هدفمند سازی بیان آنتی ژن سطحی هپاتیت ب (HBsAg) در غده های سیب زمینی با استفاده از روش بیان موقت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

چکیده

هدف: به‫منظور بررسی کارایی پیش‫بر اختصاصی غده (Patatin1)، بیان آنتی­ژن HBsAg واکسن هپاتیت ب در گیاه سیب­زمینی با استفاده از روش بیان موقت (اگرواینفیلتریشن) مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش­ها: پیش‫بر اختصاصی غده (Pat1) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با روش واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) از گیاه سیب زمینی جدا شد. این پیش‫بر در بالادست ژن بهینه­سازی شده سنتزی HBsAg در ناقل دوگانه pBI121 همسانه­سازی شد. به‫منظور مقایسه کارایی پیش‫بر اختصاصی Pat1، ژن HBsAg تحت کنترل پیش‫بر دایمی CaMV35S هم قرار داده شد. سازه­های تهیه شده پس از انتقال به اگروباکتریوم با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن به غده­ها و برگ­های گیاه سیب­زمینی انتقال یافتند. بیان موقت آنتی­ژن HBsAg با استفاده از روش الایزا اندازه­گیری شد.  
نتایج: بررسی بیان آنتی­ژن HBsAg در برگ­ها و غده­های گیاه سیب­زمینی نشان داد که پیش‫بر Pat1 به‫طور اختصاصی باعث بیان بالای آن در بافت­های غده­ای می­شود. بیان اندک این آنتی­ژن تحت کنترل پیش‫بر Pat1 در بافت­های برگی هم گزارش شده و می­تواند تاحدی به عوامل القا­کننده در محیط تلقیح بستگی داشته باشند. در حالی‫که بیان آنتی­ژن تحت پیش‫بر دایمی CaMV35S در تمامی بافت­های برگی و غده­ای اتفاق می­افتد. همچنین نتایج حاصل نشان داد که ژن HBsAg بهینه­شده کدنی برای گیاه سیب­زمینی به‫خوبی عمل کرده و آنتی­ژن مربوط را بیان می­کند.
نتیجه­گیری: نتایج این پژوهش نشان می­دهد که از پیشبر اختصاصی غده سیب­زمینی Pat1 همسانه­سازی شده می­توان به‫طور موثری برای بیان دایمی آنتی­ژن سنتزی بهینه­سازی شده کدنی HBsAg در گیاهان تراریخت سیب­زمینی استفاده کرد.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

در طی 20 سال گذشته سیستم­های بیانی مبتنی بر گیاهان تراریخت به‫عنوان یک سیستم  جایگزین ارزان، ایمن و موثر  برای تولید مقادیر بالای پروتئین­های نوترکیب توجه فراوانی را به خود جلب کرده­اند (1و 2). پیش بینی شده است که این سیستم بتواند جایگزین سیستم­های موجود مبتنی بر میکروارگانیسم­ها، کشت سلول­های حیوانی و یا حیوانات تراریخت شود (3 و 4). بنابراین، گیاهان می­توانند به‫عنوان بیوراکتوری برای تولید انواع پروتئین­های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرند (5 و 6). امروزه برخی از آنزیم­ها و پروتئین­های نوترکیب تولید شده در گیاهان به مرحله تجاری رسیده­اند که از آن جمله می­توان به کلاژن نوع 1 انسانی تولید شده در توتون (7)، تریپسین گاوی تولید شده در ذرت (TrypZean, Sigma-Aldrich) (5)، لیزوزیم و لاکتوفرین انسانی تولید شده در برنج (8 و 9) و .... اشاره کرد (5).

امروزه تولید واکسن های خوراکی در  سیستم­های تولید مبتنی بر گیاهان اهمیت پیدا کرده است (2 و 10-15). بیان آنتی­ژن‫ها در بافت­های گیاهی به‫عنوان جایگزین مهمی برای برآوردن نیازهای جهانی به واکسن­های ارزان‫تر، ایمن­تر و با کیفیت­تر مطرح شده­اند. تعداد زیادی واکسن مبتنی بر گیاهان تولید شده­اند که برخی از آن‫ها در مراحل آزمایش­های بالینی قرار دارند. به‫منظور تولید واکسن­های نوترکیب خوراکی در گیاهان انتخاب گیاه میزبان و نوع پیش‫بر برای بیان کارآمد آنتی­ژن در گیاهان از اهمیت زیادی برخوردار است (6). در بین گیاهانی که به‫عنوان بیوراکتور برای تولید واکسن­های خوراکی مورد استفاده قرار گرفته­اند می­توان به توتون، سیب زمینی، گوجه فرنگی، ذرت، برنج، موز، سیب، کاهو و... اشاره نمود. با استفاده از روش­های مهندسی ژنتیک از این گیاهان برای تولید انواع واکسن­های باکتریایی، ویروسی، انگلی و سیستم ایمنی استفاده شده است (4). در اغلب این گیاهان آنتی­ژن‫ها به‫طور هدفمند در بافت‫های خوراکی بیان شده اند. انتخاب نوع پیش‫بر در بیان هدفمند و بالای آنتی­ژن در بافت­های گیاهی از اهمیت بالایی برخوردار است (6). انتخاب پیش‫بر در میزان رونویسی و بیان تراژن موثر بوده و علاوه بر آن بر مرحله بیان، و محل بیان (نوع بافت) هم تاثیر دارد. پیش‫بر عمومی ویروس موزائیک گل کلم (CaMV35S) به دلیل قدرت بالا و بیان دایمی کاربرد زیادی در روش­های مهندسی ژنتیک دارد. اگرچه بیان بالای یک پروتئین نوترکیب از نظر اقتصادی اهمیت زیادی دارد ولی بیان پروتئین در بافت­های غیرهدف گیاهان از نظر کاربردی چندان مطلوب نیست. بنابراین انتخاب پیش‫بری با کارایی بالا و همچنین بیان هدفمند در بافت­ها می­تواند در کارایی تولید واکسن­های نوترکیب در سیستم­های گیاهی بسیار موثر باشد (16 و 17).

سیب زمینی به‫عنوان یکی از گیاهانی است که در تولید واکسن­های خوراکی مورد استفاده قرار گرفته است (3 و 5 و 18). انتخاب پیش‫بر مناسب برای بیان آنتی­ژن در غده‫های خوراکی گیاه سیب­زمینی می­تواند در تولید واکسن بسیار کارآمد باشد. پاتاتین یکی از پروتئین­های مهم ذخیره­ای در غده­های سیب­زمینی است. پیش‫بر پروتئین­های ذخیره­ای در بذرها و اندام­های تولید مثلی رویشی (مانند غده­ها) گیاهان، پیش‫برهای قدرتمندی هستند که باعث سنتز فراوان پروتئین مربوط در آن بافت یا اندام خاص می­شوند (19 و 20). ژن­های رمز کننده پروتئین پاتاتین به‫دو دسته تقسیم می­شوند: دسته اول (Class I) آن‫هایی هستند که در غده­های در حال تشکیل بیان می­شوند. بیان این دسته از ژن­های پاتاتین در برگ­ها هم توسط سوکروز القا می­شود. دسته دوم ژن‫های پاتاتین (Class II) نه تنها در غده­ها بلکه در ریشه­ها هم بیان می­شوند. بیان این دسته از ژن­ها توسط سوکروز القا نمی­شود (20). بنابراین، استفاده از پیش‫بر ژن­های پاتاتین دسته اول (Class I) می­تواند در بیان اختصاصی پروتئین­های نوترکیب در غده­ها موثر باشد.

قبل از انتقال دایمی یک تراژن به گیاه ارزیابی اجزای سازه ژنی و کارایی بیان آن می­تواند شانس موفقیت تولید گیاه تراریخت و در نتیجه تولید محصول نهایی (واکسن) را افزایش دهد. بدین منظور از روش­های مختلفی استفاده می­شود که معمول­ترین آن‫ها استفاده از بیان موقت با روش اگرواینفیلتریشن است. از این روش برای آنالیز کارکردی ژن­ها و پیش‫برهای مختلف در زمان کوتاه استفاده می­شود (21-24). اگرواینفیلتریشن روشی بسیار ساده و ارزان است و با استفاده از آن می­توان فعالیت ژن را در بافت­های گیاهان مختلف غربالگری کرد (25).

در این پژوهش کارایی پیش‫براختصاصی غده سیب زمینی (پاتاتین- Pat1) در مقایسه با پیش‫بر دایمی CaMV35S با بیان زیرواحد کوچک آنتی­ژن هپاتیت ب HBsAg  در برگ و غده­های گیاه سیب زمینی با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن مورد بررسی قرار گرفت.    

 

مواد و روش‌ها

همسانه­سازی پیشبر Pat: جهت جداسازی پیشبر اختصاصی پاتاتین (Pat1) از گیاه سیب­زمینی (رقم مارفونا)، ابتدا غده­های گیاه سیب­زمینی در شرایط گلخانه کشت شدند. از نمونه­های برگی برای استخراج DNA ژنومی با روش اصلاح شده دلاپورتا استفاده شد (26).

برای جدا کردن پیش‫بر Pat1 از DNA استخراج شده از واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) با استفاده از  آنزیمPfu­ پلیمراز و آغازگرهای اختصاصی (F-Pat1: 5′-cggaagcttgagtctagaaatcataatgtt-3′; R-Pat1: 5′- cgcggatccttttgttggtgctttgagcatataac-3′) استفاده شد. شرایط و چرخه­های PCR عبارت بودند از : دمای 94 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 دقیقه واسرشت­سازی اولیه و 35 چرخه ]  94 درجه سانتی‫گراد، 1 دقیقه، 63 درجه سانتی‫گراد، 1 دقیقه  و 72 درجه سانتی‫گراد ، 1 دقیقه[ و دمای پایانی 72 درجه سانتی‫گراد  به‫مدت 4 دقیقه. آغازگرها بر اساس توالی ژنی موجود در سایت NCBI با شماره دسترسی A0825.1 و با استفاده از نرم افزار Oligo نسخه 6 طراحی شد.

این پیش‫بر بعد از جداسازی و توالی یابی و تایید نهایی با استفاده از آنزیم­های برشی HindIII و BamHI بریده شده و جایگزین پیش‫بر CaMV35 در ناقل دوگانه pBI121 شدند. سازه حاصل pBI-Pat1-Gus نامیده شد.

سنتز توالی­ اختصاصی HBsAg برای سیب زمینی و ساخت سازه های  pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP

توالی نوکلئوتیدی آنتی‫ژن HBsAg از سایت NCBI برای سیب­زمینی با استفاده از نرم افزار OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER) بهینه­سازی کدنی شد. به‫منظور افزایش کارایی بیان ژن و هدف­گیری در شبکه اندوپلاسمی توالی قطعات KOZAK و SEKDEL به آن اضافه شد. همچنین جایگاه­های اختصاصی برای آنزیم­های BamHI و SacI در ابتدا و انتهای توالی اضافه شد (شکل 1). توالی­های طراحی شده توسط شرکت Millgene فرانسه سنتز شده و به‫صورت کلون­شده در وکتورهای pMAT  تحویل گرفته شد (شکل 1).

به‫منظور ساخت سازه­های ژنی pBI-PatHBP و pBI-35SHBP که به‫ترتیب در آن‫ها ژن بهینه­سازی شده HBsAg برای سیب­زمینی تحت کنترل پیش‫بر اختصاصی غده (Pat1) و پیش‫بر دایمی CaMV35S قرار دارند ژن  HBsAg جایگزین ژن gus در سازه­های pBI-35S-Gus (pBI121) و pBI-Pat1-Gus شد. بدین‫منظور ژن gus توسط آنزیم­های BamHI و SacI از سازه‫های فوق خارج و سپس قطعه 720 جفت بازی HBP در همان جایگاه برشی وارد شد. سازه­ها با روش هضم اختصاصی با آنزیم­های برشی و همچنین PCR تایید شدند. سازه­های نهایی با استفاده از روش انجماد- ذوب به اگروباکتریوم A. tumefacience LBA4404 منتقل شدند.

 

 

 

 

 

 

 

 

   

         
   
   

Kozak

   
   
         
   
   

BamHI

   
   

HBs-PO

 

 

gcgga tcc acc atg gaa aat att act tct gga ttt ctt gga cct ctt ctt gtt ttg caa gct gga tct ttt ttg ttg act aga atc ctt act att cca caa agt ctt gat tcg tgg tgg act tct ctt aat ttt ctt gga gga act act gtt tgt ctt gga caa aat tcg caa tct cca act tct aat cat tct cca act tct tgt cct cca act tgt cct gga tat cgt tgg atg tgt ctt cgt cgt ttt att att ttt ctt ttt att ctt ctt ctt tgt ctt att ttt ttg ttg gtt ctt ctt gat tat caa gga atg ttg cct gtt tgt cct ctt att cca gga tct tct act act agt act gga cca tgt aga act tgt act act cct gct caa gga act tct atg tat cct tct tgt tgt tgt act aaa cct tcg gat gga aat tgt act tgt att cct att cca tct tct tgg gct ttt gga aaa ttt ctt tgg gaa tgg gct tct gct cgt ttt tct tgg ctt agt ttg ctt gtt cca ttt gtt caa tgg ttt gtt gga ctt tct cct act gtt tgg ctt tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctt tat agt att ttg agt cct ttt ttg cca ctt ttg cca att ttt ttt tgt ctt tgg   gtt tat att tct gaa aaa gat gaa ctt taa gag ctc acc

 

   

         
   
   

SEKDEL

   
   
         
   
   

SacI

   
   

 

 

                                                 
 

 

 

شکل 1: توالی نوکلئوتیدی اصلاح­شده آنتی­ژن HBsAg برای گیاه سیب­زمینی (HBs-PO) (بالا) و ناقل پلاسمیدی حاوی قطعه سنتز شده (پایین)

 

 

ارزیابی بیان موقت و سنجش  آنتی ژن HBsAg

برگ­ها و غده­های گیاه سیب­زمینی به قطعات کوچک 1 سانتی­متری برش خورده و در سوسپانسیون اگروباکتریوم­ حاوی سازه­های pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP به‫طور جداگانه غوطه­ور شدند. علاوه بر محیط LB از محیط  Infection (محیط ½ MS) هم به‫عنوان محیط سوسپانسیون باکتریایی برای تیمار استفاده شد. بدین‫منظور کشت شبانه باکتریایی در محیط LB با استفاده از سانتریفوژ رسوب داده شد و سپس در حجم برابری از محیط ½ MS حل شد. به‫منظور نفوذ بهتر باکتری‫ها در نمونه­های گیاهی از دسیکاتور تحت خلا به‫مدت 15 دقیقه استفاده شد. این کار 3 بار انجام شد. نمونه­ها به ظروف پتری حاوی سه لایه کاغذ صافی استریل منتقل شده و به‫مدت 4 روز در تاریکی قرار گرفتند. 

نمونه­های تیمار شده لیوفیلایز شده و سپس در  بافر استخراج پروتئین (0.05M NaHPO4 PH 7.5, 0.15M NaCl, 1 mM EDTA, 0.3% Tween 20, and 4mM PMSF) ساییده شده و به‫مدت یک شب در4 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. نمونه­ها به‫مدت 20 دقیقه با دور 35000 سانتریفیوژ شدند. روشناور حاوی پروتئین جهت اندازه­گیری مقدار آنتی­ژن HBsAg در آزمون الایزا مورد استفاده قرار گرفت. آزمون الایزا با استفاده از کیت HBsAg ONE شرکت DIA-PRO ایتالیا و دستورالعمل مربوط انجام شد. جذب نمونه­ها با استفاده از دستگاه الایزا در طول موج 450 نانومتر اندازه‫گیری شد. مقدار تولید آنتی­ژن HBsAg براساس کنترل مثبت و منفی کیت الایزا محاسبه شد.

 

آنالیز آماری

آزمایش­ها بر پایه طرح کاملا تصادفی و  با سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم افزار SPSS صورت گرفت. همچنین مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام شد.

 

 

نتایج

یکی از مزایای سیستم بیان موقت اگرواینفیلتریشن در مقایسه با تولید گیاهان تراریخت، بیان بالای پروتئین­های نوترکیب در آنها است (27).  این امر به‫دلیل حذف "اثرات مکانی" در سیستم بیان موقت است چون در این سیستم تراژن به‫طور تصادفی وارد مناطقی از ژنوم هسته­ای که دارای فعالیت­های رونویسی نامعلومی هستند نمی­شود. زمان کوتاهتر و سطوح بالای انباشت پروتئین­های نوترکیب، سیستم بیان موقت را پلتفرمی برای تولید ترکیبات دارویی در گیاهان تبدیل کرده است. علاوه برآن سیستم­های بیان موقت روشی سریع و ارزان برای بررسی کارایی اجزای ژن‫ها به‫حساب می­آیند (27).

دستیابی به بیان بالای پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخت به‫عوامل مختلفی بستگی دارد که از آن جمله می‫توان به ترجیح کدونی، بیان پایدار و کارامد ژن خارجی و ... اشاره نمود. با این وجود، چگونگی، زمان و محل بیان ژن به‫وسیله مجموعه­ای از مکانیسم­های کنترلی تنظیم می‫شود. پیش‫برها به‫عنوان یکی از عوامل تنظیمی اصلی نقش مهمی در بیان ژن دارند. بنابراین، قبل از انتقال دایمی یک سازه ژنی به گیاهان، بررسی کارایی اجزای سازه به‫ویژه پیش‫برها و ژن هدف بسیار اهمیت دارد. در این مطالعه کارایی پیش‫بر اختصاصی غده پاتاتین و ژن اصلاح کدون شده HBsAg برای سیب­زمینی در سیستم بیان موقت مورد بررسی قرار گرفته است.

 

ساز­ه­های ژنی  

ژن­ سنتزی اصلاح شده HBsAg برای سیب زمینی با هضم توسط آنزیم­های BamHI و SacI از پلاسمیدهای pMA-T حاوی HBsAg (شکل 1) جدا شده و در جایگاه­های برشی مناسب خود در ناقل های دوگانه pBI121، pBIPat1GUS جایگزین ژن Gus شدند. به‫منظور درستی همسانه­سازی، سازه­های جدید با روش­های هضم آنزیمی و PCR با پرایمرهای اختصاصی تایید شدند (شکل 2 و 3). سازه­های جدید به‫ترتیب pBI35S-HBP و pBIPat-HBP نامیده شدند (شکل 4).

 

                                                

                           
       
       

720bp

       
       

                              

                           
       
       

970bp

       
       

                                       

                           
       
       

1900bp

       
       

                                           

                       
      
      

  4          3           2          1  

      
      

                                        

                           
       
       

800bp

       
       

                              

                           
       
       

720bp

       
       

                                       

                           
       
       

1800bp

       
       

                                       

                       
      
      

4           3                  2          1

      
      

                  

                   
     
     

الف

     
     

                

                   
     
     

ب

     
     

       

 

 

 

 

 


 

 

 

 


شکل 2: تائید سازه pBI-35S-HBT (الف) و pBI-Pat1-HBP (ب) با هضم آنزیمی. 1 (الف) و 3 (ب) نشانگر مولکولی تعیین اندازه DNA (GeneRuler DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific)، 2 (الف) و 4 (ب) هضم آنزیمی با دو آنزیم BamHI و SacI ؛ 3 (الف) و 1 (ب) هضم آنزیمی سازه با دو آنزیم HindIII و EcoRI، 4 (الف) و 2 (ب)- هضم آنزیمی با دو آنزیم HindIII و BamHI .

 

   

         
   
   

5       4          3            2            1

   
   

                 

                   
     
     

     5                4         3               2            1

     
     

                  

                   
     
     

720bp

     
     

            

 

 

 

 

 

 

شکل 3: تائید سازه­های پلاسمیدی با آزمون PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی HBsAg. 1- نشانگر مولکولی تعیین اندازه DNA (GeneRuler DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific)، 2- کنترل منفی آب، 3- کنترل مثبت (سازه pMA-T). 4- pBI-35S-HBP 5- pBI-Pat1-HBP

 

 

 

 

 

 

                       

                       
      
      

RB

      
      

                     

                       
      
      

HindIII

      
      

                                                                                           

                       
      
      

Pat1 (35S)

      
      

                         

                       
      
      

P- nos

      
      

                         

                       
      
      

nptII

      
      

                         

                       
      
      

T- nos

      
      

                                

                           
       
       

LB

       
       

                          

                           
       
       

BamHI

       
       

                          

                           
       
       

EcoRI

       
       

                                       

                           
       
       

HBP

       
       

                               

                           
       
       

T-nos

       
       

                                                                          

 

 

 

 

 


شکل 4: نقشه سازه­های pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP. RB و LB- بترتیب ناحیه سرحد مرزی راست و چب، P-nos- پیشبر نئوپالین سنتاز، nptII- ژن مقاومت به کانامایسین، T-nos- پایانبر نئوپالین سنتاز، Pat1 و 35S به‫ترتیب پیشبرPatatin و CaMV35S، HBP – توالی آنتی ژن HBsAg و HindIII، BamHI و EcoRI آنزیم­های برشی.

 


 


بیان HBsAg

سنجش میزان بیان آنتی­ژن پروتئینی HBsAg در بافت‫های برگی و غده­ای سیب زمینی نشان داد که بیان این آنتی ژن تحت کنترل پیشبر CaMV35S در همه بافت­های برگی و غده­ای اتفاق می­افتد (شکل 5) و از این جهت تفاوت معنی­داری بین بافت­های مختلف مشاهده نمی­شود. میزان بیان آنتی­ژن در بافت­های غده در دو

 

محیط تلقیح مختلف یکسان است که این وضعیت در برگ­ها هم قابل مشاهده بود. با توجه به غیر اختصاصی بودن پیش‫بر CaMV35 این نتیجه دور از انتظار نیست. پیش‫بر CaMV35S یک پیشبر دایمی است که ژن­های تحت کنترل آن در همه بافت­ها  و در همه شرایط بیان می­شوند (28).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                               

           

               
    
    

a

    
    

          

               
    
    

ab

    
    

          

               
    
    

b

    
    

          

               
    
    

ab

    
    

  

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 5: میزان بیان آنتی­ژن HBsAg تحت کنترل پیشبر CaMV35s در سازه ژنی pBI-35S-HBP با استفاده از اگرواینفیلتریشن در بافت­ها و محیط­های تلقیح مختلف. PT- غده سیب زمینی، PL- برگ سیب زمینی. AM- محیط تلقیح اگروباکتریوم، IM، محیط تلقیح آلوده­سازی. حروف متفاوت نشان­دهنده معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح اطمینان 95 درصد است.  


 

بررسی بیان آنتی­ژن واکسنی HBsAg تحت کنترل پیش‫بر اختصاصی غده پاتاتین نشان داد که این پیش‫بر باعث بیان آنتی­ژن در غده­های سیب زمینی می­شود (شکل 6). کارایی بیان این پیشبر مشابه پیشبر عمومی CaMV35S است چون میزان بیان آنتی­ژن توسط هر دو پیش‫بر حدود 3 میکروگرم/گرم وزن تر غده­ها است. همان­گونه که در شکل 6 مشاهده می­شود پیش‫بر پاتاتین با وجود اختصاصی بودن، بیان آنتی ژن HBsAg را در

 

 

برگ­های گیاهان سیب­زمینی هم القا می­نماید، هر چند میزان بیان در برگ­ها بسیارکمتر از غده­ها است. براساس گزارش­های موجود پیش‫بر پاتاتین کلاس I به‫عنوان یک پیش‫بر اختصاصی غده شناخته شده است اما در سایر اندام­های گیاه سیب زمینی مانند برگ­ها، ساقه­ها و ریشه‫ها هم تا حدی باعث بیان ژن­ها می­شود (29-31). از طرف دیگر گزارش شده است که ساکارز باعث القای پیش‫بر پاتاتین نوع I در برگ­ها می­شود (20).

 

 

                    

                   
     
     

a

     
     

                

                   
     
     

b

     
     

                

                   
     
     

c

     
     

                

                   
     
     

c

     
     

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 6: میزان بیان آنتی­ژن HBsAg تحت کنترل پیشبر Pat1 در سازه ژنی pBI-Pat1-HBP با استفاده از اگرواینفیلتریشن در بافت­ها و محیط­های تلقیح مختلف. PT- غده سیب زمینی،PL- برگ سیب زمینی، AM- محیط تلقیح اگروباکتریوم، IM، محیط تلقیح آلوده­سازی. حروف متفاوت نشان­دهنده معنی­داربودن میانگین­ها در سطح احتمال 95 درصد است. 

 

بحث

بعد از گیاه توتون، سیب­زمینی به‫عنوان یک گیاه مدل مناسب برای تولید واکسن­های خوراکی شناخته شده است (32). در سال 1995 ژن رمز کننده HBsAg تحت کنترل پیش‫بر CaMV35S به گیاهان سیب­زمینی منتقل شد که در این مطالعه میزان بیان آنتی‫ژن در ریشه­های گیاه 5-10 برابر بیش از بافت­های برگی بود. بعد از آن زیر واحدهای M و S آنتی ژن HBsAg هم به‫طور موفقیت آمیزی به سیب­زمینی انتقال یافت (33). در تحقیقی دیگر Richter و همکاران (34) توانستند با انتقال آنتی­ژن HBsAg  به گیاه سیب زمینی میزان تولید آن را به حدود 1/1 میکروگرم/گرم وزن تر غده برسانند. اخیرا  Rukavtsova و همکاران (3) هم تولید آنتی­ژن  HBsAg با استفاده پیش‫بر CaMV35S را در غده­های سیب­زمینی تراریخت تا حدود 1 میکروگرم/گرم وزن تر گزارش کرده­اند.   

پیش‫بر پاتاتین (Pat1) برای بیان هدفمند ژن سنتز اکسین (tms1) و ژن ترابرنده سوکروز OsSUT برای القای تولید غده در گیاهان سیب­زمینی به‫کار گرفته شده است (31 و 35). از این پیش‫بر برای تولید کارتنوئید (36)، تولید سرم آلبومین انسانی (37)، تولید اریتروپویتین (1)، تولید آنتی ژن HBsAg (19 و 34 و 38) و تولید واکسن اسهال (LTB) (39) در غده­های سیب­زمینی هم استفاده شده است.     

بیان آنتی­ژن HBsAg در گیاهان تراریخت سیب­زمینی تحت کنترل پیش‫برPat1 نشان داده است که مقدار این آنتی ژن از 25/0 تا حدود 1 میکروگرم/گرم وزن تر رسیده است و از این نظر مشابه پیش‫بر CaMV35S است (19).

 

نتیجهگیری

در پژوهش حاضر هم میزان بیان آنتی­ژن HBsAg در سیستم بیان موقت در گیاه سیب­زمینی حدود 32/0 میکروگرم/ گرم وزن تر گزارش شد که با توجه به روش و سیستم بیان موقت به‫کار رفته در محدوده مقدار گزارش شده توسط سایر محققان است. بدیهی است با بهینه­سازی روش انتقال موقت بتوان میزان بیان آن را افزایش داد. نتایج این پژوهش کارایی سازه ژنی در بیان هدفمند آنتی‫ژن HBsAg تحت کنترل پیش‫بر Pat1 را نشان می‫دهد. با انتقال دایمی این سازه ژنی به گیاهان سیب‫زمینی می­توان گیاهان تراریختی ایجاد کرد که قادر به تولید واکسن هپاتیت ب در خود هستند. 

 

تشکر و قدردانی

 این تحقیق در قالب پروژه شماره 7-05-05-9008 پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران انجام شد. بدین‫وسیله نویسندگان مراتب سپاس و قدردانی خود را از پژوهشگاه به‫جهت فراهم کردن امکانات و تجهیزات لازم اعلام می­دارند.

  1. Desai PN, Padh H. Expression of erythropoietin in Indian tetraploid potato variety. F1000Research 2012, 1:26 Last updated: 27 DEC. doi: 10.3410/f1000research.2012; 1(6): 26.v1
  2. Ledl K, Luthar Z. Production of vaccines for treatment of infectious diseases by transgenic plants. Acta agric Slov. 2016; 107: 191- 217.
  3. Rukavtsova EB, Rudenko NV, Puchko EN, Zakharchenko NS, et al. Study of the immunogenicity of hepatitis B surface antigen synthesized in transgenic potato plants with increased biosafety. J Biotechnol. 2015; 10(203): 84-88.
  4. Laere E, Ling APK, Wong YP, Koh RY, et al. Plant-Based Vaccines: Production and Challenges. J Bot. Volume 2016, Article ID 4928637, 11 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2016/4928637.
  5. Takeyama N, Kiyono H, Yuki Y. Plant-based vaccines for animals and humans: recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 2015; 3(5-6): 139- 154.
  6. Tiwari S, Verma PC, Singh PK, Tuli R. Plants as bioreactors for the production of vaccine antigens. Biotechnol Adv. 2009; 27(4): 449-467.
  7. Shoseyov O, Posen Y, Grynspan F. Human collagen produced in plants, More than just another molecule. Bioengineered. 2014; 5(1): 49–52.
  8. Hennegan K, Yang D, Nguyen D, Wu L, et al. Improvement of human lysozyme expression in transgenic rice grain by combining wheat (Triticum aestivum) puroindoline b and rice (Oryza sativa) Gt1 promoters and signal peptides. Transgenic Res. 2005; 14: 583–592.
  9. Yang D, Guo F, Liu B, Huang N, et al. Expression and localization of human lysozyme in the endosperm of transgenic rice. Planta. 2002; 216(4): 597–603.
 

10. Ma JK-C, Drake PMW, Christou P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nat Rev Genet. 2003; 4(10): 794-805.

11. Ma JK-C, Barros E, Bock R, Christou P, et al. Molecular farming for new drugs and vaccines. Current perspectives on the production of pharmaceuticals in transgenic plants. EMBO Rep. 2005; 6(7): 593-9.

12. Koprowski H. Vaccines and sera through plant biotechnology. Vaccine. 2005; 23(15): 1757-63.

13. Lal P, Ramachandran VG, Goyal R, Sharma R. Edible vaccines: current status and future. Ind J Med Microbiol. 2007; 25(2): 93-102.

14. Mishra N, Gupta PN, Khatri K, Goyal AK, et al. Edible vaccines: a new approach to oral immunization. Ind J Biotechnol, 2008; 7: 283-94.

15. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009; 32(2): 107-21.

16. Fischer R, Stoger E, Schillberg S, Christou P, et al. Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol. 2004; 7(2): 152-8.

17. Stoger E, Ma JK-C, Fischer R, Christou P. Sowing the seeds of success: pharmaceutical proteins from plants. Curr Opin Biotechnol. 2005; 16(2): 167-73.

18. Kumar BV, Raja TK, Wani MR, Sheikh SA, et al. Transgenic plants as green factories for vaccine production. Afr J Biotechnol. 2013; 12: 6147-6158.

19. Shulga NY, Rukavtsova EB, Krymsky MA, Borisova VN, et al. Expression and Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Potato Plants. Biochem. (Moscow), 2004; 69(10): 1158-1164.

20. Naumkina EM, Bolyakina YP, Romanov GA. Organ-Specificity and Inducibility of Patatin Class I Promoter from Potato in Transgenic Arabidopsis Plants. Russ J Plant Physiol., 2007; 54(3): 350-359.

21. Figueiredo J, Ro¨mer P, Lahaye T, Graham J, et al. Agrobacterium-mediated transient expression in citrus leaves: a rapid tool for gene expression and functional gene assay. Plant Cell Rep. 2011; 30(7): 1339–1345.

22. Bertazzon N, Raiola A, Castiglioni C, Gardiman M, et al. Transient silencing of the grapevine gene VvPGIP1 by agroinfiltration with a construct for RNA interference. Plant Cell Rep. 2012; 31(1): 133–143.

23. Hoffmann T, Kalinowski G, Schwab W. RNAi-induced silencing of gene expression in strawberry fruit (Fragaria ananassa) by agroinfiltration: a rapid assay for gene function analysis. Plant J. 2006; 48: 818–826.

24. Leckie B, Neal Stewart C. Agroinfiltration as a technique for rapid assays for evaluating candidate insect resistance transgenes in plants. Plant Cell Rep. 2011; 30(3): 325–334.

25. Faizal A, Geelen D. Agroinfiltration of intact leaves as a method for the transient and stable transformation of saponin producing Maesa lanceolata. Plant Cell Rep. 2012; 31(8): 1517-26.

26. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. A plant DNA minipreparation: version II, Plant Mol Biol Rep. 1983; 1: 19-21.

27. Chen Q, Lai H, Hurtado J, Stahnke J, et al. Agroinfiltration as an Effective and Scalable Strategy of Gene Delivery for Production of Pharmaceutical Proteins. Adv Tech Biol. Med., 2013; 1: doi:10.4172/atbm.1000103.

28. He ZM, Jiang XL, Qi Y, Luo DQ.) Assessment of the utility of the tomato fruit-specific E8 promoter for driving vaccine antigen expression. Genetica. 2008; 133: 207-214.

29. Deryabin AN, Trunova TI, Dubinina IM, Burakhanova EA, et al. Chilling tolerance of potato plants transformed with a yeast-derived invertase gene under the control of the B33 patatin. Russ J Plant Physiol. 2003; 50(4): 449–454.

30. Romanov GA, Naumkina EM, Ashapkin VV, Vanyushin BF. Methylation of GCGG sites of the patatin promoter is organspecific and inversely correlates with its activity. Dokl Biochem Biophys. 2007; 417(1): 327-330.

31. Kolachevskaya OO, Alekseeva VV, Sergeeva LI, Rukavtsova EB, et al. Expression of auxin synthesis gene tms1 under control of tuber-specific promoter enhances potato tuberization in vitro. J Integr Plant Biol. 2015; 57(9): 734-44. doi: 10.1111/jipb.12314.

32. Guan ZJ, Guo B, Huo YI, Guan ZP, et al. Overview of expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Vaccine, 2010; 28(46): 7351-7362.

33. Ehsani P, Khabiri A, Domansky NN. Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato. Gene. 1997; 190(1): 107-11.

34.Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ, Mason HS. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nat Biotechnol.2000; 18:1167-71.

35. Sun A, Dai Y, Zhang X, Li C, et al. A transgenic study on affecting potato tuber yield by expressing the rice sucrose transporter genes OsSUT5Z and OsSUT2M. J Integr Plant Biol. 2011; 53(7): 586-595.

36. Diretto G, Al-Babili S, Tavazza R, Papacchioli V, et al. Metabolic Engineering of Potato Carotenoid Content through Tuber- Specific Overexpression of a Bacterial Mini-Pathway. PLoS ONE. 2007; 2(4): e350. doi:10.1371/journal.pone.0000350.

37. Farran I, S´anchez-Serrano JJ, Medina JF, Prieto J, et al. Targeted expression of human serum albumin to potato tubers. Transgenic Res. 2002; 11(4): 337-346.

38. Joung YH, Youm JW, Jeon JH, Lee BC, et al. Expression of the hepatitis B Surface S and preS2 antigens in tubers of Solanum tuberosum. Plant Cell Rep. 2004; 22: 925-30.

39. Lauterslager TGM, Florack DEA, van derWal TJ,Molthoff JW, et al. Oral immunization of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LT-B. Vaccine. 2001; 19(17-19): 2749-55.