تاثیر سیلیکون بر میزان بیان ژن پراکسیداز و صفات ریخت‌شناسی گیاه جو تحت تنش خشکی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، قزوین، ایران

2 کارشناس ارشد دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، قزوین، ایران

-

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی تاثیر سیلیکون بر شدت بیان ژن پراکسیداز و برخی صفات ریخت‌ شناسی آن در دو لاین مقاوم و حساس گیاه جو تحت تنش خشکی بود. مواد و روش‌ها: میزان پروتئین محلول کل، رنگدانه‌های فتوسنتزی، RNA کل از برگ‌های تیمارهای مختلف استخراج شد. ژن  هدف پس از ساخت cDNA با استفاده از RT-PCR به‌صورت نیمه‌کمی بررسی شد. همچنین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز  با روش Chance و پرولین نیز با روش Bates تحت تنش خشکی مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، آزمایشی به‏صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون –خشکی (2میلی‌مولار سیلیکات‌سدیم/ کیلوگرم خاک) با سه تکرار در گلخانه اجرا شد. نتایج: کاربرد سیلیکون در هر دو لاین، میزان پروتئین محلول کل و رنگدانه‌های فتوسنتزی را تحت شرایط تنش خشکی افزایش داد.  آنالیز نیمه‌کمی RT-PCR اختلاف معنی‌داری را بین تیمارها نشان داد. بیشترین میزان بیان ژن پراکسیداز در تیمار سیلیکون-خشکی مشاهده شد. افزایش فعالیت آنزیم‌های ضد‌اکسنده و بررسی الگوی باندی این آنزیم‌ها بر روی ژل آکریل‌آمید نشان داد که شدت باندها در تیمار سیلیکون بیشتر بود. میزان پرولین در شرایط تنش در مقایسه با تیمار شاهد افزایش یافت و با کاربرد سیلیکون افزایش بیشتری مشاهده شد. نتیجه‌گیری: سیلیکون به تاثیر کاهش خسارت اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن کمک می‌کند و با افزایش در فعالیت آنزیم‌های ضداکسنده، موجب حفاظت گیاه در برابر تنش‌های محیطی می‌شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


خشکی علت اصلی کاهش رشد گیاهان و عملکرد آن‏ها در مناطق خشک و نیمه­خشک محسوب شده و موجب تحریک سلسله پاسخ­های دفاعی در سطوح مختلف مولکولی، سلولی و فیزیولوژیکی می­شود (1). تنش خشکی با علائم کاهش محتوای آب، کم شدن پتانسیل آب برگ­ها، کاهش حالت تورم سلول­های نگهبان روزنه، بستن روزنه­ها و کاهش در توسعه و رشد سلول مشخص می­شود (2، 3 و 4). پیری، تنش­ و تحریکات رشدی در گیاه باعث افزایش مقادیر مختلف اکسیژن فعال از قبیل: آنیون سوپراکساید، پراکسیدهیدروژن، رادیکال هیدروکسیل و اکسیژن منفرد می­شود. این مولکول­های فعال موجب صدمه به ماکرومولکول­ها و نیز ساختار سلولی شده یا اینکه به‏عنوان مولکول منفرد موجب فعال شدن سلسله پاسخ­های دفاعی گیاه می­‏شوند. گیاهان از دو سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی برای دفاع در مقابل گونه­های اکسیژن فعال ((ROS Reactive Oxygen) (Species  استفاده می­کنند (5 و 6). سیستم آنزیمی شامل آنزیم‏های ضداکسنده مانند کاتالاز ((CAT، پراکسیداز (POX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربیت پراکسیداز ((APX و گلوتاتیون ردوکتاز(GR) بوده که وظیفه عمده این آنزیم­ها تجزیه پراکسید هیدروژن می­باشد (8،7). از پاسخ‏های بیوشیمیایی به تنش نیز می­توان به تجمع متابولیت­هایی که قابلیت انحلال داشته ولی متابولیسم طبیعی گیاه را مختل نمی­کنند، اشاره کرد. این مواد که به اسمولیت­ها معروف هستند شامل قندها و متابولیت­های دارای بار الکتریکی مثل گلایسین بتائین و اسیدهای آمینه­ای چون پرولین است (9، 10 و 11). تجمع پرولین در شرایط تنش شوری و بی­آبی صورت می­گیرد، به‏طوری‏که پرولین در بسیاری از گیاهان به‏عنوان نشانگر بیوشیمیایی برای تشخیص تحمل به تنش مورد استفاده قرار می­گیرد (12). پرولین یکی از تنظیم­کننده­های اسمزی است که موجب سازش سلول گیاهی برای زنده ماندن در شرایط تنش­زا و حفاظت آنزیم­ها و پروتئین­های غشایی در برابر تغییرات ساختاری می­شود. جهت حفظ لیپیدهای غشا از خسارت القا شده توسط رادیکال­های آزاد اکسیژن، افزایش پرولین مشاهده می­شود و با افزایش مقدار و فعالیت آنزیم­ها و پروتئین­های دفاعی، در حفظ ساختمان کلروپلاست دستگاه فتوسنتز و کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از تنش نقش دارد (13، 14 و 15). تجمع پرولین در سلول از طریق دو کاتالیز متوالی به‏وسیله پرولین-5-کربوکسیلات­ سنتتاز (P5CS) و پرولین-5-کربوکسیلات ردوکتاز(P5CR)  انجام می­شود. در واقع در شرایط تنش خشکی فعالیت آنزیم P5CS افزایش یافته و مقدار پرولین را در داخل سلول به‏حدی بالا می‏برد که از خسارت زیاد کم آبی به گیاه جلوگیری می‏کند (16). سیلیکون بعد از اکسیژن دومین عنصر فراوان در خاک است. دی­اکسیدسیلیکون دربرگیرنده 50 تا 70 درصد توده خاک است، در نتیجه همه­ی ریشه­ گیاهان در خاک مقداری سیلیکون در بافت خود دارند (17). با این‏حال نقش سیلیکون در رشد و توسعه گیاهان نادیده گرفته شده است. از آنجایی‏که فراوانی این عنصر به‏دلیل نشانه­های قابل مشاهده در طبیعت، کمبود و یا سمی بودن آن آشکار نیست، به‏نظر می­رسد فیزیولوژیست‏های گیاهی تا حدودی آن را نادیده گرفته اند. سیلیکون در ریشه­ها به‏فرم سالیسیک اسید جذب می­شود. گیاهان مختلف در جذب سیلیکون مقادیر متفاوتی از 1/0 تا 10 درصد وزن خشک را از خود نشان می­دهند (18). نقش سیلیکون در کاهش خسارت اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی در غلات به اثبات رسیده است. اخیرا در پژوهش­های صورت گرفته به اثرات مفید و حاصل‏خیزی سیلیکون در زمان بروز تنش‏های محیطی که با افزایش در فعالیت آنزیم‏های ضداکسنده و بالا رفتن محتوای اسمولیت‏ها، نقش مهمی را در ایجاد تحمل به تنش­های زنده و غیر زنده در گیاهان ایفا می­کند، اشاره شده است. این ماده همچنین با کاهش در میزان کاربرد علف کش­ها و مواد سمی، مانع از آلودگی محیط زیست از اثرات مضر ناشی از استعمال سموم کشاورزی می­شود (19، 20، 21 و 22).

جو یکی از مهم­ترین غلاتی است که در بسیاری از کشورهای جهان کاشته می­شود. در این کشورها جو بیشتر در مزرعه و در شرایط دیم کشت می­شود و اغلب تحت تاثیر کمبود شدید آب در طی فصول خشک قرار می­گیرد. بنابراین تنش خشکی یکی از مشکلات اساسی تولید جو در این مناطق می­باشد و شناسایی راه­های افزایش محصول و کاربرد موادی که در بالا بردن مقاومت گیاهان به این تنش­ها موثر هستند، ضروری می­باشد. بدین‏منظور در این تحقیق، تاثیر سیلیکون بر محتوای پروتئین محلول کل، رنگدانه­های فتوسنتزی، میزان بیان ژن POX، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و پرولین در دو لاین جو با تحمل متفاوت به خشکی در شرایط گلخانه بررسی شد.

 

مواد و روش‏ها

در این بررسی از دو لاین گیاه جو دوردیفه                             (Hordeum) vulgare L. با تحمل متفاوت به خشکی به‏نام 20315-CB (مقاوم) و 20213CB- (حساس) تهیه شده از بخش تحقیقات غلات موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج استفاده شد. این تحقیق بر اساس طرح کاملا تصادفی در سه تکرار با سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون- خشکی در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) در سال‏های 1392 تا 1393 مورد ارزیابی قرار گرفت. بذرها پس از ضد عفونی به‏مدت 10 دقیقه در هیپوکلریت­سدیم یک درصد، در گلدان­های پلاستیکی حاوی خاک زراعی معمولی در شرایط گلخانه کاشته شدند. میانگین دما در طی رشد (2±25 درجه سانتی‏گراد) و طول روز تقریبا 10 ساعت بود. تنش خشکی با کار گذاشتن بلوک گچی در گلدان­ها کنترل شد. نمونه­برداری در مرحله چهار برگی زمانی که پتانسیل آب خاک در تیمارهای خشکی و سیلیکون- خشکی به 1- مگاپاسگال رسید، انجام شد. نمونه­های یک گرمی از برگ­های سالم هر بوته برداشت شده و پس از انجماد فوری در نیتروژن مایع در فریزر 80 – درجه سانتی‏گراد به‏منظور استفاده در سنجش­های بعدی نگه‏داری شد.

سنجش میزان پروتئین محلول کل و رنگدانه­های فتوسنتزی: استخراج پروتئین با استفاده از 100 میلی­گرم پلی‏وینیل­پیرولیدن در حضور 3 میلی­لیتر بافر استخراج (بافر فسفات­پتاسیم 50 میلی­مولار با 7pH= و سدیم متابای‏بی‏سولفیت 1 میلی­مولار) صورت گرفته و پس از سانتریفیوژ به‏مدت 25 دقیقه در 15000 rpm  و دمای 4+ سانتی‏گراد توسط دستگاه سانتریفیوژ رومیزی (Allegra 64R-Beckman Coulter)، عصاره با 25 درصد حجم از گلیسرول 50 درصد (v/v) ترکیب و در دمای 80- درجه سانتی‏گراد تا زمان مصرف ذخیره شد. میزان پروتئین محلول کل با دستگاه اسپکتروفوتومتر (UV-3200-Labomed) به­روش Bradford سنجش شد (23). جهت اندازه­گیری میزان غلظت پروتئین نمونه­های گیاهی، با استفاده از غلظت­های مختلف پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA)، منحنی استاندارد رسم شد. سپس 20 میکرولیتر از نمونه­های عصاره آنزیمی با یک میلی­لیتر معرف بردفورد 20 درصد مخلوط شده و میزان جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر قرائت شد. جهت سنجش ژلی پروتئین محلول کل از ژل  SDS-PAGEبه‏روش لاملی استفاده شد. برای استخراج و اندازه­گیری میزان کلروفیل نیز از روش Arnon استفاده شد (24).  بدین‏منظور 200 ماکرولیتر بافت خرد شده برگ را با 800 ماکرولیتر استون 100 درصد v/v)) مخلوط کرده و مخلوط حاصله به‏آرامی ورتکس شده و به‏مدت یک ساعت در فریزر 20- درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. سپس نمونه­ها با دور rpm 13000 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. در ادامه محلول رویی را برداشته و برای اندازه­گیری میزان کلروفیل از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده گردید. مقا­دیر جذب در طول موج­های 645A= و 663= B نانومتر قرائت شده و اعداد به‏دست آمده در فرمول­های زیر بر حسب (µg/ml) محاسبه گردید.

(A× (2.96– (B×12.7) =کلروفیل  a

B)×4.68) – (A×22.9) =کلروفیل b

(B×+ (8.02 (A×20.2) =کلروفیل کل

استخراج RNA: استخراج RNA توسط کیت RNX-plus شرکت سیناکلون از نمونه­های برگ فریز شده، طبق دستورالعمل صورت گرفت. کیفیت RNA استخراج شده توسط الکتروفورز روی ژل 5/1 درصد تایید شد. تشکیل دو باند RNA ریبوزومی 28S و 18S در روی ژل نشان­­دهنده کیفیت سلامت RNA تخلیص شده بود. برای بررسی کمی میزان استخراج از اسپکتروفتومتر استفاده شد. در مرحله بعد RNA استخراج شده با آنزیم DNase1 بر اساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز تیمار شد.

ساخت cDNA: تهیه cDNA با استفاده از کیت RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase  شرکت سیناکلون صورت گرفت. 1/0 تا 5 میکروگرم از محلول RNA کل به‏همراه 1 میکرولیتر Oligo-dT و 6 میکرولیتر آب دیونیزه درون میکروتیوپ مخلوط گردید. سپس به‏مدت 5 دقیقه در دمای 65+ درجه سانتی‏گراد و بلافاصله به‏مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد. مقدار 2 میکرولیتر از محلول بافر واکنش، 1 میکرولیتر از آب دیونیزه، 2 میکرولیتر از مخلوطdNTP  و 1 میکرولیتر از آنزیم RT به مخلوط واکنش اضافه شد. تیوپ­ها به‏مدت 60 دقیقه در دمای 45+ درجه سانتی‏گراد قرار گرفته و سپس به‏منظور توقف واکنش در دمای 70+ درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. نمونه­ها تا زمان مصرف در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند.

طراحی آغازگرها برایکمیتسنجىباواکنشزنجیرهاىپلیمراز: برای طراحی آغازگرها ابتدا توالی ژن­ پراکسیداز و ژن خانه­دار اَکتین از بانک اطلاعاتی NCBI گرفته شد و سپس با استفاده از نرم­افزار Oligo5 آغازگرهای مورد نظر طراحی شد (جدول1). واکنش PCR جهت بررسی سنتز cDNA در 35 چرخه دمایی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد. شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای94 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 53 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت 30 ثانیه، مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت 20 ثانیه بود .مرحله واسرشتگی اولیه در دمای94 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت سه دقیقه و مرحله تکثیر نهایی در دمای72 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت یک دقیقه انجام گرفت. نمونه­ها روی ژل آگارز 2/1 درصد (W/V) بارگذاری شدند و پس از الکتروفورز، عکس­ ژل­ها با استفاده از برنامه Image J آنالیز شدند.

 

 

 

جدول 1: مشخصات آغازگرها

TM  (درجه سانتی‏گراد)

طول قطعه

توالی آغازگر (5´-3´)

نام آغازگر

58/32

57/25

132

AGC TGT CAC CAA ACT TCC AC

AAC AGT CGT GGA AGA GGA TG

POX

58/01

51/08

143

ACC CAA AAG CCA ACA GAG AG

ACC ATC ACC AGA GTC GAG AA

ACTIN

 

 

سنجش فعالیت پراکسیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از روشChance  به­وسیله­ اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد (25). مخلوط واکنش شامل 750 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 70 میلی­مولار با 7pH=، محلول بافر فسفات پتاسیم 100 میلی­مولار با 7pH=، 750 میکرولیتر آب مقطر استریل شده، 750 میکرولیتر گوئیکول 10 میلی­مولار محلول در آب مقطراستریل بود. فعالیت آنزیم پراکسیداز در طول موج 470 نانومتر و در زمان واکنش 180 ثانیه، اندازه­گیری شد. برای سنجش این آنزیم روی ژل از روش Hart و همکاران استفاده گردید (26). در این روش ژل جداکننده 10 درصد و ژل متراکم کننده 4 درصد مورد استفاده قرار گرفت.

سنجش پرولین: استخراج پرولین از روش Bates و همکاران با استفاده از بافت تر برگی و معرف ناین هیدرین اسید انجام شد (27). غلظت پرولین نمونه­ها از روی منحنی استاندارد و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 520 نانومتر تعیین گردید.

آنالیز آماری

این تحقیق به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون –خشکی انجام شد. آنالیز داده­ها با استفاده از نرم­ افزار SPSS16 صورت گرفت و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال مربوطه و رسم نمودارها با استفاده از نرم­افزار Excel انجام شد.

نتایج

در این تحقیق، اثر لاین، تیمار و اثر متقابل لاین در تیمار برای پروتئین محلول کل، رنگدانه­های فتوسنتزی، بیان نیمه­کمی ژن POX و میزان فعالیت پراکسیداز و پرولین مورد بررسی قرار گرفت که خلاصه تجزیه واریانس داده­ها برای صفات مختلف در جدول 2 ارائه شده است.

 

جدول2: میانگین مربعات صفات مورد آزمایش

پرولین

کلروفیل کل

کلروفیل b

کلروفیل a

پروتئین محلول کل

فعالیت پراکسیداز

Gene POX

درجه آزادی

منابع تغییرات

262/358**

1/568**

0/690**

0/168**

8/547**

1/814**

291/136**

1

لاین

5108/797**

7/342**

2/979**

0/963**

61/345**

2/055**

342/610**

2

تیمار

26/922*

0/006ns

0/025ns

0/009ns

0.000ns

0/270**

21/837**

2

لاین× تیمار

4/497

0/016

0/029

0/012

0/356

0/026

1/180

12

خطا

2/15

5/86

3/13

10/21

8/29

4/33

12/77

 

  ضریب تغییرات

 

تحت تنش خشکی، میزان پروتئین کل نسبت به شاهد در هر دو لاین به­طور معنی­داری کاهش یافت. کاهش محتوای پروتئین محلول کل در تیمار خشکی نسبت به شاهد در لاین مقاوم و حساس به ترتیب به میزان 2/6 و 21/6 mg/g.FW بود. در حالی که کاربرد سیلیکون میزان پروتئین محلول کل را افزایش داد. تحت تاثیر این تیمار میزان کاهش پروتئین محلول کل نسبت به شاهد 76/1 و 78/1 mg/g.FW بود. تفکیک باندهای پروتئینی نشان­دهنده کاهش میزان پروتئین آنزیم روبیسکو در اثر تنش خشکی می­باشد ولی با کاربرد سیلیکون شدت باندهای پروتئینی نسبت به خشکی افزایش یافت (شکل 1).

 

سیلیکون خشکی شاهد   سیلیکون خشکیشاهد                                  KDa       

116

2/66

45

35

25

4/18

 

4/14

 

                   

 

شکل 1: تغییرات محتوای پروتئین کل (سمت چپ) و باندهای پروتئین محلول کل بر روی ژل SDS-PAGE در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی در دو لاین مقاوم و حساس.

          

 

میزان رنگدانه­های فتوسنتزی تحت تیمار خشکی به­طور معنی‏داری کاهش یافت. در تیمار خشکی کاهش محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در مقایسه با تیمار شاهد در لاین مقاوم به‏ترتیب  74/0، 43/1 و 19/2 mg/g.FW و در لاین حساس به میزان 86/0، 29/1 و 17/2 mg/g.FW بود.  سیلیکون باعث کاهش خسارات ناشی از تنش شده و میزان رنگدانه­های فتنوسنتزی در اثر سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی به­طور معنی­داری افزایش یافتند. به­طوری‏که میزان کاهش محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در مقایسه با تیمار شاهد در لاین مقاوم به‏ترتیب 41/0، 3/0 و 71/0 mg/g.FW و در لاین حساس به میزان 39/0، 41/0 و 81/0 mg/g.FW بود (شکل 2). نتایج حاصل از سنجش بیان ژن POX به­صورت نیمه­کمی اختلاف معنی­داری را بین تیمارهای مختلف، دو لاین و اثر متقابل لاین×تیمار در سطح احتمال یک درصد نشان داد (شکل 3). میزان بیان ژن POX در تیمار سیلیکون-خشکی در هر دو لاین نسبت به تیمارهای دیگر افزایش داشته و در لاین CB-20315 میزان بیان ژن نسبت به لاین CB-20213 بیشتر بود. تجزیه واریانس داده­ها (جدول 2) برای میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تنش خشکی اختلاف معنی­داری را بین تیمارهای مختلف، دو لاین و اثر متقابل لاین×تیمار در سطح احتمال یک درصد نشان داد. تحت تاثیر تیمار خشکی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به شاهد در هر دو رقم به­طور معنی­داری افزایش پیدا کرد (شکل4). در این تحقیق سیلیکون باعث افزایش معنی­داری در میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در هر دو رقم گردید، به­طوریکه افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تیمار سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی معنی­دار بود. همچنین در تغییراتی که در مورد فعالیت آیزوزایم­های آنزیم پراکسیداز بر روی ژل اکریل آمید مشاهده شد نشان داد که تحت تیمار خشکی و سیلیکون-خشکی شدت باندها نسبت به تیمار شاهد بیشتر است که با نتایج حاصل از سنجش اسپکتروفتومتری انطباق داشت. محتوای پرولین در تیمارهای خشکی و سیلیکون + خشکی به­طور معنی­داری افزایش یافت. افزایش محتوای پرولین تحت تیمار خشکی و سیلیکون + خشکی نسبت به شاهد در لاین مقاوم به میزان 2/46 و 67/59  U mol/g.FWو در لاین حساس به میزان 11/40 و 52/51  U mol/g.FWبود. سیلیکون باعث افزایش میزان پرولین تحت تنش خشکی گردید (شکل 5).

 

 

    

 

شکل 2: تغییرات محتوای رنگدانه­های فتوسنتزی در تیمارهای شاهد، خشکی وسیلیکون+خشکی در لاین مقاوم و حساس.

 

 

 

 

سیلیکون   خشکی    شاهد    سیلیکون    خشکی   شاهد

POX

ACTIN

                                

شکل 3: بیان ژن POX تحت تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی در دو لاین مقاوم و حساس.

 

  سیلیکون    خشکی   شاهد    سیلیکون   خشکی   شاهد

 

                       

شکل 4: تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز (سمت چپ) و فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از ژلNative- PAGE  در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی.

 

 

 شکل 5: تغییرات محتوای پرولین در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی.

 

 

بحث

در برخی از منابع پیشنهاد شده است که سیلیکون می­تواند تحمل به خشکی را در گیاهان افزایش دهد. بدین‏منظور در این تحقیق اثرات سیلیکون بر تنش خشکی در دو لاین گیاه جو بررسی شد. در نتایج تحقیق ما مشاهده شد که در هر دو رقم تیمار خشکی سبب کاهش میزان پروتئین می­شود که این کاهش توسط سیلیکون به­طور قابل توجهی جبران گردید. Ahmad  Tale و همکاران در آزمایشی اثر سیلیکون را در گیاه گندم تحت تنش خشکی در سه مرحله رشدی مورد بررسی قرار دادند. به این‏منظور از سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون-خشکی استفاده کردند. نتایج نشان داد که در تیمار سیلیکون + خشکی، سیلیکون مانع از کاهش پروتئینی در شرایط تنش می‏شود. به‏نظر می­رسد که افزایش در میزان پروتئین محلول در تیمار سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی، به‏دلیل سنتز پروتئین­های جدید و یا افزایش سطح پروتئین­های مرتبط با سازگاری و تطابق گیاه با تنش خشکی می­باشد که می­توان به آنزیم­های ضداکسنده اشاره کرد که در تیمار سیلیکون به‏میزان زیادی افزایش پیدا کرده است (7). کمبود آب به‏علت کاهش دادن رنگدانه­های فتوسنتزی، کاهش در فعالیت آنزیم­های فتوسنتزی به ویژه آنزیم روبیسکو، کاهش فتوسنتز و رشد، نتیجه خود را به‏صورت کاهش عملکرد نمایان می­سازد. در تحقیقات مختلف بین میزان فتوسنتز برگ و محتوای کلروفیل در واحد سطح همبستگی مثبتی به‏دست آمده است. در این تحقیق خشکی سبب کاهش میزان رنگدانه­های فتوسنتزی گردید، اما کاربرد سیلیکون سبب افزایش میزان کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل گردید. در آزمایش انجام شده توسط  Shenو همکاران (28)، اثر سیلیکون و اشعه ماوراء بنفش را در جوانه­زنی گیاه لوبیا در شرایط تنش خشکی مطالعه کردند. نتایج نشان داد که تنش خشکی سبب کاهش رنگدانه­های فتوسنتزی می­شود که با افزودن تیمار سیلیکون خسارات ناشی از تنش اکسیداتیو به رنگدانه­های فتوسنتزی کاهش می­یابد. آن‏ها نشان دادند که سیلیکون باعث افزایش محتوای کلروفیل و در نهایت افزایش فتوسنتز شد. نتایج نشان داد که سیلیکون میزان بیان ژن pox  و نیز میزان فعالیت آنزیم را نسبت به تیمار خشکی و شاهد افزایش می­دهد. این نتایج  با نتایج محققین دیگر مشابه بود. Bai و همکاران (29) تحت شرایط تنش خشکی تاثیر سیلیکون بر میزان فعالیت آنزیم­های ضداکسنده را در گیاه ذرت بررسی کردند. تحت شرایط تنش خشکی تغییر معنی­داری بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با نمونه­های شاهد مشاهده نگردید. ولی سیلیکون باعث افزایش در میزان فعالیت آنزیم­های ضداکسنده CAT،SOD ، APX و POX در هر دو رقم شد. به‏طوری‏که افزایش فعالیت این آنزیم­ها در تیمار سیلیکون+خشکی در مقایسه با تیمار خشکی معنی­دار بود. Sharma و همکاران (1) افزایش در فعالیت آنزیم پراکسیداز در اثر تنش خشکی در برنج را نیز گزارش کردند. در بررسی­هایی که بر روی برنج در مرحله نشاء صورت گرفت، مشخص شد که افزایش فعالیت پراکسیداز در گیاهان تحت تنش خشکی با واکنش­های اکسیدکننده به‏وجودآورنده رادیکال­های آزاد و پراکسیدهای آلی همبستگی دارد و POX نقش موثری در پاکسازی H2O2 دارد. در آزمایش اثرات سیلیکون بر گیاه لوبیا توسط Polanco و همکاران (30)، غلظت سیلیکون در برگ­های گیاهان تحت تیمار سیلیکون در مقایسه با گیاهان شاهد به‏میزان 33 درصد افزایش یافت. جذب کربن خالص، سرعت هدایت روزنه­ای، مقدار تعرق و فعالیت آنزیم­های ضداکسنده در گیاهان تحت تیمار سیلیکون نسبت به گیاهان شاهد بالاتر بود. نتایج نشان داد که سیلیکون مقاومت گیاهان را با افزایش فعالیت آنزیم­های ضداکسنده افزایش ­می­دهد. سیلیکون باعث افزایش قابل توجه­ای در میزان پرولین در شرایط تنش خشکی می‏شود. اخیرا به نقش حفاظتی پرولین در جلوگیری از مرگ سلولی ایجاد شده توسط تنش­های اکسیداتیو توجه زیادی شده است. در این تحقیق در شرایط تنش خشکی میزان پرولین افزایش یافت، ولی با کاربرد سیلیکون افزایش قابل ملاحظه­ای در میزان تجمع پرولین در شرایط تنش خشکی مشاهده شد. Ozturk و همکاران (31) نیز اثرات تنش شوری بر میزان پرولین در برگ‏های نخود در شرایط مزرعه مورد آزمایش قرار دادند. نتایج آزمایش نشان داد که تنش شوری موجب افزایش محتوای پرولین، ولی در مقابل باعث کاهش میزان H2O2 می­شود. توانایی پرولین به­واسطه تنظیمات اسمزی، ایجاد ثبات در ساختارهای سلولی و رادیکال­های آزاد به­خوبی شناخته شده است و افزایش پرولین نقش مهمی در حفاظت از آنزیم­های دخیل در سیستم‏های آنتی­اکسیدانتی در برابر اثرات مخرب تنش شوری دارد. کاهش در میزان H2O2 به­علت افزایش فعالیت آنتی‏اکسیدانت­های آنزیمی و غیرآنزیمی می­باشد که نقش مهمی را در حفاظت گیاهان از تنش­های محیطی بازی می­کنند. در آزمایشی دیگر Moussa (32) اثر سیلیکون را در شرایط تنش شوری در گیاه ذرت مورد مطالعه قرار داد. میزان پرولین در تیمار شوری و تیمار سیلیکون بدون NaCl افزایش یافت، ولی در اثر تیمار سیلیکون-شوری تجمع میزان پرولین در مقایسه با نمونه شاهد معنی­دار نشد.

نتیجه گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان می­دهد که سیلیکون با افزایش بیان و فعالیت آنزیم­های ضداکسنده تحت اثر تنش خشکی و کاهش محتوای رادیکال­های آزاد در سلول، مانع از خسارات اکسنده به سلول­های گیاه جو می­شود. همچنین سیلیکون موجب افزایش میزان پروتئین محلول کل، رنگدانه­های فتوسنتزی و میزان تجمع پرولین در هنگام تنش خشکی در این گیاه شد. در نتیجه سیلیکون می­تواند در بهبود تحمل گیاه جو نسبت به تنش خشکی نقش داشته باشد. با توجه به اینکه این پژوهش در شرایط گلخانه­ای انجام شد، پیشنهاد می­شود که در شرایط مزرعه و در شرایط تنش­های مختلف محیطی نیز مورد ارزیابی قرار بگیرد و مقادیر مختلف این عنصر بر روی این گیاه یا گیاهان دیگر برای تولید گیاهان مقاوم به تنش استفاده گردد.

 

  1. Sharma P, Dubey RS. Drought induces oxidative stress and enhances the activities of antioxidant enzymes at growing rice seedlings. Plant Growth Regulation. 2005; 46(3): 209-221.
  2. Anjum SA, Xie XY, Wang LC, Saleem MF, et al. Morphological, physiological and biochemical responses of plants to drought stress. African Journal of Agricultural Research. 2011; 6(9): 2026-2032.
  3. Ashraf M. Inducing drought tolerance in plants: recent advances. Biotechnology advances. 2010; 28(1): 169-183.
  4.  Jaleel CA, Manivannan P, Wahid A, Farooq M, et al. Drought stress in plants: A review on morphological characteristics and pigmentscomposition. International Journal of Agriculture & Biology. 2009; 1814- 959608(305): 100-105.
  5. Srivalli S, Khanna-Chopra R. Delayed wheat flag leaf senescence due to removal of spikelets is associated with increased activities of leaf antioxidant enzymes, reduced glutathione/oxidized glutathione ratio and oxidative damage to mitochondrial proteins. Plant Physiology and Biochemistry. 2009; 47:663-670.
  6. Ariano S, Bartolomeo D, Cristos X, Andras M. Antioxidant defences in Olive trees during drought stress: changes in activity of some antioxidant enzymes. Functional Plant Biology. 2005; 32:45-53.
  7. Tale Ahmad S, Haddad R, Study of silicon effects on antioxidant enzyme activitie and osmotic adjustment of wheat under drought stress. Czech Journal of Genetics and Plant Breed. 2011; 47(1): 17-27.
  8. Vinocur B, Altman A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current opinion in biotechnology. 2005; 16(2): 123-132.
  9. Yamchi A, Rastegari jazi F, Ghobadi S, Mosavi A, et al. Abundant expression of p5cs gene with the aim of increasing resistance to osmoti stresses in transgenic tobacco plants. Science and Technology of Agriculture and Natural Resources. 2004; 4: 31-39.
 

10. Rains D.W. Plant tissue and protoplast culture: application to stress physiology and biochemistry. In: Jones, H.G., Flowers, T.J., Jones, M.B. (eds.), Plants Under Stresses: Biochemistry, Physiology and Ecology and their Application to Plant Improvement. Cambridge University Press, Cambridge. 1989; pp: 181–196.

11. Hsu SY, Hsu YT, Kao CH. The effect of polyethylene glycol on proline accumulation in rice leaves. Biol. Plant. 2003; 46: 73–78.

12. Srinivas V, Balasubramanian D. Proline is a protein-compatible hydrotrope. Langmuir. 1995; 11(7): 2830–2833.

13. Yancey P.H. Compatible and counteracting solutes. In: Strange, K. (eds.), Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. CRC Press, Boca Raton, FL. 1994; pp: 81–109.

14. Kavi Kishore PB, Sangam S, Amrutha RN, Laxmi PS, et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Curr. Sci. 2005; 88(3): 424–438.

15. Ashraf M, Foolad M. Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance. Environmental and Experimental Botany. 2007; 59(2): 206-216.

16. Delauney AJ, Verma DPS. Proline biosynthesis and osmoregulationin plants. Plant J. 1993; 4(2): 215–223.

17. Balakhnina T, Borkowska A. Effects of silicon on plant resistance to environmental stresses: review. International Agrophysics. 2013; 27(2): 225-232.

18. Lovering TS, Engel C. Significance of accumulator plants in rock weathering. Bulletin of the Geological Society of America. 1959; 70(12): 781–800.

19. Sonobe K, Hattori T, An P, Tsuji W, et al. Diurnal variations in photosynthesis, stomatal conductance and leaf water relation in sorghum grown with or without silicon under water stress. Journal of plant nutrition. 2009; 32(3): 433-442.

20. Liu JJ, Lin SH, Xu PL, Wang XJ, et al. Effects of exogenous silicon on the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation in chilling-stressed cucumber leaves. Agricultural Sciences in China. 2009; 8: 1075-1086.

21. Lee SK, Sohn EY, Hamayun M, Yoon JY, et al. Effect of silicon on growth and salinity stress of soybean plant grown under hydroponic system. Agroforestry systems. 2010; 80(3): 333-340.

22. Ma JF, Yamaji N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in plant science. 2006; 11(8): 392-397.

23. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976; 72:  248-254.

24. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology. 1949; 24(1):1-15.

25. Chance B, Maehly AC. Assay of catalases and peroxidases. Methods in enzymology. 1955; 2: 764-775.

26. Hart MA, Tyson H. Bloomberg R. Measurement of activity of peroxidase isoenzymes in flax (Linum usitatissimum). Canadian Journal of Botany. 1971; 49: 2129-2137.

27. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and soil. 1973; 39: 205-207.

28. Shen X, Zhou Y, Duan L, LI Z, et al. Silicon effects on photosynthesis and antioxidant parameters of soybean seedlings under drought and ultraviolet-B radiation. Journal of plant physiology. 2010; 167(15): 1248-1252.

29. Bai L, Sui F. Effect of soil drought stress on leaf of maize. Pedosphere. 2006; 16(3): 326-332.

30. Polanco LR, Rodrigues FA, Nascimento KJT, Cruz MFA, et al. Photosynthetic gas exchange and antioxidative system in common bean plants infected by Colletotrichum lindemuthianum and supplied with silicon. Tropical Plant Pathology. 2014; 39(1): 35-42.

31. Ozturk L, Demir Y, Unlukara A, Karatas I, et al. Effects of long-term salt stress on antioxidant system, chlorophyll and proline contents in pea leaves. Rom Biotech Lett. 2012; 17: 7227-7236.

32. Moussa HR. Influence of exogenous application of silicon on physiological response of salt-stressed maize (Zea mays L.). International Journal of agriculture and Biology. 2006; 8(2): 293-297.