نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی8349-8-38156
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیرکاتچین هیدرات (CH) و اسید بوریک (BA) بر سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت(MSCs) میباشد.
مواد و روش‌ها: MSCsبا CH تیمار و با تست تریپان بلو توانائی حیات آنها در 12، 24، 36 ساعت بررسی شد. دوزهای 400و3200میکرومولار CH به همراه 6نانوگرم بر میلیلیتر BA و زمان 36 ساعت انتخاب شد. توانایی تکثیر توسط آزمون تشکیل کلونی (CFA)و دو برابر شدگی جمعیت (PDN)، مورفولوژی سلولها، سطح الکترولیتهای سدیم، پتاسیم و کلسیم و فعالیت آنزیمهای LDH،ALP، AST،ALT اندازه گیری شد. میزان مالون دی-آلدئید(MDA)، آنتیاکسیدان کل و فعالیت آنزیمهای SODوCAT نیز سنجش شد.
نتایج: در 12 ساعت تنها غلظت 3200میکرومولار و در 24و36 ساعت از 400تا3200میکرو مولار، CHباعث کاهش توانایی زیستی شد. از طرفی دوزهای انتخابی باعث کاهش معنیدار توانائی تکثیری، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم شد. تیمار با CH باعث افزایش فعالیت LDH، ALP،AST،ALT و افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل و کاهش میزان MDA و سدیم و پتاسیم شد. BA تاثیری بر توانائی زیستی، مورفولوژی و PDN نداشت ولی باعث کاهش CFA و فعالیت LDH،AST وALT شد. BA فعالیت ALP و میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم، میزان MDA و فعالیت CATوSOD را افزایش داد. اثر متقابل CHوBA تا حدودی باعث جبران کاهش توانائی تکثیر، توانائی زیستی، تغییرات مورفولوژیک، تغییر فعالیت آنزیمهای متابولیک و میزان الکترولیتها ناشی از تیمار با CH شد. از طرفی تیمار همزمان باعث شد که CH بتواند استرس اکسیداتیو حاصل از تیمار با BA را جبران نماید.
نتیجهگیری: با توجه به جبران اثرات سمی CH توسط بور میتوان هنگام مصرف چای از کشمش و خرما استفاده کرد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigating the effect of catechin hydrate on viability, proliferation, and biochemistry of rat bone marrow mesenchymal stem cells in presence of boron as a micronutrient
نویسندگان [English]
- MH Abnosi
- S Mansoori
Department of Biology, Faculty of Science, Arak University, Arak, Iran
چکیده [English]
Aim: Investigating the effect of catechin hydrate (CH) and boric acid (BA) on rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs).
material and Methods: MSCs were treated with culture media containing CH, then with the help of trypan blue the viability was investigated at 12, 24 and 36hours. 400 and 3200µM of CH along with 6ng/ml of BA and 36hours were selected for further study. Proliferation based on colony forming assay (CFA) and population doubling number (PDN), morphology, level of sodium, potassium and calcium and activity of LDH,ALP,AST,ALT were analyzed. Malondialdehyde (MDA), total antioxidant and activity of SOD and CAT were measured too.
Results: only 3200µM at 12hours and from 400 to 6400µM at 24 and 36 hours, the CH caused significant reduction in viability, proliferation, nuclei diameter and cytoplasm area. Treatment with CH caused increase in activity of LDH,ALP,AST,ALT and increased in FRAP as well as reduction of MDA and sodium, potassium level. BA did not show any effect on viability, morphology and PDN but caused reduction of CFA and activity of LDH,AST and ALT. BA also caused elevation of ALP activity and level of calcium, sodium, potassium as well as MDA level and activity of CAT and SOD. Co-treatment compensated the viability, proliferation, morphological changes, metabolic enzyme activity variation and level of electrolyte to some extent. On the other hand, co-treatment showed, CH ameliorated the oxidative stress induced by BA.
Conclusion: since boron ameliorated the CH toxicity, along with tea we may consume dry grapes and dates.
کلیدواژه‌ها [English]
- bone marrow mesenchymal stem cells
- catechin hydrate
- boric acid
- Viability
- biochemical factors
مقدمه
کاتچین هیدرات ترکیبی فلاونوییدی با خاصیت آنتی اکسیدانت قوی موجود در چای سبز (1) میباشد که فرمول مولکولی و وزن مولکولی آن بهترتیب C15H16O7 و 27/290 گرم بر مول است. این ترکیب در دمای 6/25 درجه سانتیگراد بهمیزان 2/2 میلیگرم بر میلیلیتر در آب و 50 میلیگرم بر میلیلیتر در اتانول حل می شود. انواع کاتچین های موجود در برگ چای شامل 1- اپی کاتچینEC 2- اپی گالوکاتچین EGC 3- اپی کاتچین گالات ECG 4- اپی گالو کاتچین گالات EGCG است (2). اپی گالوکاتچین گالات از جمله مهمترین پلی فنولهای آنتیاکسیدانتی موجود در چای سبز است که بهطور معمول دارای بیشترین میزان فعالیت در مقایسه با سایر آنتی اکسیدانها بوده و خاصیت آنتی اکسیدانتی این ماده 25 برابر ویتامین E و 100 برابر ویتامین D گزارش شده است (3). از طرفی کاتچین نیز که از منابع طبیعی بسیاری مانند برگ چای، دانه انگور و پوست و ساقه درخت آکاسیا استخراج و دارای خاصیبت آنتی اکسیدانی قوی و ضد سرطانی بواسطه القا آپوپتوزیس میباشد (4 و 5). یکی از مشتقات کاتچین، کاتچین هیدرات است که بهصورت تجاری از طرف شرکتها متعددی در بازار عرضه میشود. در مطالعه انجام توسط Ejaz Ahmad و همکاران (6) غلظت 10 تا20 میلیگرم بر کیلوگرم بهصورت روزانه بهمدت 21 روز به رت نژاد ویستار داده شد و مشخص شد که کاتچین هیدرات بهواسطه خاصیت آنتیاکسیدانتی و ضدالتهابی خود در درمان بیماری آلزایمر نقش دارد. در مطالعه Ejaz Ahmad تیمار کاتچین هیدرات موجب افزایش بیان آنزیمهای استیل کولین ترانسفراز و نیتریک اکسید سنتتاز القائی و کاهش سطح واسطههای التهابی نظیر IL1B ، TNF-a شد. این مطالعه مشخص کرد که کاتچین هیدرات در جلوگیری از تخریب حافظه و بهبود استرس اکسیداتیو موثر است. در مطالعهی دیگری بر روی سلولهای سرطانی MCF-7 و SiHa مشخص شد که کاتچین هیدرات باعث القای آپوپتوزیس وابسته به کاسپاز در این سلولها میشود (5 و 7). از طرفی تحقیقات پیشین نشان داده است که پلی فنلهای موجود در چای سبز در تامین سلامت بافت استخوان نقش داشته و با کاهش بازجذب استخوان و افزایش تشکیل ماتریکس استخوان و در نتیجه باعث افزایش تراکم استخوان در حیوانات آزمایشگاهی شده است (8). در مطالعه Choi و Hwang (9) نشان داده شد که کاتچین با کاهش سیتوکینهای دخیل در فعال سازی بازجذب استخوان و کاهش آپوپتوزیس در سلولهای استئوبلاست میتواند از استئوپورز و ایجاد التهاب در استخوان جلوگیری نماید. با توجه به نتایج دوگانه در تحقیقات پیشین شامل القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی از طرفی و تامین سلامت بافت استخوان از طرف دیگر، ضرورت انجام تحقیقات بیشتر بر روی تاثیر کاتچین اجتناب ناپذیر است. بهخوبی واضح است که در جامعه ایرانی چای بهخصوص نوع سیاه آن بهصورت روز افزون مصرف میشود که این مصرف میتواند بهعنوان یک شمشردولبه در سلامت ما نقش بازی کند.
از طرفی عنصر بور (B) با عدد اتمی 5، تنها نافلز در میان عناصر گروه IIIA جدول تناوبی و دارای خواص بین فلز و نافلز میباشد. بوریک اسید یک ریز مغذی ضروری برای گیاهان محسوب میشود (10). عنصر بور بهصورت آزاد در طبیعت وجود ندارد و ساده ترین فرم آن در حالت محلول ساختار تری هیدروکسی آن یا اسید بوریک است که یک اسید ضعیف لویس میباشد (11). مطالعات انجام شده توسط موحدی و آبنوسی نشان داده است که غلظت ng/ml6 اسید بوریک اثر منفی بر سلامت سلولهای مزانشیم نداشته و باعث افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و میزان کلسیم تام و در نهایت تمایز سلولها به استئوبلاست شده است (12 و 13). غذاها با منشا گیاهی نظیر خشکبار، میوههای خشک و تازه، بقولات، سبزیها منبع اصلی این عنصرهستند (14). در فرهنگ ایرانی بهصورت سنتی و برای جلوگیری از مصرف شکر، مصرف محصولات گیاهی مانند توت و خرما به هنگام نوشیدن چای سفارش شده است که البته با توجه به بررسیهای انجام شده دلیل علمی نیز برای آن یافت نشد. از آنجاکه محصولات گیاهی حاوی مقادیر قابل توجهی از عنصر بور بوده و چای نیز دارای مقادیر زیادی از کاتچین است. لذا با توجه به اهمیت سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (MSCs) که سلولهای پرتوان بوده و از طریق تمایز به استئوبلاست نقش مهمی در سلامت استخوان دارند، دراین پژوهش تاثیر کاتچین هیدرات بر این سلولها بررسی و همچنین تاثیر متقابل کاتچین هیدرات و بوریک اسید نیز بهعنوان مکمل مورد مطالعه قرار میگیرد.
مواد و روش‌ها
کلیه مواد مورد استفاده در این تحقیق از شرکت Sigma-Aldrich تهیه شد مگر در مواردی که ذکر شده است . در این مطالعه تجربی از موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 50 روز و وزن 20 ± 140 گرم استفاده شد. حیوان مورد استفاده در این پژوهش پس از خریداری از انسیتو پاستور در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط دمایی 3 ± 27 درجه سانتیگراد و با دسترسی مناسب به غذا و آب در قفسهای پلی اتیلن نگهداری شد. با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، موشها بهکمک دی اتیلن اتر بیهوش شده، استخوانهای ران و ساق پای آنها جدا و سپس بافتهای پیوندی اطراف استخوانها بهطور کامل پاک گردید. استخوانها در محیط کشت DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco Company) حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco Company) و پنیسیلین – استرپتومایسین (Gibco Company) در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفته، به زیرهود لامینار منتقل شد. دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با عمل فلاشینگ خارج و بهداخل لوله فاکون حاوی محیط کشت کامل هدایت و سپس بهمدت 5 دقیقه با دور 2500 سانتریفیوژ شد. محیط رویی خارج و رسوب سلولی در پنج میلیلیتر محیط تازه معلق شد و در فلاسک T25 کشت و در انکوباتور CO2 دار (دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2) انکوبه گردید. بعد از 24 ساعت محیط رویی حاوی سلولهای غیرچسبنده خارج و سپس بهمدت 14 روز هر سه روز یکبار محیط سلولها تعویض شد. زمانیکه کف فلاسک به تراکم بالایی از سلول رسید، سلولها با کمک Trypsin/EDTA (Gibco Company) از کف فلاسک جدا و به فلاسکهای جدید منتقل شدند. برای بهدست آوردن خلوص بالا از این سلولها سه مرحله پاساژ تکرار شد.
سنجشتواناییزیستی: برای بررسی تاثیر کاتچین هیدرات بر توان زیستی سلولها و یافتن دوز موثر، سلولهای پاساژ سوم با تراکم 50000 سلول در پلیت 24 خانه کشت داده شدند. محیط رویی سلولها خارج و محیط کامل حاوی سرم و غلظت های 0، 100، 200، 400، 800، 1600، 3200 و 6400 میکرومولار کاتچین هیدرات به چاهک های مختلف اضافه شد. سپس پلیت به انکوباتور انتقال یافت. بعد از سپری شدن 12، 24 و 36 ساعت سلولهای چسبیده تریپسین زنی و محیط کشت حاوی سلول به نسبت 1:1 با تریپان بلو 4/0 درصد مخلوط شد. پلیت بهمدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. با استفاده از لام نئوبار سلولهای آبی رنگ (سلولهای مرده) و سلولهای بیرنگ (سلولهای زنده) شمارش و درصد حیات سلولها محاسبه گردید.
با توجه به نتایج حاصل از آزمون تریپان بلو دو غلظت 400 و 3200 میکرو مولار از کاتچین هیدرات و با در نظر گرفتن مطالعه آبنوسی و موحدی (12) غلظت 6 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک انتخاب شد. در ادامه گروه های آزمایشی زیر برای آزمونهای بعدی و زمانهای مورد نظر طراحی شدند.
1) C (گروه کنترل)، این گروه در تمام مدت زمان تیمار تنها با محیط کشت تازه تیمار شدند.
2) BA- این گروه تنها با غلظت 6 نانوگرم بر میلیلیتر بوریک اسید تیمار شد.
3) CH400- این گروه با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات تیمار شد.
4) CH3200- این گروه با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات تیمار شد.
5) CH400+BA- این گره با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات و 6 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک تیمارشد.
6) CH3200+BA- این گروه با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات و 6 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک تیمارشد.
بررسیمورفولوژی: پس از تیمار سلولها، مورفولوژی هسته با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست (1میلیگرم در میلیلیتر PBS) و مورفولوژی سیتوپلاسم با استفاده از رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ )1میلیگرم بر میلیلیترPBS ( بررسی و توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus IX70-Japan)مجهز به دوربین )مدل (DP71 عکسبرداری شدند. قطر هستهها و مساحت سیتوپلاسم به کمک نرم افزار موتیک (شرکت موتیک مدل 2/1) اندازهگیری و گزارش شد.
بررسیتوانتکثیر: در راستای بررسی توان تکثیر، توان کلونی زائی (CFA) و میزان دو برابر شدگی جمعیت (PDN) بررسی شد. برای بررسی CFA، سلولهای پاساژ سوم با تراکم 50000 در پلیتهای تک خانه، بهمدت 7 روز کشت شد. در پایان سلولها دو بار با PBS شسته و با رنگ کریستال ویولت بهمدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شد. کلونیهای تشکیل شده در گروه های فوق الذکر در زیر میکروسکوپ مشاهده و شمارش شد، همچنین قطر کلونیها نیز با کمک نرم افزار موتیک (شرکت موتیک مدل 2/1) اندازهگیری شد. برای بررسی PDN، تعداد 20 هزار سلول در پلیت تکخانه کشت و سپس سلولهای بر اساس گروههای آزمایشی در زمانهای 1، 3و 6 روز تیمار شد. سلولها تریپسینه و مورد شمارش قرار گرفتند و PDN با استفاده از فرمول،logN/N0 × 3.31 N0) تعداد سلول در آغاز کشت و Nتعداد سلول در پایان کشت) محاسبه شد.
اندازهگیریفاکتورهایبیوشیمیایی :سلولهای کنترل و تیمار شده پس از 36 ساعت، تریپسینه و شستشو شدند، سپس بهکمک نیتروژن مایع سائیده و پس از لیز شدن با بافر 4/7 =PH Tris-Hcl استخراج و در rpm2000 بهمدت10 دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان پروتئین موجود در محلول رویی بهکمک روش لوری و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) بهعنوان استاندارد اندازه گیری شد. کلیه اندازهگیریها در نمونههای تیمار شده و کنترل بر اساس میزان پروتئین ثابت انجام شد.
برای اندازه گیری فعالیت آنزیمهای لاکتات دهیدروژناز (LDH) کد محصول (22 14000)، آلانین ترانس آمیناز (ALT) کد محصول1400019) و آسپارتات ترانس آمیناز(AST ) کد محصول ( 1400018) از کیتهای شرکت پارس آزمون (تهران – ایران) استفاده شد. طبق پروتکل 10 میکرولیتر از نمونه را با یک میلیلیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England) قرائت شد.
در بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) از کیت پارس آزمون (کد محصول 140002) استفاده شد و براساس روش ارائه شده توسط شرکت تولید کننده میزان 20 میکرولیتر از نمونه با یک میلیلیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 405 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (PG Instrument Company, England) قرائت شد. فعالیت ویژه آنزیم بر حسب واحد بر میلیگرم پروتئین محاسبه شد.
میزان کلسیم تام سلولی با کمک کیت کلسیم شرکت پارس آزمون (کد محصول140007) اندازهگیری شد. در این روش 20 میکرولیتر نمونه سلولی با یک میلیلیتر محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 570 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر Company, England) Instrument PG (اندازهگیری و برحسب میلیگرم بر دسی لیتر گزارش شد.
اندازه گیری غلظت سدیم و پتاسیم توسط دستگاه جذب شعلهای (Flame photometer) ساخت انگلستان مدل PFP7 انجام شد. در این روش سدیم و پتاسیم نور با طول موجهای متفاوت را ساطع میکنند که انتشار نور توسط فیلتر مناسب اندازهگیری و میزان انتشار نور متناسب با غلظت این عناصر است. با استفاده از این روش و تهیه غلظتهای متفاوت از کلرید سدیم و کلرید پتاسیم نمودار استاندارد تهیه و با استفاده از فرمولهای y=0.0127x+0.0053 و R2=0.996 و y=0.3169x+0.0001 و R2=0.999 بهترتیب غلظتهای سدیم و پتاسیم موجود در نمونه ها محاسبه شد. در فرمولهای فوق الذکر y میزن جذب و x غلظت الکترولیتها بوده و میزان الکترولیتها در نمونههای بهصورت میکروگرم بر میلیلیتر گزارش شد.
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): فعالیت آنزیم CAT با استفاده از روش Cakmak و Marschner اندازهگیری شد. مقدار 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی را با 200 میکرولیتر از محلول بافر فسفات پتاسیم 25 میلیمولار (7=pH) و 300 میکرولیتر H2O2 (mM 10) مخلوط و در طول موج 240 نانومتر سرعت حذف 2O2H بهمدت 2 دقیقه اندازهگیری شد (لازم بهذکر است که قبلا میزان جذب H2O2 در بافر فسفات در 4/0 تنظیم شد که نقطه شروع برای اندازهگیری سرعت واکنش بود). میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی 1- cm 1- mM4/39 براساس سرعت مصرف میکرومول پراکسیدهیدروژن در دقیقه بر میزان میلیگرم پروتئین محاسبه شد.
سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD): فعالیت آنزیم SOD براساس روش Giannopolitis و همکاران (15) اندازهگیری شد. در این روش اندازهگیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز براساس اثر بازدارندگی آنزیم با احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم است. مقدار 50 میکرولیتر از نمونه سلولی و 1 میلیلیتر از محلول واکنش (25 میلیمولار بافر فسفات با 6/8=pH، 12 میلیمولار متیونین، 75 میکرو مولار نیتروبلو تترازولیوم، 1 میلیمولار ریبوفلاوین، 1/0 میلیمولار EDTA و 50 میلیمولار سدیم کربنات) در لولههای آزمایش ریخته شد. از محلول فاقد عصاره بهعنوان کنترل و شاهد استفاده شد. لولههای آزمایش حاوی نمونه کنترل و نمونههای تیماری را بهمدت 10 دقیقه در روشنایی (نور مصنوعی در یک اتاقک) و نمونه بلانک در شرایط کاملا تاریکی قرار داده شد. برای صفر کردن دستگاه اسپکتوفتومتر از محلول بلانک که فاقد رنگ بود استفاده و سپس در طول 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) جذب نمونه خوانده شد و در صد فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز برای هر نمونه محاسبه شد. میزان فعالیت آنزیم در دقیقه بهازای میلیگرم پروتئین گزارش گردید.
تعیین میزان پراکسیداسیون لیپید: میزان پراکسیداسیون لیپید از روش اصلاح شده، Heath and Packer سنجیده شد. در این پژوهش سنجش مالون دی آلدهید بهعنوان شاخص پراکسیداسیون در نظر گرفته شده است. یک میلیلیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد به 100 میکرولیتر نمونه اضافه شد. مخلوط بهدست آمده بهمدت 30 دقیقه در حرارت 100درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار داده شد و بلافاصله لولهها بهمدت 15 دقیقه در یخ خرد شده قرار گرفت و بعد بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس غلظت کمپلکس تیوباربیتولیک اسید-مالون دی آلدئید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) در طول موج nm 523 خوانده شد. چون در طول موج 523 نانومتر بعضی از ترکیبات بهعنوان ترکیبات مزاحم جذب دارند پس جذب محلول را در طول موج 600 نانومتر نیز خوانده و از جذب خوانده شده در طول موج 523 نانومتر کم شد. غلظت کمپلکس تیوباربیتوریک اسید-مالون دی آلدئید تشکیل شده با استفاده از ضریب خاموشی1- cm 1- mmol155 =Ԑ و فرمولbcԐ= A (A: جذب خوانده شده، Ԑ: ضریب خاموشی، b: عرض کووت (cm1)، c: غلظت کمپلکس مالون دی آلدهید) اندازهگیری و برحسب میکرومول گزارش شد.
اندازهگیری فعالیت آنتی اکسیدانت تام (روشFRAP ): فعالیت آنتیاکسیدانتی کل با استفاده از روشBenzie and Strain طبق مراحل زیر تعیین شد. بههر لوله حاوی 150 میکرولیتر نمونه، 1700 میکرولیتر محلول FRAP (بافر سدیم استات 300 میلیمولار pH 3/6، محلول 10 میلیمولار TPTZ و محلول 20 میلیمولار کلرید آهن با حجم های مساوی) و 850 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. سپس لولهها را بهمدت 10 دقیقه در تاریکی در 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. جذب نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت instrument PG کشور انگلستان) در طول موج 593 نانومتر خوانده شد. برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سولفات آهن (FeSo4.7H2O)(شرکت Merk آلمان) استفاده شد. کلیه مراحل تهیه نمونههای استاندارد مانند مراحل فوق الذکر انجام شد و به جای نمونههای تیمار شده از غلظتهای مختلف سولفات آهن استفاه شد. فعالیت آنتیاکسیدانتی نمونههای تیمار شده پس از رسم منحنی استاندارد با استفاده از فرمول خطی y=0.0011x+0.0245 با R2=0.981 محاسبه و غلظت آنتی اکسیدانت تام بر حسب میکرو مول در میلیگرم پروتئین گزارش شد.
آنالیز آماری
آنالیز آماری دادهها با کمک نرم افزار SPSS (ساخت شرکت میکروسیستم آمریکا مدل 16) توسط روش آنالیز واریانس یکطرفه انجام و سطح معنیداری معادل05/0p< در نظر گرفته شد.
نتایج
مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها نشان داد که در طی 12 ساعت کاهش توانایی زیستی از دوز µM 3200 به بعد نسبت به گروه کنترل معنیدار بوده (05/0p<)، این در حالیاست که در طی زمان 24 و 36 ساعت این کاهش از دوز Mµ400 مشاهده شده است (جدول1). برای ادامه مطالعات در جهت بررسی اثرات همزمان کاتچین هیدرات و ng/ml 6 نانوگرم بر میلیلیتر بوریک اسید، غلظتهای400 میکرومول و3200 کاتچین هیدرات در طی زمان 36 ساعت انتخاب شدند. مقایسه میانگین دادهها نشان داد که تیمار سلولها با اسید بوریک تاثیر معنیداری بر توانائی زیستی سلولها در مقایسه با گروه C نداشت. از طرفی نیز تیمار همزمان کاتچین هیدارت و اسید بوریک نیز نتوانست مسمومیت ناشی از کاتچین هیدارت را مرتفع سازد، لذا کاتچین هیدرات در تیمارها باعث کاهش معنیدار (05/0p<) توانائی زیستی سلولهای MSCs نسبت به گروه C و BA شد (جدول2).
جدول 1:مقایسه میانگین توانایی درصد زیستی سلولها ی بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف کاتچین هیدرات توسط رنگ آمیزی تریپان بلو
|
زمان(ساعت) دوز (µM) |
12 |
24 |
36
|
|
|
0 |
0.25±a95.78 |
0.43±a95.42 |
0.23±a95.14 |
|
|
100 |
0.22±a95.30 |
0.51±a94.67 |
0.76±ab94.13 |
|
|
200 |
0.26±ab94.62 |
0.49±ab93.07 |
0.31±ab92.57 |
|
|
400 |
0.15±ab93.64 |
0.45±b92.55 |
0.34±b91.75 |
|
|
500 |
0.13±ab92.59 |
0.24±c90.65 |
1.89±c88.88 |
|
|
1600 |
0.31±ab92.34 |
0.28±cd44/89 |
0.69±c 19/88 |
|
|
3200 |
0.03±b91.00 |
0.02±d88.51 |
0.15±d83.64 |
|
|
6400 |
0.26±c67.47 |
1.90±e32.41 |
0.35±e30.74 |
|
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار میباشد (05/0p< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
جدول 2: مقایسه میانگین توانایی زیستی سلولها پس از تیمار 36 ساعته برطبق گروههای فوق الذکر توسط رنگ آمیزی تریپان بلو
|
|
گروه ها |
|
0.24±a95.20 |
C |
|
0.22± a94.34 |
BA |
|
0.26± b91.87 |
C400 |
|
0.50±b 92.14 |
C400+BA |
|
0.91±c 83.14 |
C3200 |
|
63/0±d68/86 |
C3200+BA |
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار میباشد (05/0P< بهعنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
در مدت زمان 36 ساعت تغییرات مورفولوژیک هسته سلولها در مقایسه با کنترل در گروه تیمار شده با 6 نانومولار اسید بوریک مشاهده نشد. ولی در گروههای تیمار شده با غلظتهای 400 و3200 میکرومولار کاتچین
هیدرات نسبت به کنترل تغییرات مرفولوژیک شامل متراکم شدن، شکستگی و تغییر شکل هسته مشاهده شد (شکل 1). علاوه بر نتایج میکروسکوپی، آنالیز آماری دادهها نیز کاهش معنیداری (05/0p<) بهصورت وابسته به دوز در گروههای 400 و 3200 میکرومول کاتچین هیدرات نسبت به گروههای کنترل را نشان داد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک در گروه C400+BA باعث بهبود معنیدار (05/0P<) تغییرات ناشی از تیمار با کاتچین هیدرات شد ولی این تاثیر در رابطه با دوز 3200 میکرومول مشاهده نشد (جدول 3). رنگ آمیزی آکریدین اورنژ نیز نشان داد که شکل سیتوپلاسم در سلولهای گروه C و BA چندوجهی و زوائد سلولی قابل تشخیص بوده و هستههای آنها در موقعیت مرکزی نسبت به سیتوپلاسم قرار داشتند، درحالیکه چروکیدگی و کوچک شدن سیتوپلاسم و گرد شدگی نسبی سلولها در گروههای تیمار شده با کاتچین هیدرات در مقایسه با کنترل قابل مشاهد بود (شکل 2). پیرو مشاهدات میکروسکوپی، آنالیز آماری دادهها نیز کاهش معنیدار (05/0p<) مساحت سیتوپلاسم را درگروههای تیمار شده با کاتچین هیدرات نسبت به گروه C و BA تایید کرد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک توانست تغییرات مورفولوژیک سیتوپلاسم را در مقایسه با تیمار کاتچین هیدرات به تنهائی جبران کند، بهصورتیکه دادهها نسبت به گروه کنترل معنیدار نبود (جدول 3).
شکل 1 : رنگ آمیزی فلورسنت هسته سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلورسنس هوخست پس از 36 ساعت تیمار (A)کنترل (B) ng/ml6 اسید بوریک و دوزهای (C) µM 400 کاتچین هیدرات (D) µM400 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (E) µM 3200 کاتچین هیدرات (F) µM3200کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (بزرگنمایی x 200).
شکل 2: رنگ آمیزی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ پس از 36 ساعت تیمار (A)کنترل (B) ng/ml6 اسید بوریک و دوزهای (C) µM 400 کاتچین هیدرات (D) µM400 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (E) µM3200 کاتچین هیدرات (F) µM3200 کاتچین هیدرات و ng/ml6 اسید بوریک (بزرگنمایی x 200).
|
میانگینمساحت سیتوپلاسم |
میانگین قطر هسته
|
گروه ها |
|
12/289± a61/1829 |
95/2 ± a20.59 |
C |
|
34/354±a34/1780 |
2.08±a 77/19 |
BA |
|
48/207±b61/1510 |
04/2±bc53/18 |
400C |
|
88/196±a43/1759 |
2.35±ab46/19 |
C400+BA |
|
69/206±b26/1385 |
62/1± c18/17 |
3200C |
|
63/321±ab97/1666 |
2.10±bc31/18 |
C3200+BA |
جدول3: مقایسه میانگین قطر هسته (µm) و مساحت سیتوپلاسم (µm2) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروههای فوق الذکر پس از 36 ساعت تیمار
مقادیر به صورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار میباشد(05/0P< به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
تعداد دو برابرشدگی(PDN) در روزهای 3،1 و6 روز بررسی شد. در روزهای 1، 3 و6 گروه اسید بوریک نسبت به گروه C تغییر معنیدار نشان نداد (05/0p>). این درحالی است که در گروههای تیمار شده با کاتچین هیدرات کاهش معنیداری (05/0p<) نسبت به گروههایC و BA دیده شد بهطوریکه این کاهش در گروه 3200 میکرو مول در 1، 3 و6 روز بسیار معنیدار (001/0p>) بود. در گروههای تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک، اسید بوریک توانست در همه زمانهای تیمار اثر غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدارت را بهصورت معنیدار (05/0p<) در مقایسه با تیمار فقط با کاتچین هیدرات جبران نماید. این در حالیاست که اثر جبرانی بوریک اسید بر غلظت 3200 کاتچین هیدرات فقط در زمان کوتاه یک روز قابل جبران بود و در 3 و 6 روز میزان PDN در سلولهای تیمار شده بهصورت همزمان با کاتچین هیدرات و بوریک اسید نسبت به گروههای C و BA کاهش معنیدار نشان داد (جدول 4).
|
6
|
3
|
1 |
زمان (روز) گروه ها |
|
0.07± a856/1 |
0.10±a1.248 |
0.12±a1.051 |
C |
|
0.44±ab591/1 |
0.10±ab1.186 |
12/0±a0.977 |
BA |
|
12/0±b 051/1 |
00/0±b903/0 |
15/0±ab788/0 |
C400 |
|
0.00± ab317/1 |
0.00±ab1.125 |
0.00±ab0.903 |
C400+BA |
|
00/0± c320/0 |
18/0±c427/0 |
36/0±b 534/0 |
C3200 |
|
15/0± c427/0 |
18/0±c0.534 |
18/0±ab.798/0 |
C3200+BA |
جدول4: مقایسه میانگین تعداد دو برابر شدگی جمعیت سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروههای فوق الذکر پس از 3،1 و 6 روز تیمار
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می باشد (05/0p< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
دادههای مربوط به قطر و تعداد کلونی نشان داد که تیمار با اسید بوریک باعث کاهش معنیدار (05/0p<) تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط MSCs در مقایسه با گروه C شد. از طرفی نیز تیمار سلولها با غلظتهای 400 و 3200 میکرومول همراه با کاهش بسیار معنیدار (05/0p<) بود. تیمار همزمان با اسیدبوریک و کاتچین هیدرات نیز نسبت به گروههای C و BA کاهش معنیدار (05/0p<) نشان داد و نتوانست جبران کاهش ناشی از تیمار با کاتچین بهتنهائی را بههمراه داشته باشد (جدول 5).
جدول5: مقایسه میانگین تعداد و قطرکلونیهای (mm) تشکیل شده توسط سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروههای فوق الذکر پس از 7 روز تیمار
|
میانگین قطرکلون |
میانگین تعداد کلونی |
گروه ها |
|
23/0± a 58/1 |
10/0±a50/122 |
C |
|
09/0± b 27/1 |
53/3±b 51 /113 |
BA |
|
11/0± c 04/1 |
83/2± c00/77 |
C400 |
|
18/0±b 24/1 |
24/4±d 00/95 |
C400+BA |
|
00/0± d00/0 |
00/0± e 00/0 |
C3200 |
|
00/0± d 00/0 |
00/0± e 00/0 |
C3200+BA |
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می باشد (05/0P< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
بوریک اسید باعث افزایش معنی دار (05/0p<) فعالیت آنزیمهای LDH و ALP نسبت به گروه C شد در حالیکه این ترکیب شیمیائی باعث کاهش معنیدار (05/0p<) فعالیت آنزیمهای ALT و AST در سلولهای مزانشیم مغز استخوان رت شد. از طرفی تیمار سلولها با غلظت 400 میکرومولار کاتچین هیدرات تغییری در فعالیت این آنزیمها در مقایسه با گروه C بهوجود نیاورد ولی غلظت 2300 میکرومولار باعث افزایش معنیدار فعالیت کلیه آنزیمهای فوق الذکر شد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث
کاهش معنی دار (05/0p<) میزان فعالیت آنزیمهای LDH، AST و ALT در مقایسه با گروههای تیمار شده با کاتچین هیدرات به تنهائی شد البته فعالیت این آنزیمها در مقایسه با گروه C نیز کاهش معنیدار داشت مگر در رابطه با تاثیر غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات بر فعالیت آنزیم LDH که نسبت به گروه C افزایش نشان داد (جدول6).
جدول6:مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیمهای آلانین ترانس آمیناز (ALT) و آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، لاکتات دهیدروژناز (LDH)، آلکالین فسفاتاز (ALP) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروهای مختلف پس از 36 ساعت تیمار
|
ALT |
AST |
ALP |
LDH |
گروه ها |
|
59/0±ac 55/6 |
0.32±a 67/22 |
9/7±a47/35 |
1/72 ± a1080 |
C |
|
34/0±b 16/4 |
0.20± b73/17 |
4/3±b62/44 |
60.0±b0/740 |
BA |
|
99 /0±ac 01/7 |
50/0±a 24/23 |
9/1±a61/36 |
6/34±ac0/1180 |
C400 |
|
34/0±b16/4 |
0.24±c80/19 |
08/9±b62/44 |
8/80± b6/846 |
C400+BA |
|
6/1± c41/7 |
10/0±d 11/25 |
00/0±b06/48 |
3/200± c2166 |
C3200 |
|
34/0±ab 96/4 |
0.38 ±e20.78 |
9 /1±c23/62 |
1/130± d1366 |
C3200+BA |
مقادیر بهصورت SD±mean می باشد. میانگین ها با کد حرف های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می باشد(05/0p< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA).
بوریک اسید بهتنهائی باعث افزایش معنیدار (05/0p<) غلظت کلسیم و سدیم و کاهش معنیدار (05/0p<) غلظت پتاسیم در مقایسه با گروه C شد. در گروههای تیمار شده با غلظتهای 400 و 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات میزان کلسیم داخل سلولی در مقایسه با گروه C هیچگونه تغییری نشان ندادند. این در حالیاست که غلظت 3200 میکرو مولار باعث کاهش معنی دار (05/0p<) میزان سدیم و پتاسیم گردید ولی غلظت 400 میکرومولار تنها غلظت پتاسیم را کاهش داد. غلظت همزمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث افزایش معنیدار سدیم و کاهش معنی دار پتاسیم در مقایسه با گروه Cشد (جدول 7).
|
پتاسیم (µg/dl) |
سدیم (µg/dl) |
کلسیم (mg/dl) |
گروه ها |
|
0.03± a0.87 |
0.34±a4.80 |
0.154±a1.354 |
C |
|
0.01± b0.73 |
0.35±b6.95 |
24/0±b1.805 |
BA |
|
01/0±c0.55 |
32/0±a21/4 |
09/0±a353/1 |
C400 |
|
0.01±c0.51 |
0.59±b6.17 |
0.03±ab1.676 |
C400+BA |
|
05/0± c0.47 |
34/0±c62/3 |
13/0±a205/1 |
C3200 |
|
03/0± d0.37 |
33/0±d5.19 |
12/0±a1.360 |
C3200+BA |
جدول7 -مقایسه میانگین غلظت کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی در سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروهای مختلف پس از 36 ساعت تیمار
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار میباشد (05/0p< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
آنالیز آماری دادهها نشان داد بوریک اسید باعث افزایش معنیدار (05/0p<) غلظت MDA و فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانتی SOD و CAT در سلولهای مزانشیم مغز استخوان رت شد، در حالیکه هیچگونه تغییری در میزان آنتی اکسیدانت کل بهوجود نیاورد. تیمار سلولهای با غلظتهای مختلف کاتچین هیدرات بهتنهائی باعث افزایش معنیدار (05/0p<) میزان آنتی اکسیدانت کل گردید ولی تغییر در فعالیت آنزیمها و میزان مالون دی آلدئید در مقایسه با گروه C بهوجود نیاورد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید باعث کاهش میزان آنتی اکسیدانت کل در مقایسه با گروههای تیمار شده با کاتچین هیدارت بهتنهائی شد ولی تغییر در غلظت MDA و فعالیت آنزیمها آنتی اکسیدانت در مقایسه با گروه C و گروههای تیمار شده با کاتچین هیدرات به تنهائی بهوجود نیاورد (جدول 8).
جدول8: مقایسه میانگین میزان آنتیاکسیدانت کل(FRAP)، محتوی مالون دی آلدئید(MDA)، فعالیت آنزیمهای کاتالاز (CAT) و سوپراکسیددیسموتاز(SOD) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در گروههای مختلف پس از 36 ساعت تیمار
|
SOD (Unit min-1 mg-1 of protein) |
CAT (Unit min-1 mg-1 of protein)
|
MDA )µM) |
FRAP (µM mg-1 of protein) |
گروه ها |
|
08/0±a93/4 |
02/0±a56/0 |
01/0±a17/0 |
57/0±a33/14 |
C |
|
05/0±b19/6 |
03/0±b72/0 |
01/0±b21/0 |
52/1±a33/15 |
BA |
|
07/0±a65/4 |
02/0±a56/0 |
03/0±a15/0 |
00/1±b00/20 |
C400 |
|
01/0±a83/4 |
00/0±a58/0 |
01/0± ab20/0 |
57/0± ab67/16 |
C400+BA |
|
04/0±a17/4 |
02/0±a59/0 |
02/0±c11/0 |
00/2±c00/26 |
C3200 |
|
03/0± a35/4 |
01/0± a62/0 |
01/0±a18/0 |
5/2± b33/21 |
C3200+BA |
مقادیر بهصورت SD±mean میباشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار میباشد (05/0p< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد)، Tukey test،one way ANOVA.
بحث
مطالعات زیادی در رابطه با اثر کاتچین و مشتقات آن بر روی انواع سلولهای مختلف انجام گرفته اما در رابطه با اثر این ماده در استخوان سازی و فرآیند استئوژنز اطلاعات کافی در دسترس نیست. با توجه به اهمیت سلولهای مزانشیم مغز استخوان در فرآیند ترمیم و بازسازی استخوان و با استناد بر مقاله Choi و Hwang (9) مطالعه اثر کاتچین هیدرات بروی سلامت MSCs قابل بحث و بررسی است. همچنین مطالعات آبنوسی و موحدی (12 و 13) در رابطه با اسید بوریک و تاثیر آن بر روی MSCs از طرفی و حضور قابل ملاحظه عنصر بور در گیاهان از طرف دیگر، مطالعه نقش کاتچین هیدرات بههمراه اسید بوریک بر شاخصههای بیوشیمیایی، مورفولوژی و توانایی حیات سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان را ضروری میسازد.
جدای از اثر بازداندگی رشد سلولهای سرطانی که گزارشهای متعددی در رابطه با آن وجود دارد (5، 7، 16)، اثر آنتی اکسیدانی کاتچین هیدرات (6، 17، 18) بخوبی بررسی شده است. البته بررسیهای انجام شده بر روی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان در این پژوهش نشان دادند که کاتچین هیدرات با غلظتهای تعیین شده باعث کاهش توانایی زیستی، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم میشود که این می تواند بهعلت اختلال در غشای سلول و القا آپوپتوزیس و فعال شدن نوکلئازها و پروتئازهای متعدد باشد که باعث متراکم شدن کروماتین و چروکیدگی سلول میشود (19). مطالعه صورت گرفته توسط الشتاوی نشان دادند که کاتچین هیدرات باعث القاء آپوپتوز وابسته به P53 و کاسپاز در سلولهای سرطان پستان انسانی میشود (16). لذا همانطور که قبلا متذکر شدیم احتمالا تغییر در مورفولوژی MSCs شامل تراکم کروماتین و چروکیدگی سیتوپلاسم در این پژوهش بهدلیل بروز مرگ سلولی برنامه ریزی شده میباشد. از طرفی کاهش توانائی زیستی نیز مشاهده شد که در مدت زمان کم با دوز زیاد و در مدت زمان زیاد با دوز کم، کاتچین هیدرات باعث کاهش این فاکتور زیستی در سلولهای مزانشیم مغز اسخوان رت شده است. رنگ تریپان بلو قابلیت عبور از غشای سیتوپلاسم را ندارد مگر اینکه تمامیت غشای از بین رفته باشد(20)، یکی از فاکتورهایی که باعث از بین رفتن تمامیت غشا میشود، عدم تعادل در غلظت الکترولیتها میباشد. در بررسی میزان الکترولیتها مشخص شد که کاتچین هیدرات باعث اختلال در سطح الکترولیتهای کلسیم، سدیم و پتاسیم میشود، البته باید در نظر گرفت که بوریک اسید خود نیز این اختلال را بهوجود آورد. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک نیز کاهش توانایی زیستی را نشان داد اگرچه این کاهش در تیمار همزمان تا حدودی نسبت به تیمار کاتچین هیدرات بهتنهایی مرتفع شده بود ولی دلیل بر جبران نیست و همچنان نسبت به گروه کنترل معنیدار بود. لذا عدم جبران کاهش توانائی زیستی ممکن است به این دلیل باشد که بوریک اسید نتوانسته است اختلال در سطح الکترولیتها را جبران نماید. در نتیجه میتوان گفت که استفاده همزمان این دو ترکیب فاقد هرگونه اثر هم افزایی یا جبران کنندگی در رابطه با توانائی زیستی است.
نتایج دوبرابر شدگی جمعیت کاهش تعداد جمعیت سلولی در 1، 3 و 6 روز، در هر دو غلظت کاتچین هیدرات نسبت به کنترل را نشان داد، البته در گروه تیمار شده با دوز 3200 میکرو مول کاهش بیشتری مشاهده شد. همچنین بررسی توانایی تشکیل کلونی نیز با نتیجه بهدست آمده در آزمون دو برابر شدگی جمعیت سلولی همراستا بود. این نتایج نشان داد که افزایش غلظت و طولانیتر شدن زمان تیمار اثر مسمومیت بیشتری را اعمال میکند و توانائی حیات و توانائی تکثیری سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان تحت تاثیر کاتچین هیدرات را بهشدت کاهش می‌دهد. کاتچین هیدرات بر توانائی تکثیر MSCs تاثیر نامطلوب دارد و این تاثیر نیز در مورفولوژی این سلولها دیده شد. در بررسی تاثیر همزمان کاتچین هیدرات و بوریک اسید، خسارت وارد شده توسط غلظت کم کاتچین هیدرات (400 میکرومولار) توسط بوریک اسید در آزمون PDN، قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم جبران شده بود ولی در رابطه با غلظت زیاد (3200 میکرومولار) اگرچه تاحدودی صدمات وارده جبران شد ولی کاملا بهحد کنترل نرسیده بود. جبران کاهش قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم میتواند به این دلیل باشد که بوریک اسید باعث ممانعت از ورود کاتچین هیدرات بهداخل سلول شده است. همانطور که تحقیقات پیشین اشاره میکند کاتچین هیدرات اثر آنتی اکسیدانتی دارد (6، 17، 18)، لذا در این تحقیق با روشFRAP مشخص شد که در گروههای CH400 و CH3200 میزان آنتی اکسیدانت کل بهصورت معنیدار و وابسته به غلظت افزایش داشته است. در صوتیکه تیمار همزمان اسید بوریک و کاتچین هیدرات نشان داد که میزان آنتی اکسیدانتی کل سلول کاهش معنیدار داشته است، که این میتواند بهدلیل اختلال در ورود کاتچین هیدرات به درون سلول بهواسطه حضور اسید بوریک باشد. همانطور که قبلا نیز اشاره شده است اسید بوریک یک اسید ضعیف (11) است که میتواند با گروه هیدروکسی در ترکیبات واکنش دهد و با تولید کمپلکس از ورود کاتچین هیدرات بهداخل سلول جلوگیری کند.
اختلال ایجاد شده توسط کاتچین هیدرات که در توانائی تکثیر سلولهای مزانیشم مغز استخوان (بر اساس آزمونهای PDN و CFA) بهوجود آمد ممکن است بهدلیل اختلال در سیکل سلولی اتفاق افتاده باشد (21). تا حدودی توانائی تکثیر سلولی توسط بوریک اسید جبران شده است بهخصوص در رابطه با توانائی دوبرابر شدگی جمعیت سلولی که تحت تاثیر غلظت کم (400 میکرومولار) کاتچین هیدارت بود است. در مرحله S سیکل سلولی نیاز مبرم به انرژی برای سنتز بیوملکولهای مورد نیاز در مراحل مختلف این فرآیند وجود دارد. اختلال در فرآیند تولید انرژی سلول میتواند باعث فقر انرژی در سلول و در نتیجه دلیل ایجاد اختلال در روند تکثیر سلولی باشد. در محیط کشت سلولی، کربوهیدراتها در مرکز متابولیزم قرار دارند که در نتیجه سلول با مصرف گلوکز از طریق مسیر هوازی بخش مهمی از نیاز انرژتیک خود را تامین میکند. در فرایند هوازی، گلوکز در مسیر گلیکولیز به 2 مول پیروات تبدیل شده که این مولکولها پس از تبدیل به استیل کوآ وارد چرخه کربس میشوند. در این چرخه، که در میتوکندری اتفاق می افتند، انرژی موجود در گلوکز در حمالهای انرژی از جمله NAD+ و FAD ذخیره و از طریق زنجیره انتقال الکترون در فرآیند اکسیداسیون فسفوریلاسیون در حضور اکسیژن باعث تولید ATP مورد نیاز سلول میشود (22). علاوه بر تبدیل به استیل کوآ، پیروات میتواند به لاکتیک اسید تبدیل شود، این واکنش در حضور آنزیم لاکتات دهیدروژناز انجام میپذیرد که در این صورت تنها تعداد کمی ATP نسبت به مسیر هوازی تولید میشود (23). این تغییر در فرآیند تولید انرژی را اثر واربرگ (24) مینامند که در اینصورت میزان مصرف گلوکز از طریق مسیر غیر هوازی افزایش یافته ولی میزان تولید ATP در سلول کمتر از متابولیزم هوازی است و در نهایت سلول دچار فقر انرژی میشود.
در مطالعه حاضر تیمار سلولها با اسید بوریک بهتنهایی، با تایید نتایج آبنوسی و موحدی، باعث کاهش فعالیت آنزیمهای لاکتات دهیدروژناز، آلانین ترانس آمیناز و آسپارتات ترانس آمیناز شد، که این نشاندهنده تامین انرژی سلول از طریق مصرف گلوکز بهواسطه متابولیزم هوازی است. نتایج تیمار سلول با غلظت 3200 میکرومولار کاتچین هیدرات نشان داد که فعالیت آنزیمهای دخیل در متابولیزم سلولی مانند فعالیت آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز افزایش معنیداری نسبت به کنترل داشته است، این بدان معنی است که فرآیند تولید انرژی اولا از طریق بیهوازی انجام و اثر واربرگ بهوجود آمده است که در نتیجه آن فقر انرژی در سلول ایجاد شده است. ثانیا با توجه به نتایج بهدست آمده در مطالعه حاضر افزایش فعالیت آنزیمهای ترانس آمیناز سبب شده است که سلولها برای تامین واسطههای چرخه کربس و جبران کمبود انرژی، مصرف آمینواسیدها و پروتئینها بهعنوان منبع انرژی را در دستور کار خود قرار داده اند. از طرفی تاثیر متقابل کاتچین هیدرات و اسید بوریک باعث تخفیف در فرآیند بیهوازی و بهبود تولید انرژی با کاهش این فرآیند شده است. نتیجهگیری کلی از این مطالعه نشان داد که تیمار کاتچین هیدرات کاتابولیزم سلول را هرچه بیشتر بهسمت متابولیزم بی هوازی هدایت میکند که علاوه بر فقر انرژی باعث مصرف اسید آمینه و پروتئینها برای تولید انرژی میشود. این تغییرات بیوشیمیائی علاوه بر اختلال در تعادل الکترولیتی میتواند دلیل دیگری بر تغییر در توانائی زیستی، توانائی تکثیر و تغییرات مورفولوژیک باشد.
در این پژوهش نکته قابل تامل دیگری وجود دارد که تاثیر کاتچین هیدرات و اسید بوریک بر فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز است. کاتچین هیدرات و بوریک اسید، هر یک بهتنهائی باعث افزایش فعالیت آنزیم ALP شدند و اثر متقابل آنها نیز حاکی از اثر هم افزائی در فعالیت این آنزیم است. با توجه به مطالعات آبنوسی و موحدی (12 و 13) و تحقیق منتشر شده از Choi و Hwang (9) بررسی بیشتر در این زمینه را پیشنهاد مینمائیم واز ارائه تفسیر در این زمینه خودداری می شود.
از نکات قابل اهمیت دیگر در این پژوهش این است که اسید بوریک باعث افزایش میزان MDA و همچنین افزایش فعالیت آنزیمهای SOD و CAT در سلولهای تیمار شده است. این امر نشاندهنده این واقعیت است که اسید بوریک با تولید رادیکال آزاد باعث پروکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع در سلول شده است. افزایش میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت نیز در جهت کاهش فعالیت رادیکالهای آزاد بوده است. احتمالا برخی از اختلالات ایجاد شده توسط اسید بوریک مانند کاهش معنیدار توان کلونی زائی یا کاهش 5 الی 15 درصدی قطر هسته، مساحت سیتوپلاسم و توانائی زیستی سلولها میتواند بهدلیل تولید رادیکال آزاد باشد. از طرفی تیمار سلولها با کاتچین هیدرات باعث کاهش میزان تولید MDA نسبت به گروه کنترل شده است که این خود نشان دهندهی خاصیت آنتیاکسیدانتی کاتچین هیدرات (25) است. تیمار همزمان کاتچین هیدرات و اسید بوریک باعث کاهش میزان MDA داخل سلولی نسبت به تیمار بوریک اسید بهتنهایی شده است، بهطوریکه مقدار MDA به حد کنترل رسید. میتوان اینطور تفسیر کرد که اثر آنتیاکسیدانتی کاتچین هیدرات موجب کاهش استرس اکسیداتیو تولید شده بهوسیلهی بوریک اسید شده و مصرف همزمان این ترکیبات میتواند اثرات منفی ناشی از عنصر بور که در محصولات گیاهی وجود دارد را مرتفع سازد. مطالعات انجام شده توسط Yetuk و همکاران (26) و مهرا و همکاران (27) نشان داد که مصرف کاتچین باعث کاهش میزان MDA و فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانتی میشود، این مطالعات در راستای مطالعه حاضر میباشند.
نتیجهگیری
کاتچین هیدرات یک ترکیب فلاونوییدی موجود در چای سبز است و طبق مطالعه حاضر این ترکیب سبب کاهش توانایی حیات و توانائی تکثیر سلولهای مزانشیم بهدلیل تخریب غشا، تغییر در تعادل یونها و انتقال متابولیزم از هوازی به بیهوازی میشود. از طرفی مصرف عنصر بور بهصورت اسید بوریک توانست در مواردی باعث جبران صدمات سلولی ناشی از کاتچین هیدرات بهخصوص در غلظتهای کم آن شود. از طرفی کاتچین هیدرات نیز توانست توان آنتیاکسیدانتی سلول را افزایش دهد و اثرات استرس اکسیداتیو ناشی از اسید بوریک را جبران نماید. لذا در راستای پیشنهادات طب سنتی مصرف چای بههمراه محصولات گیاهی بهخصوص خشکبارهایی مانند توت، پردههای آلو و زرد آلو و خرما که حاوی مقادیر بالایی از عنصر بور میباشند را پیشنهاد میکنیم. ضمنا با توجه به افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، تحقیقات بیشتر در رابطه با تاثیر اثر متقابل کاتچین هیدرات و اسید بوریک بر روند تمایز سلولهای مزانشیم به استئوبلاست پیشنهاد میشود.
-
- Yang HY, Yang SC , Chao JC, Chen JR. Beneficial effects of catechin-rich green tea and inulin on the body composition of overweight adults.Br J Nutr. 2012; 107(5): 749-54.
- Lee LS, Kim SH, Kim YB, Kim YC. Quantitative Analysis of Major Constituents in Green Tea with Different Plucking Periods and Their Antioxidant Activity. Molecules. 2014; 19(7): 9173-9186.
- Kawase M, Wang R, Shiomi T, Saijo R, Yagi K. Antioxidative Activity of (-)-Epigallocatechin-3-(3″- O-methyl)gallate Isolated from Fresh Tea Leaf and Preliminary Results on Its Biological Activity. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2000; 64(10): 2218-2220.
- Zhao J, Wang J, Chen Y, et al: Anti-tumor-promoting activity of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in the mouse skin two stage initiation-promotion protocol and identification of procyanidin B5- 3’-gallate as the most effective antioxidant constituent. Carcinogenesis. 1999; 20(9): 1737-1745.
- Alshatwi AA. Catechin hydrate suppresses MCF-7 proliferation through TP53/Caspase- mediated apoptosis. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2010; 29: 167-175.
- Ejaz Ahmed M, Khan MM, Javed H, Vaibhav K, Khan A, Tabassum R, et al. Amelioration of cognitive impairment and neurodegeneration by catechin hydrate in rat model of streptozotocin-induced experimental dementia of Alzheimer’stype. Neurochemistry Int. 2013: 62(4): 492-501.
- Al-Hazzani, AA., Alshatwi, AA. Catechin hydrate inhibits proliferation and mediates apoptosis of SiHa human cervical cancer cells. Food Chem Toxicol. 2011; 49(12): 3281-6.
- Shen CL, Yeh JK, Cao JJ, Chyu MC, Wang JS. Green Tea and Bone Health: Evidence from Laboratory Studies. Pharmacol Res. 2011 August ; 64(2): 155–161.
- Choi EM, Hwang JK. Effects of (+)-Catechin on the Function of Osteoblastic Cells. Biol. Pharm. Bull. 2003; 26(4): 523-526.
10. Nielsen FH. The emergence of boron as nutritionally important throughout the life cycle.Nutrition. 2000;16(7): 512-4.
11. Mokhov AV, Kartashov PM, Gornostaeva TA, Asadulin AA, Bogatikov OA. Complex nanospherulites of zinc oxide and native amorphous boron in the Lunar regolith from Mare Crisium. Doklady Earth Sciences. 2013; 448(1): 61-63.
12.Abnosi MH, Movahedi B .Investigation of the Effect of Boron on the Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells .Journal of Cell & Tissue. 2015; 5(4): 351-360. (abstract in English).
13. Movahedi Najafabadi, BH., Abnosi, MH. Boron Induces Early Matrix Mineralization via CalciumDeposition and Elevation of Alkaline Phosphatase Activity in Differentiated Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Cell Journal(Yakhteh). 2016; 18(1): 62-73.
14. Nielsen FH. The justification for providing dietary guidance for the nutritional intake of boron. Biol Trace Elem Res. 1998; 66(1-3): 319-30.
15.Giannopolitis, C.N., Ries, S.K. Superoxide dismutase. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59: 309–314.
16.Xiang LP, Wang A, Ye JH, Zheng XQ, Polito CA, Lu JL, et al. Suppressive Effects of Tea Catechins on Breast Cancer. Nutrients. 2016; 8: 458-872.
17. Iñiguez-Franco F, Soto-Valdez H, Peralta E, Ayala-Zavala JF, Auras R, Gámez-Meza N. Antioxidant Activity and Diffusion of Catechin and Epicatechin from Antioxidant Active Films Made of Poly(l-lactic acid). J. Agric. Food Chem. 2012; 60 (26): 6515–6523.
18. Mehra P1, Garg M, Koul A, Bansal DD. Effect of (+)-catechin hydrate on oxidative stress induced by high sucrose and high fat diet in male Wistar rats. Indian J Exp Biol. 2013; 51(10): 823-7.
19. Saraste, A., Pulkki, K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardio Res. 2000; 45(3): 528–537.
20. Tran SL, Puhar A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus. PLoS One. 2011; 6(9): e22876.
21. Xiang LP, Wang A, Ye JH, Zheng XQ, Polito CA, Lu JL, et al. Suppressive Effects of Tea Catechins on Breast Cancer. Nutrients. 2016 Aug; 8(8): 458-572.
22. Brand MD. The causes and functions of mitochondrial proton leak. Biochim Biophys Acta. 1994; 1187(2): 132-139.
23.Scott CB, Kemp RB. Direct and indirect calorimetry of lactate oxidation: implications for whole-body energy expenditure. J Sports Sci. 2005; 23(1): 15-19.
24. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. Science. 2009 May 22; 324(5930): 1029–1033.
25. Lee KJ, Oh YC, Cho WK, Ma JY. Antioxidant and Anti-Inflammatory Activity Determination of One Hundred Kinds of Pure Chemical Compounds Using Offline and Online Screening HPLC Assay. Evid Based Complement Alternat Med. 2015; (2015): ID165457. 13 pages.
26. Yetuk G, Pandir D, Bas H. Protective Role of Catechin and Quercetin in Sodium Benzoate-Induced Lipid Peroxidation and the Antioxidant System in Human Erythrocytes In Vitro. The Sci World J. 2014; (2014): ID 874824. 6 pages.
27. Mehra P, Koul A, Bansal DD. Studies on Antioxidant Role of (+)-Catechin Hydrate in High Sucrose High Fat Diet Induced Oxidative Stress. Am. J. Biomed. Sci. 2013; 5(2): 161-17.
)