بررسی اثر کاتچین هیدرات بر توان زیستی، توان تکثیری و بیوشیمی سلول‫های مزانشیم مغز استخوان رت در حضور عنصر بور به‫عنوان یک ریز مغذی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی8349-8-38156

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیرکاتچین هیدرات (CH) و اسید بوریک (BA) بر سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت(MSCs) می‫باشد.
مواد و روشها:  MSCsبا CH تیمار و با تست تریپان بلو توانائی حیات آن‫ها در 12، 24، 36 ساعت بررسی شد. دوزهای 400و3200میکرومولار CH به همراه 6نانوگرم بر میلی‫لیتر BA و زمان 36 ساعت انتخاب شد. توانایی تکثیر توسط آزمون تشکیل کلونی (CFA)و دو برابر شدگی جمعیت (PDN)، مورفولوژی سلول‫ها، سطح الکترولیت­های سدیم، پتاسیم و کلسیم و فعالیت آنزیم­های LDH،ALP، AST،ALT اندازه گیری شد. میزان مالون دی-آلدئید(MDA)، آنتی­اکسیدان کل و فعالیت آنزیم­های SODوCAT نیز سنجش شد.
 نتایج: در 12 ساعت تنها غلظت 3200میکرومولار و در 24و36 ساعت از 400تا3200میکرو مولار، CHباعث کاهش توانایی زیستی شد. از طرفی دوزهای انتخابی باعث کاهش معنی‫دار  توانائی تکثیری، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم شد. تیمار با CH باعث افزایش فعالیت  LDH، ALP،AST،ALT و افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل و کاهش میزان MDA و سدیم و پتاسیم شد. BA تاثیری بر توانائی زیستی، مورفولوژی و PDN نداشت ولی باعث کاهش CFA و فعالیت LDH،AST وALT شد.  BA فعالیت ALP و میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم، میزان MDA و فعالیت CATوSOD را افزایش داد. اثر متقابل CHوBA تا حدودی باعث جبران کاهش توانائی تکثیر، توانائی زیستی، تغییرات مورفولوژیک، تغییر فعالیت آنزیم­های متابولیک و میزان الکترولیت­ها ناشی از تیمار با CH شد. از طرفی تیمار همزمان باعث شد که CH بتواند استرس اکسیداتیو حاصل از تیمار با BA را جبران نماید.
نتیجه­گیری: با توجه به جبران اثرات سمی CH توسط بور میتوان هنگام مصرف چای از  کشمش و خرما استفاده کرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کاتچین هیدرات ترکیبی فلاونوییدی با خاصیت آنتی اکسیدانت قوی موجود در چای سبز (1) می‫باشد که فرمول مولکولی و وزن مولکولی آن به‫ترتیب C15H16O7 و 27/290 گرم بر مول است. این ترکیب در دمای 6/25 درجه سانتی‫گراد به‫میزان 2/2 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر در آب و 50 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر در اتانول حل می شود. انواع کاتچین های موجود در برگ چای شامل 1- اپی کاتچینEC  2- اپی گالوکاتچین EGC 3- اپی کاتچین گالات ECG 4- اپی گالو کاتچین گالات EGCG است (2). اپی گالوکاتچین گالات از جمله مهمترین پلی فنول­های آنتی­اکسیدانتی موجود در چای سبز  است که به‫طور معمول دارای بیشترین میزان فعالیت در مقایسه با سایر آنتی اکسیدان­ها بوده و خاصیت آنتی اکسیدانتی این ماده  25 برابر ویتامین E و 100 برابر ویتامین D گزارش شده است (3). از طرفی کاتچین نیز که از منابع طبیعی بسیاری مانند برگ چای، دانه انگور و پوست و ساقه درخت آکاسیا استخراج و دارای خاصیبت آنتی اکسیدانی قوی و ضد سرطانی بواسطه القا آپوپتوزیس می‫باشد (4 و 5). یکی از مشتقات کاتچین، کاتچین هیدرات است که به‫صورت تجاری از طرف شرکت‫ها متعددی در بازار عرضه می‫شود. در مطالعه انجام توسط Ejaz Ahmad  و همکاران (6) غلظت 10 تا20 میلی‫گرم بر کیلوگرم به‫صورت روزانه به‫مدت 21 روز به رت نژاد ویستار داده شد و مشخص شد که کاتچین هیدرات به‫واسطه خاصیت آنتی­اکسیدانتی و ضدالتهابی خود در درمان بیماری آلزایمر نقش دارد. در مطالعه  Ejaz Ahmad تیمار کاتچین هیدرات موجب افزایش بیان آنزیم‌های استیل کولین ترانسفراز و نیتریک اکسید سنتتاز القائی و کاهش سطح واسطه­های التهابی نظیر IL1B ، TNF-a شد. این مطالعه مشخص کرد که کاتچین هیدرات در جلوگیری از تخریب حافظه و بهبود استرس اکسیداتیو موثر است. در مطالعه­­ی دیگری بر روی سلول‫های سرطانی MCF-7 و SiHa  مشخص شد که کاتچین هیدرات باعث القای آپوپتوزیس وابسته به کاسپاز در این سلول‫ها می‫شود (5 و 7). از طرفی تحقیقات پیشین نشان داده است که پلی فنل‫های موجود در چای سبز در تامین سلامت بافت استخوان نقش داشته و با کاهش بازجذب استخوان و افزایش تشکیل ماتریکس استخوان و در نتیجه باعث افزایش تراکم استخوان در حیوانات آزمایشگاهی شده است (8). در مطالعه Choi و  Hwang (9) نشان داده شد که کاتچین با کاهش سیتوکینهای دخیل در فعال سازی بازجذب استخوان و کاهش آپوپتوزیس در سلول‫های استئوبلاست می‫تواند از استئوپورز و ایجاد التهاب در استخوان جلوگیری نماید. با توجه به نتایج دوگانه در تحقیقات پیشین شامل القای آپوپتوزیس در سلول‫های سرطانی از طرفی و تامین سلامت بافت استخوان از طرف دیگر، ضرورت انجام تحقیقات بیشتر بر روی تاثیر کاتچین اجتناب ناپذیر است. به‫خوبی واضح است که در جامعه ایرانی چای به‫خصوص نوع سیاه آن به‫صورت روز افزون مصرف می‫شود که این مصرف می‫تواند به‫عنوان یک شمشردولبه در سلامت ما نقش بازی کند.

از طرفی عنصر بور (B) با عدد اتمی 5، تنها نافلز در میان عناصر گروه IIIA جدول تناوبی و دارای خواص بین فلز و نافلز می­باشد. بوریک اسید یک ریز مغذی ضروری برای گیاهان محسوب می­شود (10). عنصر بور به‫صورت آزاد در طبیعت وجود ندارد و ساده ترین فرم آن در حالت محلول ساختار تری هیدروکسی آن یا اسید بوریک است که یک اسید ضعیف لویس می‫باشد (11). مطالعات انجام شده توسط موحدی و آبنوسی نشان داده است که غلظت ng/ml6 اسید بوریک اثر منفی بر سلامت سلول‫های مزانشیم نداشته و باعث افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و میزان کلسیم تام و در نهایت تمایز سلول‫ها به استئوبلاست شده است (12 و 13). غذاها با منشا گیاهی نظیر خشکبار، میوه­های خشک و تازه، بقولات، سبزی­ها منبع اصلی این عنصرهستند (14). در فرهنگ ایرانی به‫صورت سنتی و برای جلوگیری از مصرف شکر،  مصرف محصولات گیاهی مانند توت و خرما به هنگام نوشیدن چای سفارش شده است که البته با توجه به بررسی‫های انجام شده دلیل علمی نیز برای آن یافت نشد. از آنجا‫که محصولات گیاهی حاوی مقادیر قابل توجهی از عنصر بور بوده و چای نیز دارای مقادیر زیادی از کاتچین است. لذا با توجه به اهمیت سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (MSCs) که سلول‫های پرتوان بوده و از طریق تمایز به استئوبلاست نقش مهمی در سلامت استخوان دارند، دراین پژوهش تاثیر کاتچین هیدرات بر این سلول‫ها بررسی و همچنین تاثیر متقابل کاتچین هیدرات و بوریک اسید نیز به‫عنوان مکمل مورد مطالعه قرار می‫گیرد.

 

مواد و روش‌ها

کلیه مواد مورد استفاده در این تحقیق از شرکت  Sigma-Aldrich  تهیه شد مگر در مواردی که ذکر شده است . در این مطالعه تجربی از موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 50 روز و وزن  20 ± 140 گرم استفاده شد. حیوان مورد استفاده در این پژوهش پس از خریداری از انسیتو پاستور در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط دمایی          3 ± 27 درجه سانتی‫گراد و با دسترسی مناسب به غذا و آب در قفس­های پلی اتیلن نگه­داری شد. با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، موش­ها به‫کمک دی اتیلن اتر بیهوش شده، استخوان­های ران و ساق پای آن­ها جدا و سپس بافت­های پیوندی اطراف استخوان­ها به‫طور کامل پاک گردید. استخوان­ها در محیط کشت DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco Company) حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS)  (Gibco Company) و پنی­سیلین – استرپتومایسین (Gibco Company) در دمای 4 درجه سانتی‫گراد قرار گرفته، به زیرهود لامینار منتقل شد. دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با عمل فلاشینگ خارج و به‫داخل لوله فاکون حاوی محیط کشت کامل هدایت و سپس به‫مدت 5 دقیقه  با دور 2500 سانتریفیوژ شد. محیط رویی خارج و رسوب سلولی در پنج میلی­لیتر محیط تازه معلق شد و در فلاسک T25 کشت  و در انکوباتور CO2  دار (دمای 37 درجه سانتی‫گراد، 5 درصد CO2) انکوبه گردید. بعد از 24 ساعت محیط رویی حاوی سلول‫های غیرچسبنده خارج  و سپس به‫مدت 14 روز هر سه روز یک‫بار محیط سلول‫ها تعویض شد. زمانی‫که کف فلاسک به تراکم بالایی از سلول رسید، سلول‫ها با کمک Trypsin/EDTA (Gibco Company) از کف فلاسک جدا و به فلاسک­های جدید منتقل شدند. برای به­دست آوردن خلوص بالا از این سلول‫ها سه مرحله پاساژ تکرار شد.

سنجشتواناییزیستی: برای بررسی تاثیر کاتچین هیدرات بر توان زیستی سلول‫ها و یافتن دوز موثر، سلول‫های پاساژ سوم با تراکم 50000 سلول در پلیت 24 خانه کشت داده شدند. محیط رویی سلول‫ها خارج و محیط کامل حاوی سرم و غلظت های 0، 100، 200، 400، 800، 1600، 3200 و 6400 میکرومولار کاتچین هیدرات به چاهک های مختلف اضافه شد. سپس پلیت به انکوباتور انتقال یافت. بعد از سپری شدن 12، 24 و 36 ساعت سلول‫های چسبیده تریپسین زنی و محیط کشت حاوی سلول  به نسبت 1:1 با تریپان بلو 4/0 درصد مخلوط شد. پلیت به‫مدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شد. با استفاده از لام نئوبار سلول‫های آبی رنگ (سلول‫های مرده) و سلول‫های بی‫رنگ (سلول‫های زنده) شمارش و درصد حیات سلول‫ها محاسبه گردید.

با توجه به نتایج حاصل از آزمون تریپان بلو دو غلظت 400 و 3200 میکرو مولار از کاتچین هیدرات و با در نظر گرفتن مطالعه آبنوسی و موحدی (12) غلظت 6 نانوگرم بر میلی‫لیتر اسید بوریک انتخاب شد. در ادامه گروه های آزمایشی زیر برای آزمون‫های بعدی و زمان‫های مورد نظر طراحی شدند.

1) C (گروه کنترل)، این گروه در تمام مدت زمان تیمار تنها با محیط کشت تازه تیمار شدند.

2) BA- این گروه تنها با غلظت 6 نانوگرم بر میلی‫لیتر بوریک اسید تیمار شد.

3) CH400- این گروه با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات تیمار شد.

4)  CH3200- این گروه با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات تیمار شد.

5) CH400+BA- این گره با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات و 6 نانوگرم بر میلی‫لیتر اسید بوریک تیمارشد.

6) CH3200+BA- این گروه با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات و 6 نانوگرم بر میلی‫لیتر اسید بوریک تیمارشد.

بررسیمورفولوژی: پس از تیمار سلول‫ها، مورفولوژی هسته با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست (1میلی‫گرم در میلی‫لیتر PBS) و مورفولوژی سیتوپلاسم با استفاده از رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ )1میلی‫گرم بر میلی‫لیترPBS ( بررسی و توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus IX70-Japan)مجهز به دوربین )مدل (DP71 عکس­برداری شدند.  قطر هسته­ها و مساحت سیتوپلاسم به کمک نرم افزار موتیک (شرکت موتیک مدل 2/1)  اندازه­گیری و گزارش شد.

بررسیتوانتکثیر: در راستای بررسی توان تکثیر، توان کلونی زائی (CFA) و میزان دو برابر شدگی جمعیت (PDN) بررسی شد. برای بررسی CFA، سلول‫های پاساژ سوم با تراکم 50000 در پلیت­های تک خانه، به‫مدت 7 روز کشت شد. در پایان سلول‫ها دو بار با PBS شسته و با رنگ کریستال ویولت به­مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شد. کلونی­های تشکیل شده در گروه های فوق الذکر در زیر میکروسکوپ مشاهده و شمارش شد، همچنین قطر کلونی­ها نیز با کمک نرم افزار موتیک (شرکت موتیک مدل 2/1) اندازه­گیری شد. برای بررسی  PDN، تعداد 20 هزار سلول در پلیت تک­خانه کشت و سپس سلول‫های بر اساس گروه‫های آزمایشی در زمان­های 1، 3و 6 روز تیمار  شد. سلول‫ها تریپسینه و مورد شمارش قرار گرفتند و PDN با استفاده از فرمول،logN/N0 × 3.31   N0) تعداد سلول در آغاز کشت و Nتعداد سلول در پایان کشت) محاسبه شد.

اندازه­گیریفاکتورهایبیوشیمیایی :سلول‫های کنترل و تیمار شده پس از 36 ساعت، تریپسینه و شستشو شدند، سپس به­کمک نیتروژن مایع سائیده و پس از لیز شدن با بافر 4/7 =PH  Tris-Hcl  استخراج و در  rpm2000 به‫مدت10 دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان پروتئین موجود در محلول رویی به­کمک روش لوری و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) به­عنوان استاندارد اندازه گیری شد. کلیه اندازه‫گیری‫ها در نمونه‫های تیمار شده و کنترل بر اساس میزان پروتئین ثابت انجام شد.

برای اندازه گیری فعالیت آنزیم­های لاکتات دهیدروژناز  (LDH) کد محصول (22 14000)، آلانین ترانس آمیناز (ALT) کد محصول1400019) و آسپارتات ترانس آمیناز(AST ) کد محصول ( 1400018) از کیت­های شرکت پارس آزمون (تهران – ایران) استفاده شد. طبق پروتکل  10 میکرولیتر از نمونه را با یک میلی‫لیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England) قرائت شد.

در بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) از کیت پارس آزمون (کد محصول 140002) استفاده شد و براساس روش ارائه شده توسط شرکت تولید کننده میزان 20 میکرولیتر از نمونه با یک میلی­لیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 405 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (PG Instrument Company, England) قرائت شد. فعالیت ویژه آنزیم بر حسب واحد بر میلی­گرم پروتئین محاسبه شد.

میزان کلسیم تام سلولی با کمک کیت کلسیم شرکت پارس آزمون (کد محصول140007) اندازه­گیری شد. در این روش 20 میکرولیتر نمونه سلولی با یک میلی­لیتر محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 570 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر  Company, England) Instrument PG  (اندازه­گیری و برحسب میلی‫گرم بر دسی لیتر گزارش شد.

اندازه گیری غلظت سدیم و پتاسیم توسط دستگاه جذب شعله‫ای (Flame photometer) ساخت انگلستان مدل PFP7 انجام شد. در این روش سدیم و پتاسیم نور با طول موجهای متفاوت را ساطع می‫کنند که انتشار نور توسط فیلتر مناسب اندازه‫گیری و میزان انتشار نور متناسب با غلظت این عناصر است. با استفاده از این روش و تهیه غلظت‫های متفاوت از کلرید سدیم و کلرید پتاسیم نمودار استاندارد تهیه و با استفاده از فرمول‫های y=0.0127x+0.0053 و R2=0.996 و y=0.3169x+0.0001 و R2=0.999 به‫ترتیب غلظت‫های سدیم و پتاسیم موجود در نمونه ها محاسبه شد. در فرمول‫های فوق الذکر y میزن جذب و x غلظت الکترولیت‫ها بوده و میزان الکترولیت‫ها در نمونه‫های به‫صورت میکروگرم بر میلی‫لیتر گزارش شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): فعالیت آنزیم CAT با استفاده از روش Cakmak و Marschner اندازه­گیری شد. مقدار 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی را با 200 میکرولیتر از محلول بافر فسفات پتاسیم 25 میلی‫مولار (7=pH) و 300 میکرولیتر H2O2 (mM 10) مخلوط و در طول موج 240 نانومتر سرعت حذف 2O2H به‫مدت 2 دقیقه اندازه‫گیری شد (لازم به‫ذکر است که قبلا میزان جذب H2O2 در بافر فسفات در 4/0 تنظیم شد که نقطه شروع برای اندازه­گیری سرعت واکنش بود). میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی 1- cm 1-  mM4/39 براساس سرعت مصرف میکرومول پراکسیدهیدروژن در دقیقه بر میزان میلی‫گرم پروتئین محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD): فعالیت آنزیم SOD براساس روش Giannopolitis و همکاران (15) اندازه‫گیری شد. در این روش اندازه­گیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز براساس اثر بازدارندگی آنزیم با احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم است. مقدار 50 میکرولیتر از نمونه سلولی و 1 میلی‫لیتر از محلول واکنش (25 میلی‫مولار بافر فسفات با 6/8=pH، 12 میلی‫مولار متیونین، 75 میکرو مولار نیتروبلو تترازولیوم، 1 میلی‫مولار ریبوفلاوین، 1/0 میلی‫مولار EDTA و 50 میلی‫مولار سدیم کربنات) در لوله‫های آزمایش ریخته شد. از محلول فاقد عصاره به‫عنوان کنترل و شاهد استفاده شد. لوله­های آزمایش حاوی نمونه کنترل و نمونه­های تیماری را به‫مدت 10 دقیقه در روشنایی (نور مصنوعی در یک اتاقک) و نمونه بلانک در شرایط کاملا تاریکی قرار داده شد. برای صفر کردن دستگاه اسپکتوفتومتر از محلول بلانک که فاقد رنگ بود استفاده و سپس در طول 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument  کشور انگلستان) جذب نمونه خوانده شد و در صد فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز برای هر نمونه محاسبه شد. میزان فعالیت آنزیم در دقیقه به‫ازای میلی‫گرم پروتئین گزارش گردید.

تعیین میزان پراکسیداسیون لیپید: میزان پراکسیداسیون لیپید از روش اصلاح شده، Heath and Packer سنجیده شد. در این پژوهش سنجش مالون دی آلدهید به‫عنوان شاخص پراکسیداسیون در نظر گرفته شده است. یک میلی‫لیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد به 100 میکرولیتر نمونه اضافه شد. مخلوط به‫دست آمده به‫مدت 30 دقیقه در حرارت 100درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار داده شد و بلافاصله لوله‫ها به‫مدت 15 دقیقه در یخ خرد شده قرار گرفت و بعد به‫مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس غلظت کمپلکس تیوباربیتولیک اسید-مالون دی آلدئید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument  کشور انگلستان) در طول موج nm 523 خوانده شد. چون در طول موج 523 نانومتر بعضی از ترکیبات به‫عنوان ترکیبات مزاحم جذب دارند پس جذب محلول را در طول موج 600 نانومتر نیز خوانده و از جذب خوانده شده در طول موج 523 نانومتر کم شد. غلظت کمپلکس تیوباربیتوریک اسید-مالون دی آلدئید تشکیل شده با استفاده از ضریب خاموشی1- cm 1- mmol155 =Ԑ و فرمولbcԐ=  A (A: جذب خوانده شده، Ԑ: ضریب خاموشی، b: عرض کووت (cm1)، c: غلظت کمپلکس مالون دی آلدهید) اندازه‫گیری و برحسب میکرومول گزارش شد.

  اندازه­گیری فعالیت آنتی اکسیدانت تام (روشFRAP ): فعالیت آنتی­اکسیدانتی کل با استفاده از روشBenzie and Strain   طبق مراحل زیر تعیین شد. به‫هر لوله حاوی 150 میکرولیتر نمونه، 1700 میکرولیتر محلول FRAP (بافر سدیم استات 300 میلی‫مولار pH 3/6، محلول 10 میلی‫مولار TPTZ و محلول 20 میلی‫مولار کلرید آهن با حجم های مساوی) و 850 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. سپس لوله‫ها را به‫مدت 10 دقیقه در تاریکی در 37 درجه سانتی‫گراد قرار داده شدند. جذب نمونه‫ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت instrument  PG کشور انگلستان) در طول موج 593 نانومتر خوانده شد. برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سولفات آهن (FeSo4.7H2O)(شرکت Merk آلمان) استفاده شد. کلیه مراحل تهیه نمونه­های استاندارد مانند مراحل فوق الذکر انجام شد و به جای نمونه­های تیمار شده از غلظت‫های مختلف سولفات آهن استفاه شد. فعالیت آنتی‫اکسیدانتی نمونه­های تیمار شده پس از رسم منحنی استاندارد با استفاده از فرمول خطی y=0.0011x+0.0245 با R2=0.981 محاسبه و غلظت آنتی اکسیدانت تام بر حسب میکرو مول در میلی‫گرم پروتئین گزارش شد.

 

آنالیز آماری

آنالیز آماری داده‫ها با کمک نرم افزار SPSS (ساخت شرکت میکروسیستم آمریکا مدل 16) توسط روش آنالیز واریانس یک‫طرفه انجام و سطح معنی‫داری معادل05/0p< در نظر گرفته شد.

 

نتایج

مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها نشان داد که در طی 12 ساعت کاهش توانایی زیستی از دوز µM 3200 به بعد نسبت به گروه کنترل معنی‫دار بوده (05/0p<)، این در حالی‫است که در طی زمان 24 و 36 ساعت این کاهش از دوز Mµ400 مشاهده شده است (جدول1). برای ادامه مطالعات در جهت بررسی اثرات هم‫زمان کاتچین هیدرات و ng/ml 6 نانوگرم بر میلی‫لیتر بوریک اسید، غلظت‫های400 میکرومول  و3200 کاتچین هیدرات در طی زمان 36 ساعت انتخاب شدند. مقایسه میانگین داده‫ها نشان داد که  تیمار سلول‫ها با اسید بوریک تاثیر معنی‫داری بر توانائی زیستی سلول‫ها در مقایسه با گروه C نداشت. از طرفی نیز تیمار هم‫زمان کاتچین هیدارت و اسید بوریک نیز نتوانست مسمومیت ناشی از کاتچین هیدارت را مرتفع سازد، لذا کاتچین هیدرات در تیمارها باعث کاهش معنی­دار (05/0p<) توانائی زیستی سلول‫های MSCs نسبت به گروه C و BA شد (جدول2).   

 

 

جدول 1:مقایسه میانگین توانایی درصد زیستی سلول‫ها ی بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف کاتچین هیدرات توسط رنگ آمیزی تریپان بلو

زمان(ساعت)

دوز (µM)  

 

    12

 

        24

 

       36 

 

 

0

0.25±a95.78

0.43±a95.42

0.23±a95.14

 

100

0.22±a95.30

0.51±a94.67

0.76±ab94.13

 

200

0.26±ab94.62

0.49±ab93.07

0.31±ab92.57

 

400

0.15±ab93.64

0.45±b92.55

0.34±b91.75

 

500

0.13±ab92.59

0.24±c90.65

1.89±c88.88

 

1600

0.31±ab92.34

0.28±cd44/89

0.69±c 19/88

 

3200

0.03±b91.00

0.02±d88.51

0.15±d83.64

 

6400

0.26±c67.47

1.90±e32.41

0.35±e30.74

 

مقادیر به‫صورت SD±mean می­باشد. میانگین­ها با کد حرف­های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی­دار می­باشد (05/0p< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

جدول 2: مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول‫ها پس از تیمار 36 ساعته برطبق گروه­های فوق الذکر توسط رنگ آمیزی تریپان بلو

 

گروه ها

0.24±a95.20

C

0.22± a94.34

BA

0.26± b91.87

C400

0.50±b 92.14

C400+BA

0.91±c 83.14

C3200

63/0±d68/86

C3200+BA

مقادیر به‫صورت SD±mean می­باشد. میانگین­ها با کد حرف­های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی­دار می­باشد (05/0P< به‫عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

 

 

در مدت زمان 36 ساعت تغییرات مورفولوژیک هسته سلول‫ها در مقایسه با کنترل در گروه تیمار شده با 6 نانومولار اسید بوریک مشاهده نشد. ولی در گروه­های تیمار شده با غلظت­های 400 و3200 میکرومولار کاتچین

 

هیدرات نسبت به کنترل تغییرات مرفولوژیک شامل متراکم شدن، شکستگی و تغییر شکل هسته مشاهده شد (شکل 1). علاوه بر نتایج میکروسکوپی، آنالیز آماری داده‫ها نیز کاهش معنی‫داری (05/0p<)  به‫صورت وابسته به دوز در گروه‫های 400 و 3200 میکرومول کاتچین هیدرات نسبت به گروه­های کنترل را نشان داد. تیمار هم‫زمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک در گروه C400+BA باعث بهبود معنی‫دار (05/0P<) تغییرات ناشی از تیمار با کاتچین هیدرات شد ولی این تاثیر در رابطه با دوز 3200 میکرومول مشاهده نشد (جدول 3). رنگ آمیزی آکریدین اورنژ نیز نشان داد که شکل سیتوپلاسم در سلول‫های گروه C و BA چندوجهی و زوائد سلولی قابل تشخیص بوده و هسته­های آن­ها در موقعیت مرکزی نسبت به سیتوپلاسم قرار داشتند، درحالی‫که چروکیدگی و کوچک شدن سیتوپلاسم و گرد شدگی نسبی سلول‫ها در گروه­های تیمار شده با کاتچین هیدرات در مقایسه با کنترل قابل مشاهد بود (شکل 2). پیرو مشاهدات میکروسکوپی، آنالیز آماری داده­ها نیز کاهش معنی‫دار (05/0p<) مساحت سیتوپلاسم را درگروه­های تیمار شده با کاتچین هیدرات نسبت به گروه C و BA تایید کرد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک توانست تغییرات مورفولوژیک  سیتوپلاسم را در مقایسه با تیمار کاتچین هیدرات به تنهائی جبران کند، به‫صورتی‫که داده‫ها نسبت به گروه کنترل معنی­دار  نبود (جدول 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1 : رنگ آمیزی فلورسنت هسته سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلورسنس هوخست پس از 36 ساعت تیمار (A)کنترل (B) ng/ml6 اسید بوریک و دوزهای (C) µM 400 کاتچین هیدرات (D) µM400 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (E) µM 3200 کاتچین هیدرات (F) µM3200کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (بزرگ‫نمایی  x 200).

 

 

 

 

 

 

 


شکل 2: رنگ آمیزی سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ پس از 36 ساعت تیمار  (A)کنترل (B) ng/ml6 اسید بوریک و دوزهای (C) µM 400 کاتچین هیدرات (D) µM400 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (E) µM3200 کاتچین هیدرات (F) µM3200 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (بزرگ‫نمایی x 200).   

 

                   

میانگین­مساحت سیتوپلاسم  

میانگین قطر هسته

                    

     گروه ها

12/289± a61/1829

95/2 ± a20.59

C

34/354±a34/1780

2.08±a 77/19

BA 

48/207±b61/1510

04/2±bc53/18

400C

88/196±a43/1759

2.35±ab46/19

C400+BA

69/206±b26/1385

62/1± c18/17

3200C

63/321±ab97/1666 

2.10±bc31/18

C3200+BA

جدول3: مقایسه میانگین قطر هسته (µm) و مساحت سیتوپلاسم (µm2) سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروه‫های فوق الذکر پس از 36 ساعت تیمار

مقادیر به صورت SD±mean می­باشد. میانگین­ها با کد حرف­های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی­دار می­باشد(05/0P< به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

 

تعداد دو برابرشدگی(PDN) در روزهای 3،1 و6 روز بررسی شد. در روزهای 1، 3 و6 گروه اسید بوریک نسبت به گروه C تغییر معنی‫دار  نشان نداد (05/0p>). این درحالی است که در گروه­های تیمار شده با کاتچین هیدرات کاهش معنی‫داری (05/0p<) نسبت به گروه‫هایC  و BA دیده شد به‫طوری‫که این کاهش در گروه 3200 میکرو مول در 1، 3 و6 روز بسیار معنی‫دار (001/0p>) بود. در گروه­های تیمار هم‫زمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک، اسید بوریک توانست در همه زمان‫های تیمار اثر غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدارت را به‫صورت معنی‫دار (05/0p<) در مقایسه با تیمار فقط با کاتچین هیدرات جبران نماید. این در حالی‫است که اثر جبرانی بوریک اسید بر غلظت 3200 کاتچین هیدرات فقط در زمان کوتاه یک روز قابل جبران بود و در 3 و 6 روز میزان PDN در سلول‫های تیمار شده به‫صورت هم‫زمان با کاتچین هیدرات و بوریک اسید نسبت به گروه‫های C و BA کاهش معنی‫دار نشان داد (جدول 4).

 

    6

 

      3

 

      1

              زمان (روز)

گروه ها

0.07± a856/1

0.10±a1.248

0.12±a1.051

C

0.44±ab591/1

0.10±ab1.186

12/0±a0.977

BA

12/0±b 051/1

00/0±b903/0

15/0±ab788/0

C400

0.00± ab317/1

0.00±ab1.125

0.00±ab0.903

C400+BA

00/0± c320/0

18/0±c427/0

36/0±b 534/0

C3200

15/0± c427/0

18/0±c0.534

18/0±ab.798/0

C3200+BA

جدول4: مقایسه میانگین تعداد دو برابر شدگی جمعیت سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروه‫های فوق الذکر پس از 3،1 و 6 روز تیمار

 

 

 

 

 

مقادیر به‫صورت SD±mean میباشد. میانگین‫ها با کد حرف‫های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‫دار می باشد (05/0p< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

 

داده‫های مربوط به قطر و تعداد کلونی نشان داد که تیمار با اسید بوریک باعث کاهش معنی‫دار (05/0p<) تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط MSCs در مقایسه با گروه C شد. از طرفی نیز تیمار سلول‫ها با غلظت­های 400 و 3200 میکرو‫مول همراه با کاهش بسیار معنی‫دار (05/0p<) بود. تیمار هم‫زمان با اسیدبوریک و کاتچین هیدرات نیز نسبت به گروه‫های C و BA کاهش معنی‫دار (05/0p<) نشان داد و نتوانست جبران کاهش ناشی از تیمار با کاتچین به‫تنهائی را به‫همراه داشته باشد (جدول 5).

 

 

 

جدول5: مقایسه میانگین تعداد و قطرکلونی­های (mm) تشکیل شده توسط سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروه­های فوق الذکر پس از 7 روز تیمار

میانگین قطرکلون

میانگین تعداد کلونی

گروه ها

23/0± a 58/1

10/0±a50/122

C

09/0± b 27/1

53/3±b 51 /113

BA

11/0± c 04/1

83/2± c00/77

C400

18/0±b 24/1

24/4±d  00/95

C400+BA

00/0± d00/0

00/0± e  00/0

C3200

00/0±  d  00/0

00/0± e 00/0

C3200+BA

 

 

 

 

 

 

 

 

مقادیر به‫صورت SD±mean می‫باشد. میانگین‫ها با کد حرف‫های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‫دار می باشد (05/0P< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

 

بوریک اسید باعث افزایش معنی دار (05/0p<) فعالیت آنزیم‫های LDH و ALP نسبت به گروه C شد در حالی‫که این ترکیب شیمیائی باعث کاهش معنی‫دار (05/0p<) فعالیت آنزیم‫های ALT و AST در سلول‫های مزانشیم مغز استخوان رت شد. از طرفی تیمار سلول‫ها با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات تغییری در فعالیت این آنزیمها در مقایسه با گروه C به‫وجود نیاورد ولی غلظت 2300 میکرومولار باعث افزایش معنی‫دار فعالیت کلیه آنزیم‫های فوق الذکر شد. تیمار هم‫زمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث

کاهش معنی دار (05/0p<) میزان فعالیت آنزیم‫های LDH، AST و ALT در مقایسه با گروه‫های تیمار شده با کاتچین هیدرات به تنهائی شد البته فعالیت این آنزیم‫ها در مقایسه با گروه C نیز کاهش معنی‫دار داشت مگر در رابطه با تاثیر غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات بر فعالیت آنزیم LDH که نسبت به گروه C افزایش نشان داد (جدول6).

 

 

 

 

 

جدول6:مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیم­های آلانین ترانس آمیناز (ALT) و آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، لاکتات دهیدروژناز (LDH)، آلکالین فسفاتاز (ALP) سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروهای مختلف پس از 36 ساعت تیمار

ALT

AST

ALP

LDH

گروه ها

59/0±ac 55/6

0.32±a 67/22

9/7±a47/35

1/72  ± a1080

C

34/0±b 16/4

0.20± b73/17

4/3±b62/44

60.0±b0/740

BA

99 /0±ac 01/7

50/0±a 24/23

9/1±a61/36

6/34±ac0/1180

C400

34/0±b16/4

0.24±c80/19

08/9±b62/44

8/80± b6/846

C400+BA

6/1± c41/7

10/0±d  11/25

00/0±b06/48

3/200± c2166

C3200

34/0±ab 96/4

0.38 ±e20.78

9 /1±c23/62

1/130± d1366

C3200+BA

مقادیر به‫صورت SD±mean می باشد. میانگین ها با کد حرف های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‫دار می باشد(05/0p< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA).

 

بوریک اسید به‫تنهائی باعث افزایش معنی‫دار (05/0p<) غلظت کلسیم و سدیم و کاهش معنی‫دار (05/0p<) غلظت پتاسیم در مقایسه با گروه C شد. در گروه‫های تیمار شده با غلظت‫های 400 و 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات میزان کلسیم داخل سلولی در مقایسه با گروه C هیچ‫گونه تغییری نشان ندادند. این در حالی‫است که غلظت 3200 میکرو مولار باعث کاهش معنی دار (05/0p<) میزان سدیم و پتاسیم گردید ولی غلظت 400 میکرومولار تنها غلظت پتاسیم را کاهش داد. غلظت هم‫زمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث افزایش معنی‫دار سدیم و کاهش معنی دار پتاسیم در مقایسه با گروه Cشد (جدول 7).

 

پتاسیم (µg/dl)

سدیم (µg/dl)

کلسیم (mg/dl)

گروه ها

0.03± a0.87

0.34±a4.80

0.154±a1.354

C

0.01± b0.73

0.35±b6.95

24/0±b1.805

BA

01/0±c0.55

32/0±a21/4

09/0±a353/1

C400

0.01±c0.51

0.59±b6.17

0.03±ab1.676

C400+BA

05/0± c0.47

34/0±c62/3

13/0±a205/1

C3200

03/0± d0.37

33/0±d5.19

12/0±a1.360

C3200+BA

جدول7 -مقایسه میانگین غلظت کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی در سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروهای مختلف پس از 36 ساعت تیمار

 

 

 

 

 

 

مقادیر به‫صورت SD±mean می‫باشد. میانگین‫ها با کد حرف‫های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‫دار می‫باشد (05/0p< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

 

آنالیز آماری داده­ها نشان داد بوریک اسید باعث افزایش معنی‫دار (05/0p<) غلظت MDA و فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانتی SOD و CAT در سلول‫های مزانشیم مغز استخوان رت شد، در حالی‫که هیچ‫گونه تغییری در میزان آنتی اکسیدانت کل به‫وجود نیاورد. تیمار سلول‫های با غلظت‫های مختلف کاتچین هیدرات به‫تنهائی باعث افزایش معنی‫دار (05/0p<) میزان آنتی اکسیدانت کل گردید ولی تغییر در فعالیت آنزیم‫ها و میزان مالون دی آلدئید در مقایسه با گروه C به‫وجود نیاورد. تیمار هم‫زمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث کاهش میزان آنتی اکسیدانت کل در مقایسه با گروه‫های تیمار شده با کاتچین هیدارت به‫تنهائی شد ولی تغییر در غلظت MDA و فعالیت آنزیم‫ها آنتی اکسیدانت در مقایسه با گروه C و گروه‫های تیمار شده با کاتچین هیدرات به تنهائی به‫وجود نیاورد (جدول 8).

 

 

جدول8: مقایسه میانگین میزان آنتی­اکسیدانت کل(FRAP)، محتوی مالون دی آلدئید(MDA)، فعالیت آنزیم­های کاتالاز (CAT) و سوپراکسیددیسموتاز(SOD) سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروه‫های مختلف پس از 36 ساعت تیمار

SOD

(Unit min-1 mg-1 of protein)

CAT

(Unit min-1 mg-1 of protein)

 

MDA

)µM)    

FRAP

(µM mg-1 of protein)

گروه ها

08/0±a93/4

02/0±a56/0

01/0±a17/0

57/0±a33/14

C

05/0±b19/6

03/0±b72/0

01/0±b21/0

52/1±a33/15

BA

07/0±a65/4

02/0±a56/0

03/0±a15/0

00/1±b00/20

C400

01/0±a83/4

00/0±a58/0

01/0± ab20/0

57/0± ab67/16

C400+BA

04/0±a17/4

02/0±a59/0

02/0±c11/0

00/2±c00/26

C3200

03/0± a35/4

01/0± a62/0

01/0±a18/0

5/2± b33/21

C3200+BA

مقادیر به‫صورت SD±mean می‫باشد. میانگین‫ها با کد حرف­های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‫دار می‫باشد (05/0p< به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.

بحث

 

مطالعات زیادی در رابطه با اثر کاتچین و مشتقات آن بر روی انواع سلول‫های مختلف انجام گرفته اما در رابطه با اثر این ماده در استخوان سازی و فرآیند استئوژنز اطلاعات کافی در دسترس نیست. با توجه به اهمیت سلول‫های مزانشیم مغز استخوان در فرآیند ترمیم و بازسازی استخوان و با استناد بر مقاله  Choi و Hwang (9) مطالعه اثر کاتچین هیدرات بروی سلامت MSCs قابل بحث و بررسی است. همچنین مطالعات آبنوسی و موحدی (12 و 13) در رابطه با اسید بوریک و تاثیر آن بر روی MSCs از طرفی و حضور قابل ملاحظه عنصر بور در گیاهان از طرف دیگر، مطالعه نقش کاتچین هیدرات به‫همراه اسید بوریک بر شاخصه‫های بیوشیمیایی، مورفولوژی و توانایی حیات سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان را ضروری می‫سازد.

جدای از اثر بازداندگی رشد سلول‫های سرطانی که گزارشهای متعددی در رابطه با آن وجود دارد (5، 7، 16)، اثر آنتی اکسیدانی کاتچین هیدرات (6، 17، 18) بخوبی بررسی شده است. البته بررسی‫های انجام شده بر روی سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان در این پژوهش نشان دادند که کاتچین هیدرات با غلظت‫های تعیین شده باعث کاهش توانایی زیستی، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم می‫شود که این می تواند به‫علت اختلال در غشای سلول و القا آپوپتوزیس و فعال شدن نوکلئازها و پروتئازهای متعدد باشد که باعث متراکم شدن کروماتین و چروکیدگی سلول می­شود (19).  مطالعه صورت گرفته توسط الشتاوی نشان دادند که کاتچین هیدرات باعث القاء آپوپتوز وابسته به P53 و کاسپاز در سلول‫های سرطان پستان انسانی می­شود (16). لذا همان‫طور که قبلا متذکر شدیم احتمالا تغییر در مورفولوژی MSCs شامل تراکم کروماتین و چروکیدگی سیتوپلاسم در این پژوهش به‫دلیل بروز مرگ سلولی برنامه ریزی شده می­باشد. از طرفی کاهش توانائی زیستی نیز مشاهده شد که در مدت زمان کم با دوز زیاد و در مدت زمان زیاد با دوز کم، کاتچین هیدرات باعث کاهش این فاکتور زیستی در سلول‫های مزانشیم مغز اسخوان رت شده است. رنگ تریپان بلو قابلیت عبور از غشای سیتوپلاسم را ندارد مگر اینکه تمامیت غشای از بین رفته باشد(20)، یکی از فاکتورهایی که باعث از بین رفتن تمامیت غشا می‫شود، عدم تعادل در غلظت الکترولیت‫ها می‫باشد. در بررسی میزان الکترولیت‫ها مشخص شد که کاتچین هیدرات باعث اختلال در سطح الکترولیت‫های کلسیم، سدیم و پتاسیم می‫شود، البته باید در نظر گرفت که بوریک اسید خود نیز این اختلال را به‫وجود آورد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک نیز کاهش توانایی زیستی را نشان داد اگرچه این کاهش در تیمار هم‫زمان تا حدودی نسبت به تیمار کاتچین هیدرات به‫تنهایی مرتفع شده بود ولی دلیل بر جبران نیست و همچنان نسبت به گروه کنترل معنی‫دار بود. لذا عدم جبران کاهش توانائی زیستی ممکن است به این دلیل باشد که  بوریک اسید نتوانسته است اختلال در سطح الکترولیت‫ها را جبران نماید. در نتیجه می‫توان گفت که استفاده هم‫زمان این دو ترکیب فاقد هرگونه اثر هم افزایی یا جبران کنندگی در رابطه با توانائی زیستی است.

نتایج دوبرابر شدگی جمعیت کاهش تعداد جمعیت سلولی در 1، 3 و 6 روز، در هر دو غلظت کاتچین هیدرات نسبت به کنترل را نشان داد، البته در گروه تیمار شده با دوز 3200 میکرو مول کاهش بیشتری مشاهده شد. همچنین بررسی توانایی تشکیل کلونی نیز با نتیجه به‫دست آمده در آزمون دو برابر شدگی جمعیت سلولی هم‫راستا بود. این نتایج نشان داد که افزایش غلظت و طولانی‫تر شدن زمان تیمار اثر مسمومیت بیشتری را اعمال می­کند و توانائی حیات و توانائی تکثیری سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان تحت تاثیر کاتچین هیدرات را به‫شدت کاهش می‌دهد. کاتچین هیدرات بر توانائی تکثیر MSCs تاثیر نامطلوب دارد و این تاثیر نیز در مورفولوژی این سلول‫ها دیده شد. در بررسی تاثیر هم‫زمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید، خسارت وارد شده توسط غلظت کم کاتچین هیدرات (400 میکرومولار) توسط بوریک اسید در آزمون PDN، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم جبران شده بود ولی در رابطه با غلظت زیاد (3200 میکرومولار) اگرچه تاحدودی صدمات وارده جبران شد ولی کاملا به‫حد کنترل نرسیده بود. جبران کاهش قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم می‫تواند به این دلیل باشد که بوریک اسید باعث ممانعت از ورود کاتچین هیدرات به‫داخل سلول شده است. همان‫طور که تحقیقات پیشین اشاره می‫کند کاتچین هیدرات اثر آنتی اکسیدانتی دارد (6، 17، 18)، لذا در این تحقیق با  روشFRAP مشخص شد که در گروه‫های CH400 و CH3200  میزان آنتی اکسیدانت کل به‫صورت معنی‫دار و وابسته به غلظت افزایش داشته است. در صوتی‫که تیمار هم‫زمان اسید بوریک و کاتچین هیدرات نشان داد که میزان آنتی اکسیدانتی کل سلول کاهش معنی‫دار داشته است، که این می‫تواند به‫دلیل اختلال در ورود کاتچین هیدرات به درون سلول به‫واسطه حضور اسید بوریک باشد. همان‫طور که قبلا نیز اشاره شده است اسید بوریک یک اسید ضعیف (11) است که می‫تواند با گروه هیدروکسی در ترکیبات واکنش دهد و با تولید کمپلکس از ورود کاتچین هیدرات به‫داخل سلول جلوگیری کند.

اختلال ایجاد شده توسط کاتچین هیدرات که در توانائی تکثیر سلول‫های مزانیشم مغز استخوان (بر اساس آزمونهای PDN و CFA) به‫وجود آمد ممکن است به‫دلیل اختلال در سیکل سلولی اتفاق افتاده باشد (21). تا حدودی توانائی تکثیر سلولی توسط بوریک اسید جبران شده است به‫خصوص در رابطه با توانائی دوبرابر شدگی جمعیت سلولی که تحت تاثیر غلظت کم (400 میکرومولار) کاتچین هیدارت بود است. در مرحله S سیکل سلولی نیاز مبرم به انرژی برای سنتز بیوملکول‫های مورد نیاز در مراحل مختلف این فرآیند وجود دارد. اختلال در فرآیند تولید انرژی سلول می‫تواند باعث فقر انرژی در سلول و در نتیجه دلیل ایجاد اختلال در روند تکثیر سلولی باشد. در محیط کشت سلولی، کربوهیدرات‫ها در مرکز متابولیزم قرار دارند که در نتیجه سلول با مصرف گلوکز از طریق مسیر هوازی بخش مهمی از نیاز انرژتیک خود را تامین می‫کند. در فرایند هوازی، گلوکز در مسیر گلیکولیز به 2 مول پیروات تبدیل شده که این مولکول‫ها پس از تبدیل به استیل کوآ وارد چرخه کربس می‫شوند. در این چرخه، که در میتوکندری اتفاق می افتند، انرژی موجود در گلوکز در حمال‫های انرژی از جمله NAD+ و FAD ذخیره و از طریق زنجیره انتقال الکترون در فرآیند اکسیداسیون فسفوریلاسیون در حضور اکسیژن باعث تولید ATP مورد نیاز سلول می‫شود (22). علاوه بر تبدیل به استیل کوآ، پیروات می‫تواند به لاکتیک اسید تبدیل شود، این واکنش در حضور آنزیم لاکتات دهیدروژناز انجام می‫پذیرد که در این صورت تنها تعداد کمی ATP نسبت به مسیر هوازی تولید می‫شود (23). این تغییر در فرآیند تولید انرژی را اثر واربرگ (24) می‫نامند  که در این‫صورت میزان مصرف گلوکز از طریق مسیر غیر هوازی افزایش یافته ولی میزان تولید ATP در سلول کمتر از متابولیزم هوازی است و در نهایت سلول دچار فقر انرژی می‫شود.

در مطالعه حاضر تیمار سلول‫ها با اسید بوریک به‫تنهایی، با تایید نتایج آبنوسی و موحدی، باعث کاهش فعالیت آنزیم­های لاکتات دهیدروژناز، آلانین ترانس آمیناز و آسپارتات ترانس آمیناز شد، که این نشان‫دهنده تامین انرژی سلول از طریق مصرف گلوکز به‫واسطه متابولیزم هوازی است. نتایج تیمار سلول با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات نشان داد که فعالیت آنزیم‫های دخیل در متابولیزم سلولی مانند فعالیت آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز افزایش معنی‫داری نسبت به کنترل داشته است، این بدان معنی است که فرآیند تولید انرژی اولا از طریق بی‫هوازی انجام و اثر واربرگ به‫وجود آمده است که در نتیجه آن فقر انرژی در سلول ایجاد شده است. ثانیا با توجه به نتایج به‫دست آمده در مطالعه حاضر افزایش فعالیت آنزیم­های ترانس آمیناز سبب شده است که سلول‫ها برای تامین واسطه­های چرخه کربس و جبران کمبود انرژی، مصرف آمینواسیدها و پروتئین‫ها به‫عنوان منبع انرژی را در دستور کار خود قرار داده اند. از طرفی تاثیر متقابل کاتچین هیدرات و اسید بوریک باعث تخفیف در فرآیند بی‫هوازی و بهبود تولید انرژی با کاهش این فرآیند شده است.  نتیجه‫گیری کلی از این مطالعه نشان داد که تیمار کاتچین هیدرات کاتابولیزم سلول را هرچه بیشتر به‫سمت متابولیزم بی هوازی هدایت می­کند که علاوه بر فقر انرژی باعث مصرف اسید آمینه و پروتئین‫ها برای تولید انرژی می‫شود. این تغییرات بیوشیمیائی علاوه بر اختلال در تعادل الکترولیتی می­تواند دلیل دیگری بر تغییر در توانائی زیستی، توانائی تکثیر و تغییرات مورفولوژیک باشد.  

در این پژوهش نکته قابل تامل دیگری وجود دارد که تاثیر کاتچین هیدرات و اسید بوریک بر فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز است. کاتچین هیدرات و بوریک اسید، هر یک به‫تنهائی باعث افزایش فعالیت آنزیم ALP  شدند و اثر متقابل آنها نیز حاکی از اثر هم افزائی در فعالیت این آنزیم است. با توجه به مطالعات آبنوسی و موحدی (12 و 13) و تحقیق منتشر شده از  Choi و Hwang (9) بررسی بیشتر در این زمینه را پیشنهاد می‫نمائیم  واز ارائه تفسیر در این زمینه خود‫داری می شود.

از نکات قابل اهمیت دیگر در این پژوهش این است که اسید بوریک باعث افزایش میزان MDA و همچنین افزایش فعالیت آنزیم­های SOD و CAT در سلول‫های تیمار شده است. این امر نشان‫دهنده این واقعیت است که اسید بوریک با تولید رادیکال آزاد باعث پروکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع در سلول شده است. افزایش میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت نیز در جهت کاهش فعالیت رادیکال­های آزاد بوده است. احتمالا برخی از اختلالات ایجاد شده توسط اسید بوریک مانند کاهش معنی‫دار توان کلونی زائی یا کاهش 5 الی 15 درصدی قطر هسته، مساحت سیتوپلاسم و توانائی زیستی سلول‫ها می‫تواند به‫دلیل تولید رادیکال آزاد باشد. از طرفی تیمار سلول‫ها با کاتچین هیدرات باعث کاهش میزان تولید MDA نسبت به گروه کنترل شده است که این خود نشان دهنده­ی خاصیت آنتی­اکسیدانتی کاتچین هیدرات (25) است. تیمار هم‫زمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک باعث کاهش میزان MDA داخل سلولی نسبت به تیمار بوریک اسید به‫تنهایی شده است، به‫طوری‫که مقدار MDA به حد کنترل رسید. می­توان اینطور تفسیر کرد که اثر آنتی­اکسیدانتی کاتچین هیدرات موجب کاهش استرس اکسیداتیو تولید شده به‫وسیله­ی بوریک اسید شده و مصرف هم‫زمان این ترکیبات می­تواند اثرات منفی ناشی از عنصر بور که در محصولات گیاهی وجود دارد را مرتفع سازد. مطالعات انجام شده توسط  Yetuk و همکاران (26) و مهرا و همکاران (27) نشان داد که مصرف کاتچین باعث کاهش میزان MDA و فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی می‫شود،  این مطالعات در راستای مطالعه حاضر می­باشند.

 

نتیجه‫گیری

کاتچین هیدرات یک ترکیب فلاونوییدی موجود در چای سبز است و طبق مطالعه حاضر این ترکیب سبب کاهش توانایی حیات و توانائی تکثیر سلول‫های مزانشیم به‫دلیل تخریب غشا، تغییر در تعادل یون‫ها و انتقال متابولیزم از هوازی به بی‫هوازی می‫شود. از طرفی مصرف عنصر بور به‫صورت اسید بوریک توانست در مواردی باعث جبران صدمات سلولی ناشی از کاتچین هیدرات به‫خصوص در غلظت‫های کم آن شود. از طرفی کاتچین هیدرات نیز توانست توان آنتی­اکسیدانتی سلول را افزایش دهد و اثرات استرس اکسیداتیو ناشی از اسید بوریک را جبران نماید. لذا در راستای پیشنهادات طب سنتی مصرف چای به‫همراه محصولات گیاهی به‫خصوص خشکبارهایی مانند توت، پرده­های آلو و زرد آلو و خرما که  حاوی مقادیر بالایی از عنصر بور می‫باشند را پیشنهاد می‫کنیم. ضمنا با توجه به افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، تحقیقات بیشتر در رابطه با تاثیر اثر متقابل کاتچین هیدرات و اسید بوریک بر روند تمایز سلول‫های مزانشیم به استئوبلاست پیشنهاد می‫شود.

-

  1. Yang HY, Yang SC , Chao JC, Chen JR. Beneficial effects of catechin-rich green tea and inulin on the body composition of overweight adults.Br J Nutr. 2012; 107(5): 749-54.
  2. Lee LS, Kim SH, Kim YB, Kim YC. Quantitative Analysis of Major Constituents in Green Tea with Different Plucking Periods and Their Antioxidant Activity. Molecules. 2014; 19(7): 9173-9186.
  3. Kawase M, Wang R, Shiomi T, Saijo R, Yagi K. Antioxidative Activity of (-)-Epigallocatechin-3-(3″- O-methyl)gallate Isolated from Fresh Tea Leaf and Preliminary Results on Its Biological Activity. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2000; 64(10): 2218-2220.
  4. Zhao J, Wang J, Chen Y, et al: Anti-tumor-promoting activity of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in the mouse skin two stage initiation-promotion protocol and identification of procyanidin B5- 3’-gallate as the most effective antioxidant constituent. Carcinogenesis. 1999; 20(9): 1737-1745.
  5. Alshatwi AA. Catechin hydrate suppresses MCF-7 proliferation through TP53/Caspase- mediated apoptosis. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2010; 29: 167-175.
  6. Ejaz Ahmed M, Khan MM, Javed H, Vaibhav K, Khan A, Tabassum R, et al. Amelioration of cognitive impairment and neurodegeneration by catechin hydrate in rat model of streptozotocin-induced experimental dementia of Alzheimer’stype. Neurochemistry Int. 2013: 62(4): 492-501.
  7. Al-Hazzani, AA., Alshatwi, AA. Catechin hydrate inhibits proliferation and mediates apoptosis of SiHa human cervical cancer cells. Food Chem Toxicol. 2011; 49(12): 3281-6.
  8. Shen CL, Yeh JK, Cao JJ, Chyu MC, Wang JS. Green Tea and Bone Health: Evidence from Laboratory Studies. Pharmacol Res. 2011 August ; 64(2): 155–161.
  9. Choi EM, Hwang JK. Effects of (+)-Catechin on the Function of Osteoblastic Cells. Biol. Pharm. Bull. 2003; 26(4): 523-526.
 

10. Nielsen FH. The emergence of boron as nutritionally important throughout the life cycle.Nutrition. 2000;16(7): 512-4.

11. Mokhov AV, Kartashov PM, Gornostaeva TA, Asadulin AA, Bogatikov OA. Complex nanospherulites of zinc oxide and native amorphous boron in the Lunar regolith from Mare Crisium. Doklady Earth Sciences. 2013; 448(1): 61-63.

12.Abnosi MH, Movahedi B .Investigation of the Effect of Boron on the Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells .Journal of Cell & Tissue. 2015; 5(4): 351-360. (abstract in English).

13. Movahedi Najafabadi, BH., Abnosi, MH. Boron Induces Early Matrix Mineralization via CalciumDeposition and Elevation of Alkaline Phosphatase Activity in Differentiated Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Cell Journal(Yakhteh). 2016; 18(1): 62-73.

14. Nielsen FH. The justification for providing dietary guidance for the nutritional intake of boron. Biol Trace Elem Res. 1998; 66(1-3): 319-30.

15.Giannopolitis, C.N., Ries, S.K. Superoxide dismutase. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59: 309–314.

16.Xiang LP, Wang A, Ye JH, Zheng XQ, Polito CA, Lu JL, et al. Suppressive Effects of Tea Catechins on Breast Cancer. Nutrients. 2016; 8: 458-872.

17. Iñiguez-Franco F, Soto-Valdez H, Peralta E, Ayala-Zavala JF, Auras R, Gámez-Meza N. Antioxidant Activity and Diffusion of Catechin and Epicatechin from Antioxidant Active Films Made of Poly(l-lactic acid). J. Agric. Food Chem. 2012; 60 (26): 6515–6523.

18. Mehra P1, Garg M, Koul A, Bansal DD. Effect of (+)-catechin hydrate on oxidative stress induced by high sucrose and high fat diet in male Wistar rats. Indian J Exp Biol. 2013; 51(10): 823-7.

19. Saraste, A., Pulkki, K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardio Res. 2000; 45(3): 528–537.

20. Tran SL, Puhar A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus. PLoS One. 2011; 6(9): e22876.

21. Xiang LP, Wang A, Ye JH, Zheng XQ, Polito CA, Lu JL, et al. Suppressive Effects of Tea Catechins on Breast Cancer. Nutrients. 2016 Aug; 8(8): 458-572.

22. Brand MD. The causes and functions of mitochondrial proton leak. Biochim Biophys Acta. 1994; 1187(2): 132-139.

23.Scott CB, Kemp RB. Direct and indirect calorimetry of lactate oxidation: implications for whole-body energy expenditure. J Sports Sci. 2005; 23(1): 15-19.

24. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. Science. 2009 May 22; 324(5930): 1029–1033.

25. Lee KJ, Oh YC, Cho WK, Ma JY. Antioxidant and Anti-Inflammatory Activity Determination of One Hundred Kinds of Pure Chemical Compounds Using Offline and Online Screening HPLC Assay. Evid Based Complement Alternat Med. 2015; (2015): ID165457. 13 pages.

26. Yetuk G, Pandir D, Bas H. Protective Role of Catechin and Quercetin in Sodium Benzoate-Induced Lipid Peroxidation and the Antioxidant System in Human Erythrocytes In Vitro. The Sci World J. 2014; (2014): ID 874824. 6 pages.

27. Mehra P, Koul A, Bansal DD. Studies on Antioxidant Role of (+)-Catechin Hydrate in High Sucrose High Fat Diet Induced Oxidative Stress. Am. J. Biomed. Sci. 2013; 5(2): 161-17.