اثرات فیزیولوژیکی رقیق‌کننده انجماد مغناطیسی شده بر پارامترهای سلولی، شیمیایی و باروری اسپرم خروس پس از انجماد

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه علوم طیور، تهران، ایران

چکیده

هدف: این مطالعه به‌منظور بررسی اعمال شدت­های مختلف میدان مغناطیسی بر محیط انجمادی اسپرم انجام شد.
مواد و روش­ها: در این آزمایش از القای میدان مغناطیسی با شدت­های 0، 2000، 4000 و 6000 گوس، به‌منظور تعیین شدت بهینه در طی فرآیند انجماد-ذوب استفاده شد. نمونه‌های منیاز 10قطعهخروسگلهمرغمادرگوشتی24هفتهنژادراس308بااستفادهازروشماساژشکمی جمع­آوریشد. در این پژوهش تیمار‌های آزمایش شامل: 1) رقیق­کننده معمولی، 2) رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت G2000، 3) رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت G4000 و رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدتG 6000 بود. رقیق‌کننده مورداستفاده در این تحقیق­، رقیق‌کننده Lake بود. این رقیق‌کننده با سطح 1 درصد لسیتین سویا و 5 درصد گلیسرول ترکیب و سپس بر اساس تیمار‌های آزمایشی ذکر شده، با شدت‌های مختلف امواج مغناطیسی روبرو شد. اسپرم رقیق‌شده بر اساس هر تیمار، پسازسردسازیدرپایوت‌های 25/0 میلی‌لیتریمنجمدشد.پسازانجماد،فراسنجه‌هاییهمچونتحرک ‌کل،تحرکپیشرونده، مورفولوژیاسپرم،یکپارچگیغشایاسپرم،یکپارچگیآکروزوم،میزانتولیدمالون‌دی‌آلدهید، آپوپتوزیس و پتانسیلغشایمیتوکندری اسپرماندازه‌گیریشدند.
 نتایج: نتایج نشان داد شدت‌های مختلف میدان مغناطیسی هیچ تاثیر معنی­داری بر جنبایی کل، جنبایی پیش­رونده، یکپارچگی غشاء، مورفولوژی، پراکسیداسیون لیپیدی، یکپارچگی آکروزوم و سازوکارهای آپوپتوزیس اسپرم خروس ندارد. فقط پتانسیل غشا میتوکندری در گروه کنترل از سایر گروه­ها بیشتر بود (5/60  درصد، 05/0P<)
نتیجه گیری: ندارد باید اضافه شود
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تلقیح مصنوعی یک فناوری تولیدمثلی است که در آن از بهترین نرهای پرورشی استفاده موثر می‌شود و می­تواند منجر به ‌بهبود کیفیت ژنتیکی گله پرورشی ­شود (1). این تکنیک یکی از ابزارهای مدیریتی کارآمد برای بهینه­سازی تولید­مثل ماکیان است و لازمه استفاده بهینه از آن، امکان ذخیره‌سازی اسپرم به‌صورت مایع و منجمد می­باشد. در روش نگه‏داری اسپرم به‌صورت مایع، اسپرم­های جمع‌آوری‌شده به نسبت­های مشخص با رقیق­کننده­های مناسب رقیق می­شوند. رقیق­سازی اسپرم با حفظ متابولیسم مطلوب و جنبایی و باروری مناسب اسپرم­ها، هدف اصلی ذخیره اسپرم به‌صورت مایع است (2). در نگه‏داری اسپرم به‌صورت مایع، با افزایش زمان ذخیره­سازی، جنبایی و باروری کاهش می­یابد (3). استفاده از اسپرم مایع بیش‌ترین باروری و هچ را به‏همراه دارد ولی با توجه به مشکلات مربوط به نمونه­گیری مستمر و عدم دسترسی به پرنده­های نر برتر و افزایش هزینه نگه‏داری نمی­توان به استفاده دائم از آن تکیه کرد. محدودیت­های زمانی ذخیره­سازی به‌صورت مایع موجب گرایش محققین به‌سوی انجماد اسپرم شده است. اگرچه تلاش­های متعددی برای توسعه یک روش مناسب برای انجماد اسپرم طیور صورت گرفته است اما هنوز یک پروتکل موفق برای انجماد به دست نیامده است (4 و 5). از مزایای منجمد کردن اسپرم می‌توان به بارور نمودن هم‌زمان تعداد زیادی ماده با استفاده از اسپرم نرهای با نژاد برتر، از میان رفتن هزینه‌های مربوط به نگه‏داری نرها، افزایش مخزن ژنی، انتقال آسان مایع منی از مراکز تولید و جمع‌آوری به دورترین مکان‌ها اشاره کرد. هم‌چنین می‌توان به ذخیره‌ی ژن‌ها برای استفاده‌ی آینده و تضمین در مقابل از دست دادن نرهای منحصربه‌فرد و جلوگیری از انقراض نسل نژادهای خاص اشاره نمود. از طرفی فرآیند انجماد با مشکلات و تنش‌های انجمادی همراه است. جنس غشای اسپرم که از فسفولیپید­ها و اسیدهای چرب می­باشد باعث افزایش این حساسیت می‌شود (1). از آنجایی‌که تلقیح مصنوعی موفق تحت تاثیر دسترسی به اسپرم‌های بارور بعد از فرآیند انجماد-ذوب می­باشد، بنابراین استفاده از فناوری‌هایی که بتواند آسیب­های انجمادی را به حداقل برساند، ضروری به‏نظر می­رسد.

استفاده از امواج میدان مغناطیسی با شدت­های مختلف و کنترل ‌شده شیوه نوین و تازه­ای برای تغییر خواص بیوفیزیکی و شیمیایی رقیق‌کننده در زمینه انجماد و یا علم انجماد سلول‌های جنسی می­باشد. در مورد استفاده از امواج مغناطیسی در رقیق‌کننده‌های انجمادی اسپرم خروس تا‌کنون پژوهشی صورت نگرفته و این مطالعه اولین مورد بررسی آثار امواج مغناطیسی با شدت­های مختلف بر قابلیت انجماد اسپرم خروس می‌باشد.

هدف اصلی در این تحقیق به حداقل رساندن تخریب­های ممکن طی فرآیند انجماد-ذوب اسپرم خروس است. هرگونه دست­کاری در فرآیندها و محیط­های انجماد-ذوب اسپرم خروس تاثیر قابل‌توجهی بر کیفیت اسپرم و باروری آن دارد. حال این سوال مطرح است که آیا امواج مغناطیسی می‌تواند باعث کاهش تولید رادیکال‌های آزاد و حفظ بهتر کیفیت اسپرم پس از فرآیند انجماد-ذوب در رقیق‌کننده‌های انجمادی اسپرم می­شود؟

مواد و روش­ها

مکان آزمایش و مدیریت خروس‌ها: این پژوهش در بخش تحقیقات طیور گروه علوم طیور دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس انجام گرفت. آنالیزهای تخصصی اسپرم و مطالعات آزمایشگاهی در آزمایشگاه علوم دامی دانشکده کشاورزی تربیت مدرس و آزمایشگاه جنین‌شناسی پژوهشگاه رویان صورت گرفت. هرکدام از خروس‌ها در پن­هایی جداگانه به ابعاد یک متر در دو متر، مجهز به آب‌خوری و دان‌خوری نگه‏داری شدند. سالن از لحاظ نور، دما و رطوبت و تهویه به‌طور اتوماتیک تحت کنترل بود سن خروس‌ها 24 هفته و مدت روشنایی در طول دوره آزمایش 16 ساعت بود. دمای نگه‏داری در کل دوره آزمایش بین 18 تا 22 درجه سانتی‏گراد بود. رطوبت محل نگه‏داری در محدوده 50 تا 55 درصد حفظ شد.

مدیریتخوراکوآب: روزانه مقدار 125 گرم خوراک به‏ازای هر خروس در یک نوبت و اول صبح در اختیار آن‌ها قرار می‌گرفت. آب مصرفی هم به مقدار آزاد در مدت روشنایی در اختیار پرنده قرار داده شد و آب‏خوری‌ها مرتب کنترل می‌شدند. جیره خروس‌ها طبق کاتالوگ راهنمای سویه راس 308 دارای 2750 کیلوکالری و 12درصد پروتئین بود.

جمع‌آوری منی: جمع‌آوری منی از 10 قطعه خروس­ بالغ مادر، نژاد راس 308 با سن 24 هفته، دو بار در هفته به‏روش ماساژ شکمی انجام شد و بلافاصله پس از جمع‌آوری، منی به آزمایشگاه منتقل شد و بررسی‏های اولیه روی منی صورت گرفت. در هر انزال حجم­، غلظت­ و جنبایی اسپرم پس از جمع‌آوری تعیین شد و سپس به‌منظور حذف اثرات متقابل و فردی نمونه­ها با یکدیگر ادغام و به بخش­های مساوی مطابق با تیمارهای آزمایشی تقسیم شدند.

تیمار‌های آزمایش شامل موارد زیر بودند:

1)     رقیق­کننده معمولی

2)     رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت G2000

3)     رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت G4000

4)     رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدتG 6000

مراحل آماده­سازی رقیق‌کننده‌ها: رقیق‌کننده مورد استفاده در این تحقیق­، رقیق‌کننده Lake بود که به‏صورت دستی تهیه شده و اجزای آن در جدول 1 آورده شده است. این رقیق‌کننده با سطح 1 درصد لسیتین سویا و 5 درصد گلیسرول ترکیب و سپس بر اساس تیمار‌های آزمایشی ذکر شده، با شدت‌های مختلف امواج مغناطیسی روبرو شد.

 

جدول 1: نوع و مقدار ترکیبات لازم برای ساخت رقیق‌کننده Lake

ردیف

نام ماده

مقدار (گرم /50 میلی‌لیتر)

1

Potassium acetate

25/0 گرم

2

Sodium glutamate

96/0گرم

3

D-fructose

4/0 گرم

4

Polyvinyl pirrolidone

15/0 گرم

5

Magnesium acetate

035/0 گرم

6

Glycine

187/0 گرم

 

 

 

ساخت رقیق­کننده مغناطیسی شده: برای تهیه رقیق‌کننده مغناطیسی مواد شیمیایی توزین شده را با آب مقطر دو بار تقطیر مخلوط کرده و روی هم‏زن قرار داده تا مواد مورد نظر حل و همگن‌شده و پس ‌از آن رقیق‌کننده را به چهار بخش مساوی تقسیم کرده و طول ‌موج‌های مختلف مغناطیسی (0، 2000، 4000 و 6000 گوس) به آن‌ها القا شد. به ‌این‏‌ترتیب رقیق‌کننده پایه تهیه و در دمای چهار درجه سلسیوس نگه‏داری شد. دستگاه القا کننده میدان مغناطیسی در این مطالعه شامل دو مگنت نئودمیم بود که با سیم لاکی روپوش دار پیچیده شده بود و با استفاده از تغییر ولتاژ ورودی به آن قادر به تولید شدت های مختلف میدان مغناطیسی بود. همچنین برای عبور آب از بین دو مگنت از لوله‌ای استفاده می‌شود که در آن آب به‏مدت ده دقیقه از بین دو مگنت عبور داده می شود و پس از یک ساعت برای ساخت رقیق کننده مورد استفاده قرار می‏گرفت. برای اندازه گیری میدان مغناطیسی القا شده با شدت‏های مختف از دستگاه گوس متر استفاده شد.

فرآوری و انجماد اسپرم: بعد از جمع‌آوری اسپرم از هر یک از خروس‌ها همه اسپرم‌ها جهت حذف اثرات فردی باهم مخلوط شدند و به چهار بخش مساوی جهت رقیق‌سازی در چهار محیط انجماد تقسیم شدند. سپس با رقیق‌کننده که از قبل برای هر تیمار آماده ‌شده بود، با نسبت یک به 10 (یک میلی‌لیتر اسپرم در 10 میلی‌لیتر رقیق‌کننده) رقیق شدند. پس‌از آن لوله‌های منی در ظرف محتوی 100 میلی­لیتر آب 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد و به‏مدت دو ساعت در یخچال 5 درجه سانتی‏گراد برای رسیدن به دمای تعادل نگه‏داری شدند. پس از رسیدن دمای رقیق‌کننده حاوی تیمارهای مختلف به نزدیک پنج درجه سلسیوس، بلافاصله در نی (استرا) انجماد 25/0 میلی‌لیتری کشیده شدند. در مرحله بعد نی‌های بسته‌شده حاوی سیمن به فاصله چهار سانتی‌متری بالای سطح نیتروژن مایع قرار گرفتند. پس از گذشت چهار دقیقه با سرعت پایوت­ها در داخل نیتروژن مایع (196- درجه سانتی‏گراد) غوطه‌ور شدند و در گابلت‌های مخصوص هر تیمار قرار داده شدند. نمونه‌ها سپس به‏داخل تانک مخصوص نیتروژن انتقال داده شدند.

ارزیابی جنبایی اسپرم با استفاده از نرم‌افزارCASA : برای بررسی جنبایی و خصوصیات سرعتی اسپرم پس ‌از انجماد-ذوب، یک پایوت از هر گروه تیماری ذوب‌شده و به‏درون لوله­های میکروتیوب انتقال داده شدند. سپس با استفاده از سمپلر متغیر و با برداشتن پنج میکرولیتر از منی روی لام مخصوص ریخته می‌شود، لام مورد نظر با استفاده از نرم‌افزار CASA نصب‌شده روی کامپیوتر متصل به میکروسکوپ بررسی شد. پس از بررسی نمونه منی، داده جنبایی و همچنین داده­های وابسته به جنبایی و یا داده‌های سرعتی اسپرم توسط این برنامه ثبت شد.

ارزیابی فعالیت غشا: در این مطالعه برای بررسی فعالیت و یکپارچگی غشا از تست تورم هیپواسموتیک (HOST) استفاده شد (6). به این منظور 30 میکرولیتر از اسپرم رقیق‌شده با رقیق‌کننده به نسبت 1:10 را با 300 میکرولیتر از محلول HOST مخلوط کرده و به‏مدت 30 دقیقه در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. تعداد 200 اسپرم شمارش ‌شده و سپس درصد اسپرم‌های با غشای سالم و آسیب‌دیده محاسبه شد.

ارزیابی مورفولوژی اسپرم: به‌منظور ارزیابی مورفولوژیغیرطبیعی اسپرم و تعیین درصد اسپرم­های نرمال و غیر نرمال از محلول هانکوک استفاده شد (7). برای ارزیابی اسپرم­های غیرطبیعی حداقل سه قطره از هر نمونه به میکروتیوپ­های حاوی یک میلی­لیتر محلول هانکوک افزوده شد و سپس یک قطره از این محلول روی لام قرار داده و توسط یک لامل پوشانده شد و با شمارش حداقل 200 اسپرم، زیر میکروسکوپ فاز کنتراست، با بزرگنمایی 200، درصد اسپرم‌های با مورفولوژی غیرطبیعی محاسبه شد.

ارزیابیپتانسیلغشایمیتوکندریاسپرمخروسپس ‌از انجماد-ذوببا رنگرودامین123: پتانسیل غشای میتوکندری در اثر تنش­های اکسیداتیو و فرآوری‌های انجماد دچار افت شدید می‌شود که توسط رنگ رودامین123 مورد بررسی قرار می­گیرد (3). رودامین به‌طور فعال وارد زنجیره تنفسی میتوکندری می‌شود و تجمع آن در میتوکندری باعث تولید فلوروسنت سبزرنگ می‌شود. فقدان فلوروسنت نشان‌دهنده نقص در پتانسیل غشای میتوکندری است. در نمودار حاصل از دستگاه فلوسایتومتری نمونه دارای رودامین مثبت و PI منفی (-PI\+R123) به‌عنوان نمونه دارای میتوکندری فعال و رودامین مثبت و PI مثبت (+PI/ +R123) به‌عنوان میتوکندری غیرفعال در نظر گرفته می‌شود.

ارزیابییکپارچگیآکروزومدراسپرمخروسپس‌ از انجماد-ذوببا رنگ:PSAبرای اندازه­گیری یکپارچگی آکروزوم از رنگ فلورسنت PSA استفاده شد. تعداد 200 اسپرم در هر اسلاید با میکروسکوپ فلورسنس (Olympus; 51BX) با بزرگنمایی 400 ارزیابی شد. اسپرم­های با سر سبز به‌عنوان آکروزوم دست‌نخورده و سالم و اسپرم‌های با کمربند سبز به‌عنوان آکروزوم تخریب ‌شده در نظر گرفته شد.

ارزیابیآپوپتوزیسدراسپرمخروسپسازفرآیندانجماد-ذوب: در این آزمایش از فسفاتیدیل­ سرین، به‌عنوان نشانگر برای تشخیص زنده‌بودن یا آپوپتوزیس شدن اسپرم استفاده شد (8). حضور این نشانگر در سطح غشای پلاسمایی اسپرم، از نشانه اولیه آپوپتوزیس می­باشد که در حالت طبیعی یا حالت زنده اسپرم در داخل سیتوپلاسم اسپرم یافت می‌شود. در طول فرآیند آپوپتوزیس، فسفاتیدیل­سرین از سطح سیتوپلاسمی غشای پلاسمایی به سطح خارجی سلولی تغییر مکان می­دهد. آنکسین در حضور یون کلسیم تمایل زیادی به اتصال به فسفاتیدیل­سرین دارد و به‏همین دلیل می­تواند به‌عنوان یک نشانگر در تشخیص آپوپتوزیس مورد استفاده قرار گیرد.

در نموداری که دستگاه فلوسایتومتری ارائه می­دهد اگر نمونه­ها آنکسین منفی و PIمنفیA-/PI-) ) باشند، به‌عنوان اسپرم زنده تلقی می­شوند. اگر آنکسین مثبت و PI منفی ( A+/PI-) باشد نمونه زنده ولی دچار آپوپتوزیس اولیه شده است. اگر آنکسین مثبت و PI مثبت (A+/PI+) باشد به‌عنوان اسپرم مرده و دچار آپوپتوزیس ثانویه شده تلقی می‌شود. آنکسین منفی و PI مثبت (A-/PI+) به‌عنوان اسپرم نکروز شده تلقی می‌شود که در این مطالعه دو گروه آخر به‌عنوان اسپرم­های مرده در نظر گرفته شدند.

اندازه­گیریمیزانتغییراتمالون­دی­آلدهیدباروش:TBARSیکی از محصولات پراکسیداسیون لیپیدی مالون­دی­آلدهید (MDA) می­باشد که به‌عنوان شاخص استرس اکسیداتیو مدنظر قرار می­گیرد. یک مولکول MDA با دو ملکول TBA واکنش می­دهد و فرآورده این واکنش، مولکولی صورتی‌رنگ است که بیش‌ترین جذب را در طول‌موج 532 نانومتر دارد. جذب نوری نمونه­های مختلف یادداشت شد و در پایان، نتایج حاصل از دستگاه اسپکتروفتومتری در فرمول منحنی استاندارد گذاشته و غلظت MDA (نانو مول در میلی­لیتر منی) محاسبه شد(9).

آنالیز آماری: تجزیه‌ و تحلیلداده‌هایاستخراج‌شدهکه دارای چهارتیماروششتکراربودند درقالبطرحکاملاتصادفی بااستفادهازنرم‌افزارSAS، رویه GLMانجام شد و مقایسه میانگین با آزمون توکی در سطح 5 درصد انجامگرفت.

نتایج

در این آزمایش اثر رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت‌های مختلف امواج مغناطیسی بر کیفیت اسپرم منجمد ـ ذوب‌شده اسپرم خروس مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد قابل‌توجهی فراسنجه­های کیفی اسپرم پس ‌از انجماد-ذوب اندازه‌گیری شد تا بتوان تاثیر رقیق­کننده مغناطیسی شده با شدت­های مختلف را بر تغییرات کیفیت اسپرم خروس پس از دوره حفظ انجمادی ارزیابی نمود. فراسنجه­های اندازه‌گیری شده در این آزمایش شامل جنبایی و ویژگی­های وابسته حرکتی، مورفولوژی، زنده­مانی، آپوپتوزیس، یکپارچگی آکروزوم، پتانسیل غشای میتوکندری، میزان تغییرات مالون­دی­آلدهید پس ‌از انجماد-ذوب بود.

ارزیابیجنباییوویژگی­هایوابستهحرکتیاسپرم

جدول 2 مقادیر به‌دست‌آمده از ویژگی­های جنبایی اسپرم توسط نرم­افزار کامپیوتری آنالیز اسپرم پس از فرآیند انجماد با رقیق­کننده مغناطیسی شده را نشان می­دهد. شدت‌های مختلف میدان مغناطیسی هیچ تاثیر معنی­داری بر جنبایی کل، جنبایی پیش­رونده، میانگین سرعت حرکت اسپرم در مسیر (VAP)، سرعت در مسیر مستقیم (VSL) و سرعت در مسیر منحنی (VCL) اسپرم، پس ‌از انجماد-ذوب در گروه‏های مختلف نداشت. همچنین راستی مسیر طی شده (STR) اسپرم در گروه­های مختلف شاهد، 2000 و 6000 گوس به‏ترتیب با مقادیر (5/1 ± 5/70 )، (5/1 ± 7/68) و (5/1 ± 6/69) اختلاف معنی‏داری را نشان ندادند، ولی این سه گروه با گروه 4000 گوس با مقدار (5/1 ± 8/54) اختلاف معنی­دار داشتند.

 

جدول 2: مقایسه میزان جنبایی و ویژگی‌های حرکتی اسپرم خروس پس از فرآیند انجماد در رقیق‌کننده‌های مغناطیسی شده

صفات

0 G

2000 G

4000 G

6000 G

SEM

TM(%)

9/54

8/55

6/53

0/56

25/1

PM (%)

8/32

3/34

1/30

0/32

28/0

VAP(µm/s)

2/27

2/28

0/25

1/26

6/1

VSL(µm/s)

5/20

9/18

4/21

0/19

3/1

VCL(µm/s)

2/62

7/59

1/61

3/60

71/0

STR(µm/s)

5/70a

7/68a

8/54b

6/69a

5/1

LIN (%)

0/37

2/36

5/37

0/36

4/1

a b در هر ردیف میانگین­هایی که دارای حروف غیرمشابه هستند تفاوت معنی­دار دارند 05/0 p≤.

TM: درصد اسپرم­های دارای حرکت

PM: جنبایی پیش­رونده: درصد اسپرم­های دارای جنبایی رو به جلو

VAP: میانگین سرعت در مسیر (میکرون بر ثانیه)

VSL : سرعت در مسیر مستقیم (میکرون بر ثانیه)

VCL : سرعت در مسیر منحنی (میکرون بر ثانیه)

STR: ارینتی مسیر طی شده (درصد)               

LIN: درصد خطی بودن جنبایی (درصد)          

 

ارزیابی یکپارچگی غشا و مورفولوژی اسپرم

داده­ها نشان می­دهند که هیچ تفاوت معنی­داری بین گروه­های شاهد، 2000، 4000 و 6000 گوس از لحاظ یکپارچگی غشا اسپرم به‏ترتیب با مقادیر 54، 2/56، 1/55 و 9/54 درصد با انحراف معیار میانگین 41/1 وجود نداشت. همچنین نتایج مربوط به ارزیابی مورفولوژی اسپرم نشان می­دهد که شدت­های مختلف امواج مغناطیسی اعمال‌شده بر رقیق­کننده هیچ­گونه تاثیر معنی­داری روی مورفولوژی اسپرم نداشته است.

ارزیابی پتانسیل غشا میتوکندری و یکپارچگی آکروزوم اسپرم

جدول 3 نتایج مربوط به مقایسه میزان پتانسیل غشاء میتوکندری اسپرم خروس پس از فرآیند انجماد در رقیق‌کننده‌های مغناطیسی شده را نشان می­دهد. نتایج نشان می­دهد که میانگین پتانسیل غشا میتوکندری یا اسپرم­های با میتوکندری فعال در گروه­های تیماری 2000، 4000 و 6000 به ترتیب با مقادیر 52، 6/54 و 7/53 درصد و با انحراف معیار 1/2 هیچ­گونه اختلاف معنی­داری باهم نداشتند. در حالی‌که این مقادیر نسبت به گروه شاهد با میزان 1/2 ± 5/60 تفاوت معنی­دار داشتند (05/0p<). اعمال شدت­های مختلف مغناطیسی بر رقیق‌کننده باعث کاهش معنی­دار (05/0p<)، در اسپرم‌های با میتوکندری فعال شد. همچنین نتایج رنگ‌آمیزی PSA در این آزمایش نشان داد که یکپارچگی آکروزوم اسپرم طی فرآیند انجماد تحت تاثیر رقیق­کننده مغناطیسی شده قرار نگرفته و اختلافی بین گروه­های آزمایشی مشاهده نشد.

 

 

جدول 3: مقایسه میزان پتانسیل غشا میتوکندری، یکپارچگی آکروزوم و مالون دی آلدهید در اسپرم خروس پس از فرآیند انجماد در رقیق‌کننده‌های مغناطیسی شده

صفات

0G

2000G

4000G

6000G

SEM

پتانسیل غشاء میتوکندری(%)

5/60a

0/52b

6/54b

7/53b

1/2

یکپارچگی آکروزوم (%)

82

80

78

83

3/2

مالون دی آلدهید (nmol/ml)

54/2 a

24/3 b

35/3 b

51/3 b

78/0

a b میانگین­هایی که دارای حروف غیرمشابه هستند تفاوت معنی­دار دارند 05/0 p≤.

 

ارزیابی زنده­مانی و پیشرفتآپوپتوزیس اسپرم

نتایج میزان زنده­مانی و پیشرفت آپوپتوزیس در اسپرم ذوب‌شده در گروه­های مختلف را نشان می­دهد هیچ تفاوت معنی­داری از نظر درصد اسپرم­های زنده در گروه‌های شاهد، 2000، 4000 و 6000 گوس به‏ترتیب با مقادیر 2/60، 2/59، 61 و 5/58 درصد مشاهده نشد. با بررسی داده­های مربوط به آپوپتوزیس در گروه­ها مشاهده شد که هیچ تفاوت معنی­داری بین گروه­های شاهد، 2000، 4000 و 6000 گوس به‏ترتیب با مقادیر 4/17، 2/14، 7/13 و 8/15درصد مشاهده نشد. بررسی داده­های میزان اسپرم مرده در گروه­های مختلف نیز نشان می­دهد که هیچ اختلاف معنی­داری بین گروه­های شاهد، 2000، 4000 و 6000 گوس به‏ترتیب با مقادیر 4/22، 6/26، 3/25 و 7/25 درصد مشاهده نشد.

ارزیابیمیزانمالون­دی­آلدهیداسپرم

نتایج اکسیداسیون لیپید غشاء در گروه­های مختلف پس از فرآیند انجماد در رقیق­کننده­های مغناطیسی شده نشان می­دهد که با افزایش شدت میدان مغناطیسی اعمال‌شده بر رقیق‌کننده lake استفاده‌شده در این آزمایش میزان پراکسیداسیون لیپید نیز افزایش پیدا می‌کرد به‌طوری‌که بیش‌ترین میزان لیپید پراکسیداسیون در گروه­های 2000، 4000 و 6000 گوس به‏ترتیب با مقادیر 24/3، 35/3 و 51/3 درصد مشاهده شد که در مقایسه با گروه­ شاهد (54/2 درصد) به­طور معنی­داری بالاتر بودند (05/0p<)، اما بین سه گروه گزارش شده اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 3).

بحث

در طی فرآیند انجماد، اسپرم­ها تحت شرایط تنش­زای متعدد قرار می­گیرند که می­تواند باعث اختلال در عمل‏کرد و یا آسیب اندامک­های سلولی شود. از جمله این تنش­ها می‌توان به تنش سرمایی و تنش اسمزی اشاره کرد و در نتیجه میزان اکسیداسیون غشا به‌واسطه درصد بیشتر واکنش­های اکسیداتیو افزایش می­یابد که این امر در نهایت زنده ماندنو عمر اسپرم را کاهش می­دهد (10 و 11). نشان داده شده است که میزان لقاح پس ‌از انجماد اسپرم به‌واسطه عملکرد نامناسب غشای آن به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای کاهش می‌یابد (12 و 13). همچنین انجماد منجر به تغییرات DNA، سیتواسکلت اسپرم، مهار اتصال اسپرم به تخمک و تخریب آکسونم اسپرم شده که منجر به کاهش جنبایی آن می‌شود (14 و 15). اگرچه تلاش­های متعددی برای توسعه یک روش مناسب برای انجماد اسپرم طیور صورت گرفته است، اما هنوز یک پروتکل موفق برای انجماد به دست نیامده است (16). گونه­های فعال اکسیژن که القا کننده­های قوی آسیب­های ناشی از تنش ­اکسیداتیو هستند بر تنظیم عملکردهای خاص سلول مانند آپوپتوزیس نقش دارند. در سال­های اخیر محققین تلاش­های زیادی برای حذف رادیکال­های آزاد از محیط­های انجماد-ذوب داشته­اند. تمام روش­های جلوگیری از فعالیت رادیکال­های آزاد همواره روش­های تدافعی بوده است (17). این موضوع سبب شده است که محققین روش­ها و رویکرد‌های جدیدی برای محافظت از اسپرم در حین فرآیند انجماد-ذوب پیشنهاد دهند. فرضیه این پژوهش این بود که امواج مغناطیسی گونه­های اکسیژن فعال را از طریق الکترون‌دهی به آن‌ها غیرفعال می­کنند. میدان مغناطیسی با تضعیف پیوندهای واندروالسی بین مولکول‌های آب (18)، و با شکستن پیوندهای هیدروژنی باعث آزادسازی الکترون و افزایش انتقال الکترون (19) به گونه‌های اکسیژن فعال و در نتیجه باعث غیرفعال‌سازی آن‌ها می­شوند و این­گونه از اسپرم در برابر گونه‌های اکسیژن فعال محافظت می‌کند و در نتیجه باعث افزایش کیفیت اسپرم می‌شود. همچنین میدان مغناطیسی از طریق افزایش حلالیت محیط­های پایه رقیق­کننده و نیز از طریق تشکیل کریستال­های انجمادی کوچک‌تر، باعث محافظت از اسپرم در شرایط انجمادی و بهبود کیفیت اسپرم می‌شود.

گرچه هنوز اطلاعات دقیقی از نحوه چگونگی اثرات القای شدت­های مختلف میدان مغناطیسی بر اسپرم خروس وجود ندارد، ولی تاکنون اثرات مثبت آن بر اسپرم گونه­هایی مانند خوک، گاو، جوجه گوشتی، موش و سلول‌های بنیادی جنین انسان گزارش شده است. در طی فرآیند انجماد، اسپرم­ها تحت شرایط تنش­زا متعدد قرار می­گیرند که می­تواند باعث اختلال در عملکرد و یا آسیب اندامک­های سلولی شود. این آزمایش اولین مطالعه به‌منظور بررسی اعمال شدت­های مختلف میدان مغناطیسی بر محیط انجمادی اسپرم است (20).

سوگا و همکاران (21) که نتایج حاصل از تحقیقات آن‌ها نشان داد ذوب نمونه‌های اسپرم که میدان مغناطیسی به‏مدت 30 دقیقه به آن‌ها القاشده بود جنبایی و زنده‌مانی بالاتری نسبت به نمونه­های غیر مغناطیسی شده داشتند. همچنین در مطالعه‌ای دیگر اثر میدان مغناطیسی بر اسپرم انسان مورد بررسی قرار گرفت (22). میدان­های مغناطیسی با فرکانس 10 هرتز باعث افزایش حرکت سریع اسپرم (8/1 برابر) بعد از چهار ساعت ­شد. یافته­های حاصل از تحقیق تاتنو و همکاران (23) نشان داد که قرار گرفتن اسپرم در معرض میدان مغناطیسی باعث بهبود ویژگی­های حرکتی اسپرم در شرایط آزمایشگاهی می‌شود. با توجه به مطالعات اخیر روی اثرات میدان­های مغناطیسی بر اسپرم گاو، خوک و انسان می‌توان به این نتیجه رسید که میدان مغناطیسی باعث بهبود و افزایش برخی پارامترهای اسپرم از جمله حرکت پیشرونده اسپرم می‌شود. در این آزمایش نشان داده‌شده که میدان­های مغناطیسی با فرکانس پایین هیچ آسیبی به آکروزوم اسپرم انسان وارد نمی‌کند. کاهش جنبایی اسپرم در شدت­های بالای میدان مغناطیسی در نمونه­های رقیق‌شده با آب مغناطیسی را می­توان به علت افزایش سطح گونه­های اکسیژن فعال نسبت داد زیراROS با کاهش جنبایی اسپرم ارتباط مستقیم دارد و این احتمال وجود دارد که افزایش سطح ROS باعث اکسیداسیون گروه­های سولفیدریل و درنتیجه کاهش فسفوریلاسیون پروتئین­های آکسونمال در اسپرم ­می­شود که این امر باعث کاهش جنبایی می­گردد (24).

 یکی دیگر از دلایل کاهش عملکرد اسپرم در تیمارهای 4000 و 6000 گوس این است که رادیکال­های آزاد پس از عبور از غشا، منجر به مهار فعالیت برخی از آنزیم­ها نظیر گلوکز-6-فسفات­دهیدروژناز (G6PD) می‌شود. این آنزیم­ها میزان انتقال گلوکز از طریق شنت هگزوزمونوفسفات (مسیرپنتوزفسفات) را کنترل می‌کند این مسیر در شرایط عادی تولیدکننده نیکوتین­آمید­آدنین­دی­نوکلئوتید فسفات (NADPH) احیاشده برای واکنش­های احیایی در سلول است. NADPH به‌عنوان منبع الکترون جهت تولید ROSتوسط سیستم آنزیمی NADPH اکسیداز مورداستفاده قرار می­گیرد. مهار شنت هگزوزمونوفسفات باعث کاهش تولید NADPH به‌عنوان اکی­والان احیاء کننده در سلول می‌شود. در نتیجه عمل آنزیم گلوتاتیون­پراکسیداز به گلوتاتیون (G-SH) به فرم اکسید شده آن تبدیل می­گردد. سلول برای احیای مجدد گلوتاتیون اکسید شده به NADPH احتیاج دارد، بنابراین کاهش سطح NADPH به‏علت مهار آنزیم G6PD باعث کاهش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز به‌عنوان سد دفاعی آنتی­اکسیدانتی می‌شود، بنابراین میزان پراکسیداسیون فسفولیپیدهای غشای اسپرم افزایش می­یابد، در نتیجه سیالیت غشاء کاهش پیدا می‌کند، نتیجه­ی این تغییرات کاهش جنبایی اسپرم خواهد بود (25 و 26).

بررسی نتایج حاصل که اثر میدان مغناطیسی با شدت­های مختلف بر رقیق‌کننده استفاده‌ شده در محیط انجمادی اسپرم خروس بود، نشان می­دهد که هیچ اختلاف معنی­داری بین گروه­های شاهد، 2000، 4000 و 6000 گوس از نظر اسپرم زنده، آپوپتوتیک و مرده مشاهده نشد. در مطالعه حاضر نشان داده شد که استفاده از رقیق‌کننده مغناطیسی شده در محیط انجماد اسپرم خروس، تفاوت معنی­داری در میزان اسپرم‌های غیر نرمال ایجاد نکرد. فرض بر این است که اسپرم‌های صدمه‌دیده طی انجماد و ذوب باعث افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال می‌شود که می‌تواند به اسپرم‌های نرمال موجود در همان نمونه آسیب بزند. فاکتورها و عوامل مختلفی وجود دارد که بر شدت بهینه این امواج بر نتایج انجماد تاثیرگذار است. مهم‌ترین این فاکتورها فرمولاسیون انجمادی است و به‏نظر می‌رسد اجزای رقیق‌کننده‌های انجمادی ازجمله قندها و نمک‌ها و بافرها بر نتایج امواج با شدت‌های مختلف تاثیرگذار است. همچنین از دیگر فاکتورهای تاثیرگذار تفاوت­های گونه‌ای، مورفولوژی اسپرم و ترکیبات موجود در غشای اسپرم می‌باشد و با توجه به این‏که مورفولوژی اسپرم در خروس ساختاری کاملا متفاوت و مجزا با اسپرم پستانداران دارد، این قابل پیش‌بینی است که میزان شدت بهینه امواج در خروس و سایر گونه‌ها متفاوت باشد. امواج باعث افزایش نفوذ نگه‏دارنده‌های انجمادی به‏داخل اسپرم می‌شود. آب مغناطیسی شده نگه‏دارنده‌های انجمادی مثل لسیتین سویا را بهتر در خود حل می‌کند و باعث می‌شود پوشش آپولیپوپروتئینی لسیتین سویا غشا اسپرم را بهتر حفاظت کند.

نتیجه‌گیری

اگرچه فاکتور‌ها و عوامل متنوعی می‌توانند بر نتایج مغناطیسی کردن رقیق‌کننده‌های انجمادی تاثیرگذار باشند، اما به‌نظر می‌رسد مغناطیسی کردن مستقیم رقیق‌کننده انجمادی در پرندگان نتایج مفیدی نداشته باشد. شاید به‏دلیل بالاتر بودن فشار اسمزی رقیق‌کننده‌های پرندگان و بالا بودن تعداد نمک‌های موجود در آن‌ها سبب عدم تاثیرگذاری امواج مغناطیسی بر خود رقیق‌کننده‌ها شده باشد. با این حال انجام مطالعات بیشتر هم در نحوه ساخت رقیق‌کننده و هم در نحوه مغناطیسی کردن مستقیم خود رقیق‌کننده توصیه می‌شود.

منابع

1. Bailey JL, Bilodeau J, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. J Androl. 2000; 21(1): 1-7.

2. Noirault J, Brillard J. Effects of frequency ofsemen collection on quantitative and qualitative characteristics of semen in turkey breeder males. Poult Sci. 1999; 78(7): 1034-1039.

3. Douard V, Hermier D, Magistrini M, Labbe C. Impact of change in composition of storage medium on lipid content and quality of turkey spermatozoa. Theriogenology. 2004; 61: 1-13.

4. Long J, Kulkarni G. An effective methodfor improving the fertility of glycerol-exposed poultry semen. Poult Sci. 2004; 83(9): 1594-1601.

5. Auger JA, Ronot XA, Dadoune JP. Human sperm mitochondrial function related to motility: a flow and image cytometric assessment. J Androl. 1989; 10(6): 439-48.

6. Fattah A, Sharafi M, Masoudi R, Shahverdi A, et al. L-Carnitine in rooster semen cryopreservation: flow cytometric, biochemical and motion findings for frozen-thawed sperm. Cryobiology. 2017; 74: 148-153.

7. Shahverdi A, Sharafi M, Gourabi H, Yekta AA, et al. Fertility and flow cytometric evaluations of frozen-thawed rooster semen in cryopreservation medium containing low-density lipoprotein. Theriogenology. 2015; 83(1): 78-85.

8. Emamverdi M, Zhandi M, Zare Shahneh A, Sharafi M,et al. Optimization of ram semen cryopreservation using a chemically defined soybean lecithin-based extender. Reprod Domest Anim. 2013; 48(6): 899-904.

9. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Meth Enzym. 1990; 186: 407–421.

10. Lowe S, Lin A. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000; 21(3): 485–495.

11. Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H, Kimchi A. Life and death partners: apoptosis، autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Diff. 2009; 16(7): 966-975.

12. Lane JD, Lucocq J, Pryde J, Barr FA, et al. Caspase-mediated cleavage of the stacking protein GRASP65 is required for Golgi fragmentation during apoptosis. J Cell Biol. 2002. 156(3): 495-509.

13. Chiu R, Novikov L, Mukherjee S, Shields D. A caspase cleavage fragment of p115 induces fragmentation of the Golgi apparatus and apoptosis. J Cell Biol. 2002; 159(4): 637-648.

14. Letai AG. Diagnosing and exploiting cancer's addiction to blocks in apoptosis. Natur Rev Can. 2008; 8(2): 121-132.

15. Broadhead ML, Dass CR, Choong PF. Cancer cell apoptotic pathways mediated by PEDF: prospects for therapy. Trend Molecul Med. 2009; 15(10): 461-467.

16. Chun-Yen L, Po-Li W, Wei-Jen C, Yung-Kai H, et al. Slow freezing coupled static magnetic field exposure enhances cryopreservative efficiency—A study on human erythrocytes. PloS one. 2013; 8(3):e58988.

17. Pribenszky C, Vajta G, Molnar M, Du Y, et al. Stress for stress tolerance? A fundamentally new approach in mammalian embryology. Biol Reprod. 2010; 83(5): 690-697.

18. Krems RV. Breaking van der Waals moleculeswith magnetic fields. Phys Rev Lett. 2004; 93: 013201.

19. Chang KT, Weng CI. An investigation into the structure of aqueous NaCl electrolyte solutions under magnetic fields. Comp Mat Sci. 2008; 43(4): 1048-1055.

20. Gliozzi T, Zaniboni L, Cerolini S. DNA fragmentation in chicken spermatozoa during cryopreservation. Theriogenology. 2011; 75(9): 1613-1622.

21. Suga D, Shinjo A. Effects of 600 gauss static magnetic field on the freezing of cattle sperm. J Magnet Soc Japan. 1997; 21: 1134-1137.

22. Falahati SA, Anvari M, Khalili MA. Effects of combined magnetic fields on human sperm parameters. Iran J Radiat Res. 2011; 9(3): 195-200.

23. Tateno H, Iijima S, Nakanishi Y, Kamiguchi Y, et al. No induction of chromosome aberrations in human spermatozoa exposed to extremely low frequency electromagnetic fields. Mut Res. 1989; 414: 31–35.

24. Gil-Guzman E, Ollero M, Lopez M, Sharma R, et al. Differential production of reactive oxygen species by subsets of human spermatozoa at different stages of maturation. HumReprod. 2001; 16(9): 1922-1930.

25. Armstrong JS, Bivalacqua TJ, Chamulitrat W, Sikka S, et al. A comparison of the NADPH oxidase in human sperm and white blood cells. In J Androl. 2002; 25(4): 223-229.

26. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiw MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Ster. 2003; 79(4): 829-843

Bailey JL, Bilodeau J, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. J Androl. 2000; 21(1): 1-7.

2. Noirault J, Brillard J. Effects of frequency ofsemen collection on quantitative and qualitative characteristics of semen in turkey breeder males. Poult Sci. 1999; 78(7): 1034-1039.

3. Douard V, Hermier D, Magistrini M, Labbe C. Impact of change in composition of storage medium on lipid content and quality of turkey spermatozoa. Theriogenology. 2004; 61: 1-13.

4. Long J, Kulkarni G. An effective methodfor improving the fertility of glycerol-exposed poultry semen. Poult Sci. 2004; 83(9): 1594-1601.

5. Auger JA, Ronot XA, Dadoune JP. Human sperm mitochondrial function related to motility: a flow and image cytometric assessment. J Androl. 1989; 10(6): 439-48.

6. Fattah A, Sharafi M, Masoudi R, Shahverdi A, et al. L-Carnitine in rooster semen cryopreservation: flow cytometric, biochemical and motion findings for frozen-thawed sperm. Cryobiology. 2017; 74: 148-153.

7. Shahverdi A, Sharafi M, Gourabi H, Yekta AA, et al. Fertility and flow cytometric evaluations of frozen-thawed rooster semen in cryopreservation medium containing low-density lipoprotein. Theriogenology. 2015; 83(1): 78-85.

8. Emamverdi M, Zhandi M, Zare Shahneh A, Sharafi M,et al. Optimization of ram semen cryopreservation using a chemically defined soybean lecithin-based extender. Reprod Domest Anim. 2013; 48(6): 899-904.

9. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Meth Enzym. 1990; 186: 407–421.

10. Lowe S, Lin A. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000; 21(3): 485–495.

11. Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H, Kimchi A. Life and death partners: apoptosis، autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Diff. 2009; 16(7): 966-975.

12. Lane JD, Lucocq J, Pryde J, Barr FA, et al. Caspase-mediated cleavage of the stacking protein GRASP65 is required for Golgi fragmentation during apoptosis. J Cell Biol. 2002. 156(3): 495-509.

13. Chiu R, Novikov L, Mukherjee S, Shields D. A caspase cleavage fragment of p115 induces fragmentation of the Golgi apparatus and apoptosis. J Cell Biol. 2002; 159(4): 637-648.

14. Letai AG. Diagnosing and exploiting cancer's addiction to blocks in apoptosis. Natur Rev Can. 2008; 8(2): 121-132.

15. Broadhead ML, Dass CR, Choong PF. Cancer cell apoptotic pathways mediated by PEDF: prospects for therapy. Trend Molecul Med. 2009; 15(10): 461-467.

16. Chun-Yen L, Po-Li W, Wei-Jen C, Yung-Kai H, et al. Slow freezing coupled static magnetic field exposure enhances cryopreservative efficiency—A study on human erythrocytes. PloS one. 2013; 8(3):e58988.

17. Pribenszky C, Vajta G, Molnar M, Du Y, et al. Stress for stress tolerance? A fundamentally new approach in mammalian embryology. Biol Reprod. 2010; 83(5): 690-697.

18. Krems RV. Breaking van der Waals moleculeswith magnetic fields. Phys Rev Lett. 2004; 93: 013201.

19. Chang KT, Weng CI. An investigation into the structure of aqueous NaCl electrolyte solutions under magnetic fields. Comp Mat Sci. 2008; 43(4): 1048-1055.

20. Gliozzi T, Zaniboni L, Cerolini S. DNA fragmentation in chicken spermatozoa during cryopreservation. Theriogenology. 2011; 75(9): 1613-1622.

21. Suga D, Shinjo A. Effects of 600 gauss static magnetic field on the freezing of cattle sperm. J Magnet Soc Japan. 1997; 21: 1134-1137.

22. Falahati SA, Anvari M, Khalili MA. Effects of combined magnetic fields on human sperm parameters. Iran J Radiat Res. 2011; 9(3): 195-200.

23. Tateno H, Iijima S, Nakanishi Y, Kamiguchi Y, et al. No induction of chromosome aberrations in human spermatozoa exposed to extremely low frequency electromagnetic fields. Mut Res. 1989; 414: 31–35.

24. Gil-Guzman E, Ollero M, Lopez M, Sharma R, et al. Differential production of reactive oxygen species by subsets of human spermatozoa at different stages of maturation. HumReprod. 2001; 16(9): 1922-1930.

25. Armstrong JS, Bivalacqua TJ, Chamulitrat W, Sikka S, et al. A comparison of the NADPH oxidase in human sperm and white blood cells. In J Androl. 2002; 25(4): 223-229.

26. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiw MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Ster. 2003; 79(4): 829-843