داربست کامپوزیتی پلی کاپرولاکتون/نانوگرافن به‫منظور تمایز عصبی سلول‌های بنیادی پالپ دندان‬‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اصفهان، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی پزشکی

2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه زیست فناوری سلولی، اصفهان، ایران

چکیده

هدف: در این پژوهش طراحی و ساخت داربست­های نانوکامپوزیتی تقویت­شده با گرافن به‫منظور القای تمایز عصبی در سلول های بنیادی پالپ دندان مورد توجه قرار گرفت.
مواد و روش­ها: ابتدا داربست‫های کامپوزیتی پلی کاپرولاکتون/ نانوگرافن با درصدهای وزنی 1، 3 و 5 درصد گرافن توسط روش ریخته‫گری حلال ساخته شدند. در ادامه  میزان آبدوستی و هدایت الکتریکی نانوکامپوزیت­ها اندازه‫گیری شد. با استفاده از نتایج آزمون‫های فیزیکی ذکر شده،  داربست مناسب با درصد بهینه نانوگرافن انتخاب شد و مورفولوژی، فعالیت متابولیکی و پتانسیل تمایز عصبی سلول‫های بنیادی پالپ دندان روی آن به‫ترتیب توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، آزمون MTS و رنگ­آمیزی ایمونوفلورسنت مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: نتایج آزمون هدایت سنجی نشان داد که با افزودن گرافن به پلی کاپرولاکتون، هدایت الکتریکی کامپوزیت به‫میزان قابل توجهی افزایش می‫یابد. همچنین افزودن 5 درصد وزنی نانوگرافن به پلیمر منجر به کاهش زاویه تماس از 86/2±89/99 به 36/3±03/64 درجه می‫شود. در نهایت تصاویر میکروسکوپ SEM و رنگ­آمیزی ایمونوفلورسنت با نشانگر MAP2 نشان دادند که سلول­ها روی سطح داربست بهینه به سلول­های شبه عصبی تمایز یافته­اند.
نتیجه­گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که داربست نانوکامپوزیتی پلی­کاپرولاکتون/ 5 درصد گرافن از پتانسیل مناسبی جهت القای تمایز عصبی و کاربرد در مهندسی بافت عصب برخوردار است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

امروزه با استفاده از راه‫کارهای مهندسی ­بافت و پیشرفت‫های علمی در این زمینه، داربست‫های طبیعی و مصنوعی گوناگونی  طراحی ­شده­اند که از آن­ها می­توان به­عنوان جایگزین پیوند­های عصبی استفاده کرد. موفقیت مهندسی ­بافت عصبی به­صورت اساسی به ایجاد تعادل و نظم بین رفتار سلولی وایجاد بافت درون یک داربست مصنوعی یا طبیعی بستگی دارد. خواص فیزیکی-شیمیایی و زیستی این داربست می­بایست مشابه ماده زمینه­ خارج­ سلولی  Extracellular Matrix (ECM) بدن باشد تا بتواند از اتصال، رشد و تمایز سلول‫ها در بدن حمایت کند. خواصی مانند زیست­سازگاری، زیست­تخریب­پذیری، رسانایی و استحکام کششی مناسب از جمله خواص مورد نیاز برای یک داربست عصبی ایده  آل می‫باشند  (1, 2).

گرافن (Graphene) یک لایه تک اتمی از کربن­هایی است که به‫صورت حلقوی با هم پیوند کووالانسی برقرار کرده­اند. گرافن دارای ویژگی­های منحصربفردی از جمله هدایت الکتریکی و حرارتی بسیار بالا می­باشد. دیگر خواص ویژه گرافن مانند قابلیت کشسانی بالا و تمایل به جذب پروتئین­های سبک، می­تواند تمایز عصبی سلول­های بنیادی و رشد و تکثیر سلول­های عصبی را بهبود بخشد (3-5). پس از کشف گرافن در سال 2004 محققین به بررسی خواص و کاربردهای گرافن پرداختند که از جمله کاربردهای زیستی مورد توجه آن می­توان به استفاده در ساخت داربست‫های مهندسی بافت، تصویربرداری مولکولی و سیستم‫های رهایش ژن و دارو اشاره کرد. همچنین گزارش شده که گرافن در آزمون­های برون­تنی فاقد سمیت سلولی بوده و به‫علت هدایت الکتریکی بالا گزینه مناسبی برای مهندسی بافت عصب، می باشد (6).

در طراحی داربست­های مهندسی بافت عصب به‫دلیل خواص مکانیکی نزدیک پلیمرها به بافت عصب، استفاده از مواد پلیمری بسیار مرسوم است. تاکنون پلیمرهای زیست سازگار مصنوعی متعددی مانند پلی لاکیتیک اسید (PLA)، پلی لاکتیک گلیکولیک اسید (PLGA) و پلی کاپرولاکتون (PCL) به‫منظور طراحی و ساخت داربست‫های عصبی به‫کار رفته اند. اما جهت بهبود خواص فیزیکی، شیمیایی و زیستی این داربست­های پلیمری، نیاز به جزء دوم در زمینه داربست نیز ضروری است (7). سایار و همکارانش در گزارش خود بر این عقیده­اند که مواد کامپوزیتی پلیمری تقویت شده با پرکننده­های کربنی در مقیاس نانو، خواص مکانیکی و هدایتی بسیار بهتری نسبت به پلیمر­های خالص دارند. در این تحقیق، آنها از نانوکامپوزیت پلی­کاپرولاکتون-گرافن به‫عنوان یک داربست مهندسی بافت استفاده کردند. نتایج به‫دست آمده نشان داد که پس از ترکیب با گرافن، پلیمر خواص زیستی و فرایند­پذیری خود را حفظ می­کند، اما خواص مکانیکی و هدایتی آن به‫دلیل وجود گرافن افزایش می­یابد. همچنین چسبندگی و رشد سلول­های PC12 کشت شده روی این نانوکامپوزیت نیز در مقایسه با پلیمر خالص افزایش داشته است (8). در مطالعه­ی صورت گرفته توسط روسا  و همکارانش نیز نشان داده شده است که سلول­های بنیادی پالپ دندان (Sayyar) روی بستر کامپوزیتی پلی­کاپرولاکتون/گرافن­اکسید از خود تمایز استئوبلاستی (Osteoblastic) و اودونتوبلاستی (Odontoblastic) نشان داده اند (9).

با توجه به اینکه در مطالعات انجام گرفته توسط نویسندگان، تاکنون گزارشی مبنی بر کاربرد داربست‫های  نانوکامپوزیتی PCL/Graphene به‫منظور بررسی تمایز عصبی سلول‫های بنیادی پالپ دندان (DPSCs) مشاهده نشده است، رسیدن به هدف مذکور در این پژوهش مد ‫نظر قرار گرفت. ابتدا داربست‫های PCL/Graphene با درصد مختلف وزنی گرافن تولید شده و از نظر فیزیکی و شیمیایی مشخصه یابی شدند. سپس سلول‫های DPSCs روی آن‫ها کشت داده شدند و میزان تمایز عصبی القا شده توسط داربست روی این سلول‫ها بررسی شد. استفاده از سلول­های DPSC  به این دلیل مورد بررسی قرار گرفت که علاوه بر دسترسی آسان­تر نسبت به سایر سلول­های بنیادی، قابلیت تمایز به رده­های سلولی مختلفی چون غضروفی، چربی، عصبی، استخوانی و ماهیچه­ای را داشته و همچنین ایمنی­زایی و رد پیوند کمتری از خود نشان داده است (10). در نهایت نتایج به‫دست آمده در این پژوهش نشان دهنده پتانسیل بالای نانوذرات گرافن جهت القای تمایز عصبی در سلول‫های بنیادی به‫ویژه در روش‫های مهندسی بافت عصب بودند.

 

مواد و روش‌ها

ساخت غشای نانوکامپوزیت PCL/Graphene: ابتدا پودر نانوگرافن (نوترینو، ایران)  در حلال دی متیل فرم آمید  (DMF) (Merck، آلمان) با غلظت 5/0 درصد (w/v) پراکنده شده و به‫مدت 12 ساعت در حمام آلتراسونیک قرار گرفت تا سوسپانسیون پایداری حاصل شد. به­منظور ساخت غشای کامپوزیتی PCL/Nano Graphene، پلیمر PCL با وزن مولکولی 80000 (Sigma، آلمان) با غلظت (w/v) 10 درصد در حلال DMF حل شد. سپس سوسپانسیون‫های  نانو گرافن با درصد وزنی 1 تا 5 درصد در محلول PCL به‫مدت 3 ساعت هم زده شدند تا کاملا حل شوند. در نهایت محلول‫های آمیزه­ای درون دیش­های تفلونی با قطر 8 سانتی­متر قالب­گیری شدند و در دمای محیط کمی خشک شدند.  برای خروج مقادیر بیشتری از حلال، نمونه‫ها به‫مدت یک شبانه روز درون آون خلا در دمای پ 70 درجه سانتی‫گراد خشک شدند. به‫عنوان گروه کنترل داربست PCL خالص به روش مشابه تولید شد.

بررسی خواص فیزیکی- شیمیایی داربستها

الگوی پراش اشعه ایکس غشاها توسط دستگاه XRD مدلXMD-300، UNISANTIS ساخت کشور سوئیس تعیین شد. ولتاژ دستگاه KV45 و شدت جریان 8/0 میلی­آمپر انتخاب شدند. جهت تشخیص ساختار شیمیایی غشاها از طیف‌سنجی FTIR استفاده شد. بدین‫منظور طیف  FTIRدر محدوده طول‌موجcm-14000-400 از کلیه نمونه‫ها توسط دستگاه طیف سنج شرکت Thermo-Science مدل IS10  ساخت کشور امریکا تهیه شد. به‫منظور بررسی ترشوندگی داربست‫ها از دستگاه اندازه­گیری زاویه تماس ساخت پژوهشگاه مواد و انرژی کشور ایران، با قطره آب با حجم 4 میکرولیتر  استفاده شد که مجهز به دوربین مدل DFK23U618 ساخت کشور آلمان با قابلیت عکسبرداری از قطره و نرم‫افزار سنجش زاویه تماس قطره بود. آزمون زاویه تماس قطره آب برای هر یک از نمونه­ها در سه نقطه مختلف انجام گرفت. برای بررسی هدایت الکتریکی از روش چهار نقطه­ای و دستگاه Keithly ساخت کشور آمریکا استفاده شد. در این روش مقاومت سطحی داربست‫ها سنجیده می­شود.

آماده سازی داربست ها پیش از کشت سلول: پیش از کشت سلول­ها، ابتدا داربست­ها به اندازه­ی سطح ظروف کشت سلول 24 خانه بریده شدند به‫مدت 2 ساعت زیر هود در الکل 70 درصد فیلترشده قرار گرفتند. سپس به‫مدت 8 دقیقه در محلول بافر فسفاتی (PBS‫) دارای 1 درصد آنتی­بیوتیک (پنی‫سیلین، استرپتومایسین) قرار گرفته و با یک پنس استریل به چاهک­های 24 خانه انتقال داده شدند.  پس از 2 مرتبه شستشوی مجدد با محلول PBS، داربست‫ها به‫مدت یک شبانه روز با محیط کشت معمول مزانشیمی (HighGlucose DMEM) حاوی 1 درصد آنتی­بیوتیک و 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) در انکوباتور قرار گرفتند. کلیه مواد مورد نیاز برای کشت سلول شامل محیط کشت، سرم و آنتی بیوتیک‫ها از شرکت Gibco، کشور انگلستان خریداری شدند.

 

کشت سلو‫‫‫لهای DPSCs

به‫منظور کشت سلول‫های DPSC جهت آزمون‫های سلولی از محیط کشت معمول مزانشیمی استفاده شد. پس از استریل کردن داربست‫ها میزان 50000 سلول روی سطح هر داربست در ظروف 24 خانه کشت شد.

 

بررسی فعالیت متابولیکی سلولها روی داربستها (MTS assay)

به‫منظور بررسی فعالیت متابولیکی و میزان تکثیر سلول­ها روی داربست­های مختلف از کیت MTS ساخت شرکت Promega (امریکا) استفاده شد. به این‫صورت که محلول MTS در حضور فنازین متوسولفات (PMS)، فورموزانی تولید می­کند که در محلول فسفات بافر در محدوده 490 تا 500 نانومتر، توسط دستگاه اسپکتوفوتومتری جذب نوری آن خوانده می­شود.  به این منظور آزمون MTS در روزهای 1، 4 و 7 پس از کشت سلول انجام گرفت. روش انجام بدین‫صورت است که پس از یک مرحله شستشو با PBS منفی سلول­ها به‫همراه محلول MTS حاوی محیط کشت کامل به نسبت 1:6، به‫مدت 3 تا 4 ساعت در انکوباتور دور از نور قرار گرفتند. در نهایت جذب نوری محلول MTS روی سلول‫ها توسط دستگاه الایزا در طول موج 490 نانومتر خوانده شد.

 

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)

به‫منظور بررسی ریخت شناسی و رفتاری سلول­ها از میکروسکوپ الکترونی روبشی مستقر در مرکز پژوهش متالورژی رازی (SEM, VEGA, TESCAN, Czech Republic) استفاده شد. به‫طور خلاصه پس از قرار­دادن نمونه­ها در دستگاه، در شرایط خلا با آشکارسازی الکترون­های ثانویه (Secondary Electron (SE)، تصاویر میکروسکوپی الکترونی روبشی با بزرگنمایی مورد نظر تهیه شدند. پوشش‫دهی طلا (قبل از رویت زیر میکروسکوپ) نیز به‫مدت 10 دقیقه به‫وسیله دستگاه لایه‫گذاری انجام شد. جهت بررسی ریخت شناسی سلول­ها ابتدا باید سلول‫ها روی سطح تثبیت شوند. بدین‫منظور از محلول تثبیت کننده شامل 10 درصد فرمالدئید 37 درصد، آب دیونیزه، دی­سدیم هیدروژن­فسفات (Na2HPO4) و سدیم­دی­ هیدروژن فسفات (NaH2PO4) به‫مدت 30 دقیقه استفاده شد. از پس از تثبیت عملیات آب‫گیری با استفاده از غلظت‫های سریالی اتانول (60 ، 70 ، 80 ، 90 ، 98  و 100 درصد) انجام شد و نمونه‫ها در دمای محیط خشک شدند.

تمایز عصبی سلولهای DPSC

5 یا 6 روز پس از کشت سلول در محیط کشت مزانشیمی زمانی که سلول‫ها به تراکم مورد نظر رسیدند،  محیط کشت مزانشیمی با محیط تمایز عصبی (NB + 1% Pen/Strep + 1% NEAA + 1% L-Glu + 1% ITS) حاوی bFGF (100 ng/ml)  (رویان بیوتک، ایران) تعویض یافت. پس از گذشت 6 روز فاکتور‫های رشد shh (100ng/ml) (رویان بیوتک، ایران) و FGF8b (10ng/ml) (Sigma، آلمان) نیز به‫مدت 6 روز به محیط تمایزی اضافه شدند. طی دوره تمایز نیمی از محیط کشت سلول­ها هر سه روز یکبار تعویض شد. پس از گذشت دوره 12 روزه تمایز سلول­ها با پارافرمالدئید 4 درصد جهت رنگ­آمیزی ایمنوفلورسنت تثبیت شدند.

 

رنگ­آمیزی ایمونوفلورسنت

در رنگ­آمیزی ایمونوفلورسنت از نشانگر هسته ای DAPI (Sigma، آلمان) که به DNA هسته سلول­ها متصل می‫شود، به‫عنوان نشانگر هسته­ای سلول‫ها و از آنتی­بادی اولیه MAP2 (Microtubule-associated protein2 2 (Chemicon، امریکا) به‫عنوان (نشانگر اختصاصی تمایز عصبی استفاده شد. به این منظور پس از تثبیت سلول‫ها به‫مدت 1 شبانه روز با آنتی بادی اولیه با غلظت 1:300  در دمای 4 درجه سانتی‫گراد قرار گرفتند و سپس به‫مدت یک ساعت با آنتی بادی ثانویه (Goat anti mouse IgG-FITC, 1:600, Millipore) در دمای 37 درجه سانتی‫گراد در انکوباتور قرار گرفتند. در نهایت رنگ آمیزی هسته به‫مدت 10 دقیقه در دمای محیط انجام گرفت.

 

آنالیز آماری

به‫منظور بررسی آماری نتایج، ابتدا داده‫ها با استفاده از شاخص میانگین و همچنین انحراف معیار توصیف  گردیدند. سپس برای مقایسه داده‫های بیش از دو گروه از آزمون آماری One-Way ANOVA (آنالیز واریانس یکطرفه) در سطح معنی‫داری 95  درصد استفاده شد. آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گرفت.

 

نتایج

بررسی الگوی پراش اشعه ایکس غشاهای نانو کامپوزیتی

ساختار بلورین غشاهای کامپوزیتی توسط الگوی پراش اشعه ایکس مورد مطالعه قرار گرفت که نتایج آن در شکل 1-A نشان داده شده است. به طور کلی مشاهده می‫شود که پیک شاخص صفحه­های گرافن 84/31 آنگستروم قرار دارد که با افزایش درصد گرافن در غشاها شدت آن افزایش یافته است، همچنین الحاق گرافن تغییری در ساختار بلوری پلیمر ایجاد نکرده است. از طرفی تشابه بین الگوی پراش غشاهای مرکب با درصدهای متفاوت نانوگرافن، نشان­دهنده این است که غشاها ساختار بلوری مشابه دارند.

بررسی طیف FTIR غشاهای کامپوزیتی

در این پژوهش از طیف سنجی FTIR برای تشخیص برهم‫کنش‫های احتمالی بین ذرات نانو گرافن و پلیمر استفاده شده­است. به‫طور کلی طیف جذبی پلی‫کاپرولاکتون دارای سه پیک شاخص در اعداد موج cm-1 1720، 2865 و 2940 می­باشد، که به‫ترتیب نشان دهنده وجود ارتعاش کششی پیوندهای –CH2 و ارتعاش پیوندهای –C=O می­باشد. در مقایسه با پلی­کاپرولاکتون خالص این سه پیک در طیف­های مربوط به نمونه‫های پلی­کاپرولاکتون/گرافن نیز دیده می­شود (Error! Reference source not found.). بنابراین هیچ تفاوتی بین طیف غشای پلیمر خالص و غشاهای مرکب حاوی نانوگرافن دیده نمی­شود، بدین‫معنی که پلیمر PCL با گرافن برهمکنش فیزیکی داشته است.

 

شکل 1: A) الگوهای پراش اشعه ایکس، B) طیف های جذبی FTIR غشاهای مرکب قالب گیری شده

 

بررسی میزان آبدوستی غشاهای کامپوزیتی

پس از ساخت داربست‫ها (شکل 2-A) میزان آبدوستی سطح آن‫ها با استفاده از دستگاه اندازه­گیری زاویه ­تماس بررسی شد. نتایج نشان داده شده در شکل 2-B نشان دادند که زاویه­ی تماس آب با سطح این داربست­ها به‫ترتیب در پلی­کاپرولاکتون، پلی­کاپرولاکتون- 1 درصد گرافن، پلی­کاپرولاکتون‫ 3 درصد گرافن و پلی‫کاپرولاکتون    5 درصد گرافن برابر با 86/2±89/99، 20/1±28/70، 62/4±23/69 و 36/3±03/64 درجه می‫باشد. به این معنی که به‫طور کلی با افزایش میزان نانوگرافن در داربست‫ها، میزان ترشوندگی نیز افزایش یافته است.

 

 

 

 

 

 

بررسی هدایت الکتریکی غشاهای کامپوزیتی

 شکل 2-C نتایج اندازه گیری هدایت الکتریکی داربست‫های مختلف را نشان می‫دهد، به‫طور کلی با افزایش درصد گرافن در پلیمر هدایت الکتریکی غشاها نیز افزایش یافته است. مقدار هدایت الکتریکی داربست­ها بر اساس رابطه σ=G.L /A اندازه­گیری شد (11) . در این رابطه σ معرف رسانایی بر حسب S.cm-1، L معرف فاصله بین دو الکترود برحسب cm، A معرف مساحت مقطع عرضی غشا بر حسب cm2 و G معرف مقدار معکوس مقاومت الکتریکی غشا بر حسب زیمنس (S) است. در این مرحله با توجه به نتایج مشخصه یابی داربست‫ها، غشاءPCL-5%G برای مطالعات سلولی بعدی انتخاب شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: A) تصاویر غشاهای مرکب قالب گیری شده، B) نتایج آزمون اندازه‫گیری زاویه تماس قطره، C) نتایج آزمون اندازه‫گیری هدایت الکتریکی. علامت * نشان دهنده اختلاف معنی‫دار نتایج در مقایسه با گروه کنترل (PCL) می باشد (p≤0.05).

 

بررسی ریخت شناسی و رفتار متابولیکی سلول­ها روی غشاهای کامپوزیتی

به‫منظور بررسی تاثیر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی داربست­ها  روی رفتار چسبندگی سلول‫ها از تصویربرداری SEM استفاده شد (شکل‫های 3-A و 3-B). همان‫طور که در تصاویر مشخص است یک هفته پس از کشت، سلول­ها روی سطح داربست ایده‫ال PCL-5%G چسبندگی، پهن­شدگی و رشد مطلوبی از خود نشان داده‫اند و استحاله‫های سلولی آن‫ها نیز به‫خوبی مشخص است.

به‫منظور بررسی زنده­مانی، فعالیت متابولیکی و تکثیر سلول­ها روی داربست­های مرکب نیز از آزمون MTS استفاده شد (شکل 3-C). با توجه به نتایج جذب در روزهای مختلف اگر‫چه فعالیت متابولیکی سلول­ها روی سطح ظرف کشت سلول معولی افزایش معنی‫داری نسبت به داربست ها دارد،  اما روند افزایشی و غیرسمی بودن داربست­ها نیز حائز اهمیت است. این روند افزایشی نشان دهنده این است که داربست­های پلی­کاپرولاکتون/گرافن می­توانند بستر مناسبی جهت چسبندگی، بقا، رشد و مهاجرت سلولی باشند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: A و B) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سلول­های DPSC کشت شده روی سطح غشا PCL-5%G در دو بزرگ‫نمایی 500 و 50 میکرومتر، C) نتایج آزمون بررسی فعالیت متابولیکی سلول‫ها (MTS assay). علامت * نشان دهنده اختلاف معنی‫دار نتایج در مقایسه با گروه کنترل (PCL) می باشد (p≤0.05).

 

 

 

 

 

بررسی تمایز عصبی سلولها روی غشاهای کامپوزیتی

طبق تصاویر به‫دست آمده از رنگ آمیزی ایمنوفلورسانس سلول­های کشت شده روی سطح داربست PCL-5%G، مشاهده می­شود که سلول­ها علاوه بر اینکه نسبت به مارکر عصبی MAP2 مثبت بودند، مورفولوژی شبه نورونی نیز از خود نشان دادند (شکل 4). از طرفی روی سطح غشاهای مرکب سلول­ها در یک جهت رشد یافته اند که می­تواند به‫دلیل وجود  لایه‫های نانوگرافن باشد.

 

 

 

 

 

 

شکل4: تصاویر رنگ امیزی فلورسنت سلول­های بنیادی پالپ دندان کشت داده شده روی سطح داربست PCL-5%G  پس از 12 روز.

 

 

بحث

آسیب­های سیستم عصبی به‫خصوص آسیب­های طناب نخاعی و اعصاب محیطی یکی از مهمترین مسائل در زمینه­ پژوهش­های درمانی است که از دیرباز توجهات  بسیاری را به‫خود جلب کرده­اند. با توجه به این مساله که بافت عصبی قابلیت خود ترمیمی بسیار کمی دارد، اغلب درمان­های متداول به جایگزینی بافت با استفاده از پیوند معطوف شده است. معایب درمان‫های وابسته به پیوند مانند آسیب به ارگان­های دیگر، رد پیوند و انتقال بیماری‫ها استفاده ازاین  روش­ها را محدود کرده و توجه زیادی را به راه‫کار­های مهندسی بافت معطوف کرده­است (12). تا کنون تحقیقات بسیاری روی بیومتریال­های مختلف و روش­های سلولی برای درمان آسیب­های عصبی صورت گرفته است.

 

 

 

در این میان مطالعات متعددی به استفاده از لایه‫های کربنی گرافن جهت القاء تمایز عصبی به‫علت هدایت الکتریکی بالا، پایداری شیمیایی مناسب و زیست سازگاری بالای آن‫ها بسیار پرداخته اند (13-15). همچنین ذکر شده است که دیگر خواص گرافن مانند الاستیسیته بالا و قابلیت جذب پروتئین­های سبک، نیز می­تواند تمایز سلول­های بنیادی و رشد و تکثیر سلول­های عصبی را بهبود بخشد (16, 17).

بدین ترتیب در این پژوهش طراحی و کاربرد غشاهای کامپوزیتی پلی­کاپرولاکتون/گرافن مورد بررسی قرار گرفته‫اند. جز پلیمری به‫کار رفته به‫منظور افزایش خواص مکانیکی داربست به‫ویژه جهت کاربرد در مطالعات درون تنی بعدی انتخاب شده است.  برهم‫کنش بین ذرات نانوگرافن و پلی کاپرولاکتون به‫صورت فیزیکی بوده است که این مطلب با توجه به نتایج الگوی پراش اشعه ایکس و طیف‫های FTIR به‫دست آمده قابل اثبات می‫باشد (شکل 1). بدیهی است که چنان‫چه برهم‫کنش شیمیایی در سطح مشترک پلیمر و نانوگرافن رخ می داد تغییرات پیک‫های جذبی FTIR و تغییرات میزان بلورینگی می‫بایست مشاهده شود. برهم‫کنش‫های شیمیایی عموما در اثر افزودن اکسید گرافن  به پلیمرها گزارش شده است و در مورد گرافن به‫علت عدم وجود گروه فعال شیمیایی چنین مواردی مشاهده نمی‫شود. به‫عنوان مثال وان و همکاران (18) گزارش کرده اند که افزودن گرافن اکسید به پلی کاپرولاکتون منجر به ایجاد پیوند هیدروژنی بین دو ماده می‫شود و ساختار شیمیایی ترکیب حاصله را دچار تغییر می‫کند.

یکی از موارد مهم موثر در چسبندگی سلولی آبدوستی سطح موردنظر می‫باشد به‫صورتی‫که هر چقدر سطح داربست آبدوست­تر باشد زاویه تماس قطره آب کوچکتر و چسبندگی سلول­ها بهتر خواهد شد (9). شایان ذکر است که البته آبدوستی یک بستر کشت سلول باید میزان بهینه‫ای داشته باشد و آبدوستی بیش از حد هم منجر به جداشدن سلول‫ها از سطح می‫شود. گزارش شده است که میزان بهینه زاویه تماس قطره آب برای چسبندگی موثر سلول‫ها به یک سطح حدود 40 تا 70 درجه سانتی‫گراد می‫باشد (19). در این پژوهش با افزودن نانوگرافن به پلیمر آبدوستی آن به‫صورت معنی‫داری در مقایسه با پلیمر خالص افزایش یافته است و هرچقدردرصد نانوگرافن اضافه شده افزایش یافته است، کاهش زاویه تماس قطره آب نیز بیشتر شده است (شکل 2-B).  با توجه به مقادی زاویه تماس قطره به‫دست آمده نمونه حاوی 5 درصد گرافن به‫نظر می‫رسد در محدوده بهینه آبدوستی برای چسبیدن سلول‫ها قرار دارد. علت فزایش آبدوستی پلی کاپرولاکتون پس از افزودن گرافن را می‫توان به افزایش زبری سطح و رسانایی الکتریکی آن نسبت داد (20).

عامل موثر دیگر در طراحی داربست­های مهندسی بافت عصب،  رسانایی داربست می‫باشد. گرافن با توجه به هدایت الکتریکی بالایی که دارد هدایت  سیگنال‫های الکتریکی موثر در تمایز را تسهیل می‫کند و منجر به القای تمایز عصبی می‫شود (14). در این پژوهش هم با افزایش مقدار ماده رسانای گرافن، رسانایی داربست­ها افزایش داشته به‫طوری­که با افزودن گرافن به پلیمر خالص هدایت الکتریکی آن حدود 104 برابر شده است (شکل 2-C) به‫طوری‫که سایار و همکاران (8) نیز در مطالعات خود روی کامپوزیت پلی­کاپرولاکتون/گرافن به هدایت الکتریکی مشابه دست یافتند.  بنابراین از لحاظ هدایت الکتریکی نیز غشاهای ساخته شده با 5 درصد گرافن می­توانند پیشنهاد مناسبی برای کاربردهای مهندسی بافت عصب باشند. بنابراین از میان نمونه‫های مرکب ساخته شده، غشای مرکب حاوی 5 درصد گرافن برای مطالعات سلولی انتخاب شد.

همان‫طور که در شکل‫های 3-A و 3-B  مشخص است سلول­ها روی سطح داربست چسبندگی، پهن­شدگی و رشد مطلوبی را از خود نشان داده­اند و استحاله­های سلولی به‫خوبی مشخص است. با توجه به نتایج MTS assay  نیز (شکل 3-C)، مشاهده می‫شود که اگر چه فعالیت متابولیکی سلول­ها روی سطح ظروف کشت سلول معمولی نسبت به داربست­ها طی یک هفته کشت سلول بیشتر بوده است اما روند افزایشی فعالیت متابولیکی سلول‫ها طی زمان در سایر گروه‫ها نیز دیده می‫شود. این روند افزایشی نشان دهنده این است که غشاهای پلی­کاپرولاکتون/گرافن می­توانند بستر مناسبی جهت چسبندگی، بقا، رشد و مهاجرت سلول‫ها باشند و اثر سمیتی روی سلول‫های DPSC ندارند. به‫طور کلی گزارش­های ضد و نقیضی در زمینه سمیت سلولی ترکیبات گرافن وجود دارد که وابسته به‫روش ساخت گرافن و ماهیت سلول‫های به‫کار رفته هستند. اما در اکثر مقالات گزارش شده است که ترکیبات گرافنی روی رفتار سلولی (چسبندگی، تکثیر و تمایز) به‫صورت مثبت تاثیر گذار هستند که عمدتا به‫علت ساختار اتمی این ترکیبات است. به‫عنوان نمونه حلقه‫های آروماتیک موجود در ساختار گرافن می‫تواند تجمع پروتئین‫های ماده زمینه خارج سلولی مانند لامینین و فیبرونکتین را توسط پیوندهای غیرکووالانسی افزایش دهد (21). همچنین این حلقه ها می توانند به‫عنوان یک نقطه اتصال برای گیرنده‫های سطح سلولی عمل کنند (22).

مقالات متعددی پتانسیل بالای ترکیبات گرافنی جهت القای تمایز عصبی را گزارش کرده اند (14, 15, 22-25). به‫طور کلی نانوگرافن از سه طریق تمایز عصبی سلول‫های بنیادی را بهبود می‫بخشد:

به‫طور کلی ویژگی های سطحی منحصر به فرد گرافن می‫تواند در تمایز مستقیم سلول‫های بنیادی به رده‫های مختلف موثر باشد (14).

ساختار سه بعدی داربست‫های مرکب ریز محیطی فراهم می آورد که می‫تواند شرایط درون تنی بدن موجود زنده را شبیه سازی کند (14, 26).

عامل سوم که مهم‫ترین عامل نیز می باشد، رسانایی الکتریکی گرافن است. از آنجایی‫که سلول های عصبی با تحریک الکتریکی فعال می‫شوند و برای مهاجرت، تکثیر و تمایز به انتقال بار الکتریکی نیاز دارند، ترکیبات رسانا می توانند تاثیر زیادی در القای تمایز عصبی در آن‫ها داشته باشند (27).

یکی از مزایای قابل توجه گرافن در مقایسه با پلیمرهای رسانا برای ساخت داربست­های مهندسی بافت عصب این است که رسانایی گرافن در شرایط محیطی مختلف تقریبا پایدار باقی می‫ماند (14). در این پژوهش از گرافن به‫عنوان جزء رسانا در ساختار یک پلیمر عایق استفاده شده است تا از قابلیت انتقال بار الکتریکی ترکیب حاصله به‫منظور القای تمایز عصبی روی سلول‫های DPSC استفاده شود. بدیهی است که استفاده از جز پلیمری نه تنها قابلیت شکل‫گیری و انعطاف پذیری داربست را افزایش می‫دهد بلکه روی خواص مکانیکی آن نیز تاثیر گذار است. به‫علاوه گزارش شده است که در مواردی ساختار صفحه‫ای صاف گرافن انتقال بار الکتریکی را محدود کرده است، بنابراین استفاده از ترکیب گرافن با یک زیست پلیمر دیگر می­تواند این مشکل را رفع کند (28). در این پژوهش تصاویر ایمنوفلورسنت سلول‫های رنگی آمیزی شده با نشانگر عصبی MAP2 نشان دادند که سلول های DPSC کشت شده روی داربست PCL-5%G نسبت به این نشانگر مثبت بودند و مورفولوژی شبه نورونی را نیز از خود نشان دادند (شکل 4). به‫علاوه در غشاهای نانو کامپوزیتی می‫توان جهت گیری سلول‫های عصبی را نیز تا حدی مشاهده کرد. منابع متعددی وجود دارند که در آن‫ها داربست‫های که قادر به القای آرایش یافتگی در سلول‫ها هستند را برای کاربرد در مهندسی بافت عصب مناسب می‫دانند (7, 12).  اگرچه پروتئین MAP2 یکی از نشانگرهای اساسی در بررسی تمایز عصبی می‫باشد، اما بررسی‫های دقیق تر در سطح mRNA و پروتئین برای نشانگرهای اختصاصی دیگر مانند NF (Neurofilament) نیز پیشنهاد می‫شود.

همچنین در مطالعات بعدی استفاده از سلول‫های پیش‫ساز عصبی و پیوند داربست‫ها در مدل موش صحرایی برای مطالعات درون تنی تمایز نیز پیشنهاد می‫شود.

 

نتیجه‫گیری

با توجه به اهمیت استفاده از مواد رسانا در ساخت داربست­های مهندسی بافت عصب، در این مطالعه غشاهای نانوکامپوزیتی پلی­کاپرولاکتون/گرافن مورد بررسی قرار گرفتند. غشاهای نانوکامپوزیتی با زمینه پلی­کاپرولاکتون تقویت شده با نانوصفحه‫های گرافن با مقادیر 0-5 درصد وزنی گرافن توسط روش ریخته­گری حلالی ساخته شدند. طیف­های حاصل از طیف‫سنجی اشعه مادون قرمز و الگوی پراش اشعه ایکس برهمکنش فیزیکی بین پلیمر و ذرات نانوگرافن را نشان دادند. در آزمون هدایت سنجی نیز افزایش هدایت الکتریکی به‫ازای افزایش مقدار وزنی گرافن دیده شد. با انجام مطالعات تکمیلی روی غشاها و مقایسه خواصی همچون زاویه تماس و آزمون سمیت سلولی، با سلول­های بنیادی پالپ دندان، مشاهده شد که افزودن گرافن به پلی­کاپرولاکتون می­تواند موجب افزایش آبدوستی داربست و پاسخ سلولی مناسب­تری نسبت به پلیمر خالص شود که این مطلب توسط تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از غشاهای حاوی سلول نیز مجددا تایید شد. همچنین تمایز عصبی و مورفولوژی عصبی سلول­ها پس از گذشت دوره تمایز توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسنت و تصاویر حاصل از میکروسکوپ فلورسانس تایید شد. بنابر مطالعات انجام شده در این پژوهش، غشای نانوکامپوزیتی رسانای پلی­کاپرولاکتون/5 درصد گرافن (PCL-5%G)  برای کاربردهای مهندسی بافت عصب به‫عنوان داربست پیشنهاد می‫شود.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان این پژوهش از حمایت‫های دانشگاه اصفهان و پژوهشکده زیست فناوری پژوهشگاه رویان تشکر و قدردانی می‫کنند.

1. Bini T, Gao S, Xu X, Wang S, et al. Peripheral nerve regeneration by microbraided poly (Llactidecoglycolide) biodegradable polymer fibers. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2004; 68(2): 286-95.

2. Chang CJ, Hsu SH. The effects of low-intensity ultrasound on peripheral nerve regeneration in poly (DL-lactic acid-co-glycolic acid) conduits seeded with Schwann cells. Ultrasound in medicine & biology. 2004; 30(8): 1079-84.

3. Chen GY, Pang DP, Hwang SM, Tuan HY, et al graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and differentiation. Biomaterials. 2012; 33(2): 418-27.

4. Allen MJ, Tung VC, Kaner RB. Honeycomb carbon: a review of graphene. Chemical reviews. 2009; 110(1): 132-45.

5. Chen H, Müller MB, Gilmore KJ, Wallace GG, et al. Mechanically strong, electrically conductive, and biocompatible graphene paper. Advanced Materials. 2008; 20(18): 3557-61.

6. Jorge IRD, Bimeng Z, Daniel R, Zhi-dong S, et al. High throughput miniature drug-screening platform using bioprinting technology. Biofabrication. 2012; 4(3): 035001.

7. Masaeli E, Wieringa PA, Morshed M, Nasr-Esfahani MH, et al. Peptide functionalized polyhydroxyalkanoate nanofibrous scaffolds enhance Schwann cells activity. Nanomedicine: nanotechnology, biology and medicine. 2014; 10(7): 1559-69.

8. Sayyar S, Murray E, Thompson BC, Gambhir S, et al. Covalently linked biocompatible graphene/polycaprolactone composites for tissue engineering. Carbon. 2013; 52(29): 304-6.

9. Rosa V, Xie H, Dubey N, Madanagopal TT, et al. Graphene oxide-based substrate: physical and surface characterization, cytocompatibility and differentiation potential of dental pulp stem cells. Dental Materials. 2016;32(8):1025-19.

10. Zhang J, Lian M, Cao P, Bao G, et al. Effects of nerve growth factor and basic fibroblast growth factor promote human dental pulp stem cells to neural differentiation. Neurochemical research. 2017; 42(4): 1015-25.

11. Flores-Cedillo M, Alvarado-Estrada K, Pozos-Guillén A, Murguía-Ibarra J , et al. Multiwallcarbon anotubes/polycaprolactone scaffolds seeded with human dental pulp stem cells for bone tissue regeneration.

 

Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2016; 27(2): 35.

12. Masaeli E, Morshed M, Nasr-Esfahani MH, Sadri S, et al. Fabrication, characterization and cellular compatibility of poly (hydroxy alkanoate) composite nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. PloS one. 2013; 8(2): e57157.

13. Akhavan O. Graphene scaffolds in progressive nanotechnology/stem cell-based tissue engineering of the nervous system. Journal of Materials Chemistry B. 2016; 4(19): 3169-90.

14. Li N, Zhang Q, Gao S, Song Q, et al. Three-dimensional graphene foam as a biocompatible and conductive scaffold for neural stem cells. Scientific reports. 2013; 3: 1604.

15. Shah S, Yin PT, Uehara TM, Chueng STD. Guiding Stem Cell Differentiation into Oligodendrocytes Using Graphene Nanofiber Hybrid Scaffolds. Advanced materials. 2014; 26(22): 3673-80.

16. Shin SR, Li Y-C, Jang HL, Khoshakhlagh P, et al. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced drug delivery reviews. 2016; 1(74): 255-74.

17. Bressan E, Ferroni L, Gardin C, Sbricoli L, et al. Graphene based scaffolds effects on stem cells commitment. Journal of translational medicine. 2014; 12(1): 296.

18. Wan C, Chen B. Reinforcement and interphase of polymer/graphene oxide nanocomposites. Journal of Materials Chemistry. 2012; 22(8): 3637-46.

19. Arima Y, Iwata H. Effect of wettability and surface functional groups on protein adsorption and cell adhesion using well-defined mixed self-assembled monolayers. Biomaterials. 2007; 28(20): 3074-82.

20. Yoo BM, Shin HJ, Yoon HW, Park HB. Graphene and graphene oxide and their uses in barrier polymers. Journal of Applied Polymer Science. 2014; 131(1): 39628–39650.

21. Wang Y, Lee WC, Manga KK, Ang PK, et al. Fluorinated graphene for promoting neuroinduction of stem cells. Advanced Materials. 2012; 24(31): 4285-90.

22. Park SY, Park J, Sim SH, Sung MG, et al. Enhanced differentiation of human neural stem cells into neurons on graphene. Advanced Materials. 2011;23(36):H263-H7.

23. Li N, Zhang X, Song Q, Su R, Zhang Q, Kong T, et al. The promotion of neurite sprouting and outgrowth of mouse hippocampal cells in culture by graphene substrates. Biomaterials.  2011; 32(35): 9374-82.

24. Tang M, Song Q, Li N, Jiang Z, et al. Enhancement of electrical signaling in neural networks on graphene films. Biomaterials. 2013; 34(27): 6402-11.

25. Akhavan O, Ghaderi E, Abouei E, Hatamie S, et al. Accelerated differentiation of neural stem cells into neurons on ginseng-reduced graphene oxide sheets. Carbon. 2014; 66: 395-406.

26. Masaeli E, Morshed M, Rasekhian P, Karbasi S, et al. Does the tissue engineering architecture of poly (3‐hydroxybutyrate) scaffold affects cell–material interactions? Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2012; 100(7): 1907-18.

27. Ghasemi Mobarakeh L, Prabhakaran MP, Morshed M, Nasr Esfahani MH, et al. Application of conductive polymers, scaffolds and electrical stimulation for nerve tissue engineering. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2011; 5(4): e17-e35.

28. Wang K, Fishman HA, Dai H, Harris JS. Neural stimulation with a carbon nanotube microelectrode array. Nano letters. 2006; 6(9):2043-8.