القای التهاب عصبی با فعال‏سازی سلول‏های میکروگلیا و تاثیر آن بر بقای نورون‌های دوپامین‌ساز

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه جداسازی سلول‏های میکروگلیا از مغز نوزاد موش صحرائی، فعال کردن آن‌ها با  لیپوپلی‌ساکارید (LPS) و بررسی اثر فاکتورهای التهابی تولیدی توسط سلول‏های مزبور، روی سلول‏های نورونی دوپامین‌ساز می‌باشد.
مواد و روش‌ها: سلول‏های مخلوط گلیال از مغز نوزادان موش صحرایی 1 تا 3 روزه، تهیه و سپس سلول‏های میکروگلیا از آن‏ها جدا شدند. پس از تیمار میکروگلیا با LPS محیط مشروط آن‏ها جمع‌آوری شد. سلول‏های نورونی دوپامین‌ساز رده  SH-SY5Yدر پلیت‌های 96 خانه‌ای کشت داده شدند تا با محیط مشروط مزبور تیمار گردند. میزان بقا و مرگ نورون‏ها با تست‌های ‌MTT  و آپوپتوزیس ارزیابی شد  و داده‏ها آنالیز آماری شدند.
نتایج: سلول‏های مخلوط گلیال پس از گذشت 10 الی 13 روز شامل مخلوطی از سه نوع سلول آستروگلیا، الیگودندروسیت و میکروگلیا بودند. میکروگلیاها به‏صورت شناور و نیمه چسبیده در سطح قرار داشتند. این سلول‏ها 24 ساعت پس از جداسازی و انتقال به ظرف جدید، فرمی دوکی و منشعب به خود گرفتند. در این زمان سلول‏های مزبور با LPS تیمار شدند تا فعال شوند. فعال‌سازی آن‌ها با این ماده، از طریق تغییر مورفولوژیک سلول‏ها از فرم دوکی به آمیبی، مشاهده افزایش تولید NO با کمک تست گریس و القای بیان ژن‌های التهابی (TNF-α , iNOS) به اثبات رسید. همچنین تیمار سلول‏های نورونی دوپامین‌ساز  SH-SY5Yبا محیط مشروط میکروگلیای فعال شده، منجر به آپوپتوزیس و نکروزیس شد.
نتیجه‌گیری: فعال‏سازی میکروگلیا با  LPS منجر به بیان و ترشح فاکتورهای التهابی می‌شود. میزان زیاد فاکتورهای مزبور با ایجاد التهاب عصبی، منجر به مرگ آپوپتوتیک و نکروتیک سلول‏های دوپامین‌ساز می‌شود.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


بیماری پارکینسون دومین بیماری مخرب عصبی شایع در جهان است که شاخصه­ی اصلی آن مرگ نورون‏های دوپامین‏ساز مغز میانی می­باشد (1 و 2). دو عامل مهمی که در روند پیشرفت اکثر بیماری­های مخرب عصبی دیده می­شوند استرس اکسیداتیو (ناشی از تولید گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن) و التهاب عصبی (ناشی از فعالیت بیش ­از حد سلول‏های میکروگلیا و آستروگلیا در سیستم عصبی مرکزی) می­باشند (3).

سلول‏های میکروگلیا یکی از سه دسته سلول گلیال سیستم عصبی مرکزی (CNS) می­باشند. سلول‏های مزبور که 12 درصد از حجم مغز را به خود اختصاص می­دهند، در واقع ماکروفاژهای CNS هستند. این سلول‏ها در یک مغز سالم در حالت استراحت بوده و شکلی منشعب و شاخه شاخه دارند و به‏عنوان ناظر ایمنی در مغز عمل می­کنند. این در حالی‏است که به هنگام حمله­ی یک عامل بیماری­زا­ یا ایجاد جراحت در مغز، سلول‏های مزبور فعال شده و با تغییر مورفولوژیکی از حالت منشعب به‏حالت آمیبی­شکل عوامل بیماری­زا و سلول‏های مرده را با فعالیت فاگوسیتوزی خود پاک­سازی می‏کنند (4 و 5). سلول‏های میکروگلیا همچنین با تولید سیتوکین­ها و کموکین‏های التهابی، سایر سلول‏های سیستم ایمنی اعم از ذاتی و اکتسابی را به ناحیه­ی آسیب دیده فرا می­خوانند تا عامل بیماری­زا هر چه سریع­تر سرکوب شود (6-8).

تصور بر این است که حضور  طولانی­ مدت عامل بیماری­زا یا آسیب مغزی و نیز از کنترل خارج شدن سیستم تنظیمی سلول‏های میکروگلیا، منجر به تولید و ترشح بیش از حد فاکتور­های التهابی توسط سلول‏های مزبور شده و نه تنها عوامل عفونی بلکه سلول‏های عصبی زنده نیز آسیب دیده و یا کشته می­شوند، که اصطلاحا به این شرایط التهاب عصبی گفته می‏شود (3). شناسایی مسیرهای سیگنالینگ درگیر در مرگ نورون­ها در اثر التهاب عصبی، راه را برای پیشرفت راه‏کارهای درمانی جدید در معالجه­ی بیماری­های مخرب عصبی می‏‏گشاید. بدین منظور کشت سلول‏های میکروگلیا در محیط آزمایشگاه و تیمار رده­های سلولی نورونی دوپامین­ساز با فاکتورهای التهابی تولیدی سلول‏های میکروگلیا، می­تواند مدل مطالعاتی مناسبی برای بررسی مرگ سلولی در اثر التهاب عصبی و نیز شناسایی مسیرهای سیگنالینگ مربوطه باشد. در همین راستا روش­های متعددی برای جداسازی سلول‏های میکروگلیا ارائه شده است که یکی از پرکاربردترین آن‏ها روشی است که در سال 1996 توسط گیولیان و همکارانش (9) ارائه شد. وجه مشترک تمامی این روش­ها، استفاده از مغز نوزادان موش صحرایی یا موش خانگی 1 تا 3 روزه است که غنی از سلول‏های میکروگلیا می­باشد.

با توجه به نقش مهم میکروگلیا در ایجاد التهاب عصبی و به‏دنبال آن نقش مهم التهاب عصبی در روند پیشرفت بیماری‏های مخرب عصبی که در بالا تشریح شد، در مطالعه جاری سلول‏های میکروگلیا در محیط آزمایشگاه تهیه شدند و سپس تاثیر کشنده­ی آن‏ها بر رده­های نورونی دوپامین­ساز که در بیماری مخرب عصبی پارکینسون می­میرند، مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

مواد و روش‏ها

تهیه­ی سلول‏های مخلوط گلیال: سلول‏های مخلوط گلیال از مغز نوزادان موش صحرایی 1 تا 3 روزه­ی نژاد ویستار تهیه شد (10). به‏طور مختصر مغز نوزادان موش صحرایی 1 تا 3 روزه جدا شد و پس از جداسازی پرده­ی مننژ، بافت قشر مغز با ضربات مکانیکی و پیپت کردن خرد شده و به‏صورت همگن و یکنواخت درآمد. سپس در فلاسک­های پلی استیرن مخصوص کشت سلول در حضور محیط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی­بیوتیک Pen/Strep در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد و  CO2، 5 درصد کشت داده شدند. پس از دو روز انکوبه شدن و چسبیدن توده­های بافتی به کف فلاسک، کل محیط و بافت­های معلق دور ریخته شدند و با محیط جدید جایگزین شد. پس از آن هر سه روز یک بار نصف محیط فلاسک با محیط جدید جایگزین شد.

جداسازی سلول‏های میکروگلیا: پس از گذشت 10 الی 13 روز از کشت سلول‏های مخلوط گلیال و پرشدن کف فلاسک­ها، سلول‏های معلق یا نیمه­چسبیده که میکروگلیا بودند با تکان دادن مکرر فلاسک­ها به‏مدت 10 الی 20 دقیقه به‏صورت دستی، از سایر سلول‏ها جدا شده و به‏صورت شناور در محیط درآمدند. محیط مذکور از فلاسک خارج شد و سلول‏های معلق در آن به تعداد 80000 سلول در هر چاهک از پلیت 24 خانه‏ای کشت داده شدند.

تهیه­ی نورونهای دوپامینرژیک SH-SY5Y: رده­ی سلولی دوپامین­ساز­ SH-SY5Y از بانک سلولی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک تهیه شد و طبق شرایط مذکور در بالا در فلاسک کشت داده شد. سلول‏های مزبور 24 ساعت قبل از تیمار با محیط مشروط میکروگلیا، به تعداد 3000 سلول در هر چاهک از پلیت 96 خانه­ای کشت داده شدند.

فعال­سازی سلول‏های میکروگلیا با LPS: پودر لیپوپلی‏ساکارید (L8274) از شرکت سیگما خریداری شد و غلظت اولیه­ی 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر از آن در بافر نمکی فسفات (PBS) تهیه شد و سپس با فیلتر 2/0 میکرومتر به‏صورت استریل درآمد و برای ذخیره­سازی طولانی­مدت در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه­داری شد. غلظت­های نهایی 1 و 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر از LPS ، با هدف فعال­سازی و تولید فاکتورهای التهابی، 24 ساعت پس از جداسازی  میکروگلیا به سلول‏های مزبور اضافه و به‏مدت 48 ساعت با آن انکوبه شدند. سپس محیط مشروط این سلول‏ها جمع­آوری و با هدف ذخیره‏سازی طولانی­مدت در 20- درجه سانتی‏گراد نگه­داری شد.

تست گریس: برای تایید فعال­سازی میکروگلیا، میزان نیتریک اکسید (NO) تولیدی با استفاده از تست رنگ­سنجی گریس مورد سنجش قرار گرفت. به‏طور مختصر مقدار 50 میکرولیتر از محیط مشروط سلول‏های میکروگلیا جدا شده و به یک چاهک از میکروپلیت 96­خانه­ای اضافه شد، سپس محلول­های مخصوص تست گریس به حجم 50 میکرولیتر به آن اضافه شدند و در آخر میزان نیتریک اکسید موجود در این محیط، از طریق سنجش میزان جذب آن در طول موج 540 نانومتر با استفاده از دستگاه ELISA reader تعیین شد.

استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: چهل و هشت ساعت پس از تیمار سلول‏های میکروگلیا با LPS و جمع­آوری محیط سلول‏های مزبور، استخراج کل RNA سلولی با استفاده از کیت استخراج RNA سیناژن (RNX-Plus) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. پس از اطمینان از سلامت  RNAروی ژل آگاروز و سنجش غلظت آن با دستگاه نانودراپ، مقدار 2 میکروگرم از آن برای انجام آزمایش RT-PCR و سنتز cDNA، با استفاده از کیت مربوطه (RevertAidTM First Strand cDNA  Synthesis  Kit, Fermentase) و طبق دستورالعمل سازنده مورد استفاده قرار گرفت. غلظت cDNA تهیه شده از نمونه­های کنترل و تیمار شده با LPS، با استفاده از دستگاه نانودراپ تعیین و سپس مقدار 2 میکروگرم از هر کدام برای تکثیر هر یک از قطعات مربوط به ژن­های GAPDH (به عنوان کنترل)، TNF-α و iNOS (فاکتورهای التهابی تولیدی توسط میکروگلیای فعال) با استفاده از  پرایمرهای اختصاصی که به شرح زیر طراحی و سنتز شده بودند، استفاده شد:   

GAPDH:

Forward: 5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'

Reverse: 5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'

TNF-α:

Forward: 5'-GCTCCCTCTCATCAGTTCCA-3'

Reverse: 5'-TTGGTGGTTTGCTACGACC-3'

iNOS:

Forward: 5'-GACATCGACCAGAAGCTGTC-3'

Reverse: 5'-GGGCTCTGTTGAGGTCTAAAG-3'

واکنش PCR  برای هر یک از ژن­های مزبور با دماهای اختصاصی که برای پرایمرهای مربوطه تعیین شد، انجام گرفت.

ایجاد التهاب عصبی در رده­ی سلولی SH-SY5Y  و سنجش میزان بقا: سلول‏های SH-SY5Y به تعداد 3000 سلول در هر چاهک از پلیت 96 خانه­ای کشت داده شدند و پس از 24 ساعت با هدف تعیین LD50، با مقادیر حجمی مختلف از محیط مشروط سلول‏های میکروگلیا به‏مدت 48 ساعت تیمار شدند و در آخر حجمی از محیط مشروط میکروگلیا که در آن نیمی از سلول‏ها کشته شدند به‏عنوان LD50 انتخاب شد. LD50 تعیین شده با اعمال 100 میکرولیتر از محیط مشروط میکروگلیای تیمار شده با 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر LPS  به‏دست آمد و این مقدار محیط مشروط برای انجام آزمایشات بعدی مورد استفاده قرار گرفت. در آزمایش‏های مزبور، سلول‏ها به سه گروه تقسیم شدند: گروه کنترل که هیچ‏گونه تیماری در آن انجام نشد، گروه تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیای طبیعی و گروه تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیای فعال شده. عکس­برداری از سلول‏های SH-SY5Y  قبل و بعد از تیمار با محیط مشروط  انجام شد. چهل و هشت ساعت پس از انکوبه شدن سلول‏های مزبور با محیط مشروط، میزان بقای سلولی با استفاده از تست MTT مورد سنجش قرار گرفت. به‏طور مختصر غلظت  5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر از پودر MTT (خریداری شده از شرکت سیگما) در PBS تهیه شد و پس از استریل کردن با فیلتر 2/0 میکرومتر، مقدار 20 میکرولیتر از آن به محیط سلول‏های مذکور در پلیت 96 خانه­ای اضافه شد و به‏مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد  انکوبه شد. سپس کل محیط خارج گردید و با مقدار 100 میکرولیتر از دی متیل سولفوکساید (DMSO) جایگزین شد و به‏مدت 30 دقیقه در تاریکی در انکوباتور شیکر­دار انکوبه شد و در آخر مقدار کریستال­های فورمازان MTT از طریق سنجش میزان جذب آن در طول موج­های 580 نانومتر و 620 نانومتر تعیین شد.

تست آپوپتوزیس: سلول‏های SH-SY5Y عینا مطابق روشی که برای تست MTT گفته شد، در پلیت 96 خانه­ای تهیه شدند به‏طوری‏که گروهی از چاهک­های سلولی به‏مدت 24 ساعت و گروهی دیگر به‏مدت 48 ساعت با مقدار LD50 تعیین شده از محیط مشروط میکروگلیا تیمار شدند. سپس تست آپوپتوزیس با استفاده از کیت Annexin، طبق دستورالعمل سازنده، روی سلول‏ها انجام شد و پس از گذشت 5 الی 10 دقیقه انکوبه شدن در دمای اتاق، با میکروسکوپ فلورسانس از آن‏ها عکس‏برداری انجام شد. غشای سیتوپلاسمی سلول‏های آپوپتوتیک به‏دلیل حضور FITC متصل شده با آنکسین در کیت مزبور، در عکس­برداری فلوئورسنت به‏صورت سبز دیده می­شوند. در حالی‏که هسته­ی سلول‏های نکروتیک به‏دلیل  حضور PI (پروپیدیوم آیوداید) در کیت مزبور، در عکس­برداری به‏صورت قرمز دیده می­شوند.

آنالیز آماری: داده­های مندرج در تصاویر نماینده­ی متوسط (Mean±SEM) سه آزمایش مجزا است که هر کدام به‏صورت سه بار تکرار انجام شده­اند. آنالیز آماری داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS version 16 انجام گرفت و برای آنالیز تفاوت بین گروه­های مختلف سلولی، از آنالیز یک سویه­ی واریانس (One-way analysis of variance, ANOVA) و سپس تست دانکن (post-hoc Duncan Multiple-comparisons Test) استفاده شد. ارزش05/0p< به‏صورت معنی­دار و ارزش­ 01/0p< به‏صورت بسیار معنی­دار تفسیر شدند.

 

نتایج

جداسازی و کشت موفقیت­آمیز سلول‏های مخلوط گلیال

پس از گذشت 11 روز از کشت سلول‏های مخلوط گلیال و عکس­برداری متوالی از آن‏ها، نتایج حاصله در شکل 1 گزارش شده است.

همان‏طور که در بخش مواد و روش­ها عنوان شد، روز یازدهم پس از پر شدن فلاسک توسط سلول‏های مخلوط گلیال، سلول‏های میکروگلیا با شیک کردن جدا شده و در پلیت 24 خانه­ای کشت داده شدند. شکل 2 تصویر سلول‏های مزبور را 24 ساعت پس از جداسازی نشان می­دهد. فرم دوکی­شکل و منشعب (ramified) سلول‏ها که حاکی از غیر فعال بودن آن‏هاست، کاملا در شکل مشهود است.

 

 

 

شکل 1: سلول‏های مخلوط گلیال روز اول (چپ)، روز پنجم (وسط) و روز یازدهم (راست) پس از جداسازی از مغز. بزرگنمایی 100×

 

 

 

 

 

شکل 2: سلول‏های میکروگلیا 24 ساعت پس از جداسازی. بزرگنمایی 200×

 

 

فعال­سازی و ایجاد تغییر مورفولوژیک در سلول‏های میکروگلیا با تیمار LPS

سلول‏های میکروگلیا 24 ساعت پس از جداسازی، با LPS به‏مدت 48 ساعت تیمار شدند. شکل 3 تغییر مورفولوژیک سلول‏های مزبور را از فرم دوکی و منشعب به‏فرم آمیبی شکل (ameboid)، 48 ساعت پس از تیمار در هر دو غلظت مورد استفاده از LPS نشان می­دهد.

 

 

شکل 3: سلول‏های میکروگلیا قبل (A) و بعد از تیمار(B) با 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر  LPS. قبل (C) و بعد از تیمار(D) با 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر LPS. بزرگنمایی: 200×

 

 

 

تولید نیتریک اکسید(NO) توسط میکروگلیای تیمار شده باLPS  

تست گریس طبق دستورالعمل ارائه شده در بخش مواد و روش­ها انجام شد که نتیجه­ی آن در شکل 4 نشان داده­ می‏شود. این نمودار نشان می­دهد که میزان نیتریک اکسید (NO) تولیدی از نمونه­های تیمار شده با LPS، بسیار بیشتر از نمونه­ی کنترل (تیمار نشده) است که تاییدی بر القای بیان ژن iNOS در سطح پروتئین، در نمونه­های تیمار شده می­باشد. همچنین میزان NO تولیدی نمونه­ی تیمار شده با 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر  LPS بیشتر از نمونه­ی تیمـار شده با 1

میکروگرم بر میلی‏لیتر  LPS است.

بیان ژن­های التهابی توسط سلول‏های میکروگلیای فعال­ شده

القای بیان ژن­های کد کننده­ی فاکتورهای التهابی فرآیندی است که در روند فعال شدن میکروگلیا رخ می­دهد. در این مطالعه با استفاده از تکنیک RT-PCR، بیان ژن GAPDH (به‏عنوان کنترل) و القای بیان ژن­های iNOS  و TNF-α ،که تولیدکننده­ی فاکتورهای التهابی مربوطه هستند، ردیابی شدند که نتایج آن در شکل 5 نشان داده می­شود.

 

همان‏طور که از شکل پیداست، بیان ژن  GAPDHدر هر سه نمونه یکسان می­باشد که حکایت از یکسان بودن شرایط و صحت انجام واکنش PCR دارد. همچنین القای بیان ژن­های TNF-α و iNOS در نمونه های تیمار شده با LPS کاملا مشهود است، در حالی‏که بیان ژن­های مزبور در نمونه­ی شاهد بسیار پایین و نزدیک به صفر است. همچنین سنجش شدت باندهای مربوطه با نرم­افزار GelAnalyzer 2010a نشان داد که میزان بیان ژن TNF-α در نمونه­های تیمار شده با مقادیر 1 و 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر از LPS نسبت به این میزان در نمونه­ی کنترل، به‏ترتیب 97 و 105 برابر می­باشد. همچنین میزان بیان ژن iNOS در نمونه­های تیمار شده با  1 و 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر از  LPSنسبت به این میزان در نمونه­ی کنترل به‏ترتیب 25 و 200 برابر می­باشد. (شکل 6) نتایج مربوطه را نشان می­دهد.

تغییر مورفولوژیک سلول‏های میکروگلیا (شکل3)، تایید تولید NO بیشتر با تست گریس (شکل 4) و تایید بیان ژن­های التهابی با RT-PCR (شکل­های 5 و 6)، همگی فعال­سازی سلول‏های میکروگلیا توسط تیمار با LPS و تولید و ترشح فاکتورهای التهابی را تایید می­کنند.

 

 

 

 

 

شکل4: تست گریس. تیمار سلول‏های میکروگلیا با غلظت­های0 میکروگرم بر میلی‏لیتر(کنترل- ستون چپ)، 1میکروگرم بر میلی‏لیتر (ستون وسط) و 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر (ستون راست) ازLPS  و سنجش میزان NO تولید شده توسط سلول‏های مزبور. علامت­ *** اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) نمونه­های تیمار شده با LPS را با نمونه­ی کنترل نشان می­دهد، درحالی‏که اختلاف بسیار معنی­دار        (01/0p<) نمونه 10+ میکروگرم بر میلی‏لیتر  LPSبا نمونه 1+ میکروگرم بر میلی‏لیتر  LPS با علامت ##  نشان داده می­شود.

 

 

 

شکل 5: محصولات PCR  ژن­های GAPDH (2) ،TNF-α  (3) و iNOS (4) با پرایمرهای اختصاصی. در هر کدام به ترتیب از چپ به راست: میکروگلیای شاهد (تیمار نشده)، میکروگلیای تیمار شده با 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر LPS و میکروگلیای تیمار شده با10 میکروگرم بر میلی‏لیتر  .LPS  (1) مارکر 100 bp.

 

 

شکل 6: آنالیز کمی میزان بیان ژنهای TNF-a و iNOS  در سلول بدون LPS (گروه اول)، سلول تیمار شده با 1 ug/uL از LPS (گروه دوم) و سلول تیمار شده با 10 ug/uL از LPS. علامتهای ** و *** اختلاف بسیار معنی دار در میزان بیان iNOSبین گروههای سوم و دوم نسبت به گروه اول را نشان میدهد. همچنین علامت ## اختلاف بسیار معنی دار در TNF-a را بین گروههای سوم و دوم نسبت به گروه اول را نشان میدهد.

 

 

مورفولوژی سلول‏های SH-SY5Y پس از تیمار با محیط مشروط میکروگلیا

24 و 48 ساعت پس از تیمار سلول‏های مزبور با محیط مشروط، از آن‏ها عکس­برداری انجام شد که نتایج آن در شکل 7 نشان داده می­شود. همان‏طور که در شکل دیده می­شود، سلول‏های شاهد (تیمار نشده) و تیمار شده با محیط میکروگلیای غیرفعال (تیمار نشده با LPS) کاملا سالم و در شرایط مطلوب رشد هستند. در حالی‏که در سلول‏های تیمار شده با مقدار LD50 از محیط مشروط میکروگلیای فعال، مرگ سلولی پیشرونده­ای پس از گذشت 24 و 48 ساعت قابل مشاهده است.

 

 

 

شکل 7: تیمار سلول‏های SH-SY5Yبا محیط مشروط. سلول شاهد (تیمار نشده) (A). سلول تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیای غیرغعال (B). سلول تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیای فعال شده با LPS، 24 ساعت بعد از تیمار (C). سلول تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیای فعال شده با LPS، 48 ساعت بعد از تیمار (D). بزرگنمایی: 200×

 

تاثیر محیط مشروط میکروگلیای فعال شده بربقای سلول‏های SH-SY5Y

محیط مشروط سلول‏های میکروگلیای شاهد (تیمار نشده) و تیمار شده با LPS ، برای تیمار سلول‏های SH-SY5Y مورد استفاده قرار گرفت و تست MTT برای سنجش میزان بقا انجام شد که نتایج آن در شکل 8 گزارش می­شود. همان‏طور که از نمودار پیداست سلول‏های  SH-SY5Yتیمار­شده با محیط مشروط میکروگلیای فعال­شده با LPS (LD50 of MCM-LPS)، در مقایسه با سلول‏های شاهد و سلول‏های تیمار­شده با محیط مشروط میکروگلیای غیرفعال (MCM) از بقای بسیار کمتری برخوردارند. این نتایج نشان می­دهد که فاکتورهای التهابی تولیدی توسط میکروگلیای فعال همچون TNF-α و NO، منجر به راه­اندازی مسیرهای مرگ سلولی در سلول‏های SH-SY5Y تیمار شده با محیط مزبور شده­اند.

 

 

شکل 8: تست MTT. سلول SH-SY5Y شاهد (ستون اول). سلول SH-SY5Y تیمار شده با محیط میکروگلیای غیر فعال (ستون دوم). سلول SH-SY5Y تیمار شده با LD50 از محیط مشروط میکروگلیای فعال (ستون سوم). علامت *** اختلاف بسیار معنی­­دار (01/0p<) ستون سوم را نسبت به ستون­های اول و دوم نشان می­دهد. :MCM محیط مشروط میکروگلیای غیرفعال،  MCM-LPS : محیط مشروط میکروگلیای فعال شده با LPS.

 

 

 

مکانیسم مرگ سلول­های SH-SY5Y پس از تیمار با محیط مشروط میکروگلیا

طبق دستورالعملی که در بخش مواد و روش­ها بیان شد روی سلول­های تیمار شده با محیط مشروط میکروگلیا، 24 و 48 ساعت پس از تیمار، تست آپوپتوزیس با استفاده از کیت انکسین انجام شد. نتایج این تست در شکل‏های 9 و 10 نشان داده شده است.

همان‏طور که از شکل‏ها پیداست در ابتدا که 24 ساعت (شکل 9) از تیمار سلول­ها با محیط مشروط می­گذرد، سلول­ها کم کم به‏سمت آپوپتوزیس می­روند (غشای سیتوپلاسمی سلول­ها سبز می­شود) اما درصد نکروزیس بسیار پایین است (هسته­های قرمز). 48 ساعت (شکل 10) پس از تیمار هم میزان آپوپتوزیس بسیار بیشتر شده و هم نکروزیس به‏میزان قابل توجهی افزایش پیدا کرده است. این نتایج نشان می­دهد که فاکتورهای التهابی موجود در محیط مشروط، با گذشت زمان اثر کشندگی بیشتری را روی سلول­های دوپامین­ساز اعمال کرده، مسیرهای آپوپتوزیس و نکروزیس سلولی را با هم به راه می­اندازند و منجر به مرگ سلولی می­شوند.

 

 

 

 

 

 

 

 

    

A

B

C

  

 

شکل 9: تست آپوپتویس: تصویر فاز کنتراست از سلول SH-SY5Y (چپ). تصویر فلوئورسنت با فیلتر آبی: غشای سیتوپلاسمی سلول در حالت آپوپتوزیس سبز می­شود (وسط). تصویر فلوئورسنت با فیلتر سبز: هسته­ی سلول در حالت نکروزیس قرمز می­شود (راست). 24 ساعت پس از تیمار با مقدار LD50 از محیط مشروط میکروگلیا. بزرگنمایی 200×

 

 

    

A

B

C

شکل 10: تست آپوپتوزیس: تصویر فاز کنتراست از سلول SH-SY5Y (چپ). تصویر فلوئورسنت با فیلتر آبی: غشای سیتوپلاسمی سلول در حالت آپوپتوزیس سبز می­شود (وسط). تصویر فلوئورسنت با فیلتر سبز: هسته­ی سلول در حالت نکروزیس قرمز می­شود (راست). 48 ساعت پس از تیمار با مقدار LD50 از محیط مشروط میکروگلیا. بزرگنمایی 100×.

 

 

بحث

در این مطالعه جداسازی سلول‏های میکروگلیا، فعال­سازی آن­ها با لیپوپلی­ساکارید، تولید فاکتورهای التهابی توسط آن­ها و پتانسیل کشندگی محیط سلول‏های مزبور روی سلول‏های نورونی دوپامین­ساز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج ما نشان داد که این سلول‏ها با روشی که توسط گیولیان و همکارانش (9) ارائه شده بود، به‏خوبی قابل جداسازی هستند و مورفولوژی مناسب سلول‏های میکروگلیای غیرفعال و در حال استراحت (resting) را در محیط آزمایشگاه در پلیت نشان می­دهند. همچنین دیده شد که تیمار سلول‏های مزبور با لیپوپلی­ساکارید (LPS) که آنتی­ژن باکتری­های گرم­منفی به‏شمار می­رود، شرایطی معادل حمله­ی یک عامل بیماری­زا در محیط in vivo را شبیه­­سازی می­کند و باعث فعال شدن سلول‏های میکروگلیا، از طریق راه­اندازی مسیرهای سیگنالینگی که منجر به بیان ژن‏های التهابی می­شوند، می­گردد.

سلول‏های میکروگلیای مغز در شرایط نامطلوب مانند حمله­ی یک پاتوژن یا یک جراحت به مغز یا تجمع پروتئین­های سمی، به سرعت فعال شده و با تغییر مورفولوژی خود سیتوکین­های التهابی را با هدف از بین بردن پاتوژن­ها و فعال کردن سایر سلول‏های ایمنی، در جهت ترمیم آسیب، ترشح می­کنند (11). در صورت تداوم شرایط نامطلوب، سلول‏های میکروگلیا همچنان به تولید و ترشح فاکتور­های التهابی همچنان ادامه می‏دهند. این فاکتورها شامل سیتوکین­ها، کموکین­ها و پروستاگلاندین­ها می­باشند. سیتوکین­­های التهابی مانند TNF-α, IL-1β  هم به‏طور مستقیم و هم از طریق تحریک  آستروسیت­ها و تشدید پاسخ ایمنی ذاتی منجر به مرگ نورون­ها می­شوند، در حالی­که کموکین­هایی مثل پروتئین کموتاکتیک مونوسیتی مسئول جمع آوری سایر سلول‏های ایمنی از جمله سلول‏های ایمنی اکتسابی (لنفوسیت­های B و T) به ناحیه­ی آسیب دیده و به‏دنبال آن تشدید هر چه بیشتر التهاب می­باشند (12).

نتایج ما نشان داد که تیمار سلول‏های میکروگلیا با LPS، منجر به تغییر مورفولوژیک قابل توجه سلول‏های مزبور از فرم دوکی و منشعب به فرم آمیبی­شکل (شبه ماکروفاژی) می­شود. همچنین آزمون RT-PCR القای بیان ژن­های التهابی از قبیل TNF-α و iNOS را در سطح mRNA آشکار کرد. در همین راستا القای بیان ژن iNOS در سطح پروتئین و تولید آنزیم نیتریک اکسید سنتاز نیز، از طریق سنجش میزان NO تولیدی با کمک تست گریس به اثبات رسید.

تیمار سلول‏های میکروگلیا با غلظت­های مختلف از LPS (1µg/ml , 10µg/ml)، نشان داد که سلول‏های مزبور به مقادیر کمی از این ماده نیز حساس­اند و در پاسخ به آن فعال شده، تغییر مورفولوژی داده و فاکتورهای التهابی را تولید و ترشح می­کنند. در ادامه تیمار نورون­های دوپامین­­ساز  SH-SY5Y با محیط مشروط سلول‏های میکروگلیای فعال و به‏دنبال آن تست MTT آشکار کرد که هر حجمی از محیط مزبور منجر به مرگ نورونی نمی­شود و فقط حجمی که حاوی مقادیر بیشتری از فاکتورهای التهابی کشنده باشد (LD50=100ul of 10µg/ml LPS-induced MCM )، توانایی ایجاد التهاب عصبی و مرگ نورونی را دارد. همچنین نتایج حاصل از تست آپوپتوزیس نشان داد که فاکتورهای التهابی تولیدی از میکروگلیای فعال شده با LPS، نه تنها مسیر آپوپتوزیس بلکه مسیر نکروزیس را نیز برای کشتن سلول‏های نورونی دوپامین­­ساز SH-SY5Y به راه می­اندازند.

نتیجه گیری

با تکیه بر این نتایج و نتایج قبلی گزارش شده، بررسی و شناسایی ژن­هایی که در اثر فاکتورهای التهابی میکروگلیا، فعال شده و با راه­اندازی مسیرهای آپوپتوزیس و نکروزیس منجر به مرگ سلول‏های نورونی می­شوند، می­تواند دریچه­ی جدیدی را به سوی درمان و معالجه­ی بیماری­های مخرب عصبی همچون پارکینسون بگشاید.

تشکر و قدردانی

از همکاری آقای عمران اسماعیل زاده در تهیه این مقاله سپاسگزاری می‏شود.کلیه هزینه های این مقاله توسط پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری در قالب طرح 420 تامین گردیده است.

1. De Lau LM, Breteler MM. Epidemiology of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 2006; 5(6): p. 525-35.

2. Anglade P, et al. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients with Parkinson's disease. 1997; 12(1):25-31.

3. Taylor JM, Main BS. Crack PJ. Neuroinflammation and oxidative stress: co-conspirators in the pathology of Parkinson’s disease. Neurochemistry international. 2013; 62(5): p. 803-819.

4. Napoli I, Neumann H. Microglial clearance function in health and disease. Neuroscience. 2009;  158(3): 1030-8.

5. Neumann H, Kotter M, Franklin R. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 2009. 132(2): p. 288-295.

6. Streit WJ, Walter SA,. Pennell NA. Reactive microgliosis. Progress in neurobiology. 1999; 57(6): p. 563-581.

7. Kreutzberg GW. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends in neurosciences. 1996; 19(8): p. 312-318.

8. Streit WJ, Graeber MB,
Kreutzberg GW. Kreutzberg, Functional plasticity of microglia: a review. Glia. 1988; 1(5): p.301-307.

9. Giulian D, Baker TJ. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. The Journal of neuroscience. 1986; 6(8): p. 2163-2178.

10. Giulian D, Baker TJ. Peptides released by ameboid microglia regulate astroglial proliferation. The Journal of cell biology. 1985; 101(6): p. 2411-2411.

11. Streit WJ, Walter SA, Pennell NA. Reactive microgliosis. Progress in neurobiology. 1999; 57(6): p. 563-581.

12. Taylor JM, , Main BS, Crack PJ. Neuroinflammation and oxidative stress: co-conspirators in the pathology of Parkinson's disease. Neurochemistry international. 2013; 62(5): p. 803-819.