تمایز عصبی سلول‌های بنیادی کارسینومای جنینی کشت سه‌بعدی در دستگاه عصبی جنین مرغ

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران

o

چکیده

هدف: پژوهش حاضر به‏منظور بررسی اثر داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل آمیخته با عصاره مغز نوزاد رت NRBE)) بر تمایز عصبی سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 طراحی شد.
مواد و روش­ها: به‏منظور القای فنوتیپ عصبی، سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل آمیخته با عصاره­ی مغز نوزاد موش صحرایی کشت شدند. برای ارزیابی توان بقا، مهاجرت و تمایز سلول­های کشت سه­بعدی، این سلول­ها به دستگاه عصبی مرکزی در حال تکوین جنین جوجه پیوند شدند. سرانجام سلول­های پیوندی با استفاده از رو­­ش­های رنگ­آمیزی اختصاصی و ایمنوفلورسانس ردیابی شدند.
نتایج: رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله، فنوتیپ عصبی سلول­های پیوندی را تایید نمود. همچنین بیان پروتئین­ اختصاصی عصبی، سیناپتوفیزین با استفاده از فرآیند ایمنوفلورسانس نشان داده شد.
نتیجه­گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی P19 را می­توان به‏عنوان منبع عظیمی از سلول­های پرتوان در مطالعات پیوندی به منظور بررسی جنبه­های سلولی و مولکولی تکوین و تمایز سلولی مورد استفاده قرار داد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


-

مقدمه

درمان بیماران مبتلا به ضایعه نخاعی و رفع ناتوانی این گروه از بیماران و یا بازگرداندن برخی از توانایی­های آن­ها بسیار با اهمیت و مورد توجه پژوهش‏گران بوده است. استفاده از سلول‌درمانی و جایگزینی سلول‌­های مرده یا آسیب­دیده با سلول‌­های جدید یکی از راه‏کارهای نوین درمان برای این بیماران است. از آنجا که سلول‌­های بنیادی توانایی خودنوزایی و تبدیل به سلول‌های دیگر را دارند، در درمان می‌توان از آن­ها استفاده نمود. با توجه به اینکه کارآیی سلول‌­های عصبی متمایزشده پس از پیوند کم است استفاده از روش­های محرک رشد و بقای سلول‌­های پیوندی بایستی مورد بررسی بیشتری قرار گیرد تا سلول ‌درمانی با موفقیت بیشتری انجام­پذیر باشد. میزان بیماری­های زوال دستگاه عصبیمانند آلزایمر، پارکینسون، هانتینگتونو ام­اس در بسیاری از کشورهای جهان رو به افزایش است (1). این بیماری­ها در اثر تخریب سلول­های‌ عصبی و ضعف یا از بین رفتن عملکرد آن­ها و در نتیجه تجمع پروتئین­های سمی در دستگاه ­عصبی ­مرکزی (Central Nervous System) (CNS) ایجاد می‌شوند. گرچه مطالعه و پژوهش در زمینه درمان این بیماری‏ها نظیر درمان با سلول‌ بنیادی و محافظت از دستگاه عصبی از اهمیت بالایی برخوردار است. اما هنوز این مطالعات در مراحل ابتدایی خود هستند. در حال حاضر درمان­هایی که برای این بیماری­ها در دسترس است فاقد کارآیی کافی است و در اکثر موارد فقط می­توان بخش کوچکی از علایم را به‏طور موقت کاهش داد. دانشمندان به‏طور جدی در حال انجام پژوهش هستند تا بتوانند درمان­هایی برای انواع گوناگونی از بیماری‌ها به‏ویژه بیماری­های زوال بافت دستگاه عصبی مانند ام­اس پیدا کنند. برخی از روش­های درمان این بیماری­ها عبارتند از کاهش سطح پروتئین­های تجمع­یافته با استفاده از روش­های محدودسازی نفوذپذیری سد خونی- مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به‏منظور حمایت از سلول­های عصبی آسیب دیده، دارو درمانی و سلول‌درمانی (2 و 3). استفاده از سلول‌­های بنیادی امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت­های عصبی آسیب ­دیده فراهم آورده است. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که سلول‌­‌های بنیادی می­توانند به انواع بافت‏های‌ دیگر تمایز یابند. سلول­های‌ تمایزیافته قادرند از طریق جریان خون به‏سمت مغز حرکت نموده و توسط قسمت‌­های آسیب‌دیده جذب شوند. امروزه شاهد پیشرفت­های چشم‏گیری در عرصه­ی سلول‌­های بنیادی هستیم که راه­های نوینی را برای درمان تعدادی از بیماری­ها از جمله بیماری­های زوال عصبی پیش رو گذاشته است (4 و 5). سلول‌­های حاصل از تمایز سلول­های بنیادی مستقیما به‏درون CNS پیوند زده می­شوند و یا به عروق خونی به صورت درون­وریدی (Intravenous ) یا درون­شریانی (Intra-arterial) تزریق می­شوند (6). در سال­های اخیر، روش­های آزمایشگاهی زیادی توسعه­ یافته­اند که امکان تولید سلول‌ عصبی از سلول‌های پرتوان را در فرآیند کشت سلول فراهم می­کنند (7-9). رده ‌P19 نوعی سلول‌ بنیادی کارسینومای جنینی پرتوان است که در صورت تیمار با اسیدرتینوئیک به انواع سلول­ها‌ی ناشی از نورواکتودرم متمایز می­شود (10). ترکیب سلول‌های‌ بنیادی با داربست تهیه شده از مواد زیستی راه‏کار امیدوارکننده­ای در درمان بیماری­هاست. داربست زیست­ مواد می­تواند جایگزین بافت­های آسیب­دیده شود که برای ترمیم، بقا و تمایز سلول‌های‌ بنیادی لازم است (11).

اولین بار ارسطو از جنین جوجه به‏عنوان مدل مناسبی برای مطالعات و پژوهش­های جنین­شناسی استفاده کرد. از آن زمان تاکنون جنین جوجه به‏عنوان ابزاری ایده­آل برای مطالعات جنین­شناسی، تکوین و ایمنی‏شناسی در نظر گرفته شده است . دست­یابی آسان و سهولت دست­ورزی ، جنین جوجه را به مدلی ایده­آل برای مطالعه در زمینه­ی تکوین مهره­داران تبدیل نموده است. این مدل در فرآیند­های پیوند بافت مورد دست­ورزی پژوهشگران قرار گرفته و یافته­های بسیار مهمی را در خصوص القای بافت­های مختلف، تعیین سرنوشت سلول‌، الگودهی، مسیریابی آکسونی و مهاجرت و تمایز سلول‌ در دسترس قرار داده است (12). در این پژوهش جهت تمایز عصبی از سلول‌های‌ بنیادی پرتوان P19 استفاده شد. این سلول‌­ها برروی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل رشد یافته و پس از القای تمایز به سلول­های‌ عصبی به محل تخریب شده دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه پیوند شدند.

مواد و روش­ها

کشت، تکثیر و ذخیره سلول‌های‌ بنیادی: کشت چسبنده سلول‌­های بنیادی کارسینومای جنینی (رده P19، بانک سلولی انستیتو پاستور، تهران، ایران) در شرایط کاملا استریل، با استفاده از ظروف ویژه یکبار مصرف در محیط کشت α-MEM (α-modified Eagle's medium:Gibco, 11900- 073) همراه با ده درصد سرم FBS (Fetal bovine serum, Sigma, 10270-106)، پنی­سیلین و استرپتومایسین انجام شد. به‏منظور تامین شرایط مناسب برای رشد و تکثیر سلول‌ از انکوباتور مرطوب با میزان CO2 5 درصد و دمای 37 درجه سانتی‏گراد استفاده شد. در هنگام دستیابی به تراکم سلولی مناسب، سلول­ها واکشت شدند. در ضمن، جهت تهیه ذخایر کافی، سلول­ها با استفاده از محیط کشت حاوی سرم و DMSO (Dimethylsulfoxide) منجمد و در دمای 70- درجه سانتی­گراد و یا تانک ازت ذخیره شدند.

کشت سه بعدی سلول‌­ها و تمایز عصبی آن­ها: در این پژوهش به‏منظور تامین عوامل رشد مورد نیاز سلول‌­های بنیادی کشت شده روی داربست و تمایز آن‏ها به سلول عصبی از عصاره مغز نوزاد موش صحرایی استفاده شد. بدین‏ترتیب سلول‌های‌ بنیادی ضمن کشت سه­بعدی، به‏طور همزمان در معرض نوعی عامل القاکننده­ی طبیعی قرار گرفتند. سلول‌های‌ مذکور پس از تمایز به محل تخریب شده‌ی دستگاه عصبی جنین جوجه در مرحله 18 تا 20 جنینی پیوند شدند(13). داربست کیتوسان/ پلی‌وینیل­الکل در گروه مهندسی مواد دانشکده فنی مهندسی دانشگاه شهرکرد تهیه شد. جهت استریل و آماده‌سازی برای کشت، داربست­ها به‏مدت یک روز در الکل اتیلیک 70 درصد و سپس در سه نوبت و هر نوبت به‏مدت 3 تا 4 ساعت در محلول PBS قرار داده شدند. در آخرین مرحله شستشو با PBS داربست­ها به‏مدت 15 تا 20 دقیقه در معرض اشعه‌ی UV قرار گرفتند. کشت معلق سلول‌‌ها منجر به تشکیل دسته‌های سلولی به نام اجسام شبه جنینی (Embryoid bodies) می‌شود. اجسام شبه جنینی پس از تولید، روی داربست منتقل شده و هم‏زمان در معرض عصاره مغز نوزاد موش صحرایی قرار گرفتند. پس از گذشت یک هفته سلول‌های‌ حاصل از کشت سه‌بعدی برای پیوند استفاده شدند.

پیوند سلول‌های‌ تمایزیافته در داربست به دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه: تخم‏مرغ‏های نطفه­دار از مجتمع اصلاح و تکثیر مرغ بومی جهاد کشاورزی تهیه و در دمای 38 درجه سانتی‏گراد و شرایط مرطوب انکوباتور تا مرحله 18 تا 20 هامبرگر-هامیلتون نگه‏داری شدند (13). به‏منظور دسترسی به جنین جوجه با ایجاد پنجره­ای در پوسته آهکی تخم­مرغ و برداشتن بخشی از غشای ویتلین جنین نمایان شد. پس از تخریب بخشی از لوله عصبی در حال تکوین، بلافاصله بعد از مغز عقبی، سلول‌­ها به این بخش پیوند شدند. لازم به ذکر است که در این مرحله از سلول­های بیان­کننده GFP (Green fluorescence protein) برای پیونداستفاده شد (مراجعه به بخش بعدی). بعد از پوشاندن پنجره با پارافیلم، تخم­مرغ تا مراحل بعدی به انکوباتور بازگردانده شد تا جنین به رشد خود ادامه دهد. پس از گذشت یک تا سه روز جنین­ها از تخم­مرغ خارج و پس از شستشو با PBS در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. سرانجام از نمونه­های تثبیت­شده مقاطع بافتی تهیه شد و ردیابی سلول‌های‌ پیوندی در مقاطع بافتی با استفاده از روش‌های مختلف انجام گرفت.

تولید سلول­های بیان­کننده GFP: به‏منظور انتقال ژن GFP به سلول­ها از پلاسمید pML8 (شکل1) اهدایی از آزمایشگاه دکتر مک­برنی، McBurney's laboratory, Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canada) که ژن GFPو ژن مقاوم به پیورومایسین را تحت کنترل پروموتور Pgk-1 موشی بیان می­کند و از روش رسوب کلسیم فسفات (CaPO4) استفاده شد (10). برای ترانسفکت پایدار از محیط کشت انتخابی حاوی پیورومایسین استفاده شد و سلول ها بعد از هشت روز مورد بررسی قرار گرفتند. سلول­های بیان­کننده GFP در روز هشتم بعد از انتقال ژن با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس بررسی شدند.

 

 

شکل 1: طرح شماتیک پلاسمید PML8 که حاوی ژن پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و ژن مقاوم به پیورومایسین است.

 

رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله: مقاطع بافتی تهیه شده با استفاده از زایلل پارافین­زدایی شده و پس از آب‏دهی و شستشو در معرض رنگ کرزیل­ویوله شامل ترکیب اسیداستیک­گلاسیال (8/0 درصد)، استات‏سدیم (6/0 میلی مولار)، پودر کرزیل­ویوله (کرزیل­ویوله 25/0 درصد) و آب مقطر قرار گرفتند. نمونه­ها پس از آب‏گیری، شفاف­سازی و چسباندن روی لام با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شدند.

بررسی تمایز سلول‌های‌ پیوندشده به دستگاه عصبی جنین جوجه با استفاده از روش ایمنوفلورسنس

پس از پیوند سلول‌ و طی مرحله انکوباسیون، جنین­ها از داخل تخم­مرغ خارج و به‏سرعت در محلول فرمالین ده درصد تثبیت شدند. به‏منظور ردیابی سلول‌های‌ پیوندی و بررسی تمایز آن­ها در بدن موجود زنده مقاطع تهیه شده در معرض آنتی­بادی­های اولیه ضد GFP (Rabbit polyclonal antibody to GFP Abcam, ab290) و ضد سیناپتوفیزین (Mouse anti-synaptophysin monoclonal antibody, Abcam, ab8049) و آنتی‌بادی­های ثانویه کونژوگه شده FITC(FITC-conjugated anti-mouse IgG, Sigma, F9137) (برای سیناپتوفیزین) و Cy5.29(Cy5.29-conjugated anti-rabbit IgG, Abcam, ab6564) (برای GFP) قرار گرفتند. سپس مقاطع رنگ­آمیزی شده به‏وسیله میکروسکوپ فلورسنس بررسی شدند.

نتایج

کشت و تکثیر سلول‌های‌ بنیادی P19

سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی P19 قادرند به‏طور مداوم در محیط کشت حاوی سرم رشد نموده و برای تمایز به هر دو دودمان مزودرمی و اکتودرمی القا شوند. این سلول‌­ها بعد از این­که وارد ظرف کشت شدند به کف آن چسبیده و به‏سرعت شروع به تکثیر نمودند (شکل2 A) و پس از گذشت حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت تشکیل کلونی­های سلولی را آغاز کردند (شکل2 B). این سلول‌­ها چندین بار در محیط کشت در ظروف مخصوصی کشت و در مواقع ضروری به‏طور مداوم حداکثر تا سه مرحله واکشت شدند.

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از کشت و تکثیر سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی P19 (پیکان) در محیط کشت 𝛂-MEM همراه با ده درصد سرم گاوی جنینی. (A: 40X, B: 400X)

 

تولید اجسام شبه جنینی و کشت سه بعدی سلول‌های‌ بنیادی P19 در داربست کیتوسان/­پلی­وینیل­الکل

کشت معلق سلول­های‌ کارسینومای جنینی P19 در پتری دیش­های غیرچسبنده باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه جنینی می­شود. تصویر دو جسم شبه­جنینی به‏عنوان نمونه ارایه شده است (شکل3 A). اجسام شبه جنینی روی داربست­های استریلی که در میکروپلیت­های 12 خانه­ای قرار داده شده بودند، با محیط کشت 𝛂-MEM محتوی سه درصد سرم و عصاره مغز نوزاد رت کشت شدند (شکل3 B). محیط کشت تقریبا یک روز درمیان تعویض شد. چسبیده شدن اجسام شبه­جنینی روی داربست­ و نفوذ سلول‌های‌ بنیادی به‏داخل آن در شکل 3 B به‏خوبی نشان داده شده است. نحوه­ی قرارگیری سلول‌­ها بر روی داربست، نشان از مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول‌­ها است. این نتایج نشان می­دهد که داربست­های تهیه شده محیط و بستری بسیار مطلوب را برای اتصال و رشد سلول‌­ها فراهم کرده­اند.

 

 

شکل ‏3: تصویر میکروسکوپ نوری از اجسام شبه جنینی و کشت آن­ها روی داربست کیتوسان/­پلی­وینیل­الکل. A) اجسام شبه جنینی حاصل از کشت معلق سلول‌های‌ P19 (پیکان). پیکان یک جسم شبه جنینی کشت شده روی داربست، سر پیکان سلول‌ها و ستاره داربست را نشان می­دهد. B) شیوه قرارگیری سلول‌­ها روی داربست نشان از مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول‌­ها است. (A: 100X, B: 40X)

 

بررسی ریخت‌شناسی سلول‌های‌ تمایزیافته؛ رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله

پس از کشت سه­بعدی سلول‌­ها و استفاده از عصاره مغز، به‏منظور بررسی اولیه­ی فنوتیپ عصبی در سلول‌های‌ حاصل از تمایز از رنگ­آمیزی کرزیل­ویوله استفاده شد. شکل 4 سلول‌های‌ P19 تمایزیافته به سلول‌های‌ شبه‌عصبی را که توسط کرزیل­ویوله به رنگ بنفش در آمده­اند در دو سیستم کشت سه­بعدی (شکل4 A) و دوبعدی (شکل4 B) نشان می­دهد. سلول‌های‌ شبه­عصبی شبکه­ای سلولی روی سطح لایه سلولی غیرعصبی تشکیل دادند (شکل4 B، سر پیکان).

 

 

شکل 4: بررسی ریخت­شناسی سلول­های‌ تمایزیافته تحت تاثیر دو سیستم ترکیبی از کشت سه­بعدی و عامل القایی عصاره مغز نوزاد موش صحرایی (A) و کشت دوبعدی همراه با عامل القایی عصاره مغز نوزاد موش صحرایی (B) با استفاده از رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله. پیکان سلول‌های‌ عصبی، سر پیکان سلول‌های‌ غیرعصبی و ستاره داربست را نشان می­دهد. A: 40X,) (B: 400X

 

پیوند سلول‌های‌ P19 تمایزیافته حاصل از کشت سه­بعدی به طناب عصبی جنین جوجه

پس از کشت اجسام شبه­جنینی روی داربست و القا توسط عصاره مغز نوزاد موش صحرایی، سوسپانسیونی از سلول‌­ها جهت پیوند به طناب عصبی تخریب­شده جنین جوجه تهیه شد. از آن جایی‏که جنین جوجه مدل مناسبی برای مطالعه مهاجرت سلولی، تمایز و هدایت سیگنالی در طول تکوین است، در این پژوهش به‏منظور ردیابی سلول­های‌ بنیادی تمایزیافته پس از پیوند از این مدل استفاده شد. بدین منظور تخم مرغ‏های نطفه­دار در انکوباتور با دمای 38 درجه سانتی‏گراد و در شرایط مرطوب نگه‏داری شدند. پس از رسیدن به مرحله مورد نظر پنجره­ای در پوسته آن­ها باز شد تا جنین در دسترس قرار گیرد (شکل 5 A). در ابتدا طناب عصبی در حال تکوین جنین جوجه در محلی بلافاصله بعد از مغز عقبی در مرحله 18 تا 20 جنینی تخریب و سلول‌های‌ حاصل از تمایز به این ناحیه پیوند زده شدند . شکل5 B محل تخریب لوله عصبی را در مقطع بافتی جنین جوجه در مرحله مورد نظر نشان می‌دهد.

 

 

شکل 5: محل تخریب لوله عصبی جنین جوجه در مرحله 18 تا 20 جنینی (پیکان).A ) جنین جوجه زنده پس از باز کردن پنجره در پوسته تخم­مرغ. پیکان محل تخریب طناب عصبی جنین جوجه را بلافاصله بعد از مغز عقبی نشان می‌دهد. B) تصویر میکروسکوپ نوری از مقطع بافتی رنگ‌آمیزی شده با هماتوکسیلین ـ ائوزین که محل تخریب لوله عصبی را بلافاصله بعد از مغز عقبی نشان می­دهد (B: 40X).

 

ردیابی سلول‌های‌ پیوندی به روش ایمنوفلورسنس

سلول­های‌ تزریق شده به محل تخریب لوله عصبی چند روز پس از پیوند از نظر بیان نشانگر ویژه سلول­ها‌ی عصبی بالغ، یعنی سیناپتوفیزین مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی بیان این پروتئین به‏روش ایمنوفلورسنس نشان داد که سلول‌‌های پیوندی نسبت به سیناپتوفیزین پاسخ مثبت دادند (شکل 6). بررسی­ها نشان داد که این سلول­ها پس از پیوند توانستند مهاجرت کرده و به‏خوبی با سلول­های بافت­ میزبان ارتباط برقرار نمایند. همچنین هسته سلول‌های پیوندی نسبت به هسته سلول­های میزبان بزرگتر بوده و هتروکروماتینی بیشتری نشان می­دهد.

 

 

شکل6: شکل ایمنوفلورسنس از سلول‌های‌ پیوند شده به دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه (پیکان) مهاجرت این سلول­ها در بافت میزبان و ترکیب آن­ها را با این بافت­ها به‏خوبی نشان می­دهد. A) نشانگر اختصاصی عصبی، سیناپتوفیزین، B) پروتئین فلورسنت سبز (GFP)، C) رنگ­آمیزی هسته با استفاده از هوخست. (X 100)

 

بحث

در این مطالعه القای تمایز عصبی سلول‌های‌ تراتوکارسینومای جنینی رده P19 توسط ترکیبی از داربست کیتوسان/پلی­­وینیل­الکل و عصاره مغز نوزاد موش صحرایی مورد بررسی قرار گرفت. تقریبا دو هفته بعد از القا زیر مجموعه­ای از سلول‌­ها شکل ظاهری سلول­های‌ عصبی را نشان دادند. بررسی شکل ظاهری با استفاده از رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله جهت تایید اولیه فنوتیپ عصبی انجام شد. در مرحله بعد سلول­های‌ تمایز یافته به محل تخریب شده طناب عصبی در حال تکوین جنین جوجه در مرحله 18 تا 20 جنینی پیوند زده شدند. بررسی مقاطع پارافینی نشان داد سلول‌های‌ پیوندی به مناطق دیگر بافت عصبی مهاجرت کرده و با بافت میزبان ممزوج شدند. همچنین سلول‌های‌ مذکور نشانگر­ ویژه سلول­های‌ عصبی بالغ، یعنی سیناپتوفیزین را بیان نمودند. فاکتورهای ویژه ریز محیط هر بافت نقش اساسی در تمایز اختصاصی آن بافت دارند (14). مغز پستانداران در هنگام تولد از نظر آناتومی و فیزیولوژی بالغ نبوده و در طی دوران زندگی پس از تولد به‏تدریج تکوین می­یابد (15). بنابراین در طراحی این پروژه فرض بر آن بود که عصاره مغز در حال تکوین نوزاد رت حاوی فاکتورهای ضروری برای تمایز سلول­های عصبی است. ترکیب چنین فاکتورهایی با داربست­های مختلف به‏منظور القای فنوتیپ عصبی پیش از این نیز توسط محققین مورد توجه قرار گرفته است. کشت قطعه­ای از بافت عصبی در داربست محتوی نوروتروفین3 (NT-3) و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز(BDNF) به‏طور معنی­داری باعث رشد زواید عصبی شد (16). بر اساس گزارش‏های موجود افزودن مواد مختلف مصنوعی و طبیعی به داربست کیتوسان/پلی­­وینیل­الکل منجر به القای این فنوتیپ در سلول­های بنیادی شده است. سلول­های بنیادی پالپ دندان انسان، کشت شده روی این داربست ضمن تمایز به سلول­های عصبی، نشانگرهای ویژه بافت عصبی را بیان کردند (17). بر اساس گزارش­های متعدد مواد موجود در عصاره­های بافتی یا سلولی می­تواند باعث القای تمایز در سلول­های بنیادی شود. استفاده از ریزوزیکول­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره مغز موش صحرایی در درمان رت­های مدل سکته مغزی باعث بهبود عملکرد در آن­ها شد. بررسی­های پروتئومیکس نشان داد که این ریزوزیکول­ها سرشار از پروتئین هستند (18). القای فنوتیپ سلول­های انسولین­ساز در سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان با استفاده از عصاره بافت پانکراس پیش از این به اثبات رسیده است (19). در پژوهش حاضر با استفاده از روش ترکیبی کشت سه­بعدی و به‏کارگیری نوعی القاگر طبیعی (عصاره مغز)، سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی به سمت فنوتیپ عصبی سوق داده شدند.

 

پیوند سلول‌های‌ کشت سه­بعدی به دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه

در این پژوهش سلول‌های‌ P19 تحت القای سیستم مرکبی از کشت ­سه­بعدی و عصاره مغز نوزاد موش صحرایی به سلول‌های‌ شبه عصبی تمایز پیدا کردند. بافت­های مهندسی شده پتانسیل ترمیم و جایگزینی هر قسمت از بدن را دارند. هدف مهندسی بافت تولید داربست­های زیست­مواد مشابه با ماتریکس خارج سلولی و پیوند آن جهت درمان است. داربست می­تواند موجب تحریک تمایز سلول­های‌ بنیادی به فنوتیپ مورد نظر مانند فنوتیپ عصبی ­شود (20). در این پژوهش سلول‌­های بنیادی P19 پس از کشت روی داربست و القای تمایز به طناب عصبی در حال تکوین جنین جوجه پیوند زده شدند. به این‏ترتیب جنین هیبریدی از سلول‌های‌ موش و جوجه ایجاد شد. سلول­های پیوندی با استفاده از روش ایمنوفلورسنس و نشانگر ویژه عصبی سیناپتوفیزین در سیستم بدن میزبان ردیابی شدند. سیناپتوفیزین در مقاطع بافتی مغز و نخاع انسان به‏‌وسیله آنتی‌بادی­های منوکلونال ویژه قابل ردیابی است. این پروتئین در سلول­های عصبی بالغ و کارآمد بیان می­شود. همچنین واکنش ایمنی مثبت نسبت به این پروتئین مشخص­‌کننده ناحیه فرضی ارتباط سیناپسی بین سلول‌های‌ عصبی‌ است (21). سهولت دسترسی به جنین جوجه به‏مدت طولانی در فرآیندهای پیوندی آن را جهت ایجاد جنین هیبرید بسیار مفید ساخته است. این کار از طریق پیوند سلول‏های‌ جنین جوجه نشاندارشده به جوجه­ میزبان انجام می­شود (12). بدین ترتیب جنین هیبریدی مانند جوجه مرغ و بلدرچین به‏وجود آمده است. جنین جوجه مدل مناسبی برای مطالعه مهاجرت سلول‌، تمایز و هدایت پیام در طول تکوین است. در مطالعه­ای سلول­های بنیادی خونساز از مغز استخوان انسان بالغ به محل آسیب­دیده طناب نخاعی در حال تکوین جنین جوجه پیوند زده شدند. بررسی و ردیابی سلول­های پیوندی نشان داد که این سلول­ها ضمن بروز فنوتیپ عصبی، نشانگرهای عصبی NeuN و MAP2 را بیان کردند (22). پیوند سلول­های ملانومای متاستازی انسانی بیان­کننده GFP به میزبان جنین جوجه نشان داد که این سلول­ها نه تنها تومور ایجاد نکردند؛ بلکه با سلول­های ستیغ عصبی در حال مهاجرت میزبان همراه شده و نشانگرهای اختصاصی را بیان کردند. نتایج این مطالعه روشن نمود که شرایط محیطی جنین جوجه بر سلول­های پیوندی تاثیر گذاشته و باعث بازآرایی آن­ها شده است (23). بر اساس گزارش دیگری نشان داده شد که سلول‌های‌ عصبی­ حرکتی مشتق از سلول‌های‌ بنیادی جنینی بعد از پیوند به لوله عصبی میزبان و مهاجرت، Lhx3 را بیان کرده و آکسون­های خود را به‏سمت نواحی مناسب فرستادند. بیان Lhx3 نشان‏دهنده ارتباطات عصبی ـ ماهیچه­ای است (24). نتایج به‏دست آمده از این مطالعات در پیشبرد روش‏هایی جهت سلول‌­درمانی بسیار مورد توجه قرار گرفته است.

نتیجه­گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که سلول­های‌ بیان‌کننده GFP پیوند شده به لوله عصبی جنین جوجه در بافت میزبان مهاجرت کرده و با سلول‌های‌ بافت میزبان ممزوج شدند. این سلول­ها تحت تاثیر شرایط محیطی میزبان قرارگرفته و ضمن بروز فنوتیپ عصبی نشانگر اختصاصی عصبی سیناپنوفیزین را بیان نمودند.

تشکرو قدردانی

این پژوهش در گروه زیست­شناسی دانشکده علوم دانشگاه اصفهان انجام شده است. بدین‏وسیله از تمام کسانی که ما را در انجام این طرح یاری نمودند قدردانی می­شود.

منابع

  1. Elmann A, Telerman A, Mordechay S, Erlank H, et al., Antioxidant and astroprotective effects of a Pulicaria incisa infusion. Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012: doi:10.1155/2012/157598.
  2. Goldman SA, Windrem MS. Cell replacement therapy in neurological disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006; 361(1473): 1463-1475.
  3. Low CB, Liou YC, Tang BL. Neural differentiation and potential use of stem cells from the human umbilical cord for central nervous system transplantation therapy. J Neuroscience Res. 2008; 86(8): 1670-1679.
  4. Heile AMB, Wallrapp C, Klinge PM, Samii A, et al. Cerebral transplantation of encapsulated mesenchymal stem cells improves cellular pathology after experimental traumatic brain injury. Neurosci Lett 2009; 463(3): 176-181.
  5. Shi Kam NW, Jessop TC, Wender PA, Dai H. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J Am Chem Soc 2004; 126(22): 6850-6851.
  6. Hess DC, Borlongan CV. Stem cells and neurological diseases. Cell Prolif. 2008; 41(s1): 94-114.
  7. Esmaeili F, Tiraihi T, Movahedin M, Mowla SJ. Selegiline induces neuronal phenotype and neurotrophins expression in embryonic stem cells. Rejuv Res. 2006; 9(4): 475-484.
  8. Dohrmann U, Edgar D, Thoenen H. Distinct neurotrophic factors from skeletal muscle and the central nervous system interact synergistically to support the survival of cultured embryonic spinal motor neurons. Dev Biol. 1987; 124(1): 145-152.
  9. Bakhshalizadeh S, Esmaeili F, Houshmand F, Shirzad H, et al. Effects of selegiline, a monoamine oxidase B inhibitor, on differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells, into neuron-like cells. In Vitro Cell Dev-An. 2011; 47(8): 550-557.
  10. MacPherson PA, McBurney MW. P19 embryonal carcinoma cells: a source of cultured neurons amenable to genetic manipulation. Methods. 1995; 7(3): 238-252.
  11. Zhou C, Kong J, Dai H. Electrical measurements of individual semiconducting single-walled carbon nanotubes of various diameters. Applied Physics Letters. 2000; 76(12): 1597-1599.
  12. Stern CD. The chick: a great model system becomes even greater. Dev cell. 2005; 8(1): 9-17.
  13. Hamburger V, Hamilton HL. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 1951; 88(1):49-92.
  14. Narayanan K, Lim VY, Shen J, Tan ZW, et al. Extracellular Matrix-Mediated Differentiation of Human Embryonic Stem Cells: Differentiation to Insulin-Secreting Beta Cells. Tissue Eng Part A. 2014; 20(1-2): 424-433.
  15. Laeremans A, Van de Plas B, Clerens S, Van den Bergh G, et al. Protein expression dynamics during postnatal mouse brain development. J Exp Neurosci. 2013; 7: 61.
  16. Thompson BC, Richardson RT, Moulton SE, Evans AJ, et al. Conducting polymers, dual neurotrophins and pulsed electrical stimulation-dramatic effects on neurite outgrowth. J Control Release. 2010; 141(2): 161-167.
  17. Ghasemi Hamidabadi H, Rezvani Z, Nazm Bojnordi M, Shirinzadeh H, et al. Chitosan-Intercalated Montmorillonite/Poly (vinyl alcohol) Nanofibers as a Platform to Guide Neuronlike Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. ACS Appl Mater Interfaces. 2017; 9(13): 11392-11404.
  18. Lee JY, Kim E, Choi S-M, Kim D-W, et al. Microvesicles from brain-extract—treated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Sci Rep. 2016; 6:33038, DOI: 10.1038/srep33038.
  19. Hatamnia Z, Esmaeili F, Houshmand F, Dehdehi L. Effect of pancreatic extract on insulin secreting cell differentiation from mouse bone marrow mesenchymal stem cells. J Shahrekord Univ Med Sci. 2014; 16(2): 52-62.
  20. Kim D, Richardson-Burns S, Hendricks JL, Sequera C, et al. Effect of immobilized nerve growth factor on conductive polymers: electrical properties and cellular response. Adv Funct Mater 2007; 17(1): 79-86.
  21. MacPherson PA, Jones S, Pawson PA, Marshall KC, et al. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 1997; 80(2): 487-499.
  22. Sigurjonsson OE, Perreault M-C, Egeland T, Glover JC. Adult human hematopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal cord. Natl Acad Sci USA. 2005; 102(14): 5227-5232.
  23. Kulesa PM, Kasemeier-Kulesa JC, Teddy JM, Margaryan NV, et al. Reprogramming metastatic melanoma cells to assume a neural crest cell-like phenotype in an embryonic microenvironment. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(10): 3752-3757.
  24. Soundararajan P, Miles GB, Rubin LL, Brownstone RM, et al. Motoneurons derived from embryonic stem cells express transcription factors and develop phenotypes characteristic of medial motor column neurons. J Neurosci. 2006; 26(12): 3256-3268.

 

  1. Elmann A, Telerman A, Mordechay S, Erlank H, et al., Antioxidant and astroprotective effects of a Pulicaria incisa infusion. Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012: doi:10.1155/2012/157598.
  2. Goldman SA, Windrem MS. Cell replacement therapy in neurological disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006; 361(1473): 1463-1475.
  3. Low CB, Liou YC, Tang BL. Neural differentiation and potential use of stem cells from the human umbilical cord for central nervous system transplantation therapy. J Neuroscience Res. 2008; 86(8): 1670-1679.
  4. Heile AMB, Wallrapp C, Klinge PM, Samii A, et al. Cerebral transplantation of encapsulated mesenchymal stem cells improves cellular pathology after experimental traumatic brain injury. Neurosci Lett 2009; 463(3): 176-181.
  5. Shi Kam NW, Jessop TC, Wender PA, Dai H. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J Am Chem Soc 2004; 126(22): 6850-6851.
  6. Hess DC, Borlongan CV. Stem cells and neurological diseases. Cell Prolif. 2008; 41(s1): 94-114.
  7. Esmaeili F, Tiraihi T, Movahedin M, Mowla SJ. Selegiline induces neuronal phenotype and neurotrophins expression in embryonic stem cells. Rejuv Res. 2006; 9(4): 475-484.
  8. Dohrmann U, Edgar D, Thoenen H. Distinct neurotrophic factors from skeletal muscle and the central nervous system interact synergistically to support the survival of cultured embryonic spinal motor neurons. Dev Biol. 1987; 124(1): 145-152.
  9. Bakhshalizadeh S, Esmaeili F, Houshmand F, Shirzad H, et al. Effects of selegiline, a monoamine oxidase B inhibitor, on differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells, into neuron-like cells. In Vitro Cell Dev-An. 2011; 47(8): 550-557.
  10. MacPherson PA, McBurney MW. P19 embryonal carcinoma cells: a source of cultured neurons amenable to genetic manipulation. Methods. 1995; 7(3): 238-252.
  11. Zhou C, Kong J, Dai H. Electrical measurements of individual semiconducting single-walled carbon nanotubes of various diameters. Applied Physics Letters. 2000; 76(12): 1597-1599.
  12. Stern CD. The chick: a great model system becomes even greater. Dev cell. 2005; 8(1): 9-17.
  13. Hamburger V, Hamilton HL. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 1951; 88(1):49-92.
  14. Narayanan K, Lim VY, Shen J, Tan ZW, et al. Extracellular Matrix-Mediated Differentiation of Human Embryonic Stem Cells: Differentiation to Insulin-Secreting Beta Cells. Tissue Eng Part A. 2014; 20(1-2): 424-433.
  15. Laeremans A, Van de Plas B, Clerens S, Van den Bergh G, et al. Protein expression dynamics during postnatal mouse brain development. J Exp Neurosci. 2013; 7: 61.
  16. Thompson BC, Richardson RT, Moulton SE, Evans AJ, et al. Conducting polymers, dual neurotrophins and pulsed electrical stimulation-dramatic effects on neurite outgrowth. J Control Release. 2010; 141(2): 161-167.
  17. Ghasemi Hamidabadi H, Rezvani Z, Nazm Bojnordi M, Shirinzadeh H, et al. Chitosan-Intercalated Montmorillonite/Poly (vinyl alcohol) Nanofibers as a Platform to Guide Neuronlike Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. ACS Appl Mater Interfaces. 2017; 9(13): 11392-11404.
  18. Lee JY, Kim E, Choi S-M, Kim D-W, et al. Microvesicles from brain-extract—treated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Sci Rep. 2016; 6:33038, DOI: 10.1038/srep33038.
  19. Hatamnia Z, Esmaeili F, Houshmand F, Dehdehi L. Effect of pancreatic extract on insulin secreting cell differentiation from mouse bone marrow mesenchymal stem cells. J Shahrekord Univ Med Sci. 2014; 16(2): 52-62.
  20. Kim D, Richardson-Burns S, Hendricks JL, Sequera C, et al. Effect of immobilized nerve growth factor on conductive polymers: electrical properties and cellular response. Adv Funct Mater 2007; 17(1): 79-86.
  21. MacPherson PA, Jones S, Pawson PA, Marshall KC, et al. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 1997; 80(2): 487-499.
  22. Sigurjonsson OE, Perreault M-C, Egeland T, Glover JC. Adult human hematopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal cord. Natl Acad Sci USA. 2005; 102(14): 5227-5232.
  23. Kulesa PM, Kasemeier-Kulesa JC, Teddy JM, Margaryan NV, et al. Reprogramming metastatic melanoma cells to assume a neural crest cell-like phenotype in an embryonic microenvironment. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(10): 3752-3757.
  24. Soundararajan P, Miles GB, Rubin LL, Brownstone RM, et al. Motoneurons derived from embryonic stem cells express transcription factors and develop phenotypes characteristic of medial motor column neurons. J Neurosci. 2006; 26(12): 3256-3268.