مطالعه تاثیر برخی شرایط حاد محیطی بر میزان بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب کبد ماهی Rutilus Frissi Kutum در باکتری E. coli

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشگاه گیلان، پردیس دانشگاهی2، رشت، ایران

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

چکیده

هدف: هدف مطالعه حاضر بررسی بیان بهینه Hsp70 نوترکیب کبد ماهی Rutilus Frissi Kutum در باکتری E. coli می باشد.
مواد و روش‏ها: به‏منظور بررسی میزان بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب، باکتری E. coli ترانسفورم شده در محیط LB در زمان‏های 2، 4، 8، 12، 24، 36 و 48 ساعت، دماهای 20، 25، 30، 37، 45 و 50 درجه سانتی‏گراد، شرایط pH افراطی (5 و 9) و نیز در حضور فلزات سنگین همانند نقره، کبالت، آهن، کروم، جیوه، سرب، روی، کادمیوم، منگنز و نیکل کشت داده شد سپس با تهیه­ی عصاره­ی سلولی، میزان بیان Hsp70 با استفاده از SDS-PAGE  12 درصد مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و رنگ آمیزی با کوماسی بلو صورت گرفت.
نتایج: بیان بهینه پروتئین Hsp70 نوترکیب در زمان 4 و 8  ساعت، دمای 37 درجه سانتی‏گراد و  pH برابر 5 صورت گرفت. به‏علاوه در حضور نمک های فلزات منگنز و کبالت، به‏ترتیب بیشترین و کمترین میزان بیان پروتئین نوترکیب مشاهده شد. همچنین E. coli دارای Hsp70 در مقایسه با باکتری کنترل، نسبت به NaCl تحمل و رشد بیشتری دارد.
نتیجه گیری: همه  نتایج حاصل از مطالعه نشان می­دهد باکتری ترانسفورم شده در مقایسه با باکتری کنترل به‏دلیل دارا بودن  Hsp70 نوترکیب در برابر شرایط حاد محیطی قادر به بقا بوده است. پروتئین Hsp70 نوترکیب با خاصیت چاپرونی خود از واسرشت شدن پروتئین­های حیاتی جلوگیری کرد است. بنابراین شرایط رشد توصیف شده در این مطالعه می تواند برای تولید بهینه پروتئین Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli استفاده گردد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

همه­ی موجودات زنده در برابر استرس­های محیطی از خود پاسخ نشان می­دهند. این پاسخ به کمک خانواده­ی پروتئینی به‏نام پروتئین­های شوک حرارتی می­باشد که از باکتری­ها تا پستانداران به‏شدت حفاظت شده‏اند (1). این پروتئین‏ها به‏عنوان چاپرون‌های مولکولی عمل کرده و نقش عمومی آن‏ها کنترل کیفیت و تنظیم ساختار پروتئین­ها در سلول­ها می­باشد. پروتئین‏های شوک حرارتی بر اساس وزن مولکولی مونومرهایشان به چند خانواده دسته بندی می‏شوند: Hsp40، Hsp60، Hsp70، Hsp90، Hsp100 و Hsp های کوچک. اگرچه که بیشتر آن‏ها به شکل الیگومر وجود دارند. بر اساس نوع میان‏کنش با پروتئین های سوبسترا (Substrate) نیز به سه دسته تقسیم می‏شوند: Holdase ها، Foldase ها و Disaggregase ها (2). Hsp70 در مقایسه با سایر Hsp ها، یک هدف دارویی ((Druggable target مناسب است. Hsp70/Hsp90 تنها پروتئین شوک حرارتی است که به‏وسیله‏ی مهار فعالیت ATPase اش تنظیم می­شود بنابراین هدف گیری Hsp70 یک استراتژی جذاب برای درمان سرطان است (3 و 4). اولین یافته­های مطرح شده در ارتباط با مهار Hsp70، کاهش بیان این پروتئین از طریق مهار کردن فاکتور رونویسی کننده­ی آن یعنی HSF1 (Heat-Shock Factor 1) می­باشد (4). پیشرفت­های بیشتر در این زمینه منجر به طراحی مهار کننده­های Hsp70 مانند -فنیل اتین سولفونامید (2-phenylethynesulfonamide) یا پیفیترین-µ و 155008-VER شده است. پیفیترین-µ با دمین اتصال به سوبسترا در Hsp70 میانکنش می­دهد و از این طریق ارتباط بین Hsp با کوفاکتورهایش مانند Hsp40 و پروتئین‏های سوبسترا مانند p53 و Apaf-1(Apoptotic protease activating factor-1) را مختل می­کند (5). همچنین 155008-VER ترکیبی است که آنالوگ ATP بوده و به دمین اتصال به نوکلئوتید در Hsp70 متصل شده و در نتیجه به‏عنوان یک مهارکننده ی رقابتی ATP عمل کرده و از ارتباط آلوستریک بین دمین­های Hsp70 جلوگیری می­کند (6). بیشتر چاپرون‌ها خاصیت ATPase دارند و با تمایل زیاد به بخش­های هیدروفوب و در معرض پروتئین­های تانخورده یا بد­ تاخورده متصل می­شوند (7) و به این ترتیب از تشکیل توده‏های پروتئینی غیرقابل برگشت و پایدار جلوگیری می­کنند و همچنین تشکیل خود به‏خودی پروتئین‏های طبیعی را تسهیل می­نمایند (8). Hsp70 نقش اساسی را در متابولیسم پروتئین در شرایط طبیعی و استرسی بازی می­کند. سطح بیان این پروتئین که القاپذیرترین عضو از خانواده­ی چاپرون­هاست با توانایی تحمل سلول به گستره‏ی وسیعی از استرس­های طبیعی مثل شوک دمایی، استرس اسمزی، فلزات سنگین و التهاب مرتبط است (9). پروتئین‌های این خانواده در محدوده وزنی 68 تا 74 کیلودالتون می‌باشند و تقریبا در تمام موجودات و اندامک‏ها یافت می‌شوند. در پستانداران و اغلب یوکاریوت‌ها این پروتئین‌ها در تمام اجزای سلولی نظیر سیتوزول، میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک وجود داشته و در اعمالی نظیر تا خوردن پروتئین‌ها، انتقال پروتئین‌ها از غشا و تجزیه پروتئین‌ها دخالت دارند. Hsp70 از نظر ساختمانی دارای 3 دمین است: 1) دمین انتهای N: این دمین دارای خاصیت ATPase می‌باشد و تغییرات شکل فضایی ایجاد شده توسط ATP را به بخش متصل شونده به C-ترمینال منتقل می‌کند. 2) دمین اتصال به پروتئین: یک شیار در این دمین است که با آمینواسیدهای هیدروفوبیک میانکنش برقرار می‌کند که مطالعات پیشین نشان می­دهد که عمق این شیار برای میانکنش تا هفت رزیدو کافی است. 3) دمین انتهای C: این دمین غنی از ساختارهای آلفا هلیکس است که به عنوان یک درپوش ((Lid برای دمین اتصال به پروتئین عمل می‌کند، این درپوش در حالت اتصال به  ATP باز است و پروتئین‌ها به‏راحتی اتصال و رها می‌شوند (10). پروتئین‌های شوک حرارتی در سرطان‌های انسانی به‏طور وسیعی بیان می‌شوند و در

 تکثیر، تهاجم، متاستاز و آپوپتوزیس ( (Apoptosis سلول‌های تومور نقش دارند. یکی از مکانیسم‌های مهم در کنترل سلول‌های سرطانی، القا آپوپتوزیس در آن‏ها می‌باشد. از آنجایی‏که پروتئین های Hsp70 و Hsp90 در جلوگیری از آپوپتوزیس در سلول های سرطانی اهمیت بسیار مهمی دارند، لذا مطالعه روی پروتئین Hsp70 می­تواند به پیشرفت در این زمینه کمک کند. اولین قدم در این نوع مطالعات بررسی تاثیر ترکیبات بر Hsp70 خالص در محیط In vitro می باشد. لذا ایجاد شرایط بهینه برای تولید این پروتئین از نیازهای اساسی می باشد بنابراین در این پژوهش، به‏میزان بیان Hsp70 نوترکیب در شرایط استرسی مختلف شامل دما، فلزات سنگین و pH  در باکتری میزبان E. coli پرداخته شد و شرایط بهینه برای تولید این پروتئین معرفی شد.

مواد و روش ها

Protein Marker (#SM0431) از شرکت Fermentas تهیه شد. IPTG و کانامایسین نیز از شرکت Biobasic خریداری شد. اکریل آمید، بیس اکریل آمید، EDTA، گلیسین، تریپتون، عصاره‌ی مخمر، سدیم کلراید، تریس، ایمیدازول و فلزات سنگین از شرکت مرک تهیه شد.

بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli : جهت بیان پروتئین، باکتری E. coli دارای Hsp70 – pET28a+ مورد استفاده قرار گرفت. توالی ژن hsp70با شماره دسترسی KT380686 در پایگاه NCBI ثبت گردیده است. 20 میکرولیتر از این باکتری به 5 میلی‏لیتر از محیط کشت لوریا برتانی مایع حاوی کانامایسین با غلظت mg/ml 50 تلقیح شد. محیط به صورت شبانه در 37 درجه سانتی‏گراد هوادهی گردید. سپس 1 میلی‏لیتر از باکتری به محیط کشت لوریا برتانی جدید دارای کاناماسین 50 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر انتقال و تا رسیدن به 0.6 OD600= هوادهی شد. پس از آن با افزودن IPTG با غلظت mM 1/0، بیان Hsp70 تحریک شده و بهینه بیان پروتئین در شرایط مختلف مورد بررسی قرار گرفت (11).

تهیه عصاره سلولی از باکتری و بررسی میزان بیان Hsp70 نوترکیب تحت عوامل استرسی مختلف: سوسپانسیون باکتری­های القا شده، به‏مدت 20 دقیقه در rpm 5000 و دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. رسوب باکتری به‏دست آمده با افزودن بافر لیز­کننده با 5/7pH  حاوی ایمیدازول mM 5، تریس mM 50 و سدیم کلرید mM 100 (هم حجم رسوب) به‏حالت سوسپانسیون درآمد. پس از آن سوسپانسیون باکتری تحت سونیکاسیون (شامل 6 مرحله 10 ثانیه­ای با فواصل زمانی 10 ثانیه) قرار گرفت. همچنین جهت جلوگیری از تخریب گرمایی، تمامی مراحل سونیکاسیون درون یخ انجام شد. سلول­های لیز شده در rpm 9000 و دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی به ویال جداگانه انتقال داده شد. به‏جهت آنالیز بیان این پروتئین، نمونه‏ها بر روی ژل SDS-PAGE 12% برده شد و به‏کمک روش رنگ آمیزی کوماسی بلو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. لازم به‏ذکر است به‏منظور مشاهده و بررسی دقیق­تر، پیش از روش SDS-PAGE نمونه‏ها تحت تیمار دمایی در 80 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 ساعت قرار گرفتند.

تأثیر زمان بر بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli : جهت بررسی اثر زمان بر بیان پروتئین شوک حرارتی 70، پس از تلقیح باکتری E. coli دارای Hsp70 – pET28a+  با IPTG با غلظت mM 1/0، محیط کشت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و در زمان های 2، 4، 8، 12، 24، 36 و 48 ساعت هوادهی شد تا بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coliمورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.

تأثیر دما بر بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli: به‏منظور بررسی تأثیر دمای محیط کشت بر بیان این پروتئین در باکتری E. coli دارای Hsp70 – pET28a+ ، پس از تلقیح با IPTG با غلظت mM 1/0، محیط رشد باکتری در معرض دماهای 20، 25، 30، 37، 45 و 50 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد تا مقدار بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب تجزیه و تحلیل شود.

تاثیر pH های افراطی بر بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli : به‏منظور بررسی اثر محیط اسیدی و قلیایی بر بیان این پروتئین، باکتری ترنسفورم شده به‏همان روش ذکر شده کشت داده شد. pH محیط­های اسیدی و قلیایی به‏کمک محلول­های HCl و NaOH با غلظت M1 تنظیم شد. سپس سوسپانسیون باکتری به محیط کشت‏های با pH های 5 و 9 منتقل شد تا به 0.6 OD600= برسد. در این مرحله با افزودن IPTG با غلظت mM 1/0، بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب تحت تاثیر pH های افراطی (5 و 9) در میزبان E. coli بررسی شد. لازم به‏ذکر است محیط کشت­‏های با pH 3 و 12 نیز مورد مطالعه قرار گرفت که باکتری در این شرایط رشد نکرد.

تأثیر فلزات سنگین بر بیان Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli : همچنین بیان پروتئین در حضور فلزات سنگین (نقره، کبالت، آهن، کروم، جیوه، سرب، روی، کادمیوم، منگنز و نیکل) در محیط کشت باکتری بررسی شد. به این منظور از غلظت mM 50 از نمک‏های فلزات نقره، کبالت، آهن، کروم، جیوه، سرب، روی، کادمیوم، منگنز و نیکل استفاده شد.

تحمل NaCl : برای انجام آزمون تحمل NaCl، باکتری E.coli دارای pET-28a+-Hsp70 در محیط کشت LB دارای کانامایسین با غلظت 50 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تا رسیدن به 6/0 = 600OD  هوادهی شد. 4 ساعت پس از اضافه شدن IPTG با غلظت نهاییmM  1/0 به محیط کشت باکتری، مقداری از باکتری 108 بار رقیق شده و در محیط کشت LA حاوی M NaCl 5/0 به‏صورت سفره‏ای کشت داده شد و به‏صورت شبانه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد هوادهی شد.

از باکتری E. coli دارای pET-28a+ بدون Hsp70 به‏عنوان کنترل منفی استفاده شد.

نتایج

همان­گونه که اشاره شد، خانواده­ی پروتئین­های شوک حرارتی به انواع مختلفی مانند Hsp های کوچک، Hsp40، Hsp70، Hsp90 و Hsp110 طبقه بندی می‌شوند که در این بین Hsp70 نقش مهمی را در متابولیسم پروتئین در شرایط طبیعی و استرسی ایفاء می‌کند. در مطالعه حاضر سطح بیان این پروتئین در شرایط متفاوتی مانند زمان‏های مختلف، دماها و pH ‏های متفاوت و انواع گوناگون فلزات سنگین مورد بررسی قرار گرفت.

در بررسی فاکتورهای مختلف ابتدا اثر زمان­های مختلف بر میزان بیان پروتئین نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت.  Hsp70 نوترکیب در زمان­های مختلف از 2 تا 48 ساعت تولید شده و در نهایت نتایج نشان داد که در زمان 4و 8 ساعت میزان بهینه­ی بیان پروتئین به‏دست آمده است (شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در زمان‏های مختلف. M: مارکر پروتئین #SM0431  1: کنترل منفی: پروتئین استخراج شده از باکتری E. coli بدون Hsp70 طی 4 ساعت تحت دمای 37 درجه سانتی‏گراد، بیان پروتئین شوک حرارتی 70 در میزبان E. coli طی زمان­های  2: 2 ساعت، 3: 4 ساعت، 4: 8 ساعت، 5: 12 ساعت، 6: 24 ساعت، 7: 36 ساعت، 8: 48 ساعت

 

در مرحله‏ی بعد میزان بیان پروتئین در دماهای مختلف، که در مواد و روش‏ها به آن اشاره شده است، مورد مطالعه قرار گرفت و با توجه به نتایج در دمای 37 درجه سانتی‏گراد بیشترین میزان بیان پروتئین مشاهده شد (شکل 2).

 

 

شکل 2: بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در دماهای مختلف. M: مارکر پروتئین#SM0431 . بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coliتحت دماهای 1: 20، 2: 25، 3: 30، 4: 37، 5: 45 و 6: 50 درجه سانتی‏گراد. بیشترین بیان پروتئین Hsp70 در دمای 37 درجه سانتی‏گراد می­باشد.

 

همچنین تاثیر pH های مختلف بر میزان بیان پروتئین نشان داد که Hsp70 نوترکیب در 5 pH بیشترین بیان را دارد. نتایج مربوط به pH های مختلف در شکل 3 نشان داده شده است.

 

 

شکل 3: بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در pH های مختلف. M: مارکر پروتئین #SM0431 . بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli در pH های 1: 9 pH 2: 5/7 pH 3: 5 pH  . همان‏طور که در شکل دیده می­شود Hsp70 بیشترین بیان را در شرایط اسیدی ( 5  pH) داشته است.

 

پس از بررسی میزان بیان در حضور عوامل زمان، دما و pH، از آن جایی‏که عوامل استرس­زای محیطی مانند فلزات سنگین نیز بر متابولیسم پروتئین‏ها تأثیر می‌گذارند، بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli در حضور فلزات سنگین مورد مطالعه قرار گرفت. لازم به‏ذکر است در حضور فلزاتی از جمله جیوه، نیکل، کروم، کادمیوم، سرب و آهن، رشد باکتری E. coli ترانسفورم شده و نیز باکتری کنترل منفی مشاهده نشد. در حالی‏که، در حضور نمک های سولفات منگنز و کلرید کبالت در محیط کشت باکتری، به‏ترتیب بیشترین و کمترین میزان بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب حاصل شد (شکل4).

 

 

 

شکل 4: بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در حضور فلزات سنگین. M: مارکر پروتئین #SM0431. بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در میزبان E. coli در محیط کشت حاوی نمک‏های  1: نیترات نقره 2: استات روی 3: سولفات منگنز و 4: کلرید کبالت . طبق شکل، این پروتئین در حضور سولفات منگنز حداکثر بیان را داشته است.

 

تحمل NaCl: میزان تحمل E. coli و E. coli دارای Hsp70 نسبت به NaCl با غلظت 5/0 مولار مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج نشان داد E. coli دارای Hsp70 در مقایسه با E. coli، نسبت به NaCl تحمل و رشد بیشتری دارد (شکل 5).

 

 

شکل 5: کلونی باکتری ها در تحمل NaCl.، کلونی‏های رشد کرده ی باکتری E. coli-Hsp70 و کنترل منفی در محیط کشت حاوی NaCl M 5/0.

 

شمارش تعداد کلونی‏های رشد کرده روی محیط کشت دارای NaCl 0.5 مولار نشان می‏دهد باکتری دارای Hsp70 نوترکیب نسبت به باکتری کنترل 1.78 برابر بیشتر رشد کرده است (نمودار 1). این نتیجه تایید کننده‏ی فعالیت موثر Hsp70 است.

 

 

 

نمودار 1: نمودار تعداد کلونی‏های رشد کرده باکتری دارای Hsp70 نوترکیب و کنترل منفی. نتایج به‏وضوح نشان می‏دهد باکتری E. coliدارای Hsp70 نوترکیب در حضور NaCl 0.5 مولار رشد بیشتری را نشان می‏دهد. این موضوع تایید کننده‏ی عملکرد صحیح Hsp70 می‏باشد.

 

بحث

دسته وسیعی از استرس‏های محیطی منجر به القای تولید پروتئین‏های موسوم به شوک حرارتی می­شوند که در این بین چاپرون‏های مولکولی در مواجهه­ی سلول با استرس‌های محیطی نقش حیاتی را ایفا می­کنند (12). در این میان Hsp70 همراه با کوچاپرون خود یعنی Hsp40 به سایر پروتئین‏های سلولی کمک می­کند تا کیفیت ساختار خود را حفظ کرده و بدین‏ترتیب موجب بقای سلول می­شوند. ما در این پژوهش به بررسی اثر زمان، دما، pH و فلزات سنگین بر بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب پرداختیم. نتایج ما در بررسی فاکتور زمان نشان داد که طی زمان های 2 تا 48 ساعت تغییر محسوسی در بیان این پروتئین دیده نمی­شود به‏جز در 4 و 8 ساعت که این پروتئین کمی بیشتر بیان شده است. مطالعه Boone و همکاران (13) نشان داد که بیان 70Hsc (Heat Shock Cognate protein 70) در سلول های هپاتوسیت در 2 ساعت تا 48 ساعت، تغییر چندانی با هم ندارند.

مطالعه‏ی ما روی اثر دما بر بیان Hsp70 نوترکیب بیانگر این موضوع است که در دماهای پایین شرایط برای رشد باکتری و متعاقب آن بیان این پروتئین مطلوب نبوده است. در دماهای بالاتر از 45 درجه سانتی‏گراد نیز به‏نظر می­رسد که E. coli رشد کمی داشته است اما با آن‏حال، بیان هرچند کم Hsp70 به بقای باکتری در مقابله با دمای بالا کمک کرده است. پژوهشی که Lindquist (14) انجام داد، نشان داد که Hsp70 دروزوفیلا در دمای 23 درجه سانتی‏گراد بیان بسیار کمی داشته و در دماهای بالاتر بیان Hsp70 هم افزایش می­یابد به‏طوری‏که در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، این پروتئین شوک حرارتی به حداکثر میزان بیان خود می­رسد. شواهد موجود نشان می­دهد که در دماهای مطلوب برای رشد موجودات، پروتئین Hsp70 نیز بیان حداکثری دارد.

همچنین  Sotoو همکاران (15) مطالعه­ای را بر روی افزایش بقای E. coliترانسقورم شده تحت استرس دمایی انجام دادند. در این پژوهش نشان داده شده که پروتئین نوترکیب Hsp17.5 اثر محافظتی بر بقای سلول و پایداری سایر پروتئین‏ها دارد. به‏طوری‏که در بررسی پروتئین‏های بیان شده به‏وسیله‏ی آنالیز SDS-PAGE 12 درصد، میزان بیان پروتئین Hsp17.5 نوترکیب در باکتری ترانسفورم شده با pRSET-Hsp نسبت به باکتری کنترل به‏مراتب بیشتر بوده است. به‏همین ترتیب، Wang و همکاران (16) به بررسی تاثیر شوک دمایی بر بیان Hsp70 نوترکیب حشره ی c-nigrum در میزبان E. coli پرداختند که آنالیز SDS-PAGE 12 درصد نشان داد تحت استرس دمایی، میزان بیان پروتئین Hsp70 نوترکیب در باکتری حاوی ترانسفورم بیشتر از باکتری کنترل می­باشد.. کنترل استرس سلولی ناشی از تغییرات pH، برای سلول‏ها از اهمیت زیادی برخوردار است که بدین منظور سیستم هومئوستازی (Homeostasis ) pH در نظر گرفته شده است که در برابر تغییرات pH القا پذیر می­باشد. این سیستم‏ها منجر به تغییر در پمپاژ پروتون، کاهش تراواپذیری (Permeability) غشا، جلوگیری از آسیب به DNA و نیز تولید چاپرون‏ها می­شوند. چندین گزارش به کمک ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید دو بعدی نشان می­دهد که تولید چاپرون‏هایی مانند DnaK و GroEL تحت استرس pH اسیدی القا می­شوند (19-17). ما نیز در بخش دیگری از پژوهش به بررسی اثر pH اسیدی و قلیایی بر بیان این پروتئین نوترکیب پرداختیم. نتایج ما آشکارا نشان می­دهد تحت شرایط اسیدی (5=pH) که به محیط کشت باکتری القا می­شود، میزان بیان پروتئین Hsp70  نوترکیب بیشتر شده است. همچنین مطالعه ای که Huesca و همکاران (20) انجام دادند، نشان داد که پروتئین شوک حرارتی 70 یک نقش محوری در سازگار شدن هلیکوباکتر پیلوری برابر pH اسیدی معده دارد و باعث حفاظت از سایر پروتئین‏های این باکتری تحت شرایط اسیدی می­شود. قرار گرفتن سلول‏ها در معرض دماهای بسیار بالا، استرس اکسیداتیو و فلزات سنگین موجب دناتوره شدن پروتئین‏ها و توده­ای شدن (Aggregation) آن‏ها می­شود که در نهایت باعث القای پروتئین­های شوک حرارتی مانند Hsp70 می­‏شود که به نوبه‏ی خود مانع آپوپتوزیس و باعث بقای سلول می­‏شود. به‏دلیل شرایط محیطی ماهی سفید دریای خزر که در معرض انواع استرس‏ها از جمله فلزات سنگین قرار می­گیرد، در این پژوهش به بررسی اثر فلزات سنگین بر بیان پروتئین Hsp70 پرداخته شد. در ابتدا در حضور فلزاتی از جمله جیوه، کادمیوم و آهن با غلظت mM 50 و طی تیمار 4 ساعته و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، رشد باکتری E. coli ترانسفورم شده و نیز باکتری کنترل منفی صورت نگرفت. این در حالی است که نتایج نشان داد در حضور فلزات منگنز و کبالت در محیط کشت باکتری، Hsp70 نوترکیب بیشترین و کمترین میزان بیان را در میزبان داشته است. اما مطالعه Mahmood و همکاران (21) نشان داد که Hsp70 در حضور جیوه و کادمیوم بیان بسیار کمی دارد، به‏علاوه اینکه در حضور فلز روی، پروتئین شوک حرارتی 70 بیان بیشتری دارد نسبت به زمانی‏که در معرض جیوه و کادمیوم قرار می­گیرد.

یکی از آزمون­های تایید کننده‏ی فعالیت صحیح چاپرون‏ها در محیط in vivo، انجام آزمون تحمل به استرس نمکی می‏باشد. طی مطالعه ای که انجام شد، باکتری E. coliدارای Hsp70 – pET28a+  در شرایط استرس با NaCl  0.5 مولار قرار گرفت که در مقایسه با باکتری کنترل مقاومت بیشتری از خود نشان داد. مطالعه‏ای مشابه را Ghafoori و همکاران (22) در انجام دادند که طی آن باکتری E. coliدارای DnaJ – pET28a+و باکتری کنترل به‏مدت 72 ساعت تحت استرس NaCl 0.5 مولار و 1 مولار قرار گرفتند. نتایج نشان داد تحت شرایط استرس NaCl 5/0 مولار و 1 مولار، باکتری ترانسفورم شده نسبت به باکتری کنترل به‏ترتیب 1.85 و 1.36 برابر رشد کرد. همچنین Takalloo و همکاران (23) تاثیر NaCl 500 میلی‏مولار را بر مقاومت باکتری E. coli دارای pET28a+ - Artemin مورد ارزیابی قرار دادند که نتایج آشکارا نشان داد باکتری ترانسفورم شده نسبت به باکتری کنترل تحت استرس نمکی رشد بیشتری دارد. این نتایج بر این نکته دلالت دارند که پروتئین‏های شوک حرارتی مانند Hsp70، DnaJ و آرتمین با خاصیت چاپرونی که دارند به بقای موجود زنده کمک می‏کنند به‏طوری‏که در پروتئین Hsp70، دمین اتصال به پروتئین با میان‏کنش با پروتئین­های حیاتی سلولی که دناتوره شده یا بدتاخورده اند، موجب حفظ عمل‏کرد صحیح آن­ها شده و به این ترتیب باعث بقای جاندار می‏شود.

 

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از  این مطالعه نشان می­دهد باکتری E. coli ترانسفورم شده در مقایسه با باکتری کنترل به ‏دلیل دارا بودن  Hsp70 نوترکیب در برابر شرایط حاد محیطی قادر به بقا بوده است و بیشترین بیان پروتئین نوترکیب در زمان 4 و 8  ساعت، دمای 37 درجه سانتی‏گراد و  pH برابر 5 صورت گرفت. پروتئین Hsp70 نوترکیب با خاصیت چاپرونی خود از واسرشت شدن پروتئین­های حیاتی جلوگیری کرده و به این ترتیب موجب حفظ عملکرد باکتری ترانسفورم شده تحت استرس های محیطی می­شود.

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از پژوهشکده حوزه آبی دریای خزر دانشگاه گیلان بابت حمایت پژوهشی طی قرارداد 9319395706 از پژوهش حاضر تشکر و قدردانی به عمل می آورد.

1. Pawar H R. Agrawal G. Ramneek Brah, Expression, purification and characterization of recombinant Heat Shock Protein 70 (HSP70) from sheep and goat species. Int j Curr Microbiol Appl Sci. 2013; 2(11): 440-452.

2. Lindquist S,  Craig E. The heat-shock proteins. Annual review of genetics. 1988; 22(1): 631-677.

3. Powers  MV, Jones K, Barillari C, Westwood I, et al. Targeting HSP70: the second potentially druggable heat shock protein and molecular chaperone? Cell Cycle. 2010; 9(8): 1542-1550.

4. Goloudina AR, Demidov ON, Garrido C. Inhibition of HSP70: a challenging anti-cancer strategy. Cancer letters. 2012; 325(2): 117-124.

5. Leu JJ, Pimkina J, Frank A. A small molecule inhibitor of inducible heat shock protein 70. Molecular cell. 2009; 36(1): 15-27.

6. Mayer MP, Schlecht R, Rüdiger S, Paal K, Laufen T, et al. Functional analysis of Hsp70 inhibitors. PloS one. 2013; 8(11): e78443.

7. Malyshev I. A General Description of HSPs, The Molecular Structure of HSP70 and The HSP70 Cycle, in Immunity, Tumors and Aging: The Role of HSP70. 2013; Springer. 1-13.

8. Mayer M, Bukau B.Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cellular and molecular life sciences. 2005; 62(6): 670.

9. Ying X P, Su X, Wu H X, et al. Cloning and expression of HSP70 gene of sipuncula Phascolosoma esculenta. Fish & shellfish immunology. 2010; 28(3): 461-466.

10. Stricher F, Macri C, Ruff M, Muller S, et al. HSPA8/HSC70 chaperone protein: structure, function, and chemical targeting. Autophagy. 2013; 9(12): 1937-1954.

11. Ausubel, Frederick M, et al. "Short protocols in molecular biology." 1992: 1-2.

12. Ellis, R.J. and S.M. Van der Vies, Molecular chaperones. Annual review of biochemistry. 1991; 60(1): 321-347.

13. Boone AN, Vijayan MM. Constitutive heat shock protein 70 (HSC70) expression in rainbow trout hepatocytes: effect of heat shock and heavy metal exposure. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 2002; 132(2): 223-233.

14. Lindquist S. Varying patterns of protein synthesis in Drosophila during heat shock: implications for regulation. Developmental biology. 1980; 77(2): 463-479.

15. Soto A, Allona I, Collada C, Guevara MA, et al. Heterologous expression of a plant small heat-shock protein enhances Escherichia coli viability under heat and cold stress. Plant Physiology. 1999; 120(2): 521-528.

16.Wang L, Yang S, Han L, Kuijun ZhaoK, et al. Expression profiles of the heat shock protein 70 gene in response to heat stress in Agrotis c-nigrum (Lepidoptera: noctuidae). Journal of Insect Science. 2015; 15(1): 9.

17. Foster  JW, Hall HK. Inducible pH homeostasis and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Journal of bacteriology. 1991; 173(16): 5129-5135.

18. Heyde M, Portalier R. Acid shock proteins of Escherichia coli. FEMS microbiology letters. 1990; 69(1-2): 19-26.

19. Hickey EW, Hirshfield IN. Low-pH-induced effects on patterns of protein synthesis and on internal pH in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Applied and environmental microbiology. 1990; 56(4): 1038-1045.

20. Huesca M. Characterization of an Acidic-pH-Inducible Stress Protein (hsp70), a Putative Sulfatide Binding Adhesin, fromHelicobacter pylori. Infection and immunity.1998; 66(9): 4061-4067.

21. Mahmood K, et al. Synergistic effects of toxic elements on heat shock proteins. BioMed research international, 2014; 2014: 1-17.

22. Ghafoori H, Askari M, Sarikhan S. "Molecular cloning, expression and functional characterization of the 40-kDa heat shock protein, DnaJ, from Bacillus halodurans." Process Biochemistry. 2017; 54: 33-40.

23. Takalloo, Z. "Artemin protects cells and proteins against oxidative and salt stress." International journal of biological macromolecules. 2017; 95: 618-624.