تاثیر سیلیمارین و لیتیم کلراید بر تمامیت DNA اسپرم اپی‫دیدیمی قوچ نژاد فراهانی‬‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران

2 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی ، دانشگاه اراک، اراک، ایران

چکیده

هدف: این مطالعه با هدف بررسی اثر لیتیوم کلراید و سیلیمارین بر تمامیتDNA و هسته اسپرم اپی‫دیدیمی قوچ نژاد فراهانی انجام شد.
مواد و روش­ها: در این مطالعه، بیضه­های قوچ نژاد فراهانی پس از ذبح در کشتارگاه اراک به‫صورت روزانه به آزمایشگاه منتقل و پس از چند برش در ناحیه اپی‫دیدیم بیضه­ها، با استفاده از محیط کشت Ham,s Flo  داخل لوله­های فالکون، اسپرم­ شسته و جمع­آوری شد. سپس اسپرم‫های­ جمع­آوری شده به چهار گروه تقسیم شدند: 1- اسپرم‫های لحظه در زمان صفر 2- اسپرم‫های انکوبه شده به‫مدت 180 دقیقه (کنترل) 3- اسپرم‫های تیمار شده با لیتیوم کلراید به‫مدت 180 دقیقه 4- اسپرم تیمار شده با کلرید لیتیم به‫همراه سیلیمارین به‫مدت 180 دقیقه. تمامیت DNA به‫وسیله رنگ­آمیزی آکریدین اورنژ و تست Sperm chromatin dispersion (SCD) و ساختار مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم به‫وسیله رنگ­آمیزی دیف‫کوییک مورد ارزیابی قرار گرفت. داده­ها از طریق آنالیز واریانس یک‫طرفه بررسی و مقایسه­ی میانگین­ها با آزمون توکی انجام شد.
نتایج: آپوپتوزیس در هسته اسپرم و درصد شکست  DNAدر گروه تیمار شده با لیتیوم کلراید نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‫داری را نشان داد. در گروه سیلیمارین+لیتیوم کلراید، سیلیمارین توانست این تغییرات را به‫طور معنی‫داری نسبت به گروه لیتیوم کلراید جبران نماید.
نتیجه‌گیری: استفاده از سلیمارین با آثار آنتی اکسیدانتی توانست سبب ممانعت از اثرات منفی لیتیوم بر شکست DNA و آپوپتوزیس هسته اسپرم شود.
 

کلیدواژه‌ها


-

مقدمه

سلامت ژنتیکی اسپرم برای لقاح و تکامل جنین ضروری است. مطالعات بسیاری، آسیب DNA در اسپرم را بررسی و ارتباط آن را با ناباروری گزارش نموده­اند، آسیب DNA اسپرم را می­توان به‫طور مستقیم توسط تکنیک­های Comet (The single cell gel electrophoresis assay) ، TUNEL(Terminal deoxynucleotidyltransferaseduTPnicklabeling) و یا   (Sperm Chromatin Dispersion)  SCD که در آن‫ها شکست DNA اندازه­گیری می‫شود و همچنین با کروماتوگرافی مایع که به‫وسیله آن سطوح اکسیداسیون DNA اندازه‌گیری می­شود مورد بررسی قرار داد (1) تنش اکسیداتیو شرایطی همراه با افزایش رادیکال­های آزاد می­باشد که منجر به تخریب سلول می­شود  و توسط اکسیژن و اکسیدانت­های مشتق شده از آن تحریک می­شود (2). اسپرم­ طی فرآیند متابولیسم، رادیکال آزاد تولید می‌کنند. با وجود آن­که سطح پایین ROS(Reactive oxygen species) تاثیر فراوانی در عملکرد اسپرم دارد، زمانی‫که این مقدار از حد فیزیولوژیک خود بیشتر شود نه تنها برای سلول مفید نخواهد بود، بلکه می­تواند آثار زیان باری برای اسپرم به‫دنبال داشته باشد. آنچه باعث می­شود سطح رادیکال‫های آزاد در مایع منی انزال شده در حد متعادل باقی بماند آنتی­اکسیدانت­های درون و برون سلولی هستند که در منی یافت می­شوند (3).

در ساختمان مولکول DNA اسپرم، رادیکال­های آزاد می­توانند موجب اکسیداسیون بازهای پورین و پیریمیدین، ایجاد شکستگی در یک یا دو رشته، ایجاد جایگاه­های بدون باز، تشکیل پل­های عرضی بین DNA و پروتئین و تغییر در قند دزاکسی ریبوز شوند، رادیکال­های آزاد قادر هستند که مولکول­های زیستی حیاتی از جمله DNA را مورد حمله اکسیداتیو قرار داده و تغییراتی در ساختمان   DNAایجاد نمایند، که این تغییرات در DNA اسپرم می­تواند موجب ناباروری شود. عدم تنظیم و تعادل بین اکسیدانت و آنتی‫اکسیدانت منجر به تنش اکسیداتیو و آسیب به بخش ژنومی و هسته اسپرم می­شود (4 و 5).

مقدار دوز درمانی مشتقات لیتیوم بسیار کم است و با افزایش اندکی در میزان مصرف آن، موجب مسمومیت و القا تنش اکسیداتیو می­شود و کاهش مختصری در دوز موجب کاهش چشمگیر اثرات درمانی آن می­شود (6). لیتیوم باعث کاهش تحرک اسپرم انسان در شرایط in vitro می‌شود (7).

سیلیمارین یک ترکیب فلاونوئیدی است که از گیاه خارمریم (Silybum marianum) استخراج می‏شود. سیلیمارین از لیپوپروکسیداسیون و آسیب غشای سلولی جلوگیری می­کند (8). سیلیمارین با اثرات مهم ضداکسیداتیو از طریق کاهش اکسیداسیون گلوتاتیون و افزایش سطح آن و نیز اثر بر آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز (SOD) به‫عنوان یک پاک کننده رادیکال­های آزاد (9) عمل می­کند. همچنین سیلیمارین موجب مهار آسیب‌های وارده بر DNA از طریق پراکسید و آنیون­های سوپراکسید می‌شود (10).

مصرف سیلیمارین در موش‌های صحرایی که بیضه‌ آن‫ها با ماده داکسی روبیسین مسموم شده بود، سبب حفظ تعداد اسپرم در سطح طبیعی، تولید روزانه اسپرم، سطح تستوسترون و اسپرماتوژنز در مقایسه با گروه شاهد مثبت شد (11).

از آن­جا‫که لیتیوم، دارویی بسیار پرمصرف در روانپزشکی است و با توجه به کثرت بیماران مصرف­کننده این دارو و خطر زیاد بروز عوارض تولیدمثلی ناشی از آن و به‫خصوص با توجه به اثرات مخرب لیتیوم بر دستگاه تناسلی و به‫ویژه اسپرم و نقش آنتی­اکسیدانت سیلیمارین، و با توجه به این‫که تاکنون مطالعه­ای که در آن تاثیر هم­زمان سیلیمارین و لیتیوم را بر DNA  و قطر هسته اسپرم قوچ در محیط برون تنی نشان دهد صورت نگرفته است، این پژوهش با هدف بررسی اثر آنتی­اکسیدانتی سیلیمارین بر مهار اثرات مخرب لیتیوم بر DNA و قطر هسته اسپرم قوچ فراهانی صورت گرفته است.

 

مواد و روش‫ها

این پژوهش با همکاری گروه علوم دامی و گروه زیست‫شناسی دانشگاه اراک صورت گرفت. به‫منظور انجام این تحقیق، سی و چهار عدد از بیضه­های مربوط به قوچ نژاد فراهانی (با سن4-6 سال) بلافاصله پس از کشتار در کشتارگاه اراک، در مجاورت یخ به آزمایشگاه گروه زیست‌شناسی دانشگاه اراک انتقال داده شد. پس از انتقال بیضه­ها به آزمایشگاه، اسپرم از اپی‫دیدیم استحصال شد.

نمونه­ها با استفاده از سرنگ حاوی محیط کشت 25mM HEPES+Ham’s F10،  اسپرم­ زنده استحصال شده با روشSwim up  از اسپرم­ مرده جدا شد و پس از مخلوط­سازی نمونه­های گرفته شده، به چهار گروه مختلف تقسیم شد. در هر نمونه 106×5 اسپرم وجود داشت. گروه­های آزمایشی عبارت بودند از:

گروه اول: اسپرم ­زمان صفر، گروه دوم: اسپرم­ زمان 180 دقیقه (کنترل)، گروه سوم: اسپرم تیمار شده با لیتیوم‫ کلراید به‫مدت 180 دقیقه و گروه چهارم: اسپرم تیمار شده با سیلیمارین+لیتیوم­کلراید به‫مدت 180 دقیقه. به‫منظور غلظت­یابی لیتیوم­کلراید، نمونه­های اسپرم گروه سه به‫طور مجزا در معرض غلظت­های، 2/0، 5/0 و یک میلی­مولار لیتیوم­کلراید به‫مدت 180 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. جهت غلظت­یابی سیلیمارین، از نمونه­های اسپرم گروه 4 (سیلیمارین+ لیتیوم­کلراید) استفاده گردید. بدین صورت که اسپرم­ این گروه در لوله­های مجزا، ابتدا با غلظت‌های05/0، 1/0، و 15/0 میلی­مولار سیلیمارین تیمار شده و پس از گذشت 15 دقیقه، غلظت یک میلی­مولار لیتیوم­ کلراید اضافه شد. لوله­های حاوی نمونه به‫مدت 180 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد نگه‫داری شدند. سپس نمونه­های اسپرم گروه­های اشاره شده در بالا هرکدام به‫طور جداگانه به‫منظور بررسی ماده ژنتیکی اسپرم با استفاده از رنگ‌آمیزی­های ویژه هسته و ارزیابی ریخت‌شناسی اسپرم مورد استفاده قرار گرفت. از رنــــــگ آمیــــــــزی آکــــریدین اورنـــــژ به‫منظور بررسی تمامیت ساختمان دورشته­ای در مقابل تک­رشته­ای DNA و آزمون‫ SCD(Sperm Chromatin Dispersion) جهت بررسی شکست DNA اسپرم استفاده شد.

رنگ آکریدین اورنژ (Acros) 19/0 درصد در بافر سیترات فسفات با 5/2 =pH به صورت زیر تهیه شد:

100 میلی­گرم از پودر اکریدین اورنژ در 100 میلی­لیتر آب مقطر حل شد. این محلول در تاریکی و در یخچال قرار داده شد.

آکریدین اورنژ در واکنش با مولکول  DNAدو رشته‫‫ای رنگ سبز درخشان، در واکنش با مولکول DNA تک‫رشته­ای رنگ قرمز و با DNA حد واسط رنگ زرد ایجاد می­کند. در این روش رنگ‌‌آمیزی با استفاده از محیط اسیدی میزان مقاومت DNA به دناتوره شدن سنجیده می­شود و در پایان رنگ­آمیزی درصد اسپرم­ با DNA تک­ رشته­ای (قرمز رنگ)، دو رشته­ای سالم (سبز رنگ) و حالت حد­واسط (زرد رنگ) تعیین می‫شود (12).

با توجه به مکانیسم متراکم شدن بیشتر DNA در اسپرم نسبت به سلول­های سوماتیک، با استفاده از آزمونSCD می‫توان درجات متفاوتی از شکست DNA را با استفاده از بافر لیزکننده که منجر به شکسته شدن باندهای دی‫سولفید و خارج شدن پروتئین­ها می­شود، ارزیابی کرد. در این حالت حلقه‌­های DNA خارج شده و هاله­ای اطراف ساختار مرکزی هسته تشکیل می­شود. پس از تیمار با اسید در اسپرمی که دارای DNA شکسته شده است، پراکندگی حلقه‌­هایDNA به دام افتاده و بیانگر محدود شدن هاله­ها یا عدم وجود آن‫ها می­باشد که متفاوت از اسپرم­ است که فاقد شکست DNA است. اندازه هاله­ها بر اساس نوع رنگ­آمیزی، توسط میکروسکوپ نوری و یا فلورسانس بررسی می­شود. انجام این آزمون به‫ترتیب زیر انجام گرفت (1).

آزمون SCD  (Sperm chromatin dispersion): طبق روش Ferandez و همکاران (2003) مقدار 30 میکرولیتر از نمونه اسپرم را با 70 میکرولیتر از آگاروز با درجه ذوب پایین در دمای 37 درجه سانتی‫گراد مخلوط شد. سپس این نمونه روی لامی که قبلا با آگاروز 65 درصد پوشانده شده بود قرار گرفت و با گذاشتن یک لامل روی آن به‫مدت چهار دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‫گراد قرار گرفت. سپس لامل از لام جدا شد و هر لام به‫صورت افقی در محلول اسید کلریدریک 08/0 نرمال به‫مدت 7 دقیقه در دمای اتاق و در شرایط تاریکی قرار داده شد سپس به‫مدت 25 دقیقه در محلول لیزکننده تثبیت شد. شستشو با آب مقطر به‫مدت پنج  دقیقه (دو مرتبه) انجام شد و به‫مدت دو دقیقه در الکل 70، 90، 100 درصد آبگیری شد و در دمای اتاق لام‌ها خشک شدند سپس نمونه‫ها با رنگ Wright و PBS به نسبت 1:1 به‫مدت 10 دقیقه رنگ­آمیزی شدند و  مجددا با آب معمولی شستشو و سپس با میکروسکوپ بررسی میزان شکست DNA صورت گرفت که حالات‫های مختلف دیده شد:  هسته اسپرم با هاله بزرگ    Large Halo، هسته اسپرم با هاله متوسطMedium Halo، هسته اسپرم با هاله کوچکSmall Halo ، هسته اسپرم بدون هالهNO Halo ، سلول اسپرم باDNA  تجزیه شد.

در هر نمونه 200 اسپرم مشاهده و درصد شکست DNA به‫صورت حاصل جمع اسپرم‌ با هاله کوچک، بدون هاله و تجزیه ­شده بیان شد.

ارزیابی جنبه مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم

یکی از روش­های رنگ­آمیزی برای تهیه لام­های ریخت‌شناسی اسپرم با کنتراست و کیفیت بالا، رنگ آمیزی  Diff-Quickاست. در این تحقیق به‫منظور بررسی کمی تغییرات هسته­ی اسپرم­ مورد مطالعه در گروه­های مختلف از این روش رنگ‌آمیزی استفاده شد. در این رنگ­آمیزی آکروزوم اسپرم به‫رنگ صورتی، ناحیه پشت آکروزومی، قطعه میانی و دم بنفش تیره دیده می­شود (1). ابتدا نمونه­های اسپرم  Swim upشده شمارش و در لوله­های اپندورف جداگانه به‫طوری­که هر لوله حاوی 106×5 اسپرم بود وارد و به گروه­های مختلف ذکر شده تقسیم شدند (6=n برای هر گروه). با استفاده از عکس­های گرفته شده، اندازه­گیری قطر کوچک هسته اسپرم­ در گروه­های مختلف توسط نرم افزار موتیک برای تعداد 100 اسپرم انجام شد.

تهیه لیتیوم ­کلراید و  سیلیمارین: پودر لیتیوم ­کلراید با وزن مولکولی 391/42 گرم از شرکت Merck تهیه شد و  پودر سیلیمارین با وزن مولکولی 482 گرم از شرکت سیگما خریداری شد.

 

آنالیز آماری

داده­های حاصل به‫صورت میانگین ± انحراف معیار و روش آنالیـــــــز واریانس یک‫طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و برای مقایسه میانگین‌ها از تست Tueky استفاده شد. تفاوت میانگین­ها در سطح 5 درصد معنی­دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

به‫منظور بررسی تغییر ساختمانDNA  (دو­ رشته­ای در مقابل تک­ رشته‌ای)، اسپرم­ قوچ با غلظت یک میلی­مولار لیتیوم­کلراید به‫مدت 180 دقیقه تیمار و سپس

 

رنگ‫آمیزی اکریدین اورنژ بر روی گسترش­های اسپرمی انجام شد. نتایج نشان داد که تیمار اسپرم­ با لیتیوم­ کلراید در مقایسه با گروه کنترل، اثری بر تغییر ساختار دو‫ رشته‫ای DNA اسپرم نداشت (شکل1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1: ساختمان دو رشته­ای DNA در اسپرم قوچ. (a) کنترل: اسپرم‫های DNA دو­ رشته­ای سالم (سبز رنگ)، (b) اسپرم‫های ­تیمار شده با لیتیوم‫ کلراید (1 میلی‫مولار به‫مدت 180 دقیقه): اسپرم‫ها با DNA دو رشته­ای سالم (سبز رنگ)، (c)کنترل مثبت: اسپرم‫ها با DNA تک ­رشته‌ای (قرمز رنگ). بزرگنمایی: ×1000.

 

 

جهت بررسی درجات متفاوتی از شکست DNA از آزمونSCD استفاده شد. نتایج نشان داد که درصد شکست DNA در گروه تیمار شده با لیتیوم­ کلراید (یک میلی­مولار، 180 دقیقه) نسبت به گروه کنترل به‫طور معنی­داری (01/0>p) افزایش یافت. از طرفی در گروه سیلیمارین (1/0 میلی­مولار)+ لیتیوم­ کلراید (یک میلی‫مولار، 180 دقیقه) نسبت به گروه لیتیوم ­کلراید (یک

 

 

میلی­مولار، 180 دقیقه) کاهش معنی­داری (01/0>p) در درصد شکست DNA مشاهده شد، به‫طوری‫که درصد شکستگی DNA در گروه فوق در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معنی­داری نداشت. بنابراین سیلیمارین توانست شکستگی DNA اسپرم ناشی از لیتیوم­ کلراید را به‫طور معنی­داری (01/0>p) جبران و نزدیک به سطح کنترل نماید (شکل 1و نمودار1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: بررسی شکست DNA در اسپرم‫های قوچ با استفاده از تست SCD.  (aاسپرم­های گروه کنترل (180 دقیقه): تشکیل هاله (عدم شکستگیDNA)، (b اسپرم­های تیمار شده با لیتیوم ­کلراید (1 میلی مولار به‫مدت 180 دقیقه): عدم تشکیل هاله بیانگر شکستگیDNA، (c اسپرم‫های تیمارشده با سیلیمارین (1/0 میلی­مولار)+ لیتیوم­کلراید (1 میلی­مولار) : تشکیل هاله در اکثریت بیانگر عدم شکستگیDNA. بزرگنمایی: ×1000.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: بررسی شکست DNA اسپرم قوچ به‫کمک تست SCD. درصد شکستگیDNA اسپرم در گروه تیمار شده با لیتیوم ­کلراید (غلظت 1 میلی­مولار،180 دقیقه) نسبت به گروه کنترل (غلظت صفر) به‫طور معنی­داری (01/0>p) افزایش یافت. کاربرد مشترک سیلیمارین (1/0 میلی­مولار) و لیتیوم ­کلراید (1 میلی مولار)  توانست  اثرات مخرب لیتیوم ­کلراید را در خصوص شکست DNA،  نسبت به گروه تیمار شده بالیتیوم ­کلراید (1 میلی‫مولار) به‫طور معنی­داری جبران کند. حروف غیر مشابه بیانگر معنی­دار بودن میانگین‫ها می‫باشد. مقادیر به‫صورت میانگین±انحراف معیار ارائه شده است. آنالیز واریانس یک‫طرفه، 6 =n برای هر گروه، مرز معنی­داریp<0.05.

 

 

 

 

به‫منظور بررسی جنبه مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم از رنگ­آمیزی Diff-Quick و سپس اندازه­گیری قطر هسته اسپرم استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که قطر هسته اسپرم در گروه مورد تیمار با لیتیوم ­کلراید (یک میلی­مولار، 180دقیقه) نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری (05/0>p) داشته است. در حالی­که در گروه تیمار با سیلیمارین (1/0 میلی­مولار)+ لیتیوم­ کلراید (یک میلی­مولار) افزایش معنی­داری (05/0>p) در قطر هسته اسپرم مشاهده شد. بنابراین سیلیمارین توانست کاهش در قطر هسته اسپرم توسط لیتیوم­ کلراید را جبران نماید (نمودار 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: اندازه­گیری قطر هسته اسپرم‫های قوچ مورد تیمار با لیتیوم ­کلراید و سیلیمارین به‫کمک رنگ­آمیزیDiff-Quick. تیمار اسپرم­ها به‫مدت 180 دقیقه با لیتیوم ­کلراید (1 میلی­مولار) موجب کاهش معنی­داری در قطر هسته اسپرم نسبت به گروه کنترل شد. از طرفی تیمار با سیلیمارین (1/0 میلی‫مولار)+ لیتیوم­کلراید (1 میلی­مولار) به‫مدت 180 دقیقه، قطر هسته اسپرم را نسبت به اسپرم­های گروه لیتیوم ­کلراید (1 میلی­مولار) به‫طور معنی­داری افزایش داد. حروف غیر مشابه بیانگر معنی­دار بودن میانگین‫ها می‫باشد. مقادیر به‫صورت میانگین± انحراف معیار ارائه شده است. آنالیز واریانس  یک‫طرفه، 6n=،  p<0.05

 

 

بحث

نتایج بسیاری از مطالعات قابلیت آسیب DNA توسط لیتیوم­ کلراید را نشان می­دهد (13 و 14 و 15). لیتیوم­کلراید باعث آسیب کروموزومی می­شود ولی با این وجود به‫عنوان یک موتاژن بسیار ضعیف عمل می‫کند. پیشنهاد شده که لیتیوم­ کلراید با ایجاد ممانعت از بازسازیDNA، آسیب به DNA را گسترش می­دهد (16). برخی مطالعات نشان داده است که لیتیوم­کلراید مانع از بازسازی کل ژنوم، بازسازی مرتبط با رونویسی و در نتیجه تعمیر DNA می­شود که این امر توسط جلوگیری مستقیم یک یا تعدادی از آنزیم­های خاص صورت نمی­گیرد بلکه بیشتر از طریق سازوکارهای غیرمستقیم مثل تغییر در بیان ژن، تغییرات بعد از ترجمه و یا تغییر در انتقال فرسته اثر خود را اعمال می­کند (17).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که لیتیوم­ کلراید بر ساختمان دو­ رشته­ای DNA (تغییر ساختارDNA) بی­تاثیر بود. تاکنون مطالعه­ای در این خصوص صورت نگرفته است با این حال در پژوهش حاضر علت عدم ‌تاثیر لیتیوم ­کلراید بر ساختمان دو رشته­ای DNA می­تواند ناشی از عوامل زیر باشد:DNA  اسپرم به‫دلیل فشردگی در مقابل آسیب ناشی از لیتیوم‫ کلراید مقاوم باشد و یا ناشی از عدم تاثیر مدت زمان 180 دقیقه برای اعمال اثر لیتیوم­ کلراید باشد. همچنین ممکن است به‫دلیل عدم تاثیر غلظت استفاده شده جهت اعمال اثر لیتیوم­ کلراید موثر نشده باشد.

در پژوهش حاضر شکست DNA مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که لیتیوم ­کلراید با ایجاد شکست در DNA اسپرم باعث قطعه قطعه شدن DNA می­‫شود. شکستگی DNA یکی از مشخصه‫های مرگ سلولی آپوپتوزیس و نکروزیس می­باشد (18).

از آن‫جا که نقش لیتیوم در القا آپوپتوزیس و شکستگی DNA گزارش شده است (19 و20)، لذا این احتمال وجود دارد که در پژوهش حاضر لیتیوم کلراید از طریق القا آپوپتوزیس موجب شکستگی DNA اسپرم شده باشد که اثر مشابهی با سدیم آرسینات بر سلول‌های اسپرم­ انسان داشت (21). عوامل آنزیمی مختلفی می‫توانند در طی آپوپتوزیس منجر به شکستگی DNA گردند که از آن جمله می­توان به نقش DNaseها (22) و پروتئازهایی مثل کاسپازها (23) در این پدیده اشاره نمود. این احتمال وجود دارد که فعال نمودن مستقیم DNaseها توسط لیتیوم کلراید منجر به شکستگی DNA اسپرم شده باشد. علاوه بر این، لیتیوم کلراید می­تواند با القا آپوپتوزیس منجر به اختلال در سیستم غشایی میتوکندری­ها و تغییر پتانسیل غشا این اندامک شود (24) که این امر به نوبه خود منجر به آزاد شدن فاکتورهای آپوپتوژنیک از جمله AIF (Apoptosis-inducing Factor)  و اندونوکلئاز G از میتوکندری­ها شود (25). این عوامل به‫عنوان DNase محسوب می‫شوند که با ورود به هسته منجر به شکستگی DNA می­شوند (22). هم­چنین این احتمال وجود دارد که لیتیوم کلراید با فعال نمودن کاسپازها از جمله کاسپاز 3 در شکستگی DNA اسپرم نقش ایفا نموده باشد. در طی پدیده آپوپتوزیس در اثر محرک­های القاکننده مرگ، کاسپاز 3 فعال می­شود که خود منجر به شکستگی ارتباط بین CAD و ICAD(Inhibitor of CAD) می­شود. حال CAD فعال می­تواند با ورود به هسته منجر به شکستگی DNA شود.  مطالعات نشان می­دهد که گونه­های فعال اکسیژن با تاثیر بر غشای پلاسمایی و ساختار DNA اسپرم می­توانند سبب بروز آسیب‌هایی در کروماتین و DNA اسپرم شوند (26). از طرف دیگر مطالعات نشان دهنده وجود ارتباط مستقیم بین اختلال در ساختار کروماتین و کاهش کیفیت اسپرم می­باشند (22 و 27 و 28). با توجه به این نتایج، کاهش کیفیت اسپرم و ایجاد اختلال در تراکم کروماتین و شکستگی DNA اسپرم قوچ را می­توان به افزایش ROS و استرس اکسیداتیو نسبت داد. در همین راستا مطالعه‌ای وجود دارد که بیانگر آسیب­‌پذیر بودن DNA نسبت به سموم از جمله لیتیوم­ کلراید است (29) که با مطالعه حاضر هم­خوانی دارد. از آن جا که نتایج استفاده از سیلیمارین به‫عنوان آنتی‫اکسیدانت در پژوهش حاضر نشان داد که سیلیمارین قادر به جبران اثرات مخرب لیتیوم­ کلراید در خصوص شکست DNA اسپرم می‫باشد، لذا این احتمال که لیتیوم کلراید از طریق القا تنش اکسیداتیو به‫طور مستقیم یا غیرمستقیم (به‫واسطه تخریب میتوکندری­ها و آزاد شدن AIF و اندونوکلئاز G) موجب شکستگی DNA شده است، قوت می­یابد. عصاره پنیرک صحرایی توانست اثرات مخرب بیضه موش­های تیمار شده با لیتیم را کاهش دهد که با نتایج این مطالعه مطابقت دارد (30). محققین گزارش کرده­اند که موادی مانند هورمون ملاتونین هم قدرت ضداکسیدانتی و حفاظتی در مقابل اثر منفی لیتیوم بر بیضه­ها دارند (31). یکی از مشخصه­های مورفولوژیکی آپوپتوزیس متراکم شدن هسته و کروماتین می­باشد (18) .از آن‫جا که لیتیوم کلراید قادر است آپوپتوزیس را در سلول­های مختلف القا نماید (32)، با اندازه­گیری قطر هسته به بررسی جنبه مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم پرداخته شد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که لیتیوم­کلراید سبب کاهش معنی­دار قطر هسته اسپرم­ شده است. مکانیسم‌ اثر لیتیوم‌ دقیق مشخص ‌نیست‌، اما به‌‫دلیل‌ شباهت‌ یون‌ لیتیوم‌ به‌ یون‌ سدیم‌، جایگزین‌ سدیم‌ شده ‌و در ایجاد پتانسیل‌ عمل‌ در سلول‫های‌ عصبی‌ اختلال‌ ایجاد می‌کند، همچنین بر ‌عملکرد واسطه‌های‌ شیمیایی‌ عصبی‌ مثل‌نوراپی‌­نفرین‌، سروتونین‌، دوپامین‌ واستیل‌ کولین ‌و گیرنده‌های‌ آن‫ها تاثیر می‌گذارد و با کاهش‌ تولید پیام‌رسان‌ ثانویه ‌اینوزیتول ‌تری ‌فسفات‌ ایجاد پاسخ‌سلولی‌ را تضعیف‌ می‌کند (33 و 34).

عوامل القاکننده آپوپتوزیس قادر به فعال نمودن پروتئازهایی از جمله کاسپازها و کالپین­ها در سلول می­باشند (23). طی آپوپتوزیس شکل فعال این آنزیم‫ها قادر هستند پروتئین­های ماتریکس هسته از جمله لامین­ها (که تمامیت هسته را تضمین می‫نمایند) را مورد حمله قرار داده و منجر به فروپاشی ساختار هسته­ای و تغییراتی از جمله متراکم شدن هسته و کروماتین شود (29). از آن‫جا که در طی آپوپتوزیس فعال شدن این پروتئازها توسط تنش اکسیداتیو گزارش شده است (23) لذا این احتمال وجود دارد که لیتیوم کلراید با القا تنش اکسیداتیو و در نتیجه فعال نمودن پروتئازهایی از جمله کاسپازها و کالپین­ها منجر به شکستن پروتئین­های هسته­ای شده و بدین ترتیب موجب متراکم شدن هسته یا کاهش قطر هسته شده باشد. در مطالعه حاضر استفاده از سیلیمارین سبب جبران کاهش ایجاد شده در قطر هسته توسط لیتیوم کلراید گردید. با توجه به اثبات خاصیت آنتی­اکسیدانتی سیلیمارین، این احتمال وجود دارد که در پژوهش حاضر سیلیمارین به‫عنوان یک آنتی­اکسیدانت با مهار مشخصه­های مورفولوژیکی آپوپتوزیس قادر به جبران کاهش قطر هسته شده است.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان­دهنده اثرات مخرب کلرید لیتیم بر تمامیتDNA  و همچنین القا آپوپتوزیس در اسپرم‌های قوچ بود. در مطالعه حاضر استفاده از سیلیمارین سبب جبران کاهش ایجاد شده در قطر هسته و شکستگی DNA اسپرم ناشی شده از لیتیم ­کلراید شد.

 

تشکر و قدردانی

پژوهش حاضر در گروه زیست شناسی دانشگاه اراک و با حمایت مالی این دانشگاه صورت گرفته است. نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از تمامی افرادی که در این پژوهش یاری نموده‌اند، به‫عمل می­آورند.

1. Fernandez JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG. The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. Journal of Andrology. 2003; 24(1): 59-66.

2. Ecerhardt MK. Reactive Oxygen Metabolites: Chemistry and Medical Consequences. 1th Ed. New York CRC press. 2001.

3. Favier AE, Cadet J, Kalyanaraman B, Fontecave M, Pierre J. Analysis of free radicals in biological systems.  Berlin: Birkhauser verlag. 1995. 21.

4. O'Flaherty C. Redox regulation of mammalian sperm capacitation.Asian Journal of Andrology. 2015; 17(4): 583-90.

5. Liu Y, O’Flaherty C.  In vivo oxidative stress alters thiol redox status of peroxiredox in 1 and 6 and impairs rat sperm quality. Asian Journal of  Andrology. 2017; 19(1): 73–79.

6. Cade JR. Lithium salts in the treatment of Psychotic excitement. Medical Journal of Australia. 1991; 36: 349-352.

7. Raoof, NT., Pearson, RM.  Turner, P. Lithium inhibits human sperm motility in vitro Department of Clinical Pharmacology, St Bartholomew's Hospital Medical College, London EClA 7BE, British Journal of Clinical Pharmacology. 1989; 28: 715-717.

8. Jurjus AR, Khoury NN. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 2004; 50(2): 81-92.

9. Radko L, Cybulski W. Application of silymarin in human and animal medicine. Journal of Pre-Clinical and Clinical Research. 2007; 1(1): 022-026.

10. Nencini C, Giorgi G, Micheli L. Protective effect of silymarin on oxidative stress in rat brain. Phytomedicine, 2007; 14(2-3): 129-135.

11. Srinivas P, Vijaykran M, Mahes HV,  Ganes H. Evaluation of the Protective Effect of silymarin on Doxorubicin Induced chronic Testicular Toxicity in Parts. International Journal of Pharmacology and Biological Sciences. 2013; 4(1): 473-484.

12. Erenpreiss J, Bars J, Lipatnikova V, Erenpreisa J,  Zalkalns J. Comparative study of cytochemical tests for sperm chromatin integrity. Journal of  Andrology. 2001; 22 (1): 45-53.

13. Basu A, Mahata J, Gupta S, Giri AK. Genetic toxicology of a paradoxical human carcinogen, arsenic—a review. Mutation Research. 2001; 488(2): 171–194.

14. Rossman TG. Mechanism of Lithium carcinogenesis: an integrated approach. Mutat Res. . 2003;  533(1-2): 37-65.

15. Mahata J, Basu A, Ghoshal S, Sarkar JN, Roy AK, Poddar G, Nandy AK, Banerjee A, Ray K, Natarajan  AT, Nilsson R, Giri AK. Chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in individuals exposed to arsenic through drinking water in West Bengal, India.About this result. Mutation Research. 2003; 534(1-2): 133–143.

16. Raboch J, Smolik P, Soucek K, Raboch J, Krulik R.  Spermiologic finding during longterm lithium therapy. Activitas Nervosa Superior. 1981; 23: 274-275.

17. Macleod J, Swan RC, Aitken GA. Lithium: its effect on human spermatozoa, rat testicular tissue and upon rats in vivo. American Journal of Physiology. 1949; 157:177-183.

18. Shariatzadeh SM,  Malekirad, AA., Fani, A., Dezfoolian, A.  Free radicals and antioxidants. Aeezh publication. 2007; 37-38.(In Farsi).

19. Marmol F. Lithium: bipolar disorder and neurodegenerative diseases Possible cellular mechanisms of the therapeutic effects of lithium". Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 2008.  32 (8): 1761–1771.

20. Liu L, Trimarchi RJ, Navarro P, Blasco MA, Keefa D. Oxidative stress contributes to Lithium induced telomere attrition,

 

chromosome stability, and apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 2003; 278: 31998-32004.

21. Momeni HR, Bakhtiari, A., Soleimani Mehranjani, M., Abnosi MH., Eskandari, N.,  Rafeie, M. Evaluation of viability and apoptosis in human sperm treated with sodium arsenite. Journal of Cell and Tissue. 2014; 4(4): 381-388 (In Farsi).

22. Irvine DS, Twigg JP, Gordon, EL., Fulton, N., Milne, PA. DNA integrity in human spermatozoa. Journal of  Andrology. 2000; 21(4):  33-443.

23. Sanock D,  Kurpisz M. Reactive oxygen species and sperm cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 2004; 2: 12-19.

24. Shi H, Shi X, Liu KJ. Oxidative mechanism of Lithium toxicity and carcinogenesis. Molecular and Cellular Biochemistry. 2004; 250(2): 67-78.

25. Zhang HB, Lu S M, Ma CY, Wang L, Li X, Chen ZJEarly apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of  Andrology. 2008; 10(2): 227-235.

26. Saleh R, Agarwal A. Oxitative stress and male infertility. Journal of  Andrology. 2000; 23:737-52.

27. Spano M, Bonde JP, Hyollund HI, Kolstad HA. Sperm chromation damage impairs human fertility. Fertility and Sterility. 2000; 73(1): 43-50.

28. Evenson DP, Darzynkiewicz Z. Melamed MR. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 1980; 210(4474): 1131-33.

29. Sharma RK, Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology. 2000; 48(6): 835-50.

30. Saad AB, Rjeibi I, Alimi H, Ncib S, Smida A, Zouari N, Zourgui L. Lithium induced, oxidative stress and related damages in testes and heart in male rats: The protective effects of Malvasylvestris extract.  Biomedicine and Pharmacotherapy. 2017;  86: 127-135.

31. Shokri S, Kazemi M, Firouzjaei MA, Hemadi M, Moayeri A, Ganjkhani M, Nejatbakhsh R. Melatonin protects testes against lithium-pilocarpine-induced temporal lobe epilepsy in rats: a time course study. Andrologia. 2015; 47(3): 343-53.

32. Shen MR, Yang RC,  Chen SS. Effect of Lithium and haloperidol on human sperm motility in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 1992; 44(6): 534-6.

33. Odagaki Y, Koyama T, Matsubara S,  Yamashita I. Effects of lithium on the beta – adrenergic receptor adenylate cyclase system in rat cerebral cortical membranes. Japanese Journal of Pharmacology. 1991; 55(4): 407-14.

34. Prien RF, Kupfer, DJ,  Mansky PA, Small JC, Tuason VB, Voss CB, Johnson WE. Drug  therapy in the prevention  of recurrences in unipolar and biopolar affective disorders; Report of the NIMH collaborative study group comparing  lithium carbonate imipramine combination. Archives of General Psychiatry Journal. 1947; 41: 1096-104.