بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم (CeO2) روی رده سلولی سرطان کولون ( HT29 )و آنالیز بیان ژن های آپوپتوزی کاسپاز 3 و 9 با استفاده از روش Real Time PCR و فلوسیتومتری

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، گروه زیست شناسی، ورامین، ایران

3 دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

4 دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، گروه شیمی، ورامین، ایران

چکیده

هدف: هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات سمیت سلولی نانو ذره اکسید سریم روی رده سلولی سرطانی کلون HT29 و آنالیز بیان ژن‫های آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 می‫باشد.
مواد و روشها: در این مطالعه سلول‌های HT 29 در فواصل زمانی 24، 48 و 72 ساعت تحت تاثیر غلظت‌های  78/0، 56/1، 12/3، 25/6، 5/12، 25،50، 100 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر از نانوذره اکسید سریم قرار گرفته و میزان بقای سلول‌ها توسط روش MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) اندازه گیری شد. سپس میزان بیان ژن‌های کاسپاز 3 و 9 با روش Real Time PCR  در سلول‫های HT29 تیمار شده با غلظت IC50 نانوذره در مدت زمان 24 ساعت و القای آپوپتوزیس توسط روش فلوسایتومتری مشخص شد.
نتایج: نتایج تست MTT نشان داد که نانو ذره  در مدت زمان 72 ساعت و در غلظت‌های 25، 50 و 100 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر بیشترین سمیت سلولی را روی رده سلولی HT29 داشته است. هم‫چنین نتایج Real Time PCR نشان داد که بیان نسبی ژن‌های کاسپاز 3 و 9 در رده سلولی سرطانی HT-29 تیمار شده با نانوذره  به‫ترتیب به‫میزان (05/0p>) 76/0±36/2، (05/0p>) 95/0±4/3 طی 24 ساعت افزایش داشته و نتایج فلوسایتومتری میزان آپوپتوزیس 16 درصد درصدی را نشان داد. 
نتیجهگیری: سمیت سلولی نانو ذره اکسید سریم برای سلول‌های سرطانی HT-29 وابسته به دوز و زمان است. که در آینده با مطالعات بیشتر و با هدفمند کردن این نانوذره به‫عنوان یک ترکیب دارویی کاندید جهت اهداف درمانی می‫توان استفاده کرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان بیماری‌ است که در آن سلول‌های غیرطبیعی به‫صورت کنترل نشده تکثیر یافته و می‌توانند بافت‌های مجاور را درگیر کنند. این امر در پی وقوع چند واقعه ژنتیکی از جمله غیر فعال شدن ژن‌های سرکوب گر تومور و فعال شدن آنکوژن‌ها می‫تواند اتفاق بیافتد (1). ماهیت این وقایع شامل انواع جهش‌ها، فقدان هتروزیگوسیتی، خاموشی اپی‌ژنتیکی رونوشت ژن‫ها توسط هیپرمتیلاسیون پروموتر، تکثیر ژن و وقوع جهش‌های کسب عملکرد می‫باشد (2). سرطان‫های گوارشی در میان مردان و سرطان سینه از شایع‫ترین سرطان‫ها در میان زنان است (3). مطالعات نشان می‫دهد که شیوع سرطان کلون در سن پایین در حال افزایش است و در چند سال آینده به یک مشکل اساسی در سلامت عمومی تبدیل خواهد شد (4). سرطان کلون زمانی اتفاق می‌افتد که سلول‌های غیر طبیعی در آستر روده بزرگ (کلون) یا راست روده (رکتوم) به‫صورت پولیپ ایجاد می‌شوند (5)

امروزه از روش‫های مختلف جراحی، شیمی درمانی و اشعه درمانی جهت درمان سرطان استفاده می‫شود ولی یکی از معایب و عوارض جانبی این روش‫ها از بین بردن سلول‫های سالم می‫باشد. این امر سبب شده است که محققان به سمت روش­های جدید درمان با کاهش عوارض جانبی پیش روند (6 و 7) این روش‫ها ممکن است به بافت‌های سالم نیز آسیب رسانده و یا بافت‌های سرطانی را ناقص از بین ببرند. نقص در این روش‫ها  باعث شده تا محققان به‫دنبال روش‌های جدید جهت تشخیص و درمان سرطان با عوارض جانبی کمتر باشند (8). فناوری نانو می‌تواند وسیله‫ای برای هدف قرار دادن مستقیم، انتخابی سلول‌های سرطانی و افزایش اثر بخشی در اختیار پزشکان قرار دهد (9). نانوذرات در موارد مختلفی مانند رساندن دارو به سلول‫های سرطانی و هم‫چنین جهت تصویر برداری از سلول‫های سرطانی و مشاهده دقیق‫تر آن‌ها کاربرد دارند و دارای پتانسیل خوبی برای تشخیص و درمان سرطان هستند (10). ذرات در اندازه‌های نانومتر می‌توانند به مواد دارویی در ابعاد نانومتریک متصل شده و به‫صورت اختصاصی توسط سلول‌های سرطانی جذب شوند. با این روش، سلول‌های سالم در معرض مواد دارویی قرار نمی‌گیرند و عوارض جانبی دارو کمتر می‌شود (11).

یکی از این نانوذرات، نانوذره اکسید سریم است. طی مطالعات اخیر  نشان داده است که این نانوذره اثر سمیت سلولی روی سلول‌های سرطانی دارد، لذا بررسی‌های بیشتر جهت تعیین عوارض جانبی و استفاده از آن در درمان سرطان‌ها مورد اهمیت می‌باشد (12).

نانو ذرات اکسید سریم از یک سریم احاطه شده توسط شبکه‌های اکسیژن تشکیل شده است. این نانو ذره دارای رفتارهای آنتی اکسیدانتی شامل سوپراکسیداز دیسموتاز، فعالیت آنزیم کاتالیزی، مهار رادیکال اکسید نیتریک و مهار رادیکال هیدروکسیل و هم­چنین رفتارهای اکسیدانی دارد که شرایط مختلف از قبیل pH محیط نوع فعالیت این نانو ذره را تعیین می‌کند (13). این نانو ذره در سلول‌های پستانداران با مسیرهای چندگانه از جمله اندوسیتوز با واسطه‌ گیرنده وارد سلول‫ها می شود. نانو ذرات اکسید سریم قادرند فاکتورهای دخیل در فرایند آپوپتوزیس سلولی را از طریق افزایش تولید
Species) ROS  (Reactive Oxygen که به‫صورت غیرآنزیمی عمدتا در میتوکندری به‫ویژه در کمپلکس‌های Ⅰو Ⅲ انتقال الکترون میتوکندری به‫وجود می‌آید را فعال کنند (14). سطح بالای ROS باعث از بین رفتن غشای خارجی و داخلی میتوکندری و آزاد شدن سیتوکروم C و فعال شدن آبشار آپوپتوزیسی می‫شود (15). از آنجایی‫که سرطان کلون جز یکی از سرطان‫های شایع در ایران است و فراوانی آن روند رو  به افزایشی دارد،  در مطالعه حاضر، بررسی اثرات سایتوتوکسیک نانو ذره سریم اکساید در دستور کار قرار گرفت. زیرا مطالعات گسترده‫ای  مبنی بر تاثیر نانوذره مذکور روی سرطان کلون وجود ندارد.

 

مواد و روش‌ها

ویژگی نانوذرات اکسید سریم: این مطالعه تجربی از فروردین تا شهریور ماه 1395 در دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات تهران به انجام رسیده است. در این تحقیق نانو ذره اکسید سریم از شرکت پیشگامان نانو مواد ایرانیان با برند US Nano خریداری شد. اندازه ذرات 10 تا 30 نانومتر و به‫صورت پودر شیری رنگ بود. از نظر مورفولوژیکی ذرات کروی بوده و چگالی سطحی آن 8/0 تا 1/1 گرم بر سانتی‫متر مکعب  با در صد خلوص 97/99 درصد گزارش شد.

کشت رده سلولی سرطان کلون HT29: رده سلولی سرطانی کلون HT-29 از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. ابتدا سلول‫ها در محیط کشت RPMI (Biosera, USA) غنی شده با 1 درصد (v/v) پنی‫سیلین- استرپتومایسین و 10 درصد FBS کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد رطوبت قرار داده شدند. برای انجام تست‫های بعدی، تراکم سلول‫ها 80 درصد در نظر گرفته شد.

بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم با استفاده از تست MTT: برای بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده‌ی سلولی HT-29 در زمان‫های مختلف از روش MTT Assay استفاده شد. ابتدا تعداد یکسان سلول (10000 سلول) در هر یک از چاهک‫های پلیت 96 خانه ای ریخته شد. به‫دنبال آن غلظت­های میلی‫گرم بر میلی‫لیتر  78/0،56/1، 12/3، 25/6، 5/12،5025،، 100 از نانوذره  تهیه شده ودر فاصله زمانی 24، 48 و 72 ساعت روی رده سلولی HT-29 تاثیر داده شد و20 میکرولیتر از محلول رنگ MTT به‫داخل هر چاهک اضافه کرده و به‫مدت4 ساعت انکوباسیون ادامه یافت. سپس رنگ MTT حذف شد و 100 میکرولیتر DMSO  به‫هر چاهک اضافه شد. جذب در طول موج 570 یا 590 نانومتر با استفاده از ELISA Reader(Stat fax baraie ELISA) خوانده شد. تمامی مراحل آزمایش 3 بار تکرار و میزان درصد سلول‫های زنده با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

% Cell inhibition= 100 – [(At-Ab)/(Ac-Ab)] × 100

× 100  (میانگین جذب نمونه کنترل/ میانگین جذب نمونه تیمار )-درصد سلول‫های زنده

At= جذب نمونه مورد تست، Ab=جذب نمونه بلانک و Ac= جذب نمونه کنترل است. هم چنین واحد IC50 (غلظتی که 50 درصد سلول‫ها زنده و 50 درصد مرده هستند) نیز محاسبه شد.

بررسی بیان ژنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 توسط روش Real Time PCR: بیان ژن‫های آپوپتوزیسی کاسپاز 3 (Casp3) و 9(Casp9) با روش Real Time PCR سنجیده شد. در ابتدا کل RNA سلول‫های تیمار شده و نشده با نانوذره با استفاده از کیت استخراج RNA (کیاژن، امریکا) طبق دستورالعمل آن استخراج شد و غلظت آن توسط دستگاه فتونانومتر(IMPLEN GmbH,، آلمان) اندازه گیری شد. سنتز cDNA باکیت Revert AidTM First strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas، آمریکا) انجام گرفت که در آن مخلوط واکنش حاوی 5 میکرولیتر بافر x5، یک میکروگرم RNA،  5/0 میکرولیتر آغازگر شش نوکلئوتیدی تصادفی، 5/0 میکرلیتر آغازگرالیگوdT، دو میکرولیتر مخلوط داکسی نوکلئوتید تری فسفات (10 میلی مولار)، 10 واحد مهارکننده آنزیم RNase (20 واحد در میکرولیتر)، یک میکرولیتر آنزیم رونوشت بردار معکوس و آب مقطر دو بار تقطیر (تا حجم نهایی 20 میکرولیتر) بود. برنامه دمایی-زمانی به‫صورت 25 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 5 دقیقه (برای اتصال آغازگر)، 42 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 60 دقیقه (ساخت cDNA)، 70 درجه سانتی گراد به‫مدت 5 دقیقه (غیر فعال شدن رونوشت بردار معکوس) و 4 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 5 دقیقه انجام گرفت.

در این مطالعه از GAPDH به‫عنوان کنترل داخلی استفاده شد. توالی آغازگرهای رفت و برگشتی ژن هدف Casp3 به‫صورت:

 5'-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC -3'  رفت و 5'-GTACCAGAGCGAGATGACA-3' برگشتی بود. توالی آغازگرهای رفت و برگشتی ژن هدفCasp9 به‫صورت  :

GGCGGAGCTCATGATGTCTGTG-3'  5'-رفت و3' 5'-TTCCGGTGTGCCATCTCCATCA-برگشتی و برای ژن مرجع GAPDH:

 5'-CGTCTGCCCTATCAACTTTCG-3' رفت و5'-CGTTTCTCAGGCTCCCTCT-3' برگشتی است. در نهایت واکنش Real Time PCR با استفاده از دستگاه Light cycler (Bioneer، کره) با شرایط دمایی 95 درجه سانتی‫گراد: 1 دقیقه، 95 درجه سانتی گراد 20 ثانیه، 62 درجه سانتی گراد 40 ثانیه انجام گرفت (16).

آنالیز میزان آپوپتوزیس/نکروزیس سلولهای HT29 توسط روش فلوسایتومتری: به‫منظور بررسی میزان القای آپوپتوزیس در سلول‫های HT29 تیمار شده با نانوذره اکسید سریم، این سلول‫ها با استفاده از روش AnnexinV/propidium iodide (PI) (Apoptosis detection kit, Roch, Germany) و دستگاه فلوسایتومتر (Flumax baraie flow) بر اساس دستورالعمل مربوطه مورد مطالعه قرار گرفتند. سلول‫های HT29 (1×105 سلول/چاهک) با غلظت IC50 نانوذره به‫مدت 24 ساعت تیمار شده و سلول‫های تیمار نشده HT29 به‫عنوان کنترل مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت میزان نکروز/آپوپتوزیس شده توسط دستگاه فلوسایتومتری مورد مطالعه قرار گرفتند.

 

آنالیز آماری

محاسبه آماری این مطالعه با استفاده از نرم افزار SPSS 16 انجام شد و نتایج با آنالیز واریانس یک‫طرفه (One way ANOVA) مورد بررسی قرار گرفت. اطلاعات به‫صورت mean±standard deviation (SD) نمایش داده شده اند و 05/0­p< معنی‫دار در نظر گرفته شد. برای آنالیز بیان ژن نیز از فرمول 2 –ΔΔCt استفاده شد. معنی‫دار بودن یا نبودن نتایج نیز بر اساس آزمون T-test (05/0p<)  ارزیابی گردید.

 

نتایج

نتایج سنجش سمیت نانوذره اکسید سریم با روش آزمون  MTT

ابتدا سلول‫های  HT29با غلظت‫های  78/0،56/1، 12/3، 25/6، 5/12، 5025، ، 100 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر از نانو ذره اکسید سریم تیمار شدند. سپس درصد زنده ماندن سلول­ها پس از مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت بررسی شد. نتایج سمیت سلولی نشان داد که تیمار سلول‫های HT29 در مدت زمان 24 ساعت به‫ترتیب سبب کاهش بقای سلول‫ها به‫میزان 26/0±5/94، 51/0±89، 38/0±80، 41/0±5/68، 35/0±5/60، 25/0±7/53، 29/0±5/40، 45/0±75/32 شد. هم‫چنین، در مدت زمان 48 ساعت نانوذرات اکسید سریم در همان غلظت‫ها به‫ترتیب باعت کاهش بقای سلول‫ها به‫میزان 25/0±3/85، 42/0±5/72، 48/0±5/66، 52/0±5/50، 39/0±5/39، 31/0±31، 27/0±7/20 و 24/0±75/16 شد. به‫دنبال آن، تیمار سلول‫های HT29 با غلظت‫های فوق الذکر در مدت زمان 72 ساعت به‫ترتیب سبب کاهش بقای سلولی به‫میزان42/0±2/73، 28/0±5/59، 32/0±2/51، 38/0±5/41، 55/0±5/29، 47/0±23 و 29/0±7/1 شد (شکل 1). هم‫چنین، نتایج نشان داد که مقدار IC50 در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت در سلول­های سرطانی  HT29 به‫ترتیب 54/31، 08/6 و 96/2 میلی‫گرم در میلی‫لیتر بود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: درصد بقای سلول‫هایHT29 در برابر غلظت‫های مختلف نانوذره اکسید سریم در مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت. نتایج به‫صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‫های کنترل گزارش شده است (*:05/0­ p<­ ، **:01/0 p< ، *** 001/0p<: n=3).

 

نتایج بررسی بیان ژنهای Casp3 و Casp9 توسط Real Time PCR

در این تست، تغییر در بیان ژن‫های آپوپتوزیسی Casp3 و Casp9 در سلول‫های HT29 تیمار شده با غلظت IC50 نانوذره اکسید سریم با استفاده از روش Real Time PCR  ارزیابی شد. آنالیز داده‌های Real Time PCR بر اساس مقایسه چرخه آستانه انجام شد آنالیز منحنی ذوب ژن‫های Casp9 در دمای ذوب 82 درجه سانتی‫گراد‫، GAPDH با دمای ذوب 8/85 درجه سانتی‫گراد و Casp3 با دمای ذوب 6/88 درجه سانتی‫گراد انجام شد.

 

 

 

 

 

 

در این مطالعه، اختلاف چرخه‌های آستانه به‫دست آمده از

نمونه‌های مورد آزمایش (سلول‌های تیمار شده با نانوذره) و نمونه‌های کنترل (سلول‌های تیمار نشده با نانوذره) محاسبه و میزان بیان ژن با استفاده از فرمول ΔΔCt (نسبت ژن‌ هدف به ژن مرجع (GAPDH) از طریق 2 –ΔΔCt) محاسبه شد. نتایج نشان داد که بیان ژن‫های Casp3 و Casp9 نسبت به ژن مرجع در رده سلولی سرطانی HT29 به‫ترتیب به‫میزان (05/0p<) 76/0±36/2 و (05/0p<) 95/0± 4/3 طی 24 ساعت افزایش یافت     ( شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: بیان ژن‌های Casp3 و Casp9 نسبت به ژن مرجع GAPDH در رده سلولی سرطانی کلون  HT29تیمار شده با نانوذره اکسید سریم به‫ترتیب به‫میزان (05/0p<) 76/0±36/2 و (05/0p<) 95/0± 4/3 طی 24 ساعت افزایش یافت.

 

 

 

نتایج فلوسایتومتری جهت تعیین میزان آپوپتوزیس القا شده در رده سلولهای سرطانی کلون

به‫منظور بررسی کمی میزان آپوپتوزیس و نکروزیس در بین روش‫ها روش فلوسایتومتری روشی دقیق تر و تکرار پذیرتر می‫باشد که جهت تعیین میزان آپوپتوزیس القا شده در سلول‫های HT29 تیمار شده با نانوذره اکسید سریم، این سلول‫ها با FITC Annexin V and PI رنگ آمیزی شده و توسط روش فلوسایتومتری مطالعه شدند.

 

 

در طی فاز اولیه آپوپتوزیس، فسفاتیدیل سرین به خارج از غشا منتقل شده و توسط Annexin V رنگ می شود و رنگ PI به هسته در زمان نکروز متصل می‫شود. نتایج فلوسایتومتری در شکل 3 نشان داده شده است، دو مربع

بالا (Q1 و Q2) میزان آپوپتوزیس را نشان می‫دهد. همان‫طوری‫که نتایج نشان می‫دهد نانوذره اکسید سریم را 16 درصد سلول‫های HT29 را به‫سمت آپوپتوزیس هدایت کرده است (شکل 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: نتایج آنالیز فلوسایتومتری تاثیر نانوذره اکسید سریم بروی رده سلولی HT29. A) نمونه تیمار نشده، B) نمونه تحت تیمار. دو مربع کوچکQ1 و Q2 در نتایج، میزان آپوپتوزیس را نشان می‫دهد. همان‫طوری‫که نتایج نشان می‫دهد نانوذره اکسید سریم را 16 درصد به‫سمت آپوپتوزیس هدایت کرده است.

 

 

 

بحث

امروزه ابتلا به سرطان یکی از موارد شایع مرگ و میر در سرتاسر دنیا به‫شمار می‌رود (17). استفاده از روش‌های کنونی شیمی درمانی و رادیوتراپی در درمان سرطان دارای معایبی است. یکی از این معایب آسیب رسیدن به سلول‌های سالم اطراف تومور می‫باشد (18). از این‫رو، یک عملکرد تکنولوژیک نوآورانه برای حل این مشکل با استفاده از نانوذرات به‫عنوان پروب‌های درون سلولی است (19).

در سال‌های اخیر راه‫کار استفاده از نانو ذرات به‫عنوان سیستم حامل برای درمان و انتقال دارو پیشرفت قابل توجهی کرده است (20). یکی از این نانوذرات که توجه محققان را به‫خود جلب کرده است، نانو ذره اکسید سریم است که در سال‫های اخیر از آن به‫عنوان یک عامل درمان برای تعدادی از بیماری‌ها از جمله سرطان در شرایط in vivoوin vitro استفاده کرده اند (21). نانو ذره سریم اکساید یک نانو ذره فلزی است و برای سلول‌های سرطانی سمی است و باعث مهار تهاجم و حساس شدن سلول‌ها به پرتودرمانی و شیمی‌درمانی، محافظت گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و افزایش آپوپتوزیس در سلول می‌شود. همچنین این نانو ذره باعث مهار متاستاز نیز می‫شود (22). میوفیبروبلاست‌ها تا حد زیادی واسطه سیگنالینگ اپیتلیال و استرومال هستند که نقش مهمی در بیان اجزای ماتریکس خارج سلولی مانند آلفا اکتین عضلات صاف و کلاژن به‫منظور تسهیل در تهاجم تومور و رگ‫زایی دارد. این نانو ذره دارای توانایی تنظیم کردن تشکیل میوفیبروبلاست و تغییر از فیبروبلاست به میو‌فیبروبلاست توسط TGF-B1 که ناشی از افزایش بیان ROS وابسته به اکتین عضلات صاف است. همانطور که برخی میوفیبروبلاست‌ها در  تومورهای مهاجم هستند درمان با این نانو ذره باعث کاهش توانایی میوفیبروبلاست در تهاجم سلول‌های سنگفرشی مهاجم می‌شود. همچنین نانوذره سریم اکساید باعث کاهش ذاتی سلول‌های تومور سنگفرشی برای حمله می‌شود (23). در این مطالعه اثرات سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم در غلظت­ها و زمان‫های مختلف در رده سلولی سرطان کلون مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که این نانوذره بیشترین اثر سمیت خود را در غلظت های 5/12 تا 100 میلی‫گرم در میلی‫لیتر نشان داده و اختلاف معنی‫داری با سلول‫های کنترل داشته است (p<0.05) و اثرات سمیت سلولی آن وابسته به دوز است. هم چنین نتایج نشان داد که اثرات این نانوذره وابسته به زمان است، یعنی با افزایش زمان، میزان سمیت سلولی آن نیز افزایش می‫یابد. به‫طور کلی، با افزایش زمان و غلظت نانوذره، نانوذرات فرصت بیشتری برای ورود سلول پیدا می‫کنند و اثرات سمیت خود را با ایجاد استرس اکسیداتیو (تولید رادیکال‫های سمی اکسیژن) در درون سلول القا می‫کنند. استرس اکسیداتیو موجب برهم‫زدن هموستازی درون سلولی و برهم‫کنش با ماکرومولکول‫های سلولی مانند DNA، پروتئین‫ها و لیپیدها می‫شوند. به‫طوری‫که این استرس اکسیداتیو باعث شکست‫های DNA دورشته‫ای شده و باعث مرگ سلول‫های سرطانی می‫شود (24). مطالعات مختلفی در زمینه بررسی اثرات سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم در رده­های سلولی مختلف انجام شده است. در مطالعه ای توسطSandeep و همکاران (25) روی اثر نانو ذره اکسید سریم روی سلول‌های سرطانی ریه (A549) انجام دادند، نشان داده شد که این نانو ذره باعث سمیت قابل ملاحظه‌ و تغییرات مورفولوژیکی در رده سلولیA549 می‌شود.

تحقیق Pešić M و همکاران (26) به بررسی اثر سیتوتوکسیک CONPs روی چند نوع سرطان و رده‫های سلول‌های طبیعی پرداخته و خاصیت تغییر ردوکس داخل سلولی را بررسی کردند.  نتایج نشان داد که CONPs باعث افزایش مرگ سلولی و گونه‌های اکسیژن فعال می‌شود و بیشترین حساسیت به نانو ذره اکسید سریم در رده سلول‌های 518A2  ملانوما و HT-29 کلورکتال آدنو کارسینوما با ارزش IC50 بالا دیده شد. در نهایت نتیجه‫گیری شد که ROS باعث افزایش مرگ سلولی شده  است.

Saikat Jana و همکاران (27) تحقیقی در مورد اثر سمیت نانو ذره اکسید سریم روی رده سلولی HCT-15 انجام دادند. در این آزمایش هم ROS و پراکسیداسیون لیپیدی که شاخص‌های استرس اکسیداتیو و سمیت سلولی هستند به‫مقدار قابل توجهی باتوجه به دز افزایش پیدا کرده است.

Lin و همکاران (28) نیز اثر نانو ذره اکسیدسریم را روی رده سلول‌های ریه بررسی کردند. در نهایت نتایج تایید کننده این امر بود که نانو ذره اکسید سریم باعث افزایش مرگ سلول‌های سرطانی شده و استرس اکسیداتیو را به سلول القا می‌کند.

مکانیسم دیگر اثرات سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم، آزاد شدن سیتوکروم c و فعال شدن کاسپاز 3و9 می‫باشد. در واقع باعث افزایش آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی به‫وسیله شروع مرگ سلولی میتوکندریایی بدون تغییرات شیمیایی و از طریق هدف قرار دادن میتوکندری می‌شود (29). به‫طور کلی القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی یا آپوپتوزیس یکی از رویکردهای جذاب در در درمان سرطان به‫شمار می‫رود. مسیر مرگ سلولی می تواند شامل فعال سازی رویدادهای پروآپوپتوتیک در سلول باشد که با نفوذپذیری غشا اندامک میتوکندری توسط پروتئین‫‫های Bax و Bak شروع شده و موجب آزاد سازی سیتوکروم c از آن و نهایتا فعال شدن کاسپاز 9  و سپس کاسپاز 3 می‫شود (30). علاوه بر این پروتئین‫های Bcl2 و Bclxl با قرار گرفتن در سطح شبکه اندوپلاسمی، میتوکندری و هسته از کنار هم قرار گرفتن پروتئین‫های Bax و Bak جلوگیری می‫نماید.  بنابراین فعالیت ضد آپوپتوزیسی  نشان می‫دهند (31). در مطالعه حاضر اثرات نانوذره اکسید سریم در افزایش بیان ژن‫های آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 در سلول‫های سرطانی کلون و القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی نشان داده شد. اما بررسی‫های بیشتری  لازم است تا بتوان اثبات کرد که آیا پروفایل بیانی mRNA این ژن‫ها می‫تواند مدرکی برای نقش آن در پیش‫گویی اختصاصی و دقیق تر پاسخ سرطان به درمان باشد؟ علاوه بر این، در بخش فلوسایتومتری، برای ارزیابی میزان آپوپتوزیس و نکروزیس القا شده توسط نانوذره، از غلظت IC50 استفاده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذره توانایی القای 16 درصدی آپوپتوزیس را دارد. به‫طور کلی، ظرفیت فلوسایتومتری برای آنالیز سریع و منحصر به فرد تعداد زیادی سلول، آن را برای مطالعات مرگ سلولی ایده‏آل می‫کند. در این تست، از دو معرف Annexin V که نشان دهنده آپوپتوزیس و پروپیدیوم یدید (PI) که نمایانگر نکروز می‫باشد، استفاده شد. این روش میزان آپوپتوزیس را بر اساس جابه‫جایی فسفاتیدیل سرین لایه داخلی غشای پلاسمایی به لایه خارجی آن در فاز آپوپتوزیس می‫باشد (32). در این مطالعه نتایج فلوسایتومتری تاثیر نانوذره اکسید سریم نشان داد که این نانوذره توانایی القای آپوپتوزیس را در سلول‫های HT29 را دارد.

به‫طور کلی، نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذره بر روی رده سلولی سرطان کلون خاصیت کشندگی چشم‫گیری دارد. بنابراین پیشنهاد می‫شود که مطالعات بیشتر در مورد خواص زیستی این ناوذره انجام گیرد تا اهمیت پزشکی این نانوذره بیشتر مشخص شود و به‫عنوان یک ترکیب ضدسرطانی امیدبخش به مراکز دارویی پیشنهاد شود.

 

نتیجه‫گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذره اکسید سریم دارای اثرات سمیت سلولی علیه سلول‫های سرطان کلون می‫باشد و می‫تواند آپوپتوزیس را در این سلول‫ها القا کند. بنابراین پیشنهاد می‫شود که مطالعات بیشتر در مورد خواص زیستی این نانوذره انجام گیرد تا اهمیت پزشکی این نانوذره بیشتر مشخص شود و به‫عنوان یک ترکیب ضدسرطانی امیدبخش به مراکز دارویی پیشنهاد شود.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل بخشی از پایان نامه با عنوان بررسی اثرات سیتوتوکسیک نانوذره اکسید سریم در رده سلولی سرطان کلون و آنالیز بیان ژن‫های آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و9 در مقطع کارشناسی ارشد در سال 1395 می باشد که با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران اجرا شده است.

1. De Wever O, Lapeire L, De Boeck A, Hendrix A. Cellular and molecular mechanisms of cancer cell invasion. Verh K AcadGeneeskd Belg. 2010; 72(5-6): 309-26.

2. Meng X, Zhong J, Liu S, Murray M, Gonzalez-Angulo AM. A new hypothesis for the cancer mechanism.Cancer Metastasis Rev. 2012; 31(1-2): 247-68.

3. Kolligs FT. Diagnostics and epidemiology of colorectal cancer.Visc Med. 2016; 32(3): 158-64.

4. Faivre J, Lemmens VE, Quipourt V, Bouvier AM. Management and survival of colorectal cancer in the elderly in population-based studies.Eur J Cancer. 2007; 43(15): 2279-84.

5. Williamson B. Strum, M.D. New Engandl Journal of  Medicine. 2016; 374: 1065-1075.

6. Stacey LH, Nikki C. Chemokine signaling in cancer: Implications on the tumor microenvironment and therapeutic targeting. Cancer Ther. 2009; 14: 7(2): 254–267.

7. Golfinopoulos V, Pentheroudakis G, Pavlidis N. Treatment of colorectal cancer in the elderly: a review of the literature. Cancer Treat Rev. 2006; 32(1): 1-8.

8. Aschele C, Bergamo F, Lonardi S.Chemotherapy for operable and advanced colorectal cancer.Cancer Treat Rev. 2009; 35(6):509-16.

9. Ediriwickrema A, Saltzman WM. Nanotherapy for Cancer: Targeting and Multifunctionality in the Future of Cancer Therapies. ACS BiomaterSci Eng. 2015 Feb 9;1(2):64-78.

10. Babu A, Templeton AK, Munshi A, Ramesh R.Nanodrug delivery systems: a promising technology for detection, diagnosis, and treatment of cancer. AAPS PharmSciTech. 2014; 15(3): 709-21.

11. Ghaz-Jahanian MA, Abbaspour-Aghdam F, Anarjan N, Berenjian A, et al . Application of chitosan-based nanocarriers in tumor-targeted drug delivery.MolBiotechnol. 2015; 57(3): 201-18.

12. Das S, Dowding JM, Klump KE, McGinnis JF, et al. Cerium oxide nanoparticles: applications and prospects in nanomedicine. Nanomedicine (Lond). 2013;

 

8(9):1483-508.

13. Celardo I, Pedersen JZ, Traversa E, Ghibelli L. Pharmacological potential of cerium oxide nanoparticles.Nanoscale. 2011; 3(4): 1411-20.

14. Clark A, Zhu A, Sun K, Petty HR. Cerium oxide and platinum nanoparticles protect cells from oxidant-mediated apoptosis. J Nanopart Res. 2011; 13(10): 5547-5555.

15. Baumber j,Ball BA,Gravance CG,Medina V,DaviesMorel MC.2000.The effect of reactive oxygen species on equine sperm mobility viability acrosomal integrity mitochondrial membrane potential and membrane lipid peroxidation .J Androl. 21(6): 895-902

16. Sun BH, Zhang J, Wang BJ, Zhao XP, et al . Analysis of in vivo patterns of caspase 3 gene expression in primary hepatocellular carcinoma and its relationship to p21(WAF1) expression and hepatic apoptosis. World J Gastroenterol. 2000; 6(3): 356-360.

17. Pukkala E, Martinsen JI, Lynge E, Gunnarsdottir HK, et al. Occupation and cancer - follow-up of 15 million people in five Nordic countries. ActaOncol. 2009; 48(5): 646-790.

18. Sudhakar A. History of cancer, ancient and modern treatment methods.J Cancer SciTher. 2009: 1;1(2): 1-4.

19. Shannon AM, Williams KJ. Antiangiogenics and radiotherapy.J Pharm Pharmacol. 2008; 60(8): 1029-36.

20. Sánchez-Moreno P, Ortega-Vinuesa JL, Peula-García JM, Marchal JA, et al. Smart drug-delivery systems for cancer nanotherapy. Curr Drug Targets. 2016: 27(1): 21-29.

21. Celardo I, Pedersen JZ, Traversa E, Ghibelli L. Pharmacological potential of cerium oxide nanoparticles.Nanoscale. 2011; 3(4): 1411-20.

22. Ying Gao, Kan Chen, Jin-lu Ma, Fei Gao. 2014. Cerium oxide nanoparticles in cancer. Dovo press journal. 27(7): 835–840.

23. Can Xu and Xiaogang Qu.2014. Cerium oxide nanoparticle: a remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials (2014) 6, e90; doi:10.1038/am.2013.88.

24. Xia T, Kovochich M, Liong M, Mädler L, et al. Comparison of the mechanism of toxicity of zinc oxide and cerium oxide nanoparticles based on dissolution and oxidative stress properties. ACS Nano. 2008: 28; 2(10): 2121-34.

25. Sandeep M, Alok KP. Cerium oxide nanoparticles induced toxicity in human lung Cells: role of ROS mediated DNA damage and apoptosis. BioMed Research International. 2014: 14(2): Article ID 891934, 14 pages.

26. Pešić M , Podolski-Renić A , Stojković S , Matović B , et al. Anti-cancer effects of cerium oxide nanoparticles and its intracellular redox activity.elsevire. 2015; 232:85-93

27. Saikat Kumar Jana, Priyanka Banerjee, Soumen Das, Sudipta Seal, et al. Redox-active nanoceria depolarize mitochondrial membrane of human colon cancer cells.Journal of Nanoparticle Research. 2014; 16: 2441.

28. Lin W, Huang YW, Zhou XD, Ma Y. Toxicity of cerium oxide nanoparticles in human lung cancer cells.Int J Toxicol. 2006; 25(6): 451-7.

29. Arya A, Sethy NK, Das M, Singh SK, et al. Cerium oxide nanoparticles prevent apoptosis in primary cortical culture by stabilizing mitochondrial membrane potential. Free Radic Res. 2014; 48(7): 784-93.

30. Lalier L, Cartron PF, Juin P, Nedelkina S, et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis.Apoptosis. 2007; 12(5): 887-96.

31. Billen LP, Shamas-Din A, Andrews DW. Bid: a Bax-like BH3 protein. Oncogene. 2008; 27 Suppl 1: S93-104.

32. Demchenko AP. Beyond annexin V: fluorescence response of cellular membranes to apoptosis. Cytotechnology. 2013; 65(2): 157-72.