت­های 6-10 یا 7-10 مولار پپتید) در حضور H2O2 نسبت به کنترل منفی (حاوی  H2O2و بدون پپتید) و عدم حضور H2O2  نسبت به گروه شاهد (فاقد H2O2و بدون پپتید)

 

غلظت نمونه­های مختلف از پپتید (مولار)

درصد کاهش تولید NO در حضور H2O2

درصد کاهش تولید NO در عدم حضور H2O2

(SP-H)+C6-10

36

49

7-10(SP-H)+C

24

32

SP+C6-10

14

22

SP+C7-10

5

17

 

 

 

 

 

 

 

 

چنانچه در جدول 2 مشاهده می­شود در حضور و عدم حضور  H2O2 هر دو ترکیب به‫طور معنی­داری (05/0p<) موجب کاهش تولید NO درون سلولی شده­اند و این کاهش به‫نحوی است که در شرایط عدم وجود  پراکسید هیدروژن، در غلظت­ 6-10 مولار، پپتید هموسیستئینه توانسنته 27 درصد بیشتر از پپتید طبیعی منجر به کاهش تولید NO  شود و در غلظت 7-10 مولار نیز پپتید هموسیستئینه  توانسنته  15 درصد بیشتر از پپتید طبیعی تولید NO  را کاهش دهد و شدت تاثیر هموسیستئینه شدن Substance p  در میزان تولید NO به گونه ای بوده است که حتی در شرایطی که یک عامل مهار کننده‫ی رشد مثل H2O2 نیز در محیط وجود داشته باشد توانسته به‫خوبی منجر به کاهش درصد تولید NO  شود چنانچه در حضور  H2O2 در غلظت­ 6-10 مولار، پپتید هموسیستئینه 22 درصد بیشتر از پپتید طبیعی منجر به کاهش تولید NO  شده است و در غلظت 7-10 مولار 19 درصد بیشتر از پپتید طبیعی تولید NO  را کاهش داده است.

 

بحث

یکی از انواع گونه­های فعال اکسیژن (ROS)، پراکسید هیدروژن است که بسته به غلظت آن در درون سلول، در بسیاری از مسیرهای انتقال پیام و تصمیمات سلولی دخیل است.

در سلول­های سرطانی به‫دلایل مختلفی چون فعالیت متابولیک بالا، مسیرهای انتقال پیام، اختلال عملکرد میتوکندری، فعال شدن آنکوژن­ها سطح ROS افزایش می­یابد. گرچه سلول­های سرطانی قادر هستند 

 

واکنش‫های سازگاری ایجاد کنند تا بتوانند فنوتیپ­های بدخیم خود را حفظ کنند، با این حال هنگامی که تعادل مجدد سلول­های سرطانی شدیدا مختل می­شود، در اثر استرس اکسیداتیو حاصله خسارات فراوانی به بار می­آید که نهایتا می­تواند با فعال کردن مسیرآپوپتوز و یا نکروزه کردن سلول­ها منجر به مرگ سلول شود. (24، 25، 29، 30)

یکی دیگر از انواع ROS نیتریک اکسید است. غلظت فیزیولوژیک واقعی NO در سلول­ها بسیار پایین است (20 تا 100 نانومولار) است. وقتی غلظت نیتریک اکسید در سلول کم باشد، اثرات موافق با تومور اتفاق می­افتد که شامل: تکثیر، رگزایی، تهاجم، متاستاز و سرکوب آپوپتوز می­باشند و در غلظت­های بالا اثرات ضد توموری و مرگ سلولی اتفاق می­افتد که شامل آسیب DNA، استرس اکسیداتیو/ نیتروزاتیو (Oxidative/ Nitrosative Stress )، سمیت سلولی و آپوپتوزیس است. مطالعات متعددی این اثر وابسته به غلظت را روی سلول­های مختلف نشان داده­اند. به عنوان مثال در سلول­های PC12 به خوبی نشان داده شده است که غلظت پایینNO و اهدا کننده­ی NO (DETA) (NO donors (Diethylenetriamine Nitric Oxide Adduct) به‫طور قابل توجهی باعث تحریک تکثیر شده­اند در حالی که غلظت بالا (200 تا600 نانومتر NO) مانع از تکثیر شده است. این روند درسلول­های کراتینوسیت (Keratinocytes )، هپاتو کارسینوما (Hepatocellular Carcinoma)، لوسمی انسانی(HL-60)  (Human Leukemia (HL-60)) نیز دیده شد و افزایشiNOS  یکی از شاخص­های تشخیص تومور در سلول­های گلیوبلاستوما (Glioblastoma) است. همچنین یافته­های محققین نشان می­دهد که آپوپتوز ناشی از NO در سلول­های PC12 به فعالیت p53 بستگی دارد و مستقیما شامل رونویسی ژن آپوپتوزیس، فعال­سازی کاسپاز (Caspaseactivation)، دپلیمریزاسیون غشا میتوکندری و تقسیم هسته ای DNA می­شود (19و30).

پراکسیدهیدروژن یکی از عوامل افزایشNO  درون سلول است زیرا آنزیم iNOS قادر است  L-Arg  را توسط H2O2 اکسید کرده و منجر به تولیدNO  ­شود. از طرفی علاوه بر این که افزایش غلظت H2O2 و NO هر دو برای سلول سمی است از واکنش آن‫ها با هم امکان تشکیل پراکسی نیتریت به وجود می­آید که بسیار سمی­تر است و موجب آسیب شدیدتر به سلول­های تومور می­شود (31).

لذا در صورتی که تاثیر نمونه­های مورد مطالعه بر رشد سلول­های سرطانی مثبت باشد، می­توان از H2O2 برای ایجاد استرس اکسیداتیو استفاده کرد (32) و میزان تولید NO در برابر سمیت پراکسید هیدروژن را نیز مورد مطالعه قرار داد تا مشخص شود که آیا نمونه­های مورد مطالعه می­توانند سلول را در برابر سمیت پراکسید هیدروژن در غلظتی که برای سلول سمی و کشنده است نیز محافظت کند. سنجش توان حیاتی سلول­ها با استفاده از تست MTT نشان داد که در حضور سیستئین، پپتید SP باعث افزایش رشد سلول­های PC12 می­شود و هموسیستئینه شدن این پپتید باعث افزایش بیشتر رشد این سلول­ها خصوصاً در غلظت 1میکرومولار می­شود به نحوی که همان طور که در شکل 2 دیده می­شود، به لحاظ کیفی هیچ گونه تغییر مورفولوژیکی (26) مشخصی بین سلول­هایی که در معرض SP+C و SP-H+C قرار گرفته­اند با سلول­هایی که در معرض آن‫ها قرار نداشته­اند وجود ندارد. مطالعات محققین نشان می­دهد که SP با مکانیسم­های مختلفی می­تواند از طریق گیرنده NK1 باعث افزایش رشد سلول شود. به‫عنوان مثال فعال­سازی مسیر MAPK  و تحریک میتوز در سلول­های استروما (U-373MG Astrocytoma Cell Line) (29)، کاهش آپوپتوزیس از طریق مسیر انتقال پیام Akt در سلول‫های کاردیومیوسیت (Cardiomyocytes) موش و افزایش تکثیر و کاهش آپوپتوزیس از طریق فعال شدن مسیر Akt / GSK-3β (Human Retinal Pigment Epithelium Cell Line) درسلول­های RPE (Human Retinal Pigment Epithelium Cell Line) چشم که باعث نجات سلول­ها از مرگ القا شده توسط اکسیدان H2O2 شده است (33). نتایج حاصل از اندازه­گیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی با استفاده از تست NO در حضور و عدم حضور (g/mlµ150) H2O2 در شکل 4 نیز به خوبی نشان می‫دهد که به‫طور کلی میزان تولید NO در سلول­هایی که در معرض (g/mlµ150) H2O2 و سیستئین همراه با پپتیدهای SP و SP-H بوده­اند از سلول­های کنترل منفی که حاوی (g/mlµ150) H2O2 بوده اما با نمونه­های پپتیدی و سیستئین تیمار نشده بودند کمتر می­باشد و این کاهش معنی­دار، در میزان تولید NO در سلول­هایی که در معرض سیستئین و پپتیدهای SP و SP-H بوده­اند نسبت به سلول­های کنترل مثبت که فاقد  H2O2 بوده و با نمونه­های پپتیدی و سیستئین هم تیمار نشده بودند مشاهده می­شود. بنابراین حضورSP+C و SP-H+C باعث کاهش میزان تولید NO در سلول­های PC12 شده است. البته مکانیسم مولکولی که مسبب این کاهش است تاکنون گزارش نشده است (34). اما از آن‫جایی‫که NOS1 و NOS3 غلظت نانومولار NO را برای دوره­های بسیار کوتاه مدت (ثانیه / دقیقه) تولید می­کنند و NOS2 غلظت میکرومولار NO را برای دوره­های زمانی طولانی (ساعت و روز) تولید می­کند و نقش موثرتری در سرطان دارد (19)، همچنین گزارش شده است که افزایش بیش از حد  NO درون سلولی خود اثر منفی بر تولید بیشتر آن دارد (35)، به‫نظر می­رسد نمونه­های پپتیدی قادر خواهند بود  با یک بازخورد منفی در مهار و یا کاهش بیان این آنزیم تاثیرگذار باشند. همچنین چنانچه از جدول 2 مشخص است کهSP-H+C  تأثیر بیشتری در تولید NO نسبت به SP+C دارد. این امر می­تواند نشان دهنده این موضوع باشد که در برخی بیماری­ها مثل سرطان که میزان SP و هموسیستئین خون افزایش می­یابد، تشکیلSP-H  می‫تواند از طریق کاهش تولید نیتریک اکسید درون سلولی و حفاظت در برابر استرس اکسیداتیو باعث افزایش رشد بیشتر سلول­های سرطانی شده و روند پیشرفت سرطان را سرعت بخشد.

 

نتیجه‫گیری

بنابراین با توجه به این‫که در درمان سرطان یکی از روش‫های پیشنهادی استفاده از آنتاگونیست­های Substance P می­باشد در طراحی آن بایستی این نکته مورد توجه قرار گیرد که آنتاگونیست طراحی شده علاوه بر ممانعت از فعال سازی NK1، مانع از هموسیستئینه شدن SP در خون نیز شود.

 

تشکر و قدردانی

از حمایت­های ﮔﺮوه بیوفیزیک و بیوشیمی بخش فناوری زیستی دانشگاه صنعتی مالک اشتر در انجام این پروژه ﺻﻤﻴﻤﺎﻧﻪﻗﺪرداﻧﻲ ﻣﻲ­ﺷﻮد.

1. Nazir S, Hussain T, Ayub A, Rashid U, et al. Nanomaterials In Combating Cancer: Therapeutic Applications And Developments. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology And Medicine. 2014; 10(1):19-34.

2. Marzouni HZ, Lavasani Z, Shalilian M, Najibpour R, et al. Women's Awareness And Attitude Toward Breast Self-Examination in dezful city, Iran, 2013: Iranian Red Crescent Medical Journal. 2015; 17(1): 17829.

3. Muñoz M, Coveñas R. Involvement Of Substance P And The NK-1 Receptor In Pancreatic Cancer. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 2014; 20(9): 2321–2334.

4. Rizo J, Gierasch LM. Constrained Peptides: Models Of Bioactive Peptides And Protein Substructures. Annual Review Of Biochemistry. 1992; 61(1): 387-416.

5. Jensen J. Substance P And Other Tachykinins.  The Comparative Physiology Of Regulatory Peptides: Springer; 1989. 130-49.

6. Munoz M, Rosso M, Pérez A, Covenas R, Et Al. Antitumoral action of the neurokinin-1-receptor antagonist L-733,060 and mitogenic action of substance P on human retinoblastoma cell lines. Investigative ophthalmology & visual science. 2005; 46(7): 2567-70.

7. Yang L, Sui W, Li Y, Qi X, et al. Substance P inhibits hyperosmotic stress-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the mechanism of Akt activation and reactive oxygen species scavenging via the neurokinin-1 receptor. PLoS One. 2016; 11(2): e0149865.

8. Chen X-Y, Ru G-Q, Ma Y-Y, Xie J, et al. High Expression Of Substance P And Its Receptor Neurokinin-1 Receptor In Colorectal Cancer Is Associated With Tumor Progression And Prognosis. Oncotargets And Therapy. 2016; 9: 3595–3602.

9. Munoz M, Covenas R. Neurokinin-1 Receptor: A New Promising Target In The Treatment Of Cancer. Discovery Medicine. 2010; 10(53): 305-13.

10.  Rosso M, Munoz M, Berger M. The role of neurokinin-1 receptor in the microenvironment of inflammation and cancer. The Scientific World Journal. 2012; 2012: 381434.

 11. Muñoz M, Berger M, Rosso M, Gonzalez-Ortega A, Et Al. Antitumor activity of neurokinin-1 receptor antagonists in MG-63 human osteosarcoma xenografts. International journal of oncology. 2014; 44(1): 137-46.

12. Davoudmanesh S, Mosaabadi JM. Investigation of the effect of homocysteinylation of substance P on its binding to the NK1 receptor using molecular dynamics simulation. Journal of Molecular Modeling. 2018; 24(7): 177.

13. Scott JM, Weir DG. Folic Acid, Homocysteine And One-Carbon Metabolism: A Review Of The Essential Biochemistry. Journal Of Cardiovascular Risk. 1998; 5(4): 223-7.

14. Jakubowski H. Molecular Basis Of Homocysteine Toxicity In Humans. Cellular And Molecular Life Sciences CMLS. 2004; 61(4): 470-87.

15.  Ackers GK, Smith FR. Effects Of Site-Specific Amino Acid Modification On Protein Interactions And Biological Function. Annual Review Of Biochemistry. 1985; 54(1): 597-629.

16. Calorini L, Peppicelli S, Bianchini F. Extracellular Acidity As Favouring Factor Of Tumor Progression And Metastatic Dissemination. Exp Oncol. 2012; 34(2): 79-84.

17. Nurwidya F, Takahashi F, Minakata K, Murakami A, Et Al. From Tumor Hypoxia To Cancer Progression: The Implications Of Hypoxia-Inducible Factor-1 Expression In Cancers. Anatomy & Cell Biology. 2012; 45(2): 73-8.

18. Brynczka C, Merrick BA. Nerve growth factor potentiates p53 DNA binding but inhibits nitric oxide-induced apoptosis in neuronal PC12 cells. Neurochemical research. 2007; 32(9): 1573-85.

 

19. Burke AJ, Sullivan FJ, Giles FJ, Glynn SA. The yin and yang of nitric oxide in cancer progression. Carcinogenesis. 2013; 34(3): 503-12.

20. Haviv R, Lindenboim L, Yuan J, Stein R. Need For Caspase‐2 In Apoptosis Of Growth‐Factor‐Deprived PC12 Cells. Journal Of Neuroscience Research. 1998; 52(5): 491-7.

21. Martin T, Grishanin R. PC12 Cells As A Model For Studies Of Regulated Secretion In Neuronal And Endocrine Cells. Methods Cell Biol. 2003; 71(34): 267-86.

22. Munoz M, Rosso M, Covenas R, Montero I, Et Al. Neurokinin-1 Receptors Located In Human Retinoblastoma Cell Lines: Antitumor Action Of Its Antagonist, L-732,138. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2007; 48(6): 2775-81.

23. Nunes SC, Ramos C, Lopes-Coelho F, Sequeira CO, Et Al. Cysteine allows ovarian cancer cells to adapt to hypoxia and to escape from carboplatin cytotoxicity. Scientific Reports. 2018 Jun 22; 8(1): 9513.

24.Najmi Ns, Zhaleh H, Azadbakht M. Protective Effects Of Morphine Low Concentration On Dexamethasone-Induced Cell Death In Differentiated Pc12 Cells. 2013; 15(5): 7-16.

25. Vilema-Enríquez G, Arroyo A, Grijalva M, Amador-Zafra RI, Et Al. Molecular And Cellular Effects Of Hydrogen Peroxide On Human Lung Cancer Cells: Potential Therapeutic Implications. Oxidative Medicine And Cellular Longevity. 2016; 2016: 1-13.

26. Lu YH, Su MY, Huang HY, Yuan CG. Protective effects of the citrus flavanones to PC12 cells against cytotoxicity induced by hydrogen peroxide. Neuroscience Letters. 2010; 484(1): 6-11.

27. Lai Y, Shen L, Zhang Z, Liu W, Et Al. Synthesis and biological evaluation of furoxan-based nitric oxide-releasing derivatives of glycyrrhetinic acid as anti-hepatocellular carcinoma agents. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2010; 20(22): 6416-20.

28. Cheong CU, Yeh CS, Hsieh YW, Lee YR, Et Al. Protective effects of Costunolide against hydrogen peroxide-induced injury in PC12 cells. Molecules. 2016; 21(7): 898.

29. Lu W, Ogasawara MA, Huang P. Models of reactive oxygen species in cancer. Drug Discovery Today: Disease Models. 2007; 4(2): 67-73.

30. Kumari S, Badana AK, Malla R. Reactive oxygen species: A key constituent in cancer survival. Biomarker insights. 2018;13:1177271918755391.

31. Fan W, Lu N, Huang P, Liu Y, et al. Glucose Responsive Sequential Generation of Hydrogen Peroxide and Nitric Oxide for Synergistic Cancer Starving Like/Gas Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 2017; 56(5): 1229-33. 

32. Lv R, Du L, Lu C, Wu J, Et Al.Allicin protects against H2O2‑induced apoptosis of PC12 cells via the mitochondrial pathway. Experimental and therapeutic medicine. 2017; 14(3): 2053-9.

33. Baek SM, Yu SY, Son Y, Hong HS. Substance P promotes the recovery of oxidative stress-damaged retinal pigmented epithelial cells by modulating Akt/GSK-3β signaling. Molecular vision. 2016; 22: 1015.

34. Villalobo A. Nitric oxide and cell proliferation. The FEBS journal. 2006; 273(11): 2329-44.

35. Kang BN, Jeong KS, Park SJ, Kim SH, Et Al. Regulation of apoptosis by somatostatin and substance P in peritoneal macrophages. Regulatory peptides. 2001; 101(1-3): 43-9.