بررسی اثر حفاظت نورونی عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع Mentha pulegiumبر دژنراسیون نورون های حرکتی نخاع پس از کمپرسیون عصب سیاتیک در رت های نر نژاد ویستار

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

گروه زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، مشهد، ایران

چکیده

هدف:  این پژوهش به‫منظور بررسی اثرات محافظت نورونی عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع بر دژنراسیون نورون‫های حرکتی آلفای شاخ قدامی نخاع، پس از کمپرسیون عصب سیاتیک در رت انجام شد.
مواد و روشها: در این مطالعه 30 سر رت نر نژاد ویستار با وزن 200 تا 250 گرم به‫صورت تصادفی به 5 گروه کنترل، کمپرسیون و گروه‫های تیمار با دوز های 50، 70 و 100 میلی‫گرم عصاره هیدروالکلی نعناع تقسیم شدند. به‫منظور ایجاد کمپرسیون، عصب سیاتیک با استفاده از قیچی قفل دار به‫مدت 60 ثانیه در معرض کمپرسیون قرار گرفت. عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع به‫صورت تزریق درون صفاقی طی هفته‫های اول و دوم پس از کمپرسیون صورت گرفت، پس از 28 روز از زمان کمپرسیون رت‫ها تحت متد پرفیوژن از نخاع کمری ناحیه L4 تحت نمونه برداری قرار گرفتند و پس از نمونه برداری نخاع ناحیه کمری، دانسیته نورون‫ها با روش دایسکتور و متد استریولوژی محاسبه و نتایج گروه ها با هم مقایسه شدند.
نتایج : دانسیته نورونی در گروه کمپرسیون نسبت به کنترل کاهش معنی‫دار و در گروه های تیمار نسبت به کمپرسیون افزایش معنی‫دار نشان داد  (001/0p

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نورون‫ها تحت تاثیر عوامل فیزیکی، شیمیایی و پاتولوژیک دچار صدمه می‫شوند و تخریب(degeneration)  آن‫ها یک صدمه دائمی محسوب می‫شود (1). هر نورون یک واحد عملکردی و ساختمانی است و سلول‫هایی هستند که برای ارسال و دریافت علایم تخصص یافته‫اند. قسمتی از سلول که حاوی هسته می‫باشد، جسم سلول نامیده می‫شود و سیتوپلاسم این قسمت پریکاریون نام دارد (2). هنگامی‫که یک عصب قطع می‫شود، ارتباط آکسون با جسم سلولی قطع شده و قطعه دیستال آن از محل ضایعه تا انتها شروع به دژنراسیون هم‫زمان می‫کند. به‫علاوه دژنراسیون تا اولین گره رانویه به‫سمت پروگزیمال نیز ادامه می‫یابد که این فرایند را دژنراسیون والرین می‫گویند (3). چنانچه میزان تخریب بخش پروگزیمال شدید باشد اثرات ضایعه رو به عقب به‫سوی جسم سلولی توسعه یافته و سبب دژنراسیون مرکزی (تخریب جسم سلولی) می‫شود، اجسام نیسل شکسته شده و در سرتاسر سیتوپلاسم پراکنده می‫شود که این فرآیند را کروماتولیز گویند. همچنین هسته از موقعیت مرکزی خود به‫سمت محیط سلول تغییر مکان می‫دهد و جسم سلولی به‫دلیل تغییرات اسمزی متورم می‫شود (4). اگرچه نورون‌ها عموما پس از تولد فاقد قدرت تکثیر می‫باشند. اما می‫توانند در مقابل درجات معینی از ضایعات مقاومت کرده و بهبود یابند. اگر یک فیبر عصبی قطع شود هم در اعصاب محیطی و هم در اعصاب مرکزی تغییراتی ایجاد می‫شود که در صورت شدید بودن این تغییرات منجر به مرگ سلولی می‫شود (5). استفاده از ماده ای که در این مرحله بتواند شدت ضایعات را کاهش دهد و یا به روندهای التیامی شدت ببخشد، می‫تواند راه‫گشای بسیاری از مشکلات عصبی باشد. در این زمینه بهره جویی از عصاره‫های گیاهی به‫علت طبیعی بودن و نداشتن اثرات جانبی بر عملکرد سایر دستگاه‌های بدن مورد توجه اکثر محققان می‌باشد. یکی از گیاهانی که در روند ترمیم سیستم عصبی نقش دارد، گیاه نعناع است. نعناع با نام علمی Menthapulegium از خانواده نعناعیان(Lamiacace)  گیاهی علفی چند ساله با فرم خوابیده و یا خیزان، با ساقه‫های متعدد، از قاعده منشعب، پوشیده از کرک‫های متراکم گسترده، برگ‫ها با دمبرگ‌های کوتاه می‫باشد (6). گیاه نعناع دارای خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضدالتهابی است که منتول موجود در گیاه نعناع به‫طور اختصاصی تولید 3 مدیاتور اصلی التهاب توسط مونوسیت‫ها را مهار می‫کند (7). وجود منتول دارای اثر ضد التهابی بوده، که این ترکیب اثر خود را از طریق بلوکه کردن تولید پیش التهاب‌های بیوشمیایی مثل کولوترین و پروستاگلاندین اعمال کرده و نیز آزاد سازی هیستامین و دیگر میانجی‫های آلرژیک را مهار می‌کند. همچنین منتول موجود در عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع خاصیت آنتی اکسیدانتی اثبات شده‌ای دارد نشان داده شد با افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانتی ترکیب GSH و آنزیم GSH-Px و GR در گروه‌های حاوی منتول باعث کاهش میزان سیتوکین‌های التهابی مانند فاکتورهای نکروز کننده توموری آلفا (TNF-α)، اینترلوکین یک بتا (1L-1β) و اینترلوکین 6 (1L-6) جلوگیری می‌نماید (8).گیاه نعناع به‫علت دارا بودن فلاونول‌های بالا و ساختار فیتوشیمیایی آن فعالیت ضد میکروبی دارد که در درمان بیماری‫های انسان و پروسه‫های التهابی کاربرد دارد (9). نعناع حاوی غلظت بالایی از آنتی اکسیدانت‫ها می‫باشد که این گیاه حاوی بالاترین ترکیبات فنولیک و فلاونوئید است که فلاونوئیدها از طریق چلاته کردن یون‫های فلزی فعالیت آنتی اکسیدانتی خود را اعمال می‫کنند .با توجه به اثرات ضد التهابی و آنتی‌آپوپتوزی عصاره این گیاه احتمال می‌رود که بتوان از آن جهت کاهش شدت ضایعات عصبی و یا بهبود روند ترمیم استفاده نمود (10). بر این اساس این تحقیق با هدف بررسی اثر حفاظت نورونی عصاره هیدروالکلی نعناع بر دانسیته نورون‌های آلفای شاخ قدامی نخاع پس از کمپرسیون عصب سیاتیک در موش‫های صحرایی نر انجام شده است.

 

مواد و روش‌ها

به‫‌منظور رعایت اصول اخلاقی، کار بر روی حیوانات بر اساس پروتوکل هلسینکی و دستور کار انجمن علوم اعصاب آمریکا انجام شد (11). گیاه نعناع به‫طور دستچین از استان خراسان رضوی و توابع شهرستان نیشابور جمع‫آوری شد. این گیاه توسط مرکز هرباریوم دانشکده علوم دانشگاه آزاد مشهد با کد 9828 مورد تایید قرار گرفت. بعد از شستن با آب معمولی، اجزای گیاه در سایه خشک شدند. سپس به‫صورت پودر جمع آوری شدند. 50 گرم از پودر خشک گیاه نعناع داخل کاغذ مخصوص کارتوش ریخته و در دستگاه سوکسله قرار داده شد. سپس 150 میلی‫لیتر آب مقطر و 150 میلی‫لیتر اتانول 96 درصد در محفظه مخصوص دستگاه ریخته شد. همچنان که کیسه حرارتی دستگاه، آرام آرام گرم می‌شود حلال (آب و الکل) نیز گرم شده و عصاره گیاه نعناع با حلال مخلوط گشته و به بالن بر می‌گردد. بدین ترتیب از حجم کل محلول کاسته نمی‌شود. عصاره‌گیری در 10 ساعت صورت گرفت تا اطمینان حاصل شود که تمام عصاره قابل حل در حلال از پودر استخراج شده است (12). در نهایت 34/6 گرم عصاره خشک به‫دست آمد بازده روش 68/12 درصد بود. موش‌های صحرایی نر از بخش حیوانات دانشکده پزشکی دانشگاه فردوسی مشهد خریداری شدند. تا زمان انجام آزمایش حیوانات در شرایط نوری استاندارد روزانه و درجه حرارت 22 تا 24 درجه سانتی‌گراد در اتاق حیوانات دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد نگه‫داری شدند. آب مورد نیاز حیوانات از آب آشامیدنی شهر و غذای آن‌ها نیز دارای فرمول استاندارد و از شرکت جوانه خراسان تهیه شد. در این تحقیق 30 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 250 تا 300 گرم به شش گروه 5 تایی کنترل، کمپرسیون، کمپرسیون + تیمار با دوز50 میلی گرم (A)، کمپرسیون + تیمار با دوز 75 میلی‫گرم .(B) کمپرسیون+ تیمار با دوز 100میلی گرم (C) تقسیم شدند. به‫صورت تجربی در مطالعات قبلی اثبات شده است که این دوز‫هامی‫تواند موثر باشد (13).

عصاره در 2 نوبت در روزهای اول هم‌زمان با کمپرسیون و در روز هفتم به‌‫صورت درون صفاقی تزریق شد. رت‌های هر گروه با تزریق داخل صفاقی ماده بیهوشی زایلازین 6 میلی‌گرم و کتامین 60 میلی‫گرم به نسبت وزن بدن بی‫هوش شدند، سپس عصب سیاتیک پای راست در ناحیه سر استخوان ران توسط پنس قفل‌دار (قفل دوم برای 60 ثانیه) تحت کمپرسیون قرار گرفت (13). پس از کمپرسیون محل ضایعه ضدعفونی و توسط گیره فلزی بخیه زده شد. بعد از این که موش‌ها هوشیاری اولیه خود را به‫دست آوردند به قفس‌های جداگانه منتقل و در شرایط استاندارد اتاق حیوانات از نظر نور، دما و رطوبت نگه‫د‫اری شدند. در گروه‌های تیمار اولین تزریق عصاره بلافاصله بعد از انجام عمل کمپرسیون انجام شد و دومین مرحله تزریق درون صفاقی عصاره در گروه‌های تیمار 7 روز پس از اولین تزریق صورت گرفت. 28 روز پس از کمپرسیون از قطعات نخاعی مربوط به عصب سیاتیک (L4-L6) نمونه برداری انجام شد (13). از آنجا که بافت عصبی بافتی حساس است و سریعا دچار فرآیند‫های اتولیز می‫شود و علاوه بر این تثبیت کننده به‫علت وجود پرده‫های سخت اطراف نخاع نیز به‫خوبی در آن نفوذ نمی‫کند. برای تثبیت از روش پرفیوژن استفاده شد. در این روش در حیوان بی‫هوش، تثبیت کننده (فرمالین 10 درصد نمکی) در بستر‫های عروقی جریان می‫یابد (14). پس از اتمام پرفیوژن، نمونه برداری از نخاع انجام شد. ابتدا با قیچی ناحیه قفسه سینه باز شده تمام محتویات قفسه سینه و شکم خارج می‫شود سپس در ناحیه مهره‫های قفسه سینه با اسکارپل ستون مهره‫ها به‫طور عرضی برش خورده و به‫آرامی با قیچی نوک باریک سطح شکمی مهره‫ها تا انتهای ستون مهره‫ها  برش خورده و برداشته شده و نخاع به‫صورت کامل خارج می‫شود. برای یکسان بودن نمونه برداری در همه نمونه‫ها،  نخاع به‫طور کامل تا انتهای دم اسب جدا شد و از انتهای دم اسب به اندازه 18 میلی‫متر بالا رفته و نمونه‫هایی به‫طول 8 میلی‫متر تهیه شد. نمونه‫های تهیه شده به‫مدت 2 هفته درون فیکساتور قرار گرفته و پس از آن وارد مرحله پاساژ بافتی شدند. نمونه‫ها پس از طی مراحل پاساژ وارد مرحله برش‫گیری شده، برش‫گیری با استفاده از دستگاه میکروتوم انجام شد. برش‫گیری به‫صورت سریالی صورت گرفت به این صورت که از هر 30 برش 3 برش متوالی بر روی لام قرار گرفت و در نهایت از هر نمونه 30 لام تهیه شد. و برش‫های سریال 7 میکرونی تهیه شده با آبی تولوئیدین و ائوزین رنگ آمیزی شدند (14). با استفاده از دستگاه فتومیکروسکپ از منطقه شاخ قدامی نخاع در سمت راست در لام‫های تهیه شده، از 2 برش متوالی عکس‫هایی تهیه شد برای شمارش نورون‫های حرکتی آلفا شاخ قدامی نخاع در سمت راست، از روش دایسکتور استفاده شد. در این روش در یک چهار چوب مرجع نورون‫ها شمارش می‌‫شوند. اگر ذره‫ای در چهار چوب مرجع باشد ولی در چهار چوب بعدی (در برش متوالی بعدی) نباشد، در شمارش به‫حساب می‫آید، اما اگر نورونی در هر دو چهار چوب باشد، در شمارش محسوب نمی‫شود (15).

 

آنالیز آماری

برای بررسی داده‫ها به پارامتر دانسیته نورون‫ها (ND) نیاز بود که از طریق فرمول زیر محاسبه شد (15).

ND=åQ/åFrame × V dissector

Q∑: مجموع نورون­های شمارش شده در یک نمونه

frame∑: مجموع دفعات نمونه ­برداری شده

V dissector: حجم چهارچوب نمونه­برداری که برابر است با:

Vdissector =A Frame×H

:A Frame مساحت چهارچوب نمونه ­برداری

H: فاصله بین دو برش یا ضخامت هر برش

 

نتایج

شمارش نورون‫های حرکتی آلفا و دانسیته نورونی در شاخ قدامی نخاع در گروه‫های مختلف نشان داد که پدیده کمپرسیون باعث کاهش معنی‫دار دانسیته نورونی در نورون‌های شاخ قدامی نخاع پس از کمپرسیون نسبت به گروه کنترل شده (001/0p<) و در گروه‫های تیمار در مقایسه با کمپرسیون دانسیته نورونی افزایش یافته است (001/0p<). بیشترین اثرات حفاظت نورونی مربوط به دوز 100 میلی‫گرم بود.

 

 

 

 

جدول 1: بررسی معنی‫داری اختلاف دانسیته نورون‌های حرکتی آلفا در شاخ قدامی نیمه راست نخاع بین گروه کمپرسیون و سایر گروه‌ها (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100)

نام گروه

آزمون Paired t-test

SE Mean

Mean (NV)

P-value

کنترل

0/40

0/2288

 

000/0

کمپرسیون

0/39

0/788

عصاره دوز 50

0/52

0/1971

000/0

عصاره دوز 75

0/51

0/2229

000/0

عصاره دوز 100

0/76

0/2257

000/0

 

 

نمودار 1: مقایسه دانسیته تعداد نورون‌های حرکتی آلفا در شاخ قدامی نیمه راست نخاع بین گروه­ کمپرسیون و سایرگروه­ها (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100) (6n=). در هرگروه اعداد بیانگر میانگین دانسـیته نورونی ± انحراف استاندارد می‌باشد.

***: اختلاف معنی‫داری را نشان می‫دهد 001/0p<. (مقایسه گروه­های تیمار با گروه کمپرسیون)

&&&: اختلاف معنی‫داری را نشان می‫دهد001/0p<. (مقایسه گروه کمپرسیون با گروه کنترل)

 

 

آنالیز داده‌ها نشان می‌دهد که بین گروه کمپرسیون با گروه‌های (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100) تفاوت معنی‌داری (001/0p<) در دانسیته نورونی وجود دارد به‫طوری‫که این معنی‫داری به‫صورت افزایش دانسیته تعداد نورون‌ها در گروه‫های تیمار هیدروالکلی (دوز 50 میلی‫گرم برکیلوگرم) و (دوز 75 میلی‫گرم برکیلوگرم) و (دوز 100 میلی‫گرم برکیلوگرم) نسبت به گروه کمپرسیون می باشد.

 

نتایج هیستولوژی

جهت بررسی میکروسکوپی تغییرات ایجاد شده، از شاخ قدامی  نیمه راست نخاع تصاویری تهیه شده که در آن تغییرات جسم سلولی نورون‫ها در گروه‫های مختلف قابل مقایسه است. در گروه‫های تیمار و کنترل، جسم سلولی نورون‫های حرکتی نخاع وضعیت نرمال داشته و پدیده دژنراسیون در آن‫ها کمتر دیده می‫شود که بیانگر اثرات احتمالی حفاظتی عصاره هیدروالکلی این گیاه بر جسم سلولی نورون‫ها پس از آسیب عصب سیاتیک است. درحالی‫که در گروه کمپرسیون جسم سلولی چروکیده و غیر نرمال است.

 

 

 

شکل 1: در شکل الف برش عرضی نخاع را در گروه کنترل را نشان می‫دهدکه جسم سلولی نورون های سالم می‫باشد (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب که هسته در مرکز قرار گرفته و  شکل نورون‫ها به‫حالت کروی است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

شکل 2: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه کمپرسیون را نشان می‫دهد که هسته به کنار رانده شده است و به‫تدریج در حال ناپدید شدن است (درشت نماییx 200 ). در شکل ب  نورون‫ها از حالت کروی خارج شده است و ظاهر چندوجهی به‫خود گرفته است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

 

شکل 3: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 50 (کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 50 میلی گرم/ کیلوگرم) که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع  را  نشان می‫دهد که تزریق عصاره هیدروالکلی دوز (50 میلی‫گرم برکیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب رژنراسیون در آکسون می شود. به‫دنبال تغییرات رژنراسیون در آکسون، جسم سلولی به‫حالت طبیعی در آمده، تورم سلولی کم می‫شود (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب نورون‫ها را نشان می‫دهد که تقریبا به‫حالت کروی نزدیک شده اند (درشت‫نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

 

شکل 4: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 75 ( کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 75 میلی‫گرم/ کیلوگرم)  که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع را  نشان می‫دهد که تزریق عصاره هیدروالکلی (دوز 75 میلی‫گرم بر کیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب تغییرات رژنراسیون در آکسون می‫شود (درشت نماییx 200 ).  در شکل ب به‫دنبال این تغییرات، جسم سلولی تقریبا به‫حالت طبیعی درآمده و هسته به مرکز برگشته است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

[

 

شکل 5: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 100 ( کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 100 میلی‫گرم/ کیلوگرم) که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع را نشان می‫دهد تزریق عصاره هیدروالکلی (دوز100 میلی‫گرم بر کیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب تغییرات رژنراسیون در آکسون می‫شود (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب  به‫دنبال تغییرات در رژنراسیون آکسون، جسم سلولی به‫حالت طبیعی در آمده، تورم سلولی کم می‫شود، هسته به مرکز بر می‫گردد و این تغییرات به ویژگی‫های گروه کنترل نزدیک‫تر می‫شود(درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

 

شکل 6: تصویر میکروسکپی حاصل از برش عرضی قطعات نخاعی عصب سیاتیک (L1-L4)

 

در شکل1 جسم سلولی آلفا موتونورون‫های شاخ قدامی به‫شکل منظم مشاهده می‫شود و هسته در مرکز قرار گرفته است. مطابق شکل 2  دانسیته نورون ها در گروه کمپرسیون کاهش یافته و شکل نورون ها به حالت چندوجهی شده است در حالی که در گروه های تحت تیمار که در تصاویر 3 الی 5 دانسیته نورون ها افزایش یافته و شکل نورون ها به حالت کروی شده که به گروه کنترل نزدیک تر شده است.

گروه‫های کنترل و کمپرسیون و  تیمار تغییری مشاهده نشده است. همچنین در این تصویر شاخ قدامی را نشان می‫دهد که دانسیته تعداد نورون‫ها در گروه کمپرسیون نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‫داری داشته و تعداد آلفا موتونورون‫های شاخ قدامی در گروه کمپرسیون کاهش قابل توجهی داشته است  و این به این معناست که کمپرسیون عصب سیاتیک جانور سبب پدید آمدن اثرات دژنراسیون مرکزی به‫صورت رتروگراد به‫سمت جسم سلولی نورون‫های حرکتی در شاخ قدامی نخاع شده و در نهایت دانسیته نورونی در گروه کمپرسیون در مقایسه با کنترل کاهش معنی‫داری دارد ولی در گروه‫های  تیمار مخصوصا در دوز 100  نشان می‫دهد تزریق عصاره هیدروالکلی (دوز 100 میلی‫گرم بر کیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب تغییرات رژنراسیون در آکسون می‫شود. به‫دنبال تغییرات در رژنراسیون آکسون، جسم سلولی به‫حالت طبیعی در آمده، تورم سلولی کم می‌شود، هسته به مرکز بر می‫گردد و این تغییرات به ویژگی‌های گروه کنترل نزدیک می‫باشد که به‫علت وجود مواد موثره در گیاه نعناع است. همچنین آلفا موتونورون‫ها را نشان می‫دهد که به فیبرهاى عضلات اسکلتى عصب مى‫دهند. نورون‫هاى آلفا با توجه به نوع عضله واحدهاى حرکتى کوچک یا بزرگ به‫وجود مى‌آورند. به این ترتیب، نورون‫هاى حرکتى آلفا اعمال انقباضى فیبرهاى عضلات اسکلتى را کنترل مى‫کنند و در نتیجه تمام فعالیت‫هاى حرکتى بستگى به جریان عصبى دارد که نهایتا به آلفا موتونورون‫ها برخورد مى‫کند. نورون‌ها در حالت سالم و نرمال به اشکال و اندازه‫های مختلف هستند که این‫ها سیتوپلاسم وسیع و یکنواخت‫+‫اجسام نیسل، هسته بزرگ واحد و هستک دارند که این‫ها از ویژگی‫های نورون‫های گروه کنترل است ولی در گروه کمپرسیون که نورون‫ها اتولیز شده‌اند و سیتوپلاسم نورون‫ها تقریبا بازوفیلی شده است و هسته کمی متراکم و به کنار می‫رود و اجسام نیسل به‫ویژه در اطراف هسته از بین رفته‫اند و هسته و سیتوپلاسم قابل تشخیص نیست و سلول کاملا چروکیده می‫شود.  نورون‫های سالم و نورون‫های چند وجهی در گروه‫های کنترل و کمپرسیون و گروه‫های تحت تیمار نشان داده شد ولی اجسام نیسل فقط در درشت‫نمایی بیشتر  مشاهده می‫شود که در آن‫حالت وضوح تصویر کاهش می‫یابد. در گروه تیمار با عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع با دوز 100 میلی‫گرم به‫علت وجود مواد حفاظتی در عصاره تغییرات اندک بوده و شکل سلول‫ها به‫حالت نرمال نزدیک‌تر است.

 

بحث

بررسی میکروسکوپی تغییرات ایجاد شده، از شاخ قدامی نیمه راست نخاع که در آن تغییرات جسم سلولی نورون‫ها در گروه‫های مختلف قابل مقایسه است که در گروه کنترل جسم سلولی آلفا موتونورون‫های شاخ قدامی نخاع به شکل منظم مشاهده می‫شود و هسته در مرکز قرار دارد ولی در گروه کمپرسیون نشان می‫دهد کمپرسیون عصب سیاتیک موجب دژنراسیون مرکزی و تخریب جسم سلولی آلفا موتونورون‫های شاخ قدامی نخاع می شود (16). همچنین مطابق جدول 1: نشان می‫دهد که در گروه کمپرسیون دانسیته نورونی کاهش یافته که شکل نورون‫ها به‫حالت چند وجهی شده است در‫حالی‫که در گروه‫های تحت تیمار دانسیته نورونی افزایش یافته و در دوز 100 نسبت به سایر دوز‫ها دانسیته افزایش بیشتری داشته و شکل نورون‫ها به‫حالت کروی درآمده و به گروه کنترل نزدیک‫تر شده است که این نتایج هم‫راستا با سایر دانشمندان می باشد.

با کمپرسیون شدید اعصاب و تخریب شدید بخش پروگزیمال آکسون‫ها اثرات ضایعات رو به عقب (رتروگراد) به‫سمت جسم سلولی نورون‫ها توسعه یافته و سبب دژنراسیون مرکزی و تخریب جسم سلولی نورون‌ها شد (17). همچنین مرگ ناشی از ضایعه در نورون‌های سیستم عصبی مرکزی امری طبیعی است و قطع عصب سیاتیک یا کمپرسیون آن سبب القای مرگ نورونی در آلفا موتونورون‫های نخاع می شود (18). این مطالعه نشان می‌دهد کمپرسیون عصب سیاتیک سبب کاهش معنی‫دار دانسیته تعداد نورون‫های آلفای شاخ قدامی نخاع در موش صحرایی شده و عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع با دوز‫های 50، 75، 100 میلی‫گرم در موش‫هایی با کمپرسیون عصب سیاتیک سبب افزایش معنی‫دار دانسیته تعداد نورون‫های آلفای شاخ قدامی نخاع می‫شود که احتمالا از طریق ویژگی‌های آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی عناصر قابل حل در عصاره این گیاه می‫باشد. همان‫طور که می‌دانیم در روند کمپرسیون، فرآیندهای التهابی فعال می‫شوند و باعث پدید آمدن محیط شیمیایی زیان آور و آسیب بیشتر می‫شوند. احتمالا عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع با داشتن اثرات ضد التهابی و آنتی اکسیدانتی از پیشرفت آن‫ها جلوگیری می‫کند (19). به‫طوری‫که در پژوهش حاضر در گروه‫های تیمار پیشرفت ضایعه کند شده بود. شواهد موجود نشان می‫دهد که گیاه نعناع دارای خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی است. منتول موجود در گیاه نعناع به طور اختصاصی تولید 3 مدیاتور اصلی التهاب توسط مونوسیت‫ها را مهار می‫کند. سنتز لکوترین b4، پروستاگلندین و اینترلوکین 1 توسط منتول مهار می‌شود (20).  یکی دیگر از عوامل موثر در مرگ سلولی، رادیکال‫های آزاد می‫باشد که به‫دنبال آسیب مکانیکی و یا کمپرسیون عصب سیاتیک تولید رادیکال‫های آزاد افزایش می‫یابد تولید بیش از حد این رادیکال‫ها باعث آسیب به عملکرد سلول می‫شود عصاره این گیاه باعث حذف رادیکال‫های آزاد در محل آسیب می شود (21). خردمندی و همکاران طی آزمایشی پی بردند که گیاه نعناع با قابلیت آنتی اکسیدانتی نقش اساسی در کاهش فعالیت رادیکال‫های آزاد و آسیب‫های اکسیداتیو به بدن انسان را دارد و می‫توان آن‫را به‫عنوان روغن گیاهی استفاده کرد (22). درمان و ترمیم آسیب‫های عصبی یکی از اهداف اساسی در پزشکی و نوروفارماکولوژی می‫باشد. تصادفات و جراحات وارده به بدن، بیماری‫هایی نظیر دیابت و عفونت‫ها می‌توانند آسیب دائمی به اعصاب وارد کنند و به‫دنبال آن درد مزمن شدید و از دست دادن حس و کنترل حرکتی یا فلجی اتفاق می‫افتد. بر خلاف ترمیم سلول‫ها در سایر نواحی بدن، پاسخ عصب محیطی به صورت روند میتوز و تکثیر سلولی نمی‌باشد، در واقع پاسخ این اعصاب به سادگی در ناحیه آسیب دیده و به‫صورت موضعی اتفاق نمی افتد بلکه جسم سلولی نورون که در طناب نخاعی یا عقده عصبی قرار دارد را درگیر می‫سازد. از آن‫جایی‫که جسم سلولی نورون مرکز متابولیکی آن است، در صورت صدمه به نورون، جسم سلولی آن تخریب شده و باعث مرگ نورون می‌شود و تحت عنوان دژنراسیون والرین خوانده می‫شود. به‫دنبال قطع یا کمپرسیون عصب، دژنراسیون عصب در بخش خلفی آغاز می‌شود. بعد از آسیب نفوذ پذیری سد خونی عصبی افزایش یافته تا اجازه دهد فاکتورها و سلول‫های خونی که ترمیم عصب را تسهیل می‫کنند، وارد عصب شوند. از مهم‫ترین سلول‫های وارد شده به ناحیه آسیب دیده، ماکروفاژها هستند (23). به‫دنبال قطع اعصاب محیطی و شروع دژنراسیون والرین، سلول‫های شوان و ماکروفاژها و مونوسیت‫ها با همکاری یکدیگر میلین و اجزای قطعه انتهایی آکسون را در روزهای اول پس از آسیب بیگانه خواری می‌کنند. انشعابات آکسون در قسمت پروگسیمال، فاکتورهای رشد را جذب می‫کند (23).  وقایع بیولوژیکی متعددی به‫دنبال کمپرسیون عصب سیاتیک در سطح سلولی و مولکولی رخ می‫دهد که از آن جمله می‫توان به بروز آپوپتوزیس، افزایش ورود کلسیم به‫درون نورون، آزادشدن نوروترانسمیترهای تحریکی مانند گلوتامات، ایجاد رادیکال‌های آزاد و فعال شدن فرآیندهای التهابی اشاره نمود و اگر کمپرسیون عصب شدید باشد منجر به دژنراسیون مرکزی در نخاع می‫شود. به‫دنبال له شدگی عصب تغییرات مورفولوژیکی و متابولیکی تحت عنوان کروماتولیز در جسم سلولی نورون ها به وجود می آید و شامل پاره پاره شدن اجسام نیسل و تبدیل آن‫ها به ذرات ریز و ناپدید شدن آن‌ها، حجیم و مدور شدن جسم سلولی نورون، قطعه قطعه شدن نوروفیبریل‫ها و جابه‫جایی هسته از مرکز به محیط می باشد. اگرچه نورون‫ها پس از تولد فاقد قدرت تکثیر می‫باشند، اما می‫توانند در مقابل درجات معینی از ضایعات مقاومت کرده و بهبود یابند که به این فرآیند رژنراسیون می‫گویند (24).

مکانیسم آپوپتوزیس یکی از اصلی‫ترین راه‫های حذف سلول‌های ناخواسته است که در بدن موجودات پرسلولی و حتی تک سلولی انجام می‫شود، شکل گیری بافت‫ها و اندام‫های بدن انسان در دوره جنینی و کنترل میزان رشد و تکثیر سلول‌های بدن همگی از نتایج این پدیده زیستی است، شناسایی این فرآیند سلولی و راه‫های کنترل آن در دست‌یابی به داده‫های ضد سرطانی و ضد التهابی راه گشا است (25).

اغلب گیاهان خانواده نعناع تولید کننده ترپن‫ها و انواع ترکیبات دیگر هستند که این ترکیبات به‫طور عمده در غدد اپیدرمی برگ‫ها، ساقه‫ها، و اندام‫های زایشی خود ذخیره می‫کنند. این ترکیبات شامل: منتول، منتون، منتوفوران، پولگون، کاروتن، توکوفرول، بتایین، کولین، بتااوسمین، کارواکرول، ژرماکرن دی، لیمونن، سابین هیدرات، بتاکاریوفیلن است (26). بنابراین علت کاهش دژنراسیون در گروه‫های تیمار شده با عصاره نعناع (نمودار1) احتمالا به‫دلیل وجود ترکیبات فوق در عصاره بوده که با داشتن اثرات آنتی اکسیدانتی ضد التهابی از پیشرفت ضایعه جلوگیری کرده است. با توجه به نتایج حاصل در گروه کنترل هسته در مرکز قرار دارد و شکل نورون کروی بوده ولی در گروه کمپرسیون هسته در کنار و چروکیده می‫باشد ولی در گروه‌های تیمار با دوز‫های 100،75،50 میلی‫گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی نعناع نورون‫ها مجددا طبیعی نمایان شده است که در گروه تیمار با دوز 75 میلی‫گرم بر کیلوگرم هسته‫ها واضح‫تر دیده می‫شوند و به گروه کنترل نزدیک‌تر شده است.

نتایج این تحقیق نشان می‫دهد که عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع یک عامل حفاظت نورونی بوده که احتمالا می‫توان آن را جهت درمان بسیاری از بیماری‫های نورودژنراتیو استفاده نمود.

نتیجه گیری

 افزایش دانسیته نورونی در گروه‫های تیمار نسبت به گروه کمپرسیون حاکی از آن است که مواد موجود در این گیاه دارای اثرات ترمیمی بر سیستم عصبی مرکزی بوده و علاوه بر کاهش شدت دژنراسیون روند‫های ترمیمی را نیز سرعت می بخشد.

 

تشکر و قدردانی: این تحقیق در گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد صورت گرفت از مدیریت محترم گروه زیست شناسی سرکار خانم دکتر مریم طهرانی پور و ریاست محترم دانشکده علوم جناب آقای دکتر سعیدی کمال تشکر و قدردانی را دارم.

 

1. Tehranipour M, Bahar ara J, Mostafaee M. The neuroprotective effect of CSF interaperitotoneal injection on alpha motor degeneration after sciatic nerve compression in rat.amuj. 2009; 12(3): 101-108.

2. Wood MD, Kemp SW, Weber C, Borschel GH, et al. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Ann Anat 2011; 193: 321-333.

3. Tehranipour M, Javadmoosavi Z. The Neuroprotective Effect of Alcoholic Extract of Cannabis Sativa on Neuronal Density of Spinal Cord Alpha Motoneurons after Sciatic Nerve Injury in Rats. J of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2011; 19(3): 339-349.

4. Coleman MP, Conforti L, Buckmaster EA, Tarlton A, et al. An 85- kb tandem triplication in the slow Wallerian degeneration (Wlds) mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95(17): 9985-90.

5. Lebel-Hardenack S, Grant SR. Genetics of sex determination in flowering plants. Trends Plant Sci.1997; 2(4): 130-6.

6. Zeinali H. Arzani A. Razmjoo R. Rezaee MB. Evaluation of Oil Compositions of Iranian Mints. 2005; 17: 156-59.

7. Miraj S, Kiani S. Study of pharmacological effect of Mentha pulegium: A review. Der Pharmacia Lettre. 2016; 8(9): 242-245.

8. Basak S, Hoffmann A. Crosstalk via the NF-kappaB signaling system Cytokine Growth Factor Rev. 2008; 19(3-4): 187–197.

9. Khosravi Zanjani M A , Mohammadi N, Zojaji M, Bakhoda H. Chemical Composition of the Essential Oil of Mentha pulegium L. and its Antimicrobial Activity on Proteus mirabilis, Bacillus subtilis and Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Food Biosciences and Technology. 2014; 5(2): 31-40.

10. Aris A, Marrinhas E, Carvalho R, Dias C,et al. Phytochemical Composition and Antibacterial Activity of ahaydroalcoholic Extract of Pterospartum tridentatum and Mentha Pulegium against Staphylococcus aureus. Biomed Res int. 2016; 1-12.

11. Fadaei  F, Zahedi L, Farahani Z, Ghasemzade N.Review of two version of declaration of Helsinki (2013 and 2008): challenges and changes. 2008; 9(3): 75-92.

12. Razavi M, Tehranipour m, khayatzade j.Effects of aqueous extract saliva chloroleuca leaves on degeneration alpha motoneurons in spinal cord after sciatic nerve compression in rat. 2013; 10(2): 22-30.

 

 

13. Tehranipour M, Attariyan F.The neuroprotective effect of stachys lavandulifolia Vahl leaves aqueous extract on the density of alpha neurons in anterior horn of spinal cord after sciatic nerve compression in rats. J shahrekord Univ Med Sci. 2015; 17(2): 119-126.

14. Alikhanzade M, Tehranipour M , Khayatzade J. The study of effect of aquatic extracts of Achillea biebersteinii leave on repair alpha motoneurons after sciatic nerve injury in rat. J Shahrekord. 2013; 15(4): 16-25.

15. Behnam rasouli M. Nikravesh M. Mahdavi shahri N. Tehranipour M. post operative time effect after sciatic nerve crush on the number of alpha motonrurons using asterio gical counting metod(dissector). Iran Biomed j. 2000; 4(1): 9-45.

16. Hejazi Sh, Tehranipour M.The Study of Effect of Aqueous and Alcoholic Extracts of Portulaca oleracea Leaves on NT3 Gene Expression in Degeneration of Alpha Neurons after Sciatic Nerve Compression in Rats.AMUJ. 2017; 19(117): 52-60.

17. Shahraki A, shahraki A. Achillea mellifolium ethanolic extract Protective effects on ventral horn of the spinal cord alpha motoneurons degeneration after sciatic nerve compression in rats Birjand University of Medical Sciences j. 2016; 22 (4): 340-348.

18. Groves MJ, Schanzer A, Simpson AJ, Kuol T,et al. Profile of adult rat sensory neuron loss, Apoptosis and replacement after sciatic nerve crush.J Neurocytol. 1997; 32(2): 113-22.

19. Alpsoy L, Sahin H, Karaman S. Anti-oxidative and anti-genotoxic effects of methanolic extract of Mentha pulegium on human lymphocyte culture. J Toxicol Ind Health. 2011; 27(7): 647-54.

20.  Hirata I, Naito Y, Handa O, Hayashi N, et al. Heat-shock protein 70-overexpressing gastric epithelial cells are resistant to indomethacininduced apoptosis. Digestion. 2009; 79: 243–250.

21. Stankiewicz AR, Lachapelle G, Foo CP, Radicioni SM, et al. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation. J Biol Chem. 2005; 280(46): 38729–38733.

22. Kheradmandi M, Ataye salehi E, Esmaeilzadeh Kenari R, Tahereh nasiri Takami S. The Antioxidant Effect of Mentha Pulegium Extracts on the Stability of Canola Oil during Storage Conditions. J. Appl. Environ. 2014; 117-112.

23. Vargas ME, Barres BA, Why is wallerian degeneration in the CNS so slow? Annu Rev Neurosci 2007; 30: 79-153.

24. Jalali M,Tehranipour M,Mahdavi Shahri N.Effect of alcoholic extract of Nigella sativa seed on alpha motor neurons density of spinal cord following sciatic nerve compression in rats.J Gorgan Uni of Med Sci. 2014; 15(4): 29-34. 

25. Salga MS, Ali HM, Abdulla MA, Abdelwahab
SI. Gastroprotective activity and mechanism
of novel dichloride – zinc (II) – 4 - (2 - (5 -methoxybenzylideneamino) ethyl) piperazin-1-iumphenolate complex on ethanol-induced gastric ulceration. Chem Biol Interact. 2012; 195:144-153.

 

26. Boukhebti H , Nadjib Chaker A, Belhadj H, Sahli F, et al. Chemical composition and antibacterial activity of Mentha pulegium L. and Mentha spicata L. essential oils. Der Pharmacia Lettre. 2011; 3 (4) 267-275.