ارزیابی اثرات توکسیسیتی و ضد سرطانی فراکشن های حاصل از زهر مار کبری ایرانی Naja naja oxiana بر رده سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد Jurkat E6.1))

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران مرکز، دانشکده علوم پایه، گروه آموزشی بیوشیمی، تهران، ایران

چکیده

هدف: سرطان یک بیماری تهدید کننده زندگی که توسط تمایز کنترل نشده و تکثیر‫ی تعیین شده است. شیمی درمانی روش معمول در درمان سرطان است، اما تومورها اغلب به شیمی درمانی که منجر به عوارض جانبی بسیاری نیز می‫شود مقاومت نشان می‫دهند. بسیاری از سموم بیولوژیکی دارای ترکیبات فعال با فعالیت ضد توموری می‫باشند. این مطالعه جهت جستجوی یک عامل ضد سرطان از زهر مار کبری ایرانی انجام شد.
مواد و روشها: ابتدا زهر مار کبری ایرانی (Naja naja oxiana) لیوفیلیزه و سپس با استفاده از روش BCA تعیین غلظت شد. از روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (FPLC) و تعویض یونی، SDS-PAGE، جهت تخلیص زهر استفاده شد. فعالیت ضد سرطانی فراکشن‫ها توسط تست MTT بر روی سلول Jurkat E6.1) ) بررسی شد.
نتایج: پیک سوم از کروماتوگرام FPLC دارای بیشترین اثر سمیت بود و جهت کروماتوگرافی تعویض یونی انتخاب شد. چهار پیک آنیونی و یک پیک کاتیونی جمع آوری شد. پیک دوم از کروماتوگرافی تعویض آنیونی دارای اثر سمی 1±43 درصد در مقدار5/1 میکروگرم بود. این فراکشن در سلول نرمال سمیتی حدود 1±8 درصد از خود نشان داد (05/0p≤).
نتیجه گیری: ترکیبات ضد سرطان طبیعی مشتق شده از سم Naja naja oxiana می‫تواند در  مبارزه با سرطان کمک کننده باشد. این اولین گزارش از فراکشن ضد سرطان از مار کبری ایرانی با اثر سمیت بر روی سلول Jurkat E6.1 و اثر سمیت کمتر بر روی ی نرمال است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سالیانه منابع زیادی در پیشگیری، تشخیص و درمان سرطان سرمایه گذاری شده و تمرکز اصلی بسیاری از شرکت‫های داروسازی بر توسعه و کشف عوامل ضد سرطان است در حال حاضر بسیاری از محققین در سراسر دنیا ترکیبات ضد سرطانی متنوعی را شناسایی کرده اند که از سموم زیستی جدا شده اند (1).

سرطان خون علت اصلی مرگ مرتبط با سرطان در کودکان است، میزان بروز این نوع سرطان 3/34 مورد در

هر یک میلیون نفر می باشد (2). گزینه‫های درمان سرطان خون (لوسمی حاد) به‫طور اختصاصی در درجه‫ی اول شامل‫، شیمی درمانی است و گاهی و از پرتو درمانی هم به‫عنوان مکمل استفاده کرد. داروهایی که برای شیمی درمانی استفاده می‫شود علاوه بر ی بدخیم‫، ی سالم را نیز تحت تاثیر قرار می‫دهد و بیش از همه بر روی بافت‫های فعال و در حال رشد مانند مغز استخوان اثر زیان بخش می‫گذارد (3). عوارض جانبی سمی و ظهور مقاومت دارویی از مشکلات عمده مواجه با شیمی درمانی است. بسیاری از بیو توکسین‫ها فعالیت ضدتوموری دارند. بعضی مستقیما سلول توموری را از بین می برند و بعضی مانع آنژیوژنز تومور شده و رشد تومور را مهار می‫کنند (1). این پروتئین‫ها می‫توانند سمی یا غیرسمی باشند. زهر مار در In vivo  و In vitro اثر مهاری بر روی تومور داشته و ممکن است در درمان سرطان کاربرد داشته باشد (1و4).

القای آپوپتوزیس مهم‫ترین مکانیسم بسیاری از عوامل ضد سرطان است (4). با توجه به اینکه ونوم مار شامل ترکیبات وسیعی است که سبب آپوپتوزیس و متاستاز سلولی می‫شود، می‫توان به توسعه‫ی یک داروی جدید ضد سرطان از ونوم مار در آینده امیدوار بود (1و4).

Disintegrin (یک گروه از پروتئین‫های متصل شونده به اینتگرین) که در ونوم بعضی از مارها یافت شده اند در پروسه‫ی کشندگی سلولی و مهاجرت آن‫ها دخالت کرده و در درمان سرطان و مهار متاستاز نقش دارند (5). هدف از این تحقیق جداسازی اجزای زهر مار کبری ایرانی به‫روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و تعویض یونی و بررسی اثر ضد سرطانی فراکشن‫های به‫دست آمده بر رده سلولی سرطان خون  Jurkat E6.1 می‫باشد و اثر فراکشن خالص تر بر تکثیر ی سرطانی نیز بررسی می‫شود. رده سلولی شاهد HEK-293 بوده و محدوده وزن مولکولی فراکشن موثر با SDS-PAGE مشخص خواهد شد.  

 

مواد و روش‌ها

زهر لیوفیلیزه شده‫ی مار کبری ایرانی در آزمایشگاه ونوم و بیومولکول‫های درمانی انستیتو پاستور موجود بود که به‫روشmilking  بر طبق توصیه سازمان WHO  زهرگیری انجام شده بود (6).

به‫منظور تخلیص زهر مار کبری ایرانی به‫روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، ابتدا 200 میلی گرم از زهر خام در 2 میلی لیتر آمونیوم استات (MERK آلمان)  mM 20 )8 (pH: حل شد و محلول به‫مدت 5 دقیقه با دورg 13000 جهت حذف پارتیکل‫ها سانتریفوژ شد و مقدار پروتئین محلول اندازه‫گیری شد. متعادل سازی ستون سفاکریل 60/16Sephacryl 200- HR- HiPrep S  (شرکت GE آمریکا) (طول 60 سانتی‫متر و قطر 1.6 سانتی‫متر) از طریق شستشو با بافر آمونیوم استات 20 میلی‫مولار  انجام شد و زهر به دستگاه FPLC (شرکت GE - مدل AKTA10) تزریق شد. کروماتوگرافی با سرعت جریان 1 میلی‫لیتر در دقیقه انجام شد. فراکشن‫های زهر مار کبری ایرانی در طول موج 280 نانومتر و به صورت دستی جمع آوری شدند.

تغلیظ و لیوفیلیزاسیون فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی در دستگاه فریز درایر (شرکت Christ آلمان) صورت گرفت.

تعیین مقدار پروتئین نمونه‫ها بر اساس روش BCA و با استفاده از کیت مخصوص BCA (کمپانی Intronbio کره جنوبی) اندازه گیری شد. فراکشن‫های تغلیظ شده توسط آب مقطر تزریقی­­ رقیق شد و با بافرهای موجود در کیت مخلوط کرده و درون چاهک‫های میکروپلیت 96 خانه ریخته و در انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 30 دقیقه قرار داده شد. سپس عدد جذب هر یک از نمونه‫ها در طول موج 562 نانومتر قرائت شد (7).

جهت تعیین محدوده ی وزنی  فراکشن‫های به‫دست آمده، ابتدا فراکشن‫ها را با بافر نمونه مخلوط شده و در مدت زمان 3 تا 5 دقیقه حرارت غیر مستقیم داده و در ژل پلی اکریل آمید با ژل ((Resolving12 درصد و ژل (Stacking) 4 درصد، بر اساس روش لاملی الکتروفورز شدند (8).  پس از آماده سازی نمونه‫های پروتئینی، مقدار 20 میکروگرم از نمونه در هر چاهک دستگاه تانک عمودی (Bio-Rad) تزریق شده و در جریان 30 میلی آمپر به‫مدت 3 ساعت الکتروفورز شد. رنگ آمیزی ژل با رنگ کوماسی آبی 250  R صورت گرفت.

به‫منظور تخلیص بیشتر، مقدار یک میلی گرم از فراکشن شماره 3، به دستگاه FPLC (شرکت GE – مدل10 AKTA ) و ستون Mono Q (شرکت GE آمریکا - طول 10 سانتی‫متر و قطر 6/1 سانتی‫متر) تزریق شد. در این روش از کروماتوگرافی ابتدا پروتئین­هایی که جذب ستون آنیونی نشده بودند، از ستون خارج شده و بعد از اینکه این پروتئین‫ها کاملا خارج شدند، بلافاصله شیب غلظت (گرادیان نمک) NaCl  از صفر تا 1 مولار با 7pH: به‫مدت 60 دقیقه اعمال شد. جذب فراکشن‫ها در طول موج 280 نانومتر قرائت و منحنی جذب آن ثبت شد. کروماتوگرافی نیز با سرعت-جریان 1 میلی‫لیتر در دقیقه انجام شد. به‫منظور نمک زدایی از فراکشن­های به‫دست آمده، از لوله فالکن دیالیز (Milli pore ) استفاده و سپس به‫روش فوق لیوفلیزه شد. همچنین اندازه‫گیری مقدار پروتئین با استفاده از کیتBCA  مطابق روش ذکر شده، انجام پذیرفت و  الکتروفورز  (SDS-PAGE) بر اساس روش لاملی انجام شد.

کشت و نگه‫داری رده سلولها رده سلول سرطانی Jurkat E6.1 و سلول نرمال293 HEK- از بانـک سلولی انسیتو پاستور ایران تهیه و در محـیط کـشت 1640RPMI  (Gibco)  حـاوی10 درصد سـرم جنـین گـاوی‫(FBS)، محلول پنیـسیلین U/ml 100 - استرپتومایسین µg/ml) 100) و mM  2– L گلوتـامین کـشت داده شدند. سپس در انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد و در مجاورت 2CO پنج درصد نگه‫داری و هر سه روز محیط کشت آ‫ن‫ها تعویض شد (9و10).

اثرسمیت سلولی فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی (ژل فیلتراسیون و تعویض یونی) بر روی ی سرطانی Jurkat E6.1 و شاهد رده 293-HEK  بررسی شد. برای این منظور هنگامی‫که حداقل 70 درصد ی سرطانی Jurkat E6.1 و رده‫ی شاهد در فلاسک کشت به رشد کامل رسیدند، به‫کمک تریپسینEDTA-  از کف فلاسک جدا شده و سانتریفوژ شد. پس از شمارش ی زنده در سوسپانسیون سلولی توسط لام نئوبار، تعداد  104×2  سلول به هر چاهک میکروپلیت 96 خانه منتقل شد و یک گروه کنترل نیز در نظر گرفته شد. مقادیر مختلف از هر فراکشن کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و تعویض یونی به‫ترتیب (125- 97 /0) و (6- 04/0) میکروگرم به‫هر یک از چاهک‫های گروه تست اضافه شد پس از انکوباسیون 24 ساعته جذب فراکشن ها در طول موج 570 نانومتر توسط ( دستگاه Epoch  شرکت BioTek آمریکا) ثبت شد و به این‫ترتیب فراکشن موثر و دارای بیشترین اثر سیتوتوکسیک انتخاب شد.

بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی فراکشن کاندید بـه‫روش رنـگ سـنجی، بـا استفاده از MTT  (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) انجام شد (20). اساس ایـن روش بر پایه‫ی فعالیت آنزیم سوکـسینات دهیـدروژنـاز میتوکنـدریایی ی زنده استواراست، که در این روش محلول زرد رنگ MTT بـه کریستال‫های بنفش رنگ فورمازان تبدیل می‫شود و پس از حل کردن درDMSO  می‫توان آن‫ها را در دستگاه الایزا ریـدر مـــورد ســـنجش قـــرار داد (11).

برای هر غلظت از فراکشن کاندید، 3 تکرار انجام شد و درصد سمیت سلولی در گروه کنترل منفی 100 در نظر گرفته شد و از فرمول  زیر محاسبه صورت گرفت (12و13).

 

 

 

 

 

آنالیز آماری

نتایج بر اساس میانگین± انحراف معیار با استفاده از از نرم افزار آماری16 SPSS گزارش و رسم نمودار ها با نرم افزار Excel انجام شد. جهت بررسی و تجزیه و تحلیل آماری داده ها از آزمون student t-test  استفاده شد (05/0> p)

 

نتایج

در مرحله‫ی اول تخلیص، نتایج کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون 200 میلی گرم زهر مار کبری ایرانی در (شکل 1) نشان داده شده است. به این‫صورت که 6 فراکشن مجزا به‫ترتیب وزن مولکولی در مدت زمان 130 دقیقه از ستون خارج و جمع آوری شدند (شکل 1).

 

 

 

شکل 1:  فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون زهر مار کبری ایرانی. 6 فراکشن با شدت جریان 1میلی لیتر در دقیقه مشاهده و جمع آوری شد. ستون مورد استفاده سفاکریل (S-200) و باقر آمونیوم استات  20 mM بود.

 

 

 

نتیجه‫ی الکتروفورز (SDS-PAGE) و تعیین وزن مولکولی فراکشن هدف تخلیص شده و پروتئین استاندارد به کار گرفته شده در محدوده‫ی وزنی 9 تا 170 کیلو دالتون جهت تعیین وزن مولکولی  با استفاده از ژل  12

 

درصد در (شکل2) نشان داده شده است. فراکشن‫های اول دارای وزن مولکولی بیشتر و فراکشن انتهایی دارای وزن مولکولی کمتر نشان دهنده‫ی این مهم بود که پروتئین و پپتید‫هایی با وزن مولکولی متفاوت در ساختار ونوم مار کبری وجود داشت (شکل 2).

 

 

 

شکل2:  تعیین وزن زهر خام مار کبری  ایرانی و فراکشن‫های حاصل از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون زهر به‫روش

  SDS-PAGE  با استفاده از ژل پلی آکریل آمید 12 درصد

 

 

بررسی اثر سمیت سلولی فراکشن‫های به‫دست آمده از FPLC با استفاده از تست MTT در (شکل 3) قابل مشاهده است. در این تست فراکشن شماره 3 حاصل از

 

کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون در مقدار 125 میکروگرم دارای بیشترین اثر سمیت بر روی رده‫ی سلولی Jurkat E6.1 کشت داده شده بود (شکل 3). 

 

 

 

 

 

شکل3: بررسی اثر سمیت فراکشن های حاصل از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و زهر خام مار کبری ایرانی به‫روش MTTرا نشان می‫دهد. فراکشن 3(F3) دارای بیشترین میزان اثر سمی نسبت به دیگر فراکشن‫ها بر روی رده ی سلولی Jurkat E6.1 بود. مقادیر موجود در نمودار معادل Mean ±SD    (05/0p≤) است.

 

 

 

 

 

پس از بررسی تست سمیت فراکشن سوم حاصل از  FPLC، تخلیص مجدد با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی و ستون Mono Q انجام شد و نتایج در شکل 4

 

 

نشان داده شده است. در این مرحله 4 فراکشن در محدوده‫ی آنیونی مشاهده و جمع آوری شد. پیک‫های محدوده‫ی کاتیونی نیز جدا سازی شد.

 

 

 

 

شکل4: فراکشن‫های به‫دست آمده با روش کروماتوگرافی تعویض یونی (ستون Mono Q) در مدت زمان 100 دقیقه و با استفاده از بافر Tris-Hcl 20Mm و NaCl 1M جمع آوری شدند.

 

 

 

پس از جدا سازی فراکشن‫های حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی و انجام لیوفیلیزاسیون‫، با استفاده از روش

 

 

 

الکتروفورزSDS-PAGE  وزن مولکولی فراکشن هدف (F2) در حدود 47 کیلو دالتون بر آورد شد و به‫صورت باند تک در شکل 5 قابل مشاهده است.

 

 

 

47kDa

 

 

شکل5: الکتروفورز SDS-PAGE  فراکشنF2  حاصل ازکروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از ژل پلی آکریل آمید12 درصد را نشان می‫دهد.

 

اثر سمیت سلولی فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی نشان داد که فراکشن F2 در

 

مقدار 5/1 میکروگرم بیشترین اثر را بر روی رده‫ی سلولی Jurkat E6.1  داشت. نتایج در شکل  6  آمده است.

 

 

 

 

شکل6 :نتایج تست بررسی اثر سمیت سلولی (MTT ) فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی فراکشن 3 F بر روی سلول‫های سرطانی رده Jurkat E6.1 . فراکشن 2 (F2) در مقدار 5/1 میکروگرم بیشترین اثر را از خود نشان داد.  داده های موجود در نمودار معادل Mean ±SD  (P ≤ 0.05) است.

 

 

بررسی اثر سمیت سلولی (توکسیسیته ) فراکشن F2 به‫دست آمده ازکروماتوگرافی تعویض یونی بر رده‫ی ی شاهد   HEK-293 و رده‫ی سلولی Jurkat E6.1 در شکل 7 آمده است. در این بررسی مشخص شد که فراکشن F2 دارای کمترین اثر سمی به‫میزان 8 درصد بر روی رده‫ی سلولی شاهد‫ بود.

 

 

 

 

شکل7: مقایسه درصد سمیت سلولی فراکشن 2 F  در تست MTT   بر رده سلول سرطانی Jurkat E6.1 و سلول  شاهد 293  HEK- انسانی. اطلاعات موجود در نمودار معادل Mean ±SD  (05/0p≤) است.

 

 

 

 

یافته‫های حاصل از ارزیابی اثر فراکشن F2 حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی در مقادیر مختلف 6 تا 18/0

میکروگرم بر روی سلول نرمال 293HEK-   و ی سرطانی Jurkat E6.1 در شکل7 بیانگر این مهم است که فراکشن 2F  بر روی سلول‫های سرطانی Jurkat E6.1 در مقدار 5/1 میکروگرم‫، دارای اثر سایتوتوکسیسیتی قوی‫تر و به‫میزان 43 درصد بود.

 

بحث

سرطان تقسیم نا متقارن سلول‫های بدن است. سلول‫های سرطانی از ساز وکار‫های عادی تقسیم و رشد سلول‫ها جدا می‫افتند. سرطان پس از آسیب ژنتیکی به DNA گسترش می‫یابد. این آسیب ژنتیکی بر روی عملکرد طبیعی سلول از جمله تکثیر سلولی مرگ سلولی برنامه ریزی شده (آپوپتوزیس) و ترمیم DNA تاثیر می‫گذارد و در نهایت منجر به تولید تومور می‫شود که آن قسمت را از کار می اندازد و به قسمت‫های دیگر نیز متاستاز می‫دهد (14). آمارهایی که توسط NCI و انجمن سرطان آمریکا در سال 2015 برآورده شده است، سالانه 5/2 نفر در هر 100.000 نفر مبتلا به سرطان لوسمی حاد می شوند که از این میزان درصد ابتلا جنس مذکر نسبت به مونث 52 درصد در مقابل 48 درصد می‫باشد. میزان شیوع سرطان ALL در آمریکا و اقیانوسیه بیشتر از مناطق آسیایی و شرق اروپا می باشد ( 15و 19).

محققین در پی رسیدن به ترکیبات و فرمولاسیون‫هایی هستند که بتواند جایگزین این نوع داروهای شیمیائی و کاهش عوارض جانبی آن‫ها شوند. یک استراتژی مهم جهت توسعه داروهای ضد سرطان، مطالعه عوامل ضد سرطان به‫دست آمده از منابع طبیعی است (16و21). از گذشته به‫طور سنتی بشر می‫داند که از زهر جانوران سمی از جمله مار می‫تواند دارو تهیه کند. پژوهشگران در چند دهه اخیر دست به تحقیقات مختلفی جهت دست یابی به فراکشن خالص ضد سرطانی زده اند. اکثر این فراکشن‫ها دارای اثر سمی بر سلول‫های سرطانی بودند اما مشکل این تحقیقات این بود که این فراکشن‫های پپتیدی یا پروتئینی دارای اثر سمی بر سلول‫های نرمال بدن بودند. این ویژگی زهر، تحقیقات مرتبط با سرطان را با چالش مواجه کرد و کیفیت تحقیقات در این زمینه را کاهش داد.

ونوم بعضی مارها حاوی مولکول Disintegrin  است که دارای ساختار‫های مختلف و ویژگی‫های خاص هستند که ابتدا از ونوم  مارهای Viperidae  جدا شد و بعد‫ها در ونوم مارهای دیگر نیز دیده شد (5 و 20). Disintegrin‫های موجود در زهر مارها دارای افینیتی بالایی جهت چسبیدن به اینتگرین‫ها می‫باشند. اینتگرین‫ها مولکول‫های پروتئینی هستند که به‫طور طبیعی در سطح سلول‫های متحرک بدن وجود داشته و ابزار حرکتی آن‫ها می‫باشند. این مولکول‫ها را می‫توان در غشای پلاسمایی نوتروفیل‫، مونوسیت‫، سلول‫های اندوتلیال و سایر سلول‫ها یافت. تجمع اینتگرین بر روی سلول‫های عادی بسیار کمتر از سلول‫های متحرک است. در بعضی از سرطان‫ها بیان ژن اینتگرین‫ها به‫صورت نابه‫جا افزایش می‫یابد و لذا سلول به‫صورت غیرطبیعی می‫تواند دارای ویژگی تحرک بوده و از بستر خود جدا شده و به مناطق اطراف مهاجرت کند (22 و 23). وجود این مولکول‫ها در زهر خانواده کبری ثابت شده  و لذا این تحقیق جهت جستجوی یک فراکشن ضد متاستاز با خاصیت ضد سرطانی هدف گذاری شد. مریم کاکنج  و همکاران (17)  در دانشگاه شهید بهشتی مطالعاتی را بر روی سم گرزه مار انجام دادند. در این مطالعه با استفاده از تست MTT  مشخص شد که سم خالص گرزه مار بر روی سلول‫های بند ناف ورید اندوتلیال انسانی (HUVECS) اثر کشندگی دارد. در حالی‫که در مطالعه‫ی حاضر با استفاده از تست MTT  بر روی سلول نرمال (شاهد)  اثر کشندگی دیده شد و بر روی سل لاین سرطان خون Jurkat E6.1 تا مقدار 04/0 میکروگرم دیده شد. همچنین در این مطالعه که بر روی سلول‫های (HUVECS) انجام دادند تغییرات مورفولوژیک سلول‫ها در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. در حالی‫که در تحقیق حاضر، این تغییرات مشاهده نشد. همچنین در طی مطالعه ای که توسط کولیپارا و همکاران (18) صورت گرفت و اثرات NK cells  های فعال شده توسط سم را بر روی سل لاین‫های A549  و NCI-H 460  سرطان ریه صورت گرفت که سبب مهار قابل توجهی در رشد سلول‫های سرطانی ریه و ممانعت از اتصال به DNA  و آزاد سازی سایتوکاین‫ها و گرانول‫ها که منجر به جلوگیری از پرولیفراتیو سلول‫ها و آپوپتوزیس می شود را نشان داد لیکن به‫دلیل عدم استفاده از سلول نرمال شاهد نمی‫توان نتیجه‫ای جامع از این تحقیقات به‫منظور دست یابی به اطلاعات دست یابی به اطلاعات تکمیلی جهت انجام مطالعات فاوماکولوژیک به‫دست آورد.

لیانگ ژانگ و لیجون وی (24)، مطالعه ای بر روی مار  Agkistrodonacutus و بررسی روند القای آپوپتوزیس در سرطان دهانه ی رحم انجام دادند و به نتایج قابل قبول و اثر مطلوب سم مار بر روند القای آپوپتوزیس بر سلول‫های سرطانی دهانه ی رحم دست یافتند. با این‫حال به‫دلیل عدم استفاده از سلول نرمال شاهد‫، نمی‫توان نتیجه‫ای جامع از این تحقیقات به‫منظور دست‫یابی به اطلاعات تکمیلی جهت انجام مطالعات فارماکولوژیک‫، به‫دست آورد.

OnsZakraui و همکاران (25) به بررسی اثر لبئین حاصل از ونوم مار Marcroviperalebetina روی سلول‫های سرطانی کولون انسانی به‫صورت In vivo و In vitroپرداختند. در این بررسی نتایج مشابهی مشاهده شد و لبئین که نوعی دیس اینتگرین می‫باشد باعث مرگ 56 درصدی سلول و القای آپوپتوزیس، کاهش چسبندگی و مهاجرت سلولی در سلول‫های174 LS و همچنین مانع گسترش آدنو کارسینومای کولون انسانی در موش شد.

در پژوهشی دیگر آنتونی ساویولا و همکاران (26) اثر Tzabcanin استخراج شده از سم مار زنگی آسیای میانه (C.simustzabcan) را روی سلول‫های سرطانی ملانوما 375 A- و ریه 549 A- مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه  اثر سایتوتوکسیسیتی قابل ملاحظه ای مشاهده نشد. Tzabcanin در بروز اثر ضد چسبندگی نیز با شکست مواجه شده ولی توانست در ممانعت از مهاجرت سلولی موفق عمل کند.

نتایج مطالعه‫ی ما بر روی زهر مار کبری ایرانی نشان داد که فراکشن‫های به‫دست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی دارای اثرات ضد سرطانی به‫صورت اثر سمیت سلولی و کشندگی بر روی سلول‫های سرطان خون  Jurkat E6.1است، در حالی‫که بر سلول‫های نرمال ، دارای حداقل اثرات سمیت سلولی است و با توجه به یافته‫های حاصل از این مطالعه پیشنهاد می‫شود که فعالیت ضد سرطانی و القای آپوپتوزیس پروتئین نوترکیب حاصل از فراکشن هدف و همچنین انجام مطالعه در مرحله‫ی In vivo  و اثر فراکشن فعال بر روی مدل حیوانی در ادامه‫ی فرآیند بررسی شود.

 

نتیجه گیری

با توجه به نتایج نشان داده شده از سمیت 43 درصدی بر روی سلول‫های سرطان   Jurkat E6.1و اثر سمیت کم (8 درصد) فراکشن2 Fحاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی بر رده ی سلول‫های شاهد، می‫توان بیان داشت که فراکشن به‫دست آمده دارای اثر سیتوتوکسیک و کشندگی قابل ملاحظه ای بر روی سلول Jurkat E6.1  بوده است. بنابراین در شرایطی که  بتوان داروی ضد سرطان از زهر مار کبری ایرانی به‫دست آورد با کمترین عارضه و در یک دوره درمانی مناسب می‫تواند موجب نابودی سلول‫های سرطانی شود.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش در آزمایشگاه ونوم و بیومولکول‫های درمانی (بخش بیوتکنولوژی) انستیتو پاستور ایران انجام شده است. بدین وسیله از راهنمایی و حمایت جناب آقای دکتر کامران پوشنگ باقری و سرکار خانم رویا میرزایی دانشجوی دکتری سم شناسی قدردانی می‫شود.

1. Ajit S. Narang , Divyakant S. Desai, Anticancer Drug Development. Pharmaceutical Perspectives of Cancer Therapeutics. 2009; 45: 49-92.

2. Murray & Nadel's Textbook of Respiratory Medicine. 5th eds. Alberg AJ, Samet JM; 2010; Chapter 46.". Saunders Elsevier.

3. Heloisa S. Selistre-de-Araujo, Carmen L. S. Pontes, Cyntia F. Snake Venom Disintegrins and Cell Migration. Toxins (Basel). 2010; 2(11): 2606–2621.

4. Kumar Vyas V, Brahmbhatt K, Bhatt H, Parmar U. Therapeutic potential of snake venom in cancer therapy: current perspectives. Asian Pac J Trop Biomed. 2013; 3(2): 156–162.

5. Lucena S, Castro R, Lundin C, Hofstetter A, et.al. Contortrostatin, a snake venom disintegrin with anti-angiogenic and anti-tumor activity. Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34(4-5):169-76.

6. Abubakar M, Sule M, Pateh U, Abdurahman E, et al. In vitro snake venom detoxifying action of the leaf extract of Guiera senegalensis. Journal of ethnopharmacology. 2000; 69(3):25.

7. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. J Biol chem. 1951; 193(1): 265-75

8. Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 .Nature.1970; 227(5259): 680-685.

9. Freidberg R. An investigation into the antimicrobial and anticancer activities of Geranium incanum, Artemisia afra and Artemisia absinthium: Nelson Mandela Metropolitan University; 2009. 13: 1-245.

10. Ian A, Cree MB, Ch B. editor .cancer cell culture .New York :Springer ; 2011.

11. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival Application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunollogical Methods.1983; 65(1-2): 55-63.

12. Masters R. Animal cell culture cytotoxicity and viability assays. New York: Oxford University Press; 2000.

13. Shang ZJ, Li ZB, Li JR. In vitro effects of nitric oxide synthase inhibitor L-NAME on oral squamous cell carcinoma: a preliminary study. International journal of oral and maxillofacial surgery. 2006; 35(6): 539-43.

14. Holland-Frei Cancer Medicine 8th eds. People's Medical Publishing House USA.Brown,KM,keats JJ, sekulic A et al; 2012.

15. Katz AJ, VM, SchoovenWM et al. Cancer Causes Control. 2015; 26: 1627.

16. Riyasat Ali, Zeenat Mirza, Ghulam MD, Ashraf,et al. New Anticancer Agents: Recent Developments in Tumor Therapy. Anticancer reserch. 2012; 32: 2999-3006.

17. Kakanj M, Ghazi-Khansari M. Abbas Zare Mirakabadi, Bahram Daraei and Hossein Vatanpour. Cytotoxic Effect of Iranian Vipera lebetina Snake Venom on HUVEC cells. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2015; 14

(Supplement): 109-114.

18. Cui-Cui, Yang H, Zhang L, Zhang, Bo Chen Q, Wang Y. biotoxins for Cancer Therapy.Asian Pac J Cancer Prev. 2014;15(12):4753-8.

19. International Journal of Cancer.Ferlay, J; Shin HR ,Bray F et al. (December 2010)

20. Leonardo A. Calderon, Juliana C. Sobrinho, Kayena D. Zaqueo, Andrea A. de Moura, Amy N. Grabner, Maurício V. Mazzi, Silvana Marcussi,et al. Heloisa S. Selistre-de-Araujo,* Carmen L. S. Pontes, Cyntia F. Montenegro, and Ana Carolina B. M. Martin, Snake Venom Disintegrins and Cell Migration. Toxins (Basel). 2010; 2(11): 2606–2621.

21. Mirzaei R, Shahbazzadeh D, Pooshang Bagheri K , [Anti-cancer Activity of Fractions Derived from Venom of Iranian Cobra Snake ( Naja naja oxiana ) on Breast Cancer Cell Line 4T1], Iranian Journal of Infectious Diseases. 2016; 74: 7-19 (Text in Persian).

22. Chessum N, Jones K, Pasqua E, Tucker M. Recent Advances in Cancer Therapeutics, Progress in Medicinal Chemistry. 2015; 54: 1–63.

23. Thangam R, Gunasekaran P, Kaveri K, Sridevi G, et al. A novel disintegrin protein from Naja naja venom induces cytotoxicity and apoptosis in human cancer cell

 

lines in vitro. Process Biochemistry. 2012; 47(8): 1243-9.

24. Zhang L , Wei LJ, Fox JW, Naito M, Tsuruo T., Molecular cloning and functional analysis of apoxin I, a snake venom-derived apoptosis-inducing factor with L-amino acid oxidase activity. Biochemistry. 2000; 39(12):3197-205

25. Zakraoui O, Marcinkiewicz C, Aloui Z, Othman H, Grépin R, Haoues M, et al. Lebein, a snake venom disintegrin, suppresses human colon cancer cells proliferation and tumorinduced angiogenesis through cell cycle arrest, apoptosis induction and inhibition of VEGF expression. Molecular carcinogenesis. 2016.

26. Saviola AJ, Burns PD, Mukherjee AK, Mackessy SP. The disintegrin tzabcanin inhibits adhesion and migration in melanoma and lung cancer cells. International journal of biological macromolecules. 2016; 457: 64-88.