جداسازی و تعیین توالی ژن چالکون سنتاز از گیاه استبرق (Calotropis procera)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

2 دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کرمان، ایران

-

چکیده

هدف: چالکون سنتاز (CHS) آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فلاونوئید می‌باشد و نخستین مرحله بیوسنتز فلاونوئیدها را کاتالیز می‌کند. هدف این تحقیق شناسایی ژن چالکون سنتاز در گیاه استبرق بود.
مواد و روش‏ها: DNA ژنومی از برگ‏های تازه استخراج و به‏عنوان الگو جهت PCR استفاده شد. آغازگرها بر اساس نواحی حفاظت شده این ژن از سایر گیاهان طراحی شدند. فراورده حاصل از PCR تخلیص و توالی‌یابی شد. نتایج تعیین توالی ابتدا هم‌ردیف و سپس با توالی‌های برخی ژن‌های CHS موجود در بانک ژن و با نرم‌افزار DNAMAN مقایسه شد. درخت فیلوژنتیکی مربوط به توالی CHS در استبرق و گونه‌های گیاهی دیگر با نرم افزار MEGA 6 و به‏روش Neighbor-joining رسم شد.
نتایج: نتایج PCR بیانگر وجود ژن چالکون سنتاز و تکثیر قطعه 572 نوکلئوتیدی متعلق به اگزون شماره2 این ژن بود. این  با نام CpCHS و شماره بازیابی (KM878672) در بانک ژن ثبت شد. مقایسه توالی CpCHS با سایر توالی‌های ژن CHS نشان داد این ژن با توالی CHS درArabidopsis thaliana59 درصد، Nicotiana tabacum 63 درصد، Olea europaea 63 درصد و Petunia x hybrida 64 درصد یکسانی دارد. بیشترین یکسانی با توالی ژن CHS در Catharanthus roseus و برابر با 68 درصد بود. رسم درخت فیلوژنی نشان داد که CpCHS با ژن CHS گیاه Catharanthus roseus در یک شاخه قرار دارد.
نتیجه گیری: این نتایج نشان می‌دهد که به احتمال CpCHS نیز همانند سایر ‍‍‍‍ژن‌‌های CHS در تنظیم مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها نقش دارد و شناسایی این ژن در گیاه استبرق منجر به یافتن راه‏کاری کارآمد جهت افزایش تولید مواد مؤثره دارویی و ارزشمند این گیاه باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


استبرق (proceraCalotropis) که متعلق به تیره‌ی Asclepiadaceae است (1)، درختچه‌ای افراشته یا درختی کوچک، پایا و همیشه سبز به ارتفاع تا 5 متر می‌باشد (2). عصاره ریشه، ساقه و برگ گیاه استبرق یک منبع مهمی از ترکیبات ثانویه مانند فلاونوئیدها است (3). این گیاه خاص مناطق باز با رقابت کم است که به‏صورت خودرو و تحت شرایط آب و هوایی فوق العاده گرم در نواحی گرمسیری و معتدل گرم رشد می‏کند (4).

از بافت‌های استبرق به‏‌ویژه، پوست ریشه، در درمان بیماری‌های مختلفی شامل جذام، تب، خونریزی رحم، مالاریا و مار‌گزیدگی استفاده می‌شود (5). گزارش شده‌ است که گیاه استبرق جهت جداسازی و برداشت فلزات سنگین مانند کادمیم و سرب از خاک، فاضلاب‌های صنعتی یا آب‌های آلوده زیر‌زمینی نیز به‌کار برده می‌شود (6). تمام بخش‌های گیاه به‌ویژه دانه‌ها و شیرابه، اغلب سمی‌ بوده و دارای آلکالوئیدها و گلیکوزیدهای متنوعی ‌هستند که تعداد زیادی از آن‏ها در داروسازی و به‏عنوان حشره‏کش‌ها استفاده می‌شوند. شیرابه گیاه دارای خاصیت ضد ‌درد و التیام‌ دهنده زخم و ریشه گیاه دارای خواص ضد ‌بارداری و ضد‌ زخم معده است. خواص حفاظت کبدی و آنتی‌اکسیدانتی گیاه را به فلاونوئید‌های موجود در گل نسبت داده‌اند (7).

شیرابه گیاه استبرق منبع مهمی از ترکیبات جدید گسترده مانند فلاونوئید کوئرستین، گلیکوزیدهای فلاونوئیدی، آنتوسیانین، رزین، آنزیم‌های هضم کننده پروتئین در شیرابه، تانن، استرول، ساپونین و تری ترپنوئیدها می‏باشد (8 و 9). آنالیز شیمیایی عصاره‏های برگی گیاه استبرق حضور ترکیباتی از قبیل گلیکوزیدها، پروتئین‏ها، تری ترپنوئیدها، استروئیدها و فلاونوئیدها را آشکار کرد، که بیانگر اهمیت و خواص دارویی گیاه مذکور می‌باشد (10).

بیوسنتز فلاونوئیدها پیچیده و مراحل آنزیمی متعددی در آن در‌گیر می‌شوند. در مراحل اولیه سنتز فلاونوئیدها، فنیل آلانین مشتق از مسیر شیکمیک به‏وسیله آنزیم‏های مسیر فنیل پروپانوئیدی (فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL))، سینامات 4 هیدروکسیلاز (C4H) و 4-کومارات-کوانزیم آ لیگاز (4CL) به کوماریل کوانزیم آ تبدیل می‌شود. چالکون سنتاز (CHS)، اولین آنزیم سنتز فلاونوئید موجب ترکیب کوماریل کوانزیم آ با سه مولکول مالونیل کوانزیم آ حاصل از استیل کوانزیم آ برای تشکیل نارینژنین می‌شود. سپس نارینژنین چالکون به‏وسیله چالکون ایزومراز (CHI) به نارینژنین تبدیل می‌شود. نارینژنین به‏وسیله گلیکوزیله شدن، آسیله شدن و متیله شدن سه حلقه خود به انواع دیگر تبدیل می‌شود (11).

ژن چالکون سنتاز(CHS) اولین بار در سلول‌های کشت شده جعفری (Petroselinum hortense) شناسایی شد که پروتئینی با وزن مولکولی حدود 42 کیلودالتون را کد می‌کند (12). ساختار ژن CHS در تاکسون‏های مختلف حفظ شده و دارای دو اگزون می‌باشد که توسط یک اینترون جدا شده اند (13). مکان اینترون کاملا حفظ شده اما به لحاظ اندازه در گونه‏های مختلف از کمتر از 100 تا چندین کیلو باز متغیر است (14). این آنزیم یک پلی‌کیتید سینتاز ویژه گیاهان می‌باشدکه به‏نام پلی‌کتید نوع III شناخته شده است و یک خانواده ژنی را شامل می‌شود که از نظر ساختاری و عملکردی مشابه یکدیگرند (15). تنش‌های محیطی مثل نور، پرتوی فرابنفش، آسیب دیدگی و زخم، پاتوژن‏ها و عصاره‌های قارچی باعث القای بیان آن می‌شوند (16).

ژن‏های رمز کننده چالکون سنتاز از طیف گسترده ای از گیاهان شامل خزه ها، سرخس‏ها، بازدانگان، دولپه‏ای و تک لپه‏ای‏ها جداسازی شده‏اند(17). آنزیم چالکون سنتاز که حاصل بیان ژن CHS می‌باشد به‏عنوان یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوشیمیایی ترکیبات فلاونوئیدی از اهمیت ویژه‏ای برخوردار است (18). فلاونوئید از جنبه­های گوناگون اثرات متنوعی بر زیست­شناسی گیاهان دارند و دامنه وسیعی از عملکردها را در فیزیولوژی، بیوشیمی، اکولوژی از قبیل حفاظت در مقابل شرایط نامساعد محیطی مانند خشکی، شوری، پرتو فرابنفش، آلودگی هوا، دگرآسیبی (آللوپاتی)، مقاومت در برابر پاتوژن‌ها، رنگ گل و جلب گرده‌افشان‌ها، هم‌زیستی و به‏عنوان مارکرهای بیولوژیکی در مطالعات کیموتاکسی، رشد نمو دانه‌های گرده و گیاه به‏طور کلی، انتقال قطبی اکسین و ... بر عهده دارند (21-19). از دیگر خصوصیات مهم و قابل توجه فلاونوئید ارزش غذایی و اهمیت دارویی آن‏ها برای انسان مانند خواص ضد سرطانی و آنتی‏اکسیدانتی می­باشند (19). تاکنون هیچ گزارشی در مورد توالی ژن (خانواده ژنی) چالکون سنتاز از گیاه استبرق منتشر نشده است. با توجه به نقش‌های اساسی ذکر شده برای این ترکیبات و نیز مقاومت بالای این گیاه در مناطق بسیار گرم و خشک و نیز خواص دارویی و رنگ خاص گل آن، مطالعه ساختار و عملکرد این ژن در گیاه مورد مطالعه دارای اهمیت می‌باشد. همچنین می‌توان با افزایش بیان آن، گامی موثر در یافتن راه‏کارهای کارآمد جهت افزایش تولید مواد موثره دارویی و ارزشمند این گیاه پیدا کرد.

 

مواد و روش‏ها

گیاه مورد استفاده:بذر استبرق (proceraCalotropis) از جنوب استان کرمان (شهرستان کهنوج) جمع آوری شد. در تیرماه، بذرها در گلدان‌هایی حاوی مخلوط 1:1 از خاک و ماسه کشت شدند. برای مطالعات مولکولی از بافت‌های تازه برگ و ساقه در مراحل جوانی (مرحله 2 تا 3 برگی) به‏روش زیر استفاده شد.

استخراج DNA ژنومی:DNA  ژنومی از برگ تازه گیاه استبرق با استفاده از کیت استخراج DNA (Qiagene, DNeasy Plant Mini Kit, Germany) به روش ذکر شده در کیت استخراج شد. برای بررسی حضور و ارزیابی خلوص DNA از روش بیوفتومتری (Eppendorf AG, Germany) و الکتروفورز افقی ( BIO-RAD powerpac, USA) روی ژل آگارز 1 درصد استفاده شد (22).

طراحی آغازگر‌:اولین مرحله در شناسایی ژن، طراحی آغازگر‌های مناسب و استفاده از آن‏ها در واکنش‌PCR  است. از آنجا که توالی ژن مورد نظر نامشخص بود، آغازگرها بر اساس توالی‌های ژن موجود از سایر گیاهان طراحی شدند. اگرچه اولویت با گیاهان هم جنس یا هم خانواده است اما از آنجا که تاکنون این ژن در هیچ گیاه هم جنس یا هم خانواده گیاه مورد مطالعه شناسایی نشده بود از توالی ژن چالکون سنتاز در گیاهان سایر خانواده‌ها استفاده شد.

به این منظور توالی ژن CHS در Catharanthus roseus (Accession no: AJ131813.1)، Eustoma grandiflorum (Accession no: AB078954.1)، Gentiana triflora (Accession no: D38043.1) و Solanum tuberosum (Accession no: U47738.1) از بانک ژن NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) گرفته شد. هم‏ردیفی توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار ClustalW2 صورت گرفت. براساس نقاط حفاظت شده موجود، آغازگرهایی با استفاده از نرم‏افزار GeneRunner طراحی گردیدند و سپس مناسب بودن آن‏ها به‏وسیله نرم‏افزار BLAST مورد بررسی قرار گرفت. توالی آغازگرها به‏صورت زیر می‌باشد:

F-CpCHS< 5′- CATGATGTACCAACAAGG -3′ >

R- CpCHS< 5′- TGAACAAAACACAAGCACT -3′ >

شکل 1 نشان دهنده ساختار ژن در سایر گیاهان و مکان تقریبی آغازگرهای اختصاصی طراحی شده است. سنتز آغازگرهای طراحی شده توسط شرکت تکاپوزیست صورت گرفت. طبق روش شرکت، محلول ذخیره و محلول کاری  با استفاده از آغازگرهای لیوفیلیزه تهیه شدند.

 

 

 

شکل 1: شکل شماتیک ژن CHS و محل تقریبی قرار گرفتن آغازگرهای طراحی شده.

 

 

شناسایی ژن چالکون سنتاز با PCR:به این منظور از DNA ژنومی استخراج شده به‏عنوان DNA الگو استفاده شد. برای PCR، مقدار 200 نانوگرم از DNA و 1 میکرولیتر از آغازگرهای پیش‏برنده و برگرداننده با غلظت نهایی 5/0 میکرومولار ، درون لوله لیوفیلیزه PCR (BIONEER, AccuPowerR PCR PreMix, Korea) ریخته و با آب دوبارتقطیر استریل به حجم 20 میکرولیتر رسانده و با پیپت کردن، به‏طور کامل مخلوط شد.        انجام PCR توسط ترموسایکلر مدل PTC  (1148MJ Mini Personal Termal Cycler BioRad, USA) و با مرحله واسرشتگی اولیه به‏مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‏گراد آغاز گردید و با انجام 30 چرخه با دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 دقیقه، دمای اتصال، 53 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 دقیقه و دمای طویل شدن، 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 دقیقه ادامه یافت و با مرحله طویل شدن یه مدت 8 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به اتمام رسید. پس از انجام PCR، کیفیت محصول برروی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد.

تخلیص و توالی‏یابی محصول PCR: به‏منظور تخلیص از روی ژل و  تعیین توالی قطعه تکثیر شده، 50 میکرولیتر از محصول PCR به‏همراه 20 میکرولیتر از آغازگرهای پیش‏برنده و برگرداننده به شرکت تکاپوزیست فرستاده شد.

آنالیز آماری

نتایج حاصل از تعیین توالی ابتدا با نـرم‌افزار‌های BLAST و ClustalW آرایه بندی شده و سپس توالی نوکلئوتیدی و توالی‌های برخی از ژن‌های CHS موجود در بانک ژن NCBI با استفاده از نرم‌افزار  DNAMAN 5.2.2 مقایسه و میزان یکسانی ‌آن بررسی شد. با استفاده از نرم افزار MEGA 6 و به‏روش Neighbor-joining درخت فیلوژنتیکی مربوط به ژن CHS در استبرق و 31 گونه گیاهی دیگر رسم گردید (جدول1).

نتایج

استخراج DNA ژنومی با کمیت و کیفیت مطلوب از نیازهای بنیادی پژوهش‌های مولکولی است. استخراج از بافت گیاه به‏علت حضور کربوهیدرات‌ها، تانن‌ها، ترکیبات پلی‌فنلی و پروتئین‌ها که بر کیفیت DNA اثر منفی می‌گذارد با مشکلاتی روبروست. برای تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده و خلوص آن و عدم شکستگی و مناسب بودن برای واکنش PCR، 6 میکرولیتر DNA استخراج شده با 1 میکرولیتر بافر بارگذاری و 1 میکرولیتر ژل رد درون چاهک ژل آگارز 1  درصد تخلیه و الکتروفورز افقی انجام شد. وجود تنها یک باند در نیم‏رخ الکتروفورزی، دلیلی بر کیفیت مطلوب DNA استخراج شده است. کمیت آن با دستگاه بیوفتومتر سنجیده شد که شاخص خلوص (Purity index) در تابش دو طول موج مختلف 260 به 280 نانومتر عدد 77/1 تا 02/2 را نشان می‌دهد که DNA ژنومی از کمیت مناسبی برخوردار است.

الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد نشان داد که قطعه اختصاصی برای ژن CHS به طول تقریبی 570 جفت باز به خوبی تکثیر شده است (شکل 2). این مطلب نشان دهنده طراحی و عملکرد صحیح آغازگر‌ها و برنامه PCR مناسب (به‏خصوص دمای اتصال) می‏باشد.

 

جدول 1: شماره بازیابی ژن‌های CHS متعلق به گونه‌ها‌ی مختلف

) با استفاده از سایت (NCBI

Accession

Number

گونه گیاهی

AF112086

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

KM878672

Calotropis procera (Ait.) R. Br.

AF112106

Capsella rubella Reut.

JN808444

Capsicum annuum L.

AJ131813

Catharanthus roseus (L.) G. Don

JX027616

Ceratopteris thalictroides (L.) Brongn.

EU410483

Citrus sinensis (L.) Osbeck

KJ135628

Dryopteris erythrosora (D.C.Eaton) Kuntze

AB030004

Equisetum arvense L.

AY647263

Ginkgo biloba L.

HQ142023

Ipomoea amnicola Morong

HM622754

Lilium hybrid

DQ507392

Lupinus luteus L.

KJ013407

Morus alba var. multicaulis (Perr.)Loudon

JQ796710

Narcissus tazetta var. chinensis M.Roem

KF927021

Nicotiana tabacum L.

KF935224

Olea europaea L.

AB058397

Oryza sativa L.

AB678720

Petunia x hybrida hort. ex E. Vilm

DQ275627

Physcomitrium patens (Hedw.) Mitt.

DQ371806

Picea abies (L.) H.Karst.

D88262

Pisum sativum L.

DQ371802

Populus alba L.

AB022682

Psilotum nudum (L.) Beauv.

AF144541

Sisymbrium irio L.

NM_001247107

Solanum lycopersicum L.

HQ659493

Solanum tuberosum L.

AB018074

Streptomyces griseus

AY286094

Thinopyrum ponticum Podp.

AF144535

Thlaspi arvense L.

AY286096

Triticum aestivum L.

AB015872

Vitis vinifera L.

 

 

شکل 2: تکثیر بخشی از ژنCHSدر گیاه استبرق توسط PCR. 1) محصول PCR 570 جفت بازی با استفاده از آغازگرهای F-CpCHS و R-CpCHS. (M نشانگر مولکولی DNA 1kb (Fermentase).

نتایج توالی یابی محصولات PCR: نتایج تعیین توالی نشان دهنده خوانش 572 نوکلئوتید مربوط به اگزون 2 ژن CHS در استبرق بود. این ژن با نام CpCHS و با شماره بازیابی (Accession no. KM878672) در بانک ژن NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) ثبت گردید. با استفاده از نرم افزار BLAST مشخص شد که CpCHS اولین توالی نوکلئوتیدی گزارش شده ژن چالکون سنتاز در زیر خانواده Asclepiadoideae است (شکل3).

بررسی هومولوژی این توالی با توالی‌های ژن CHS در برخی از گیاهان و با استفاده از نرم افزار DNAMAN 5.2.2 انجام شد. این نتایج نشان داد این توالی نوکلئوتیدی با توالی ژن CHS درArabidopsis thaliana(Accession no. NM_121396) 59 درصد و با Nicotiana tabacum (Accession no. KF927021)، Olea europaea (Accession no. KF935224) و Petunia x hybrida (Accession no. X04080) به‏ترتیب 63، 63 و 64 درصد یکسانی دارد. بیشترین یکسانی این توالی نوکلئوتیدی با توالی ژن CHS در catharanthus roseus (Accession no. AJ131813) و برابر با 68 درصد بود. ماتریس هومولوژی توالی نوکلئوتیدی CpCHS و گونه‌های ذکر شده، آورده شده است (شکل‌های4 و5).

تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی توالی CpCHS: رسم درخت فیلوژنتیکی مربوط به ژن CHS در استبرق و 31 گونه گیاهی دیگر (جدول1) و با استفاده از نرم افزار MEGA 6 و به‏روش Neighbor-joining صورت گرفت (شکل 6).

 

 

 

شکل 3: توالی نوکلئوتید و آمینواسید استنباطی ژن CpCHS در استبرق (Accession no. KM878672).

 

 

شکل 4: ماتریس همولوژی توالی نوکلئوتیدی CpCHS (Accession no. KM878672) و ژن CHS درArabidopsis thaliana(Accession no. NM_121396Nicotiana tabacum (Accession no. KF927021Olea europaea (Accession no. KF935224Petunia x hybrida (Accession no. X04080) و catharanthus roseus (Accession no. AJ131813) با استفاده از نرم افزار DNAMAN 5.2.2.

 

شکل 5: مقایسه توالی نوکلئوتیدی  CpCHS (Accession no. KM878672) و ژن‌ CHS درArabidopsis thaliana(Accession no. NM_121396Nicotiana tabacum (Accession no. KF927021Olea europaea (Accession no. KF935224Petunia x hybrida (Accession no. X04080) و Catharanthus roseus (Accession no. AJ131813) با استفاده از نرم افزار DNAMAN 5.2.2. نواحی سیاه رنگ نشان دهنده شباهت 100 درصد است.

 

شکل 6: درخت فیلوژنتیکی با استفاده از توالی نوکلئوتیدی ژن‌ چالکون سنتاز در گیاهان مختلف (جدول 1) با استفاده از نرم افزار MEGA 6 و روش Neighbor-joining. گیاه مورد مطالعه با کادر مشخص شده است.

 

بحث

فلاونوئیدها از جنبه‌های گوناگون اثرات متنوعی بر زیست‌شناسی گیاهان دارند و دامنه وسیعی از عملکردها را در فیزیولوژی، بیوشیمی، اکولوژی از قبیل حفاظت در مقابل نور ماورای بنفش، ایجاد رنگ گل‌ها و جذب گرده افشان‌ها، به‏عنوان سیگنال‌های مولکولی در برهم‏کنش گیاهان با محیط، به‏عنوان مارکرهای بیولوژیکی در مطالعات کیموتاکسی، دفاع و استحکام گیاه بر عهده دارند. از دیگر خصوصیات مهم و قابل توجه فلاونوئید ارزش غذایی و اهمیت دارویی آن‏ها برای انسان مانند خواص ضد سرطانی و آنتی‌اکسیدانتی می‌باشند. از دیگر نقش‌های آن‌ها در گیاهان می‌توان به نقش‌های ساختاری در بافت‌های محافظ‌، عامل جذب کننده حشرات گرده افشان، اشاره نمود (16 و 23).

اخیرا Kumar و همکاران (16) نشان دادند که فلاونوئیدها به‏عنوان ممانعت کننده تنش اکسیداتیو و تنظیم کننده رشد گیاهی عمل می‏کنند. تنش‏های زیستی و غیر زیستی متعددی منجر به تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) ناشی از تنش اکسیداتیو می‏شوند. بیوسنتز فلاونوئیدها به‏طور قابل توجهی تحت تنش اکسیداتیو افزایش می‏یابد. همچنین نقش آن به‏عنوان تنظیم کننده حرکت و کاتابولیسم اکسین گزارش شده است (16). در مسیر بیوسنتزی فلاونوئید واکنش بیوسنتزی بسیار مهم از تجمع سه مولکول مالونیل COA و یک مولکول P- کوماریل COA است که با دخالت آنزیم چالکون سنتاز (CHS) تولید چالکون می‌کند (24). با توجه به اینکه فلاونوئیدها در خزه‏ها و گیاهان آوندی یافت شده‏اند بنابراین انتظار می‏رود که ژن‏های کد کننده چالکون سنتاز یا آنزیم‏های شبه چالکون سنتاز در ژنوم خزه‏ها و گیاهان عالی حضور داشته باشند. تاکنون ژن‏های چالکون سنتاز متعددی از نوعی خزه، نهان‏زادان آوندی، بازدانگان و نهان‏دانگان کلون شده‏اند (13 و 25).

ژن‏های چالکون سنتازی که تاکنون در گیاهان بررسی شده‏اند دارای یک اینترون و دو اگزون هستند، به‏استثنای این ژن در Antirrhinum majus و Physcomitrellapatens که حاوی دو اینترون می‏باشند (26 و 25). ژن CHS درZea mays  نیز تنها دارای یک اگزون بوده و فاقد اینترون است (27). طول اینترون در Arabidopsis thaliana 85 جفت باز و در Ginkgo biloba119 جفت باز است (28 و 29). اینترون‌هایی با طول بلندتر نیز در سویا (645 جفت باز) و گردو (669 جفت باز) گزارش گردیده است (30 و 31). همچنین مشخص شده است که اینترون در بین کدون سیستئین در نواحی کد کننده که در تمام چالکون سنتازهای بررسی شده حفاظت می‏شود. اگزون شماره 1 حدود60 باقیمانده آمینواسیدی را کد می‏کند، درحالی‏که اگزون شماره 2 حدود 340 باقیمانده آمینواسیدی را کد می‏کند. تشابه بالای توالی و ساختار ژنی حفاظت شده پیشنهاد می‌کند که ژن‏های چالکون سنتاز ممکن است از یک جد مشترک منشا گرفته باشند (13).

در این پژوهش سعی شد تا ژن CHS در گیاه دارویی استبرق که دارای ترکیبات فلاونوئیدی بسیاری است، شناسایی شود. بدین منظور در ابتدا بر اساس نقاط حفاظت شده موجود در اگزون 2 توالی ژن‌های CHS در سایر گیاهان، آغازگرهای مناسب طراحی و در واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد نشان داد که قطعه اختصاصی برای ژن CHS به‏طول تقریبی 570 جفت باز به‏خوبی تکثیر شده است (شکل2). این مطلب نشان دهنده طراحی و عملکرد صحیح آغازگر‌ها می‏باشد. با توجه به مکان طراحی آغازگرها و قطعه تکثیر شده، به احتمال این قطعه مربوط به اگزون شماره 2 ژن CHS در گیاه استبرق می‌باشد. نتایج PCR و توالی‌یابی نشان دهنده تکثیر قطعه 572 جفت بازی متعلق به ژن CHS در گیاه استبرق (Calotropis procera) بود. بنابراین این ژن CpCHS نام گذاری شد.

هومولوژی قطعه 572 جفت بازی CpCHS و برخی دیگر از ژن‌های CHS در سایر گیاهان بررسی شد (شکل 5). نتایج نشان دهنده شباهت بیش از 59 درصدی این قطعه از ژن با سایر توالی‌ها بود. بیشترین شباهت (68 درصد) بین ژن CpCHS و ژن CHS در گیاه هم خانواده آن یعنی catharanthus roseus مشاهده شد (شکل 4). همچنین تجزیه و تحلیل نتایج BLASTاین توالی نشان می‏دهد که به‏ احتمال این قطعه متعلق به اگزون 2 ژن CpCHS می‌باشد. اگزون شماره 2 از لحاظ طول و توالی نوکلئوتیدی بیشتر از اگزون شماره1 حفاظت شده است. همچنین چهار باقیمانده آمینواسیدی که به‏عنوان جایگاه های فعال از لحاظ شیمیایی عمل می‏کنند، در اگزون شماره2 قرار گرفته‏اند و در تمام آنزیم‏های شناسایی شده حفاظت شده هستند (14).

درخت فیلوژنتیکی حاصل از هم‏راستایی ژن CpCHS و توالی ژن CHS در برخی دیگر ازگیاهان (جدول 1) رسم شد. توالی ژن CHS در باکتری Streptomyces griseus به‏عنوان Outgroup در رسم درخت استفاده شد. نتایج نشان دهنده تشکیل پنج شاخه اصلی شامل خزه، سرخس‌ها، بازدانگان، دولپه‌ای‌ها و تک لپه‌ای‌ها بود. CpCHS در شاخه دولپه‌ای‌ها قرار گرفته که خود این شاخه نیز بر اســاس گونه‌های گوناگـون به چند زیر شاخه تقسیم شده است. برای مثال ژن‌های چالکون سـنتاز متعـلق به A. thaliana، Capsella rubella، Sisymbrium irio و Thlaspi arvense که همگی متلق به خانواده Brassicaceae هستند در یک شاخه قرار گرفته ‌اند. یا گیاهان خانواده Solanaceae شامل Solanumtuberosum، Solanum lycopersicum، Capsicum annuum، Nicotiana tabacum و Petunia x hybrida که در یک شاخه قرار گرفته‌‌اند. این نتایج نشان می‏دهد که ژن CHSدر بین شاخه‌های مختلف گیاهی حفاظت شده است و از طرفی در هر گونه گیاهی دارای ویژگی‌‌های مشخص است. CpCHS نیز در شاخه ژن CHS متعلق به گیاه هم خانواده خود یعنی Catharanthus roseus قرار گرفته است که نشان دهنده جد مشترک احتمالی این دو گونه می‌باشد (شکل6).

مطالعات نشان می‌دهد که ژن چالکون سنتاز به‏صورت خانواده ژنی در گیاهان وجود دارد اما تاکنون تکامل ژن‌های چالکون در خانواده‏های مختلف نهاندان‏گان به‏طور گسترده مطالعه نشده است (13). بنابراین توالی یابی کامل ژن CHS و بررسی بیان آن در اندام‌ها و مراحل مختلف نمو گیاه می‌تواند نقش مهمی در شناسایی عملکرد و نقش این ژن در گیاه استبرق داشته باشد.

نتیجه‏گیری

عصاره ریشه، ساقه و برگ گیاه استبرق یک منبع مهمی از ترکیبات ثانویه مانند فلاونوئیدها است. فلاونوئیدها درگیاهان نقش‏های مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی، مانند تجمع رنگدانه در گل و حفاظت در برابر آسیب پرتوی فرابنفش و پاتوژن ایفا می‏کنند. چالکون سنتاز، آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها می‏باشد (13) در این پژوهش قطعه 572 جفت بازی متعلق به ژن CHS در گیاه استبرق شناسایی شد. این قطعه متعلق به اگزون 2 ژن CHS بوده و با نام CpCHS و شماره بازیابی (Accession no. KM878672) در بانک ژن ثبت شد. رسم درخت فیلوژنی نشان داد که CpCHS با ژن CHS گیاه Catharanthus roseus، گونه هم خانواده خود، در یک شاخه قرار دارد.

  1. Sennblad B, Bremer B. Classification of apocynaceae s.l. according to a new approach combining Linnaean and phylogenetic taxonomy. Systematic biology. 2002; 51(3): 389-409.
  2. Zaeifi M, Assadi M. Flora of Iran. Asclepiadaceae. Islamic Republic of Iran, Ministry of Agriculture; N: 28. 2000.
  3. Hassan SW, Bilbis FL, Ladan MJ, Umar RA, et al. Evaluation of Antifungal Activity and Phytochemical Analysis of leaves, Roots and stem bark extracts of Calotropis procera (Asclepiadaceae). Pakistan Journal of Biological Science. 2006; 9(14): 2624-2629.
  4. Ghahreman A. Cormophytes of Iran (plant systematic). Tehran: Publication of Center of University; 1994; 2: 841.
  5. Varshney A, Bhoi K. Cloth from bast fibre of the Calotropis procera (Aak) plant. Biological wastes. 1988; 26(3): 229-232.
  6. D'Souza RJ, Varun M, Masih J, Paul MS. Identification of Calotropis procera L. as a potential phytoaccumulator of heavy metals from contaminated soils in Urban North Central India. Journal of hazardous materials. 2010; 184(1): 457-464.
  7. Qureshi AA, Prakash T, Patil T, Viswanath Swamy AH, et al. Hepatoprotective and antioxidant activities of flowers of Calotropis procera (Ait) R. Br. in CCl4 induced hepatic damage. Indian journal of experimental biology. 2007; 45(3): 304-310.
  8. Khasawneh MA, Elwy HM, Fawzi NM, Hamza AA, et al. Antioxidant Activity, Lipoxygenase Inhibitory Effect and Polyphenolic Compounds from Calotropis procera (Ait.) R. Br. Research Journal of Phytochemistry. 2011; 5(2): 80-88.
  9. Sharma AK, Kharb R, Kaur R. Pharmacognostical aspects of calotropis procera (Ait.) R. Br. International Journal of Pharma and Bio Sciences. 2011; 2(3): 480-488.

10. Tiwari A, Singh S, Singh S. Chemical Analysis of Leaf Extracts of Calotropis procera. International Journal of Scientific and Research Publications. 2014; 4(1):  407-424.

11. Roslan ND, Tan C-S, Ismail I, Zainal Z. cDNA cloning and expression analysis of the chalcone synthase gene (CHS) from'polygonum minus. Australian Journal of Crop Science. 2013; 7(6): 777.

12. Reimold U, Kroger M, Kreuzaler F, Hahlbrock K. Coding and 3' non-coding nucleotide sequence of chalcone synthase mRNA and assignment of amino acid sequence of the enzyme. The EMBO journal. 1983; 2(10): 1801-1805.

13. Huang J-X, Qu L-J, Yang J, Yin H, et al. A preliminary study on the origin and evolution of chalcone synthase (CHS) gene in angiosperms. Acta botanica sinica-English Edition-. 2004; 46(1): 10-19.

14. Ferrer JL, Jez JM, Bowman ME, Dixon RA, et al. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis. Nature structural biology. 1999; 6(8): 775-784.

15. Eckermann C, Schroder G, Eckermann S, Strack D, et al. Stilbenecarboxylate biosynthesis: a new function in the family of chalcone synthase-related proteins. Phytochemistry. 2003; 62(3): 271-286.

16. Kumar S, Pandey AK. Chemistry and biological activities of flavonoids: an overview. TheScientificWorldJournal. 2013; 2013(2013): 162750.

17. Niesbach-Klösgen U, Barzen E, Bernhardt J, Rohde W, et al. Chalcone synthase genes in plants: a

 

tool to study evolutionary relationships. Journal of molecular evolution. 1987; 26(3): 213-225.

18. Bohm, Bruce A. 1998. Introduction to flavonoids: Australia: Harwood academic publishers. 1: 503.

19. Bourgaud, F, A Gravot, S Milesi, Gontier E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 2001; 161(5): 839-851.

20. Stoilova I, Krastanov A, Stoyanova A, Denev P, Gargova S. Antioxidant activity of a ginger extract (Zingiber officinale). Food chemistry. 2007; 102(3): 764-770.

21. Rezanejad F. Air pollution effects on structure, proteins and flavonoids in pollen grains of Thuja orientalis L.(Cupressaceae). Grana. 2009; 48(3): 205-213.

22. Sambrook J, Russell DW.Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 1: 628.

23. Forkmann G. Genetics of flavonoids. The Flavonoids: Springer; 1994; 537-564.

24. Lee YJ, Kim JH, Kim BG, Lim Y, et al. Characterization of flavone synthase I from rice. BMB Reports. 2008; 41(1): 68-71.

25. Jiang C, Schommer CK, Kim SY, Suh DY. Cloning and characterization of chalcone synthase from the moss, Physcomitrella patens. Phytochemistry. 2006; 67(23): 2531-2540.

26. Sommer H, Saedler H. Structure of the chalcone synthase gene of Antirrhinum majus. Molecular Genetics and Genomics. 1986; 202(3): 429-434.

27. Ma W, Wu Y, Wu M, Ren Z, et al. Cloning, characterization and expression of chalcone synthase from medicinal plant Rhus chinensis. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 2013; 24(1). 18-24.

28. Feinbaum RL, Ausubel FM. Transcriptional regulation of the Arabidopsis thaliana chalcone synthase gene. Molecular and Cellular Biology. 1988; 8(5): 1985-1992.

29. Pang Y, Shen G, Wu W, Liu X, et al. Characterization and expression of chalcone synthase gene from Ginkgo biloba. Plant Science. 2005; 168(6): 1525-1531.

30. Akada S, Kung SD, Dube SK. Nucleotide sequence of a soybean chalcone synthase gene with a possible role in ultraviolet-B sensitivity, Gmchs6. Plant Physiology. 1993; 102(2): 699-701.

31. Claudot A-C, Ernst D, Sandermann Jr H, Drouet A. Cloning and characterization of two members of the chalcone synthase gene family from walnut. Plant Physiology and Biochemistry. 1999; 37(1): 721-730.