مقدمه

درمان بیماران مبتلا به ضایعه نخاعی و رفع ناتوانی این گروه از بیماران و یا بازگرداندن برخی از توانایی­های آن­ها بسیار با اهمیت و مورد توجه پژوهش‏گران بوده است. استفاده از سلول‌درمانی و جایگزینی سلول‌­های مرده یا آسیب­دیده با سلول‌­های جدید یکی از راه‏کارهای نوین درمان برای این بیماران است. از آنجا که سلول‌­های بنیادی توانایی خودنوزایی و تبدیل به سلول‌های دیگر را دارند، در درمان می‌توان از آن­ها استفاده نمود. با توجه به اینکه کارآیی سلول‌­های عصبی متمایزشده پس از پیوند کم است استفاده از روش­های محرک رشد و بقای سلول‌­های پیوندی بایستی مورد بررسی بیشتری قرار گیرد تا سلول ‌درمانی با موفقیت بیشتری انجام­پذیر باشد. میزان بیماری­های زوال دستگاه عصبیمانند آلزایمر، پارکینسون، هانتینگتونو ام­اس در بسیاری از کشورهای جهان رو به افزایش است (1). این بیماری­ها در اثر تخریب سلول­های‌ عصبی و ضعف یا از بین رفتن عملکرد آن­ها و در نتیجه تجمع پروتئین­های سمی در دستگاه ­عصبی ­مرکزی (Central Nervous System) (CNS) ایجاد می‌شوند. گرچه مطالعه و پژوهش در زمینه درمان این بیماری‏ها نظیر درمان با سلول‌ بنیادی و محافظت از دستگاه عصبی از اهمیت بالایی برخوردار است. اما هنوز این مطالعات در مراحل ابتدایی خود هستند. در حال حاضر درمان­هایی که برای این بیماری­ها در دسترس است فاقد کارآیی کافی است و در اکثر موارد فقط می­توان بخش کوچکی از علایم را به‏طور موقت کاهش داد. دانشمندان به‏طور جدی در حال انجام پژوهش هستند تا بتوانند درمان­هایی برای انواع گوناگونی از بیماری‌ها به‏ویژه بیماری­های زوال بافت دستگاه عصبی مانند ام­اس پیدا کنند. برخی از روش­های درمان این بیماری­ها عبارتند از کاهش سطح پروتئین­های تجمع­یافته با استفاده از روش­های محدودسازی نفوذپذیری سد خونی- مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به‏منظور حمایت از سلول­های عصبی آسیب دیده، دارو درمانی و سلول‌درمانی (2 و 3). استفاده از سلول‌­های بنیادی امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت­های عصبی آسیب ­دیده فراهم آورده است. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که سلول‌­‌های بنیادی می­توانند به انواع بافت‏های‌ دیگر تمایز یابند. سلول­های‌ تمایزیافته قادرند از طریق جریان خون به‏سمت مغز حرکت نموده و توسط قسمت‌­های آسیب‌دیده جذب شوند. امروزه شاهد پیشرفت­های چشم‏گیری در عرصه­ی سلول‌­های بنیادی هستیم که راه­های نوینی را برای درمان تعدادی از بیماری­ها از جمله بیماری­های زوال عصبی پیش رو گذاشته است (4 و 5). سلول‌­های حاصل از تمایز سلول­های بنیادی مستقیما به‏درون CNS پیوند زده می­شوند و یا به عروق خونی به صورت درون­وریدی (Intravenous ) یا درون­شریانی (Intra-arterial) تزریق می­شوند (6). در سال­های اخیر، روش­های آزمایشگاهی زیادی توسعه­ یافته­اند که امکان تولید سلول‌ عصبی از سلول‌های پرتوان را در فرآیند کشت سلول فراهم می­کنند (7-9). رده ‌P19 نوعی سلول‌ بنیادی کارسینومای جنینی پرتوان است که در صورت تیمار با اسیدرتینوئیک به انواع سلول­ها‌ی ناشی از نورواکتودرم متمایز می­شود (10). ترکیب سلول‌های‌ بنیادی با داربست تهیه شده از مواد زیستی راه‏کار امیدوارکننده­ای در درمان بیماری­هاست. داربست زیست­ مواد می­تواند جایگزین بافت­های آسیب­دیده شود که برای ترمیم، بقا و تمایز سلول‌های‌ بنیادی لازم است (11).

اولین بار ارسطو از جنین جوجه به‏عنوان مدل مناسبی برای مطالعات و پژوهش­های جنین­شناسی استفاده کرد. از آن زمان تاکنون جنین جوجه به‏عنوان ابزاری ایده­آل برای مطالعات جنین­شناسی، تکوین و ایمنی‏شناسی در نظر گرفته شده است . دست­یابی آسان و سهولت دست­ورزی ، جنین جوجه را به مدلی ایده­آل برای مطالعه در زمینه­ی تکوین مهره­داران تبدیل نموده است. این مدل در فرآیند­های پیوند بافت مورد دست­ورزی پژوهشگران قرار گرفته و یافته­های بسیار مهمی را در خصوص القای بافت­های مختلف، تعیین سرنوشت سلول‌، الگودهی، مسیریابی آکسونی و مهاجرت و تمایز سلول‌ در دسترس قرار داده است (12). در این پژوهش جهت تمایز عصبی از سلول‌های‌ بنیادی پرتوان P19 استفاده شد. این سلول‌­ها برروی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل رشد یافته و پس از القای تمایز به سلول­های‌ عصبی به محل تخریب شده دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه پیوند شدند.

مواد و روش­ها

کشت، تکثیر و ذخیره سلول‌های‌ بنیادی: کشت چسبنده سلول‌­های بنیادی کارسینومای جنینی (رده P19، بانک سلولی انستیتو پاستور، تهران، ایران) در شرایط کاملا استریل، با استفاده از ظروف ویژه یکبار مصرف در محیط کشت α-MEM (α-modified Eagle's medium:Gibco, 11900- 073) همراه با ده درصد سرم FBS (Fetal bovine serum, Sigma, 10270-106)، پنی­سیلین و استرپتومایسین انجام شد. به‏منظور تامین شرایط مناسب برای رشد و تکثیر سلول‌ از انکوباتور مرطوب با میزان CO₂ 5 درصد و دمای 37 درجه سانتی‏گراد استفاده شد. در هنگام دستیابی به تراکم سلولی مناسب، سلول­ها واکشت شدند. در ضمن، جهت تهیه ذخایر کافی، سلول­ها با استفاده از محیط کشت حاوی سرم و DMSO (Dimethylsulfoxide) منجمد و در دمای 70- درجه سانتی­گراد و یا تانک ازت ذخیره شدند.

کشت سه بعدی سلول‌­ها و تمایز عصبی آن­ها: در این پژوهش به‏منظور تامین عوامل رشد مورد نیاز سلول‌­های بنیادی کشت شده روی داربست و تمایز آن‏ها به سلول عصبی از عصاره مغز نوزاد موش صحرایی استفاده شد. بدین‏ترتیب سلول‌های‌ بنیادی ضمن کشت سه­بعدی، به‏طور همزمان در معرض نوعی عامل القاکننده­ی طبیعی قرار گرفتند. سلول‌های‌ مذکور پس از تمایز به محل تخریب شده‌ی دستگاه عصبی جنین جوجه در مرحله 18 تا 20 جنینی پیوند شدند(13). داربست کیتوسان/ پلی‌وینیل­الکل در گروه مهندسی مواد دانشکده فنی مهندسی دانشگاه شهرکرد تهیه شد. جهت استریل و آماده‌سازی برای کشت، داربست­ها به‏مدت یک روز در الکل اتیلیک 70 درصد و سپس در سه نوبت و هر نوبت به‏مدت 3 تا 4 ساعت در محلول PBS قرار داده شدند. در آخرین مرحله شستشو با PBS داربست­ها به‏مدت 15 تا 20 دقیقه در معرض اشعه‌ی UV قرار گرفتند. کشت معلق سلول‌‌ها منجر به تشکیل دسته‌های سلولی به نام اجسام شبه جنینی (Embryoid bodies) می‌شود. اجسام شبه جنینی پس از تولید، روی داربست منتقل شده و هم‏زمان در معرض عصاره مغز نوزاد موش صحرایی قرار گرفتند. پس از گذشت یک هفته سلول‌های‌ حاصل از کشت سه‌بعدی برای پیوند استفاده شدند.

پیوند سلول‌های‌ تمایزیافته در داربست به دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه: تخم‏مرغ‏های نطفه­دار از مجتمع اصلاح و تکثیر مرغ بومی جهاد کشاورزی تهیه و در دمای 38 درجه سانتی‏گراد و شرایط مرطوب انکوباتور تا مرحله 18 تا 20 هامبرگر-هامیلتون نگه‏داری شدند (13). به‏منظور دسترسی به جنین جوجه با ایجاد پنجره­ای در پوسته آهکی تخم­مرغ و برداشتن بخشی از غشای ویتلین جنین نمایان شد. پس از تخریب بخشی از لوله عصبی در حال تکوین، بلافاصله بعد از مغز عقبی، سلول‌­ها به این بخش پیوند شدند. لازم به ذکر است که در این مرحله از سلول­های بیان­کننده GFP (Green fluorescence protein) برای پیونداستفاده شد (مراجعه به بخش بعدی). بعد از پوشاندن پنجره با پارافیلم، تخم­مرغ تا مراحل بعدی به انکوباتور بازگردانده شد تا جنین به رشد خود ادامه دهد. پس از گذشت یک تا سه روز جنین­ها از تخم­مرغ خارج و پس از شستشو با PBS در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. سرانجام از نمونه­های تثبیت­شده مقاطع بافتی تهیه شد و ردیابی سلول‌های‌ پیوندی در مقاطع بافتی با استفاده از روش‌های مختلف انجام گرفت.

تولید سلول­های بیان­کننده GFP: به‏منظور انتقال ژن GFP به سلول­ها از پلاسمید pML8 (شکل1) اهدایی از آزمایشگاه دکتر مک­برنی، McBurney's laboratory, Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canada) که ژن GFPو ژن مقاوم به پیورومایسین را تحت کنترل پروموتور Pgk-1 موشی بیان می­کند و از روش رسوب کلسیم فسفات (CaPO₄) استفاده شد (10). برای ترانسفکت پایدار از محیط کشت انتخابی حاوی پیورومایسین استفاده شد و سلول ها بعد از هشت روز مورد بررسی قرار گرفتند. سلول­های بیان­کننده GFP در روز هشتم بعد از انتقال ژن با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس بررسی شدند.

شکل 1: طرح شماتیک پلاسمید PML8 که حاوی ژن پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و ژن مقاوم به پیورومایسین است.

رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله: مقاطع بافتی تهیه شده با استفاده از زایلل پارافین­زدایی شده و پس از آب‏دهی و شستشو در معرض رنگ کرزیل­ویوله شامل ترکیب اسیداستیک­گلاسیال (8/0 درصد)، استات‏سدیم (6/0 میلی مولار)، پودر کرزیل­ویوله (کرزیل­ویوله 25/0 درصد) و آب مقطر قرار گرفتند. نمونه­ها پس از آب‏گیری، شفاف­سازی و چسباندن روی لام با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شدند.

بررسی تمایز سلول‌های‌ پیوندشده به دستگاه عصبی جنین جوجه با استفاده از روش ایمنوفلورسنس

پس از پیوند سلول‌ و طی مرحله انکوباسیون، جنین­ها از داخل تخم­مرغ خارج و به‏سرعت در محلول فرمالین ده درصد تثبیت شدند. به‏منظور ردیابی سلول‌های‌ پیوندی و بررسی تمایز آن­ها در بدن موجود زنده مقاطع تهیه شده در معرض آنتی­بادی­های اولیه ضد GFP (Rabbit polyclonal antibody to GFP Abcam, ab290) و ضد سیناپتوفیزین (Mouse anti-synaptophysin monoclonal antibody, Abcam, ab8049) و آنتی‌بادی­های ثانویه کونژوگه شده FITC(FITC-conjugated anti-mouse IgG, Sigma, F9137) (برای سیناپتوفیزین) و Cy5.29(Cy5.29-conjugated anti-rabbit IgG, Abcam, ab6564) (برای GFP) قرار گرفتند. سپس مقاطع رنگ­آمیزی شده به‏وسیله میکروسکوپ فلورسنس بررسی شدند.

نتایج

کشت و تکثیر سلول‌های‌ بنیادی P19

سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی P19 قادرند به‏طور مداوم در محیط کشت حاوی سرم رشد نموده و برای تمایز به هر دو دودمان مزودرمی و اکتودرمی القا شوند. این سلول‌­ها بعد از این­که وارد ظرف کشت شدند به کف آن چسبیده و به‏سرعت شروع به تکثیر نمودند (شکل2 A) و پس از گذشت حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت تشکیل کلونی­های سلولی را آغاز کردند (شکل2 B). این سلول‌­ها چندین بار در محیط کشت در ظروف مخصوصی کشت و در مواقع ضروری به‏طور مداوم حداکثر تا سه مرحله واکشت شدند.

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از کشت و تکثیر سلول‌های‌ بنیادی کارسینومای جنینی P19 (پیکان) در محیط کشت 𝛂-MEM همراه با ده درصد سرم گاوی جنینی. (A: 40X, B: 400X)

تولید اجسام شبه جنینی و کشت سه بعدی سلول‌های‌ بنیادی P19 در داربست کیتوسان/­پلی­وینیل­الکل

کشت معلق سلول­های‌ کارسینومای جنینی P19 در پتری دیش­های غیرچسبنده باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه جنینی می­شود. تصویر دو جسم شبه­جنینی به‏عنوان نمونه ارایه شده است (شکل3 A). اجسام شبه جنینی روی داربست­های استریلی که در میکروپلیت­های 12 خانه­ای قرار داده شده بودند، با محیط کشت 𝛂-MEM محتوی سه درصد سرم و عصاره مغز نوزاد رت کشت شدند (شکل3 B). محیط کشت تقریبا یک روز درمیان تعویض شد. چسبیده شدن اجسام شبه­جنینی روی داربست­ و نفوذ سلول‌های‌ بنیادی به‏داخل آن در شکل 3 B به‏خوبی نشان داده شده است. نحوه­ی قرارگیری سلول‌­ها بر روی داربست، نشان از مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول‌­ها است. این نتایج نشان می­دهد که داربست­های تهیه شده محیط و بستری بسیار مطلوب را برای اتصال و رشد سلول‌­ها فراهم کرده­اند.

شکل ‏3: تصویر میکروسکوپ نوری از اجسام شبه جنینی و کشت آن­ها روی داربست کیتوسان/­پلی­وینیل­الکل. A) اجسام شبه جنینی حاصل از کشت معلق سلول‌های‌ P19 (پیکان). پیکان یک جسم شبه جنینی کشت شده روی داربست، سر پیکان سلول‌ها و ستاره داربست را نشان می­دهد. B) شیوه قرارگیری سلول‌­ها روی داربست نشان از مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول‌­ها است. (A: 100X, B: 40X)

بررسی ریخت‌شناسی سلول‌های‌ تمایزیافته؛ رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله

پس از کشت سه­بعدی سلول‌­ها و استفاده از عصاره مغز، به‏منظور بررسی اولیه­ی فنوتیپ عصبی در سلول‌های‌ حاصل از تمایز از رنگ­آمیزی کرزیل­ویوله استفاده شد. شکل 4 سلول‌های‌ P19 تمایزیافته به سلول‌های‌ شبه‌عصبی را که توسط کرزیل­ویوله به رنگ بنفش در آمده­اند در دو سیستم کشت سه­بعدی (شکل4 A) و دوبعدی (شکل4 B) نشان می­دهد. سلول‌های‌ شبه­عصبی شبکه­ای سلولی روی سطح لایه سلولی غیرعصبی تشکیل دادند (شکل4 B، سر پیکان).

شکل 4: بررسی ریخت­شناسی سلول­های‌ تمایزیافته تحت تاثیر دو سیستم ترکیبی از کشت سه­بعدی و عامل القایی عصاره مغز نوزاد موش صحرایی (A) و کشت دوبعدی همراه با عامل القایی عصاره مغز نوزاد موش صحرایی (B) با استفاده از رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله. پیکان سلول‌های‌ عصبی، سر پیکان سلول‌های‌ غیرعصبی و ستاره داربست را نشان می­دهد. A: 40X,) (B: 400X

پیوند سلول‌های‌ P19 تمایزیافته حاصل از کشت سه­بعدی به طناب عصبی جنین جوجه

پس از کشت اجسام شبه­جنینی روی داربست و القا توسط عصاره مغز نوزاد موش صحرایی، سوسپانسیونی از سلول‌­ها جهت پیوند به طناب عصبی تخریب­شده جنین جوجه تهیه شد. از آن جایی‏که جنین جوجه مدل مناسبی برای مطالعه مهاجرت سلولی، تمایز و هدایت سیگنالی در طول تکوین است، در این پژوهش به‏منظور ردیابی سلول­های‌ بنیادی تمایزیافته پس از پیوند از این مدل استفاده شد. بدین منظور تخم مرغ‏های نطفه­دار در انکوباتور با دمای 38 درجه سانتی‏گراد و در شرایط مرطوب نگه‏داری شدند. پس از رسیدن به مرحله مورد نظر پنجره­ای در پوسته آن­ها باز شد تا جنین در دسترس قرار گیرد (شکل 5 A). در ابتدا طناب عصبی در حال تکوین جنین جوجه در محلی بلافاصله بعد از مغز عقبی در مرحله 18 تا 20 جنینی تخریب و سلول‌های‌ حاصل از تمایز به این ناحیه پیوند زده شدند . شکل5 B محل تخریب لوله عصبی را در مقطع بافتی جنین جوجه در مرحله مورد نظر نشان می‌دهد.

شکل 5: محل تخریب لوله عصبی جنین جوجه در مرحله 18 تا 20 جنینی (پیکان).A ) جنین جوجه زنده پس از باز کردن پنجره در پوسته تخم­مرغ. پیکان محل تخریب طناب عصبی جنین جوجه را بلافاصله بعد از مغز عقبی نشان می‌دهد. B) تصویر میکروسکوپ نوری از مقطع بافتی رنگ‌آمیزی شده با هماتوکسیلین ـ ائوزین که محل تخریب لوله عصبی را بلافاصله بعد از مغز عقبی نشان می­دهد (B: 40X).

ردیابی سلول‌های‌ پیوندی به روش ایمنوفلورسنس

سلول­های‌ تزریق شده به محل تخریب لوله عصبی چند روز پس از پیوند از نظر بیان نشانگر ویژه سلول­ها‌ی عصبی بالغ، یعنی سیناپتوفیزین مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی بیان این پروتئین به‏روش ایمنوفلورسنس نشان داد که سلول‌‌های پیوندی نسبت به سیناپتوفیزین پاسخ مثبت دادند (شکل 6). بررسی­ها نشان داد که این سلول­ها پس از پیوند توانستند مهاجرت کرده و به‏خوبی با سلول­های بافت­ میزبان ارتباط برقرار نمایند. همچنین هسته سلول‌های پیوندی نسبت به هسته سلول­های میزبان بزرگتر بوده و هتروکروماتینی بیشتری نشان می­دهد.

شکل6: شکل ایمنوفلورسنس از سلول‌های‌ پیوند شده به دستگاه عصبی در حال تکوین جنین جوجه (پیکان) مهاجرت این سلول­ها در بافت میزبان و ترکیب آن­ها را با این بافت­ها به‏خوبی نشان می­دهد. A) نشانگر اختصاصی عصبی، سیناپتوفیزین، B) پروتئین فلورسنت سبز (GFP)، C) رنگ­آمیزی هسته با استفاده از هوخست. (X 100)