تاثیر ایجاد تغییرات اپی‌ژنتیکی با کوچک ‌مولکول‌ها بر بیش‌بیان ژن به‏روش لنتی‌ویروسی در سلول‌های بنیادی جنینی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک، تهران، ایران

2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‏های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلول‏های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران

-

چکیده

هدف: در این مطالعه کارایی روش انتقال ژن به روش لنتی‌ویروسی و بیش‌بیان ژن با پروموتر سایتومگالوویروس (CMV) بررسی و تاثیر کوچک‌‌مولکول (small molecules)‌ های مهارکننده مسیرهای اپی‌ژنتیکی بر بیش‌بیان ژن ارزیابی شده‌است. مواد و روش‌ها: سلول‌های ES  موشی با مقادیر مختلف لنتی‌ویروس بیان کننده پروتئین فلورسنت سبز (green fluorescent protein; GFP) تراریخت شده و درصد سلول‌های بیان‌کننده GFP با روش فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد. ماندگاری بیان GFP در مدت هشت روز بررسی گردید. به‌کمک لنتی‌ویروس بیان‌کننده ژن فاکتور رونویسی پانکراسی و دئودنومی 1 (Pdx1)، تاثیر تیمار کوچک‌مولکول‌های 5-آزاسایتادین (5-AZA)، DZNep و BIX01294  بر سیستم بیانی ارزیابی شد. نتایج: انتقال لنتی‌ویروسی ژن به سلول‌های ES با استفاده از ضریب آلوده‌سازی (Multiplicity of infection; MOI) 10 و 20 موجب تراریخت شدن بیش از 90 درصد این سلول‌ها شد. با این‌حال، بیان ژن انتقال‌یافته در طول هشت روز کاهش چشم‏گیر داشت. کوچک‌‌مولکول 5-AZA در محیط کشت تسهیل‌کننده تمایز (permissive)، بیان ژن از سیستم لنتی‌ویروسی را 5/2 برابر افزایش داد. همچنین DZNep در محیط‌های پر توانی (pluripotency) و تسهیل‌کننده تمایز موجب افزایش به‏ترتیب 5/26 و 9/5 برابری بیان ژن شد. بیان ژن Pdx1 داخلی خود سلول نیز در تیمار با DZNep افزایش یافت. نتیجه‌گیری: انتقال لنتی‌ویروسی ژن با MOI بیش از 10، روشی کارآمد برای انتقال ژن به سلول‌های ES موشی است، اما این روش به‌همراه استفاده از پروموتر CMV موجب خاموش شدن بیان ژن در درازمدت می‌شود. تیمار با DZNep موجب فعال شدن این سیستم بیانی می‌شود. اما می‌تواند با تاثیراتی بر بیان سایر ژن‌های سلول نیز همراه باشد.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سلول‌های بنیادی جنینی (Embryonic Stem, ES) از ویژگی‌های پرتوانی (Pluripotency) و خود‌نوزایی (Self-renewal) برخوردار هستند. همین ویژگی‌ها باعث شده‌اند تا این سلول‌ها به‏عنوان منبعی تجدیدپذیر برای تولید انواع سلول‌های سوماتیک به‌شمار بروند. مطالعه تمایز سلول‌های ES هم برای تامین سلول‌های لازم در درمان‌های سلولی و هم به‏منظور مطالعه فرآیند‌های تمایز سلولی و شبیه‌سازی آزمایشگاهی شرایط تکوینی حائز اهمیت است (1). دست‏کاری ژنتیکی سلول‌های ES روشی مفید برای انجام مطالعات ژنتیکی روی فرایندهای تمایزی این سلول‌ها است (2). برای این منظور، توسعه روش‌های دست‏کاری ژنتیکی و بررسی کارکرد عناصر و ابزارهای مربوطه در سلول‌های ES امری ضروری است. تاکنون روش‌های مختلفی برای انتقال ژن به سلول‌های ES به‌کار رفته است، که از آن میان می‌توان به الکتروپوریشن (Electroporation) (3 و 4) نوکلئوفکشن (Nucleofection) (5 و 6) و لیپوفکشن (Lipofection) (7 و 8) اشاره کرد. در این روش‌ها محدودیت‌هایی از نظر میزان انتقال ژن (9 و10)، سمیت سلولی (4 و11) و بیان کوتاه‌ مدت ژن (5 و 6) مشاهده شده‌است. یکی از کارآمدترین روش‌های انتقال ژن به سلول‌های جانوری استفاده از ناقل‌های لنتی‌ویروسی است (12,13). این ناقل‌ها معمولا در انتقال ژن به سلول‌های جانوری کارایی بالایی دارند. به‌علاوه، ناقل‌های لنتی‌ویروسی با واردکردن ژن به ژنوم سلول، می‌توانند موجب بیان دراز مدت آن ‌شوند (12). پیش از این نیز ناقل‌های لنتی‌ویروسی برای انتقال ژن به سلول‌های ES با موفقیت به‌کار گرفته شده‌اند (14 و 15).

گذشته از انتقال کارآمد ژن به سلول، استفاده از عناصر تنظیمی مناسب برای دستیابی به‏میزان موثری از بیان ژن ضروری است. پروموتر، به‏عنوان مهم‏ترین عنصر تنظیمی، تاثیر عمده‌ای در بیان ژن دارد. عمدتا چند پروموتر شناخته شده که فعالیت مناسبی در اکثر انواع سلولی دارند، در ناقل‌های جانوری تعبیه شده و برای بیش‌بیان (overexpression) ژن‌ها به‏کار می‌روند. برخی مطالعات نشان داده‌اند که این پروموترها از حیث فعالیت در سلول‌های ES متفاوتند (9 و 15). یکی از دلایل شناخته شده خاموش شدن بیان ژن‌های انتقال ‌یافته به سلول‌های ES، تاثیر عوامل اپی‌ژنتیکی بر پروموتر این ژن‌ها است (16 و 17). ساز و کارهای اپی‌ژنتیکی متعددی در ES شناخته‌ شده‌اند که مسئول خاموش نگه‏داشتن ژن‌های تمایزی و در نتیجه حفظ شرایط پرتوانی هستند (18 و 19). این سازوکارها می‌توانند بعضی از پروموترهایی را که برای بیش‌بیان ژن‌ها به‏کار می‌روند شناسایی و غیرفعال کنند. به‏همین دلیل است که برای دست‏کاری ژنتیکی موثر و دستیابی به بیش‌بیان ژن، بررسی کارایی هر سیستم بیانی و بهینه‌سازی شرایط بیش‌بیان حائز اهمیت است. یکی از روش‌هایی که دست‏کاری فرآیندهای اپی‌ژنتیکی استفاده از کوچک ‌مولکول‌ها (small molecules) است. کوچک ‌مولکول‌ها عنوانی‌ کلی برای دسته‌ای از مواد با وزن مولکولی پایین است که می‌توانند به‏راحتی از غشا سلولی عبور کرده و وارد سلول شوند. این مولکول‌ها عمدتا با مهار فعالیت پروتئین‌های سلول سازوکار‌های سلولی را تحت تاثیر قرار می‌دهند (20). کوچک‏ ‌‏مولکول‌هایی که باعث مهار فعالیت آنزیم‌های اپی‌ژنیکی، مانند متیلاسیون DNA و استیلاسیون و متیلاسیون هیستون‌ها می‌شوند ابزاری بالقوه برای دست‏کاری این فرآیند‌های اپی‌زنتیکی و در نتیجه القای تغییر در بیان ژن‌ها به‏شمار می‌روند (21 و 22). برای نمونه، کوچک‌ مولکول 5-آزاسایتادین (5-AZA) با مهار آنزیم‏های DNA متیل ترانس‌فراز، مانع فرایند متیله شدن DNA می‌شود (23). همچنین کوچک ‌مولکول BIX01294 (BIX) که مهارکننده هیستون متیل‌ترانسفرازهای خانواده G9a و G9a-like است، متیلاسیون لایزین 9 از هیستون سه (H3K9me2) را که عمدتا با فعالیت PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1) در ارتباط است، کاهش می‌دهد (24). کوچک مولکول 3-دی‌آزانپلانوسین A (3-Deazaneplanocin A یا  DZNep) مهارکننده فعالیت هیستون متیل‌ترانسفرازی با گرایش اختصاصی به Ezh2 است (25 و 26). پرروتئین Ezh2 هیستون متیل‌ترانسفرازی است که باعث متیلاسیون لایزین 27 از هیستون سه (H3K27me3) می‌شود و یکی از اجزای اصلی PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) به‏شمار می‌رود (26).

در این مطالعه پس از تعیین میزان لنتی‌ویروس موردنیاز برای انتقال کارآمد ژن به سلول‌های ES، پایداری بیش‌بیان ژن خارجی انتقال‌یافته (اگزوژن) طی مدت هشت روز بررسی شده‌است. در ادامه این فرضیه که مهار ساز و کارهای اپی‌ژنتیکی سلول ES می‌تواند منجر به افزایش فعالیت سیستم بیانی لنتی‌ویروسی با پروموتر CMV شود، مورد آزمایش قرار‌گرفته است. برای این منظور سلول‌های ES تراریخت با کوچک‌ مولکول‌های مهارکننده سه مسیر اپی‌ژنتیکی که منجر به متیلاسیون DNA و ریشه‌های لایزین 9 و 27 از هیستون سه (H3K9me3 و H3K27me3) می‌شوند، تیمار شده و در نهایت تاثیر این تیمارها بر بیان اگزوژن و ژن داخلی خود سلول (اندوژن) بررسی شده است.

 

مواد و روش‌ها

کشت سلول‌: کشت سلول‌های ES موشی رده Royan B20 به روشی که قبلا شرح داده شده است (27 و 28) صورت گرفت. به‏طور مختصر، این سلول‌ها در ظروف کشت پوشش‌داده ‌شده با ژلاتین در محیط کشت DMEM/F12 (Life technologies) حاوی 15 درصد جایگزین سرم (Knock-out serum replacement، Life technologies)، غلظت X1 از مخلوط اسیدهای آمینه غیرضروری (None-essential amino acids، Life technologies)، 2 میلی‌مولار اِل-گلوتامین (Life technologies)، 10 واحد در میلی‌لیتر عامل مهارکننده لوسمی (LIF) (29) و دو مهار کننده کوچک مولکولی (R2i)‌ SB431542 (10 میکرومولار) و PD404182 (یک میکرومولار) کشت‌ داده‌ شدند. سلول‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با هوای حاوی پنج درصد CO2 نگه‏داری شدند. محیط کشت‌ها هر روز تعویض شد و پاساژ سلول‌ها در فواصل دو روزه و به‏روش معمول با محلول تریپسین و EDTA (Life technologies) انجام شد.

برای تیمار سلول‌ها با کوچک مولکول‏های مهارگر اپی‌ژنتیکی به‏منظور تعیین دوز کشنده یا سنجش تاثیر کوچک‌ مولکول‌ها بر بیان ژن، ابتدا سلول‌های ES با تراکم 104 × 2 سلول در هر سانتی‌متر مربع در ظروف پوشش‌داده شده با ژلاتین کشت شدند و پس از یک روز محیط کشت با محیط حاوی یکی از کوچک ‌مولکول‌های 5-آزاسایتادین (Sigma)، کوچک مولکول DZNep (Sigma) یا BIX (Sigma) تعویض شد. غلظت‌های کوچک ‌مولکول‌های به‏کار رفته در هر آزمایش در قسمت نتایج ذکر شده‌است. سلول‌ها برای مدت سه روز، با تعویض محیط روزانه، در محیط کشت حاوی کوچک ‌مولکول نگه‏داری شدند.

کشت سلول‌های HT1080 و LentiX-293T (Clonetech) در محیط DMEM (Life technologies) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (Life technologies)، غلظت X1 از مخلوط اسیدهای آمینه غیرضروری (Life technologies)، 2 میلی‌مولار اِل-گلوتامین (Life technologies) انجام شد.

تولید سازه‌های ژنی: برای تهیه سازه‌های ژنی لنتی‌ویروسی pLenti6.3-Pdx1، توالی کدکننده ژن Pdx1 موشی پس از بهینه‌سازی کدونی، به‏روش سنتزی تولید و در ناقل pENTR-21 کلون شد (Gene Arts). سپس این ژن با روش Gateway (Life technologies) به ناقل pLenti6.3/TO/DEST منتقل شد (Gene Arts). برای تولید سازه pLenti6.3-GFP نیز مشابه بالا عمل شد با این تفاوت که توالی GFP از ناقل pEGFP-N1 جدا گردید. در انتها صحت سازه‌های نهایی با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید‌های کمکی تولید لنتی‌ویروس شامل pMDLg، pRSV و pMD2.G از Addgene  خریداری شدند.

تولید ویروس: برای تولید ذرات لنتی‌ویروسی مطابق با دستور کار شرکت Life technologies عمل شد، به‏طور خلاصه، سلول‌های LentiX-293T در ظروف کشت پوشش‌ داده‌ شده با ژلاتین به تعداد پنج میلیون سلول در هر ظرف ده سانتی‌متری کشت داده شدند. سپس سه پلاسمید کمکی (pMDLg، pRSV و pMD2.G) به‏همراه پلاسمید لنتی‌ویروسی (pLenti6.3-Pdx1 یا pLenti6.3-GFP)، هر کدام سه میکروگرم، با استفاده از Lipofectamin (Life technologies) و با روش ارائه شده در دستور کار شرکت، به سلول‌های LentiX-293T انتقال یافتند. محیط حاوی ویروس در روزهای دوم و سوم پس از ترانسفکشن جمع‌آوری و ذرات لنتی‌ویروسی با سانتریفیوژ در g 20000 به‏مدت دو ساعت، از محیط جدا شدند. رسوب لنتی‌ویروسی در محیط کشت DMEM/F12 فاقد سرم حل شدند و تا زمان مصرف در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگه‏داری شدند.

اندازه‌گیری تیتر و آلوده‌سازی ویروسی: برای اندازه‌گیری تیتر ویروس‌ها، سلول‌های HT1080 به تعداد 20000 سلول در هر چاهک از ظروف شش‌خانه‌ای کشت شدند. پس از یک روز رقت‌های مختلف از ویروس به‏همراه 2 میکروگرم در میلی‌لیتر از پلی‌برن (Sigma) به سلول‌ها اضافه شد. سلول‌ها برای مدت 18 تا 20 ساعت در معرض ویروس و سپس برای یک‌ شبانه روز در محیط فاقد آنتی‌بیوتیک قرار‌گرفتند. در ادامه سلول‌ها برای مدت 12 تا 14 روز در محیط کشت حاوی 5 میکروگرم در میلی‌لیتر بلاستوسیدین (Sigma) نگه‏داری شدند. در نهایت با رنگ ‌آمیزی متیلن‌بلو کلونی‌های برجای‌مانده از تیمار آنتی‌بوتیکی مشخص و شمارش شدند. تیتر ویروس فعال در واحد حجم با درنظر گرفتن ضریب رقت‌، بر حسب واحد ترانسداکشن (transduction unit) در میلی‌لیتر  محاسبه شد.

برای آلوده سازی سلول‌های ES، ابتدا مقدار مورد نیاز از سوسپانسیون ویروسی بر حسب تیتر ویروس و تعداد سلول‌ها تعیین شد. به این ترتیب که به‏ازای هر 105 × 2 سلول در یک ظرف 3 سانتی‌متری، برای ضریب آلوده‌سازی یا               MOI (Multiplicity of infection)  1، 5، 10 و 20 به‌ترتیب 105 × 2، 106، 106 × 2 و 106 × 4 واحد ترانسداکشن از ذرات لنتی‌ویروسی استفاده شد. پس از اضافه کردن محلول حاوی ویروس، به همان حجم محیط کشت سلول ES حاوی پلی‌برن و با غلظت دو برابر از همه محتویات، روی سلول‌ها ریخته‌شد. با این روش، با توجه به این‌که ویروس‌ها در محیط کشت DMEM/F12 حل شده‌بودند، محیط نهایی کاملا مطابق با محیط کشت معمولی سلول‌های ES بود. بعد از 12 تا 14 ساعت محیط کشت با محیط فاقد آنتی‌بیوتیک تعویض شد.

بررسی میکروسکوپی و فلوسایتومتری: برای بررسی و عکس‌برداری میکروسکوپی سلول‌ها به‏صورت زنده و در محیط کشت با میکروسکوپ فلورسنت مدل DP72 (Olympus) مشاهده و عکس‌برداری شدند. برای بررسی فلوسایتومتری سلول‌ها با تریپسین جدا و سپس سانتریفیوژ شدند. رسوب سلولی با بافر نمکی فسفات بدون کلسیم (D-PBS) دو بار شستشو شد. در نهایت سوپ سلولی در D-PBS توسط دستگاه فلوسایتومتر مدل BD FACS Calibur (BD  Biosciences) بررسی و نتایج با نرم ‌افزار Flowing Software 2.5.1 (Turku Centre for Biotechnology) تجزیه و تحلیل شدند. 

اندازه‌گیری بیان ژن به روش real time RT-PCR: برای جداسازی RNA از کیت RNeasy Micro (Qiagen) و طبق دستورالعمل کیت استفاده شد. کیفیت و کمیت RNA به‏دست آمده با الکتروفورز بر روی ژل آگاروز و اسپکتروفوتومتری در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر ارزیابی شد. ساخت cDNA با استفاده از کیت RevertAidTM H Minus M-Mulv (Thermo Scientifics) مطابق با دستورالعمل مربوطه انجام گرفت. واکنش realtime PCR در دستگاه Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science) و با استفاده از مخلوط آماده PCR حاوی سایبرگرین (Takara) انجام شد. برنامه واکنش شامل این مراحل بود: پنج دقیقه دمای 95 درجه سانتی‌گراد برای دناتوراسیون اولیه، چهل چرخه، هر چرخه شامل سی ثانیه 95 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه 60 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه 72 درجه سانتی‌گراد و خوانش فلورسنت؛ اندازه‌گیری دمای ذوب محصول با شیب دمایی 95 تا 65 درجه سانتی‌گراد انجام پذیرفت. توالی پرایمرهای به‌کار رفته برای هر‌کدام از ژن‌ها در جدول 1 نشان ‌داده ‌شده‌است. بیان ژن‌ها با روش ∆∆Ct، بر اساس بیان ژن گلیسرآلدهید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) نرمال شد و نسبت به نمونه شاهد (سلول ES) محاسبه شد.

آنالیزهای آماری: برای مقایسه آماری داده‌ها از آنالیز واریانس (ANOVA) استفاده و مقادیر p کمتر از 05/0 معنی‌دار تلقی شدند. محاسبه توسط نرم‌افزار GraphPad Prism 3 انجام گرفت.

 

جدول1: توالی پرایمرهای به‏کار رفته برای بررسی بیان ژن‌ها با qRT-PCR

Gene Symbol

Primer Sequence

Gapdh

F: 5’-CAACTCCCACTCTTCCACTT-3’

R: 5’-GCAGCGAACTTTATTGATGGTA-3’

WPRE

F: 5’-CGTTGTCAGGCAACGTG-3’

R: 5’-CTGACAGGTGGTGGCAAT-3’

Pdx1 (endogenous)

F: 5’-CCTGGAAGAGCCCAACCGC-3’

R: 5’-TCCGCTGTGTAAGCACCTCCT-3’

 

 

نتایج

تعیین مقدار ویروس برای انتقال موثر ژن به سلول‌های ES موشی

برای تعیین نسبت مناسب از ذرات لنتی‌ویروس و سلول ES از لنتی‌ویروس حاوی ژن GFP (pLenti6.3-GFP) استفاده شد. تعداد 105×5/2 سلول ES موشی با نسبت MOI  صفر (به‏عنوان شاهد)، یک، پنج، 10 و 20 انجام شد. سلول‌ها پس از دو روز ارزیابی شدند. در تصاویر میکروسکپ فلورسنت  بیان GFP در سلول‌ها، به‏ویژه آن‌هایی که با MOI بیشتر آلوده شده‌بودند، دیده می شد (شکل 1، الف). بررسی کمی با فلوسایتومتری نشان داد که بیشترین مقدار انتقال ژن در MOIهای 20  و 10 صورت می‌گیرد و منجر به بیان GFP در بیش از 90 درصد سلول‌ها می‌شود. در MOI پنج نیز 80 درصد از سلول‌ها GFP را بیان می‌کردند. این در حالی است که با MOI یک، کمتر از 15 درصد سلول‌ها بیان GFP را نشان می‌دادند (شکل 1، ب). این نتایج در مجموع نشان‌داد که MOI بالاتر از ده منجر به انتقال موثر و کارآمد ژن به سلول‌های ES موشی می‌شود. از این‌رو در ادامه و برای سایر آزمایش‏ها از MOI 10 برای انتقال ژن به سلول‌های ES استفاده شد.

 

 

شکل1: تعیین MOI برای آلوده‌سازی ویروسی سلول‌های ES موشی. الف) تصاویر میکروسکوپی فازکنتراست (ردیف بالا) و فلورسنت (ردیف پایین) سلول‌های ES را دو روز بعد از انتقال ژن با مقادیر مختلف از لنتی‌ویروس بیان کننده GFP نشان می‌دهند. نمونه MOI صفر که هیچ ویروسی دریافت نکرده‌، به‏عنوان شاهد نشان‌ داده شده است. ب) بررسی کمی میزان سلول‌های بیان‌کننده GFP در مقادیر مختلف MOI با استفاده از فلوسایتومتری. نمونه MOI صفر (با زمینه خاکستری) به‏عنوان شاهد به کار رفته‌است.

 

 

بررسی پایداری بیش‌بیان ژن

برای بررسی پایداری بیش‌بیان ژن با استفاده از سیستم بیانی لنتی‌ویروسی با پرموتر CMV، سلول‌های تراریخت‌شده با لنتی‌ویروس pLenti6.3-GFP، پس از گذشت دو، چهار، شش و هشت روز از زمان انتقال ژن بررسی شدند. برای این کار سلول‌های ES موشی در گروه‌های جداگانه با فواصل دو روزه و MOI برابر 10 با لنتی‌ویروس pLenti6.3-GFP آلوده شدند. بررسی کمی تعداد سلول‌های بیان کنده GFP با فلوسایتومتری پس از گذشت هشت روز از اولین آلوده‌ سازی ویروسی انجام شد. در طول این مدت سلول‌ها در همه گروه‌ها تکثیر داشته و هر دو روز یک‏بار پاساژ داده‌شدند. نتایج بررسی بیان GFP با فلوسایتومتری نشان داد که بیان این ژن به مرور زمان طی پاساژهای متوالی کاهش می‌یابد (شکل 2). در حالی‏که درصد سلول‌های بیان‌کننده GFP در روز دوم مشابه با آزمایشات تعیین MOI، بیش از 90 درصد بود. به این ترتیب هرچند سیستم بیانی مبتنی بر پرموتر CMV و ناقل لنتی‌ویروسی قابلیت بیان ژن در سلول‌های ES موشی را دارد، اما این بیان به مرور دچار کاهش ‌می‌شود.

تاثیر کوچک ‌مولکول‌های مهارکننده مسیر‌های اپی‌ژنتیکی بر بیش‌بیان ژن

سه مورد از عمده‌ترین ساز و کارهای اپی‌ژنتیکی که به‏طور گسترده در سلول‌های ES فعال هستند و می‌توانند موجب مهار بیان اگزوژن‌ شوند، متیلاسیون DNA (30)، تری‌متیلاسیون لایزین 27 از هیستون سه (H3K27me3) (31 و 32) و دی‌متیلاسیون لایزین 9 از هیستون سه (H3K9me2) (18 و 33) هستند. در ادامه برای مطالعه نقش احتمالی این مکانیزم‌ها در غیرفعال شدن سیستم بیانی لنتی‌ویروسی با پروموتور CMV و نیز بهره‌برداری از مهار این مسیر‌ها برای فعال کردن دوباره این سیستم بیانی، از مهار‌کننده‌های کوچک ‌مولکولی استفاده شد. برای این منظور، کوچک ‌مولکول 5-آزاسایتادین (5-AZA) برای مهار DNA متیل ترانس‌فراز، کوچک مولکول DZNep به‌عنوان مهارگر H3K27me3 و کوچک ‌مولکول BIX (BIX01294) به‌عنوان مهارگر H3K9me2 به‌کار گرفته ‌شدند. ابتدا برای تعیین حداکثر غلظت قابل استفاده از این کوچک ‌مولکول‌ها، سلول‌های ES موشی در حضور چهار غلظت‌ مختلف از کوچک ‌مولکول‌ها برای مدت سه روز کشت داده شدند. بررسی کشندگی کوچک ‌مولکول‌ها به‏صورت کیفی و با مشاهده میکروسکوپی، برمبنای تشکیل کلونی‌های طبیعی سلول‌های ES صورت گرفت (شکل 3). نتایج نشان دادند که حد‌اکثر غلظتی که تکثیر و تشکیل کلونی طبیعی ES را مختل نمی‌کند برای هریک از کوچک مولکول‌های 5-AZA، BIX و DZNep به‏ترتیب      1/0، 1 و 5 میکرومولار است، بنابراین از همین غلظت‌ها برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد.

 

 

شکل 2: پایداری بیان GFP با پروموتر CMV پس از انتقال لنتی‌ویروسی به سلول ES. گروه‌های جدا از سلول‌ها در فواصل دو روزه با MOI 10 در معرض لنتی‌ویروس pLenti-GFP  قرار‌گرفتند و پس از گذشت هشت روز از اولین آلوده‌سازی با فلوسایتومتری بررسی شدند. گروه‌هایی که روز‌های بیشتری پس از انتقال ژن سپری کرده‌اند درصد کمتری از سلول‌های بیان کننده GFP دارند.

 

شکل 3: ارزیابی سمیت کوچک مولکول‌های 5-AZA، BIX و DZNep روی سلول‌های ES موشی. سلول‌ها در حضور غلظت‌های مختلفی از کوچک ‌مولکول‌ها برای مدت سه روز کشت شدند. تفاوت میزان بقای سلول‌ها در غلظت‌های مختلف مشهود است. به‏ویژه حضور چند نمونه از کلونی‌های ES با فلش نشان داده شده است. بر مبنای تشکیل کلونی‌های ES با مورفولوژی طبیعی، بیشترین غلظت‌های قابل استفاده برای کوچک ‌مولکول‌های 5-AZA، BIX و DZNep  به‏ترتیب 1/0، 1 و 5 میکرومولار تعیین شد.

 

با توجه به این‌که سه ساز و کار اپی‌ژنتیکی موردبررسی، مسئول غیرفعال نگه‌داشتن بسیاری از ژن‌های تمایزی در سلول ES هستند و از این‏طریق به حفظ شرایط بنیادینگی سلول کمک می‌کنند، مهار این ساز و کارها می‌تواند منجر به القای تمایز در سلول ES شود. از آنجا که هدف این مطالعه نیز دستیابی به ساز و کاری برای بیش‌بیان ژن‌ها در سلول ES به‌منظور القای تمایز بود، در ادامه، تاثیر مهارگرهای کوچک ‌مولکولی بر بیش‌بیان Pdx1، به‏عنوان یک ژن تمایزی، مورد بررسی قرارگرفت. برای این منظور سلول‌های ES موشی تراریخت شده با pLenti-Pdx1 برای مدت سه روز سلول‌ها در معرض هرکدام از کوچک مو‌لکول‌ها و در دو محیط کشت پرتوانی (حاوی LIF و R2i) و تسهیل کننده تمایز (فاقد LIF و R2i) قرار گرفتند. بررسی بیان Pdx1 اگزوژن با استفاده از پرایمر‌های ویژه توالی WPRE نشان داد که در محیط پرتوانی، بیان اگزوژن تنها درحضور DZNep افزایش معنی‌دار و 5/26 برابری در مقایسه با نمونه تیمار نشده نشان می‌دهد (شکل 4، الف). در محیط تسهیل‌کننده تمایز نیز تیمار با DZNep و 5-AZA موجب افزایش به‏ترتیب 9/5 و 5/2 برابری بیان اگزوژن در مقایسه با نمونه تیمار نشده، می‌شوند (شکل4، ب). به این ترتیب می‌توان نتیجه گرفت مهار کوچک ‌مولکولی متیلاسیون لایزین 27 هیستون سه با استفاده از DZNep، بیشترین تاثیر را در فعال کردن دوباره سیستم بیش‌بیان لنتی‌ویروسی با پروموتور CMV دارد.

 

 

شکل 4: تاثیر کوچک ‌مولکول‌های مهارکننده مسیرهای اپی‌ژنتیکی بر بیان Pdx1 اندوژن و اگزوژن. الف) برای بررسی تاثیر کوچک‌ مولکول‌های 5-AZA، BIX و DZNep روی بیان ژن Pdx1  اگزوژن از سیستم بیانی لنتی‌ویروسی pLenti-Pdx1، سلول‌های تراریخت شده با این لنتی‌ویروس برای مدت سه روز در محیط‌ پرتوانی در معرض هرکدام از این کوچک ‌مولکول‌ها قرار گرفتند. بررسی بیان اگزوژن با استفاده از پرایمرهای ویژه توالی WPRE نشان داد که تنها تیمار با DZNep موجب افزایش معنی‌دار بیان اگزوژن در این محیط شده‌است. ب) نتیجه تیمار سلول‌های تراریخت با کوچک‌ مولکول‌ها در محیط تسهیل‌کننده تمایز نشان می‌دهد که بیان اگزوژن با تیمار 5-AZA و DZNep افزایش معنی‌دار داشته ‌است. ج) بررسی بیان اگزوژن (با پرایمر‌های ویژه WPRE) و Pdx1 اندوژن (با پرایمر‌های ویژة نسخه اندوژن این ژن) در حضور یا غیاب DZNep و در سلول‌های غیر تراریخت یا تراریخت‌شده با pLenti-Pdx1 نشان داد که DZNep مستقیما و مستقل از بیان Pdx1 اگزوژن، بیان Pdx1 اندوژن را افزایش داده ‌است. مقدار نسبی بیان براساس نسبت بیان به نمونه ES موشی غیرتراریخت پس از نرمال شدن با بیان Gapdh محاسبه شده ‌است. همه نمودار‌ها میانگین سه تکرار و خطوط خطا (error bars) انحراف معیار (standard deviation ) را نشان می‌دهند. آزمون آماری داده‌ها در مقایسه با نمونه سلول‌های تراریخت تیمار نشده انجام ‌گرفته و تفاوت‌های معنی‌دار با یک ستاره برای 05/0p<  و دو ستاره برای 01/0p< گزارش شده‌اند.

 

تاثیر تیمار کوچک ‌مولکول DZNep بر بیان Pdx1 اندوژن

مهار ساز و کارهای اپی‌ژنتیکی که مسئول خاموش نگه‌داشتن ژن‌های تمایزی هستند، می‌تواند منجر به فعالیت و افزایش بیان این ژن‌ها در سلول ES شود. برای این‌که بدانیم کوچک ‌مولکول DZNep گذشته افزایش بیان Pdx1 اگزوژن، چه تاثیری روی بیان ژن‌های سلول داشته ‌است، بیان Pdx1 اندوژن را در سلول‌های غیرتراریخت و تراریخت شده با pLenti-Pdx1، در حضور و در غیاب DZNep اندازه‌گیری کردیم. این آزمایش در محیط کشت تسهیل کننده تمایز انجام‌شد. مطابق انتظار بیان Pdx1 اگزوژن در سلول‌های غیرتراریخت تشخیص داده ‌نشد و در سلول‌های تراریخت در حضور DZNep افزایش داشت. درحالی‌‏که تیمار با DZNep چه در سلول‌های تراریخت و چه سلول‌های غیر تراریخت، موجب افزایش دو برابری بیان Pdx1 اندوژن شد (شکل 4، ج).

 

بحث

بیش‌بیان ژن‌ها برای بررسی تاثیر آن‌ها در فرآیندهای مختلف مرتباط با سلول ES مانند چرخه سلولی و خودنوزایی، مهار تمایز  و پرتوانی، و نیز خروج از پرتوانی و تمایز به رده‌های مختلف سلولی کاربرد دارد. از آنجا که ناقل‌های لنتی‌ویروسی یکی از کارآمدترین روش‌های انتقال ژن به شمار می‌روند، برای انتقال ژن به سلول‌های ES نیز گزینه‌ای بالقوه مناسب هستند. پیش از این نشان داده شده ‌بود که در انتقال لنتی‌ویروسی ژن به سلول‌های ES با MOI 30 حدود 42 درصد (34) و با MOI 50 کمتر از 90 درصد سلول‌ها (35) تراریخت می‌شوند. این‌ در حالی‌است که در این مطالعه بیش از 90 درصد سلول‌های ES با MOI 10 و 20 تراریخت شدند. این تفاوت می‌تواند ناشی از اختلاف شیوه کشت سلول‌های ES باشد؛ چرا که در مطالعات یاد شده از روش کشت سلول ES بر روی لایه سلولی فیبروبلاست جنینی موش استفاده شده بود و در اینجا ما از روش بدون لایه سلولی فیبروبلاست با استفاده از محیط حاوی مهارکننده‌های R2i استفاده نمودیم. همچنین جزئیات روش آلوده‌سازی سلول‌ با ویروس نیز می‌تواند بر کارایی فرایند تاثیرگذار باشد (36). مطالعات قبلی نتایج متفاوتی را در مورد کارآیی سیستم لنتی‌ویروسی و پروموتر CMV گزارش کرده‌اند. در بعضی از این مطالعات عنوان‌شده است که استفاده از انتقال لنتی‌ویروسی با خاموش شدن بیان ژن همراه بوده‌ است (37,38) حال آنکه در موارد دیگر بیان موفقیت‌آمیز ژن با این سیستم گزارش شده ‌است (15,34,35). در مورد پروموتر CMV نیز، هر چند در برخی مطالعات از ناکارآمدی این پروموتر در سلول‌های ES موشی خبر داده‌اند (9,15,39)، گزارشاتی از بیش‌بیان ژن با این پروموتر نیز موجود است (40,41). نتایج ما نشان می‌دهد که پس از تراریخت نمودن سلول‌های ES توسط سیستم لنتی‌ویروسی با پروموتر CMV بیش از 90 درصد سلول‌ها ژن انتقال‌یافته را بیان می‌کنند. با این حال، بیان ژن پایدار نیست و با گذشت زمان خاموش می‌شود. نشان‌داده‌ شده است که خاموش بودن پروموتر CMV مربوط به شرایط و سازوکارهای بنیادینگی سلول ES است، به طوری که با تمایز این سلول‌ها به سلول‌های پیشساز عصبی‌ پروموتر CMV دوباره فعال می‌شود (15). همچنین پیش از این، از کوچک ‌مولکول 5-AZA و مهار متیلاسیون DNA برای فعال‌کردن بیان ژن انتقال یافته با لنتی‌ویروس سلول‌های مختلف استفاده شده بود (42,43). در مطالعه ما 5-AZA تنها در محیط تسهیل‌کننده تمایز موجب افزایش معنی‌دار در فعالیت سیستم بیانی شد. کوچک ‌مولکول DZNep که مهارکننده خاصیت هیستون متیل‌ترانسفرازی Ezh2 از مجموعه مهاری PRC2 است، هم در محیط حاوی R2i و LIF و هم محیط بدون R2i و LIF باعث افزایش معنی‌دار در فعالیت سیستم بیانی شد. این نتایج با یافته‌های قبلی که نشان‌ می‌دهند PRC2 یکی از مهمترین عوامل مهار ژن‌های تمایزی در سلول ES است (18,31)، سازگاری دارد. همچنین پیش از این مشخص شده‌است که فعالیت هیستون متیل‌ترانسفرازی Ezh2 در لنفوسیت‌های T می‌تواند باعث غیر فعال شدن توالی لنتی‌ویروسی شود (44). کوچک ‌مولکول‌های DZNep و 5-AZA علیه سلول‌های سرطانی و به‏عنوان یک عامل تمایزدرمانی (differentiation therapy) به کار رفته‌ و تاثیر آن‌ها در روشن کردن ژن‌های خاموش‌کننده تومور (tumor repressive genes) نشان‌ داده شده است (26 و 45). از سوی دیگر کوچک مولکول‌های BIX و 5-AZA برای کمک به فرآیند تمایز زدایی در باز برنامه ریزی سلولی (cell reprogramming) و تولید سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (Induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs) به‏کار رفته‌اند (46 و 47). با توجه به این‌که ژن‌های خاموش‌شده در سلول ES، عمدتا ژن‌های تمایزی هستند، می‌توان انتظار داشت که تیمار این سلول‌ها با DZNep موجب افزایش بیان در این ‌ژن‌ها شود. بررسی تاثیر DZNep بر بیان Pdx1 اندوژن نیز حاکی از افزایش بیان این ژن بود.

 

نتیجه گیری

انتقال‌ لنتی‌ویروسی ژن‌ها به سلول‌های ES با MOI بالاتر از 10، روشی مناسب برای تراریخت نمودن این سلول‌ها است. اما استفاده از لنتی‌ویروس دارای پروموتر CMV موجب کاهش و غیرفعال شدن بیان ژن در درازمدت می‌شود. برای فعال‌سازی دوباره این سیستم بیانی، می‌توان از مهار متیلاسیون لایزین 27 هیستون سه با کوچک ‌مولکول DZNep استفاده کرد. با این‏حال، با توجه به تاثیر DZNep بر ژن‌های تمایزی، برای استفاده از این کوچک مولکول برای فعال کردن پروموتر CMV در سلول‌های ES باید تاثیرات احتمالی تمایزی آن نیز مد نظر قرار گیرد.

 

تشکر و قدردانی

این طرح توسط دانشگاه تربیت مدرس و پژوهشگاه رویان در قالب طرح پژوهشی شماره 91000102 مورد حمایت مالی قرار گرفته‌است.

1. Zhu Z, Huangfu D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 2013; 140(4): 705–17.

2. Menendez P, Wang L, Bhatia M. Genetic manipulation of human embryonic stem cells: a system to study early human development and potential therapeutic applications. Curr Gene Ther. 2005; 5(4): 375–85.

3. Xie X, Cao F, Sheikh AY, Li Z, et al. Genetic modification of embryonic stem cells with VEGF enhances cell survival and improves cardiac function. Cloning Stem Cells. 2007; 9(1): 549–63.

4. Furuya M, Yasuchika K, Mizutani K-I, Yoshimura Y, et al. Electroporation of cynomolgus monkey embryonic stem cells. Genesis. 2003; 37: 180–7.

5. Lakshmipathy U, Pelacho B, Sudo K, Linehan JL, et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 2004; 22(4): 531–43.

6. Lorenz P, Harnack U, Morgenstern R. Efficient gene transfer into murine embryonic stem cells by nucleofection. Biotechnol Lett. 2004; 26(20): 1589–92.

7. McLenachan S, Sarsero JP, Ioannou P a. Flow-cytometric analysis of mouse embryonic stem cell lipofection using small and large DNA constructs. Genomics. 2007; 89(6): 708–20.

8. Ribeiro SC, Mendes R, Madeira C, Monteiro G a, et al. A quantitative method to evaluate mesenchymal stem cell lipofection using real-time PCR. Biotechnol Prog. 2010; 26(5): 1501–4.

9. Chung S, Andersson T, Sonntag K-C, Björklund L, et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells. 2002 Jan; 20(2): 139–45.

10. Eiges R, Schuldiner M, Drukker M, Yanuka O, et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 2001; 11:514–8.

11. Zwaka TP, Thomson J a. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2003; 21(3): 319–21.

12. Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012; 443(3): 603–18.

13. Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007; 36(3): 184–204.

14. Somers A, Jean JC, Sommer C a, Omari A, et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 2010; 28(10): 1728–40.

15. Hong S, Hwang D-Y, Yoon S, Isacson O, et al. Functional analysis of various promoters in lentiviral vectors at different stages of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Mol Ther. 2007 Sep; 15(9): 1630–9.

16. Schumacher A, Koetsier P a, Hertz J, Doerfler W. Epigenetic and genotype-specific effects on the stability of de novo imposed methylation patterns in transgenic mice. J Biol Chem. 2000; 275(48): 37915–21.

17. Dietz-Pfeilstetter A. Stability of transgene expression as a challenge for genetic engineering. Plant Sci. Elsevier Ireland Ltd; 2010; 179(3): 164–7.

18. Li M, Liu G-H, Belmonte JCI. Navigating the epigenetic landscape of pluripotent stem cells. Nat

 

Rev Mol Cell Biol. 2012; 13(8): 524–35.

19. Lund RJ, Närvä E, Lahesmaa R. Genetic and epigenetic stability of human pluripotent stem cells. Nat Rev Genet. Nature Publishing Group; 2012; 13(9): 732–44.

20. Efe J a, Ding S. The evolving biology of small molecules: controlling cell fate and identity. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011; 366(1575): 2208–21.

21. You JS, Han JH. Targeting components of epigenome by small molecules. Arch Pharm Res. 2014; 37(11): 1367–74.

22. Knapp S, Weinmann H. Small-molecule modulators for epigenetics targets. ChemMedChem. 2013; 8:1885–91.

23. Issa JPJ, Kantarjian HM. Targeting DNA methylation. Clinical Cancer Research. 2009; 15(12): 3938–46.

24. Kubicek S, O’Sullivan RJ, August EM, Hickey ER, et al. Reversal of H3K9me2 by a small-molecule inhibitor for the G9a histone methyltransferase. Mol Cell. 2007 Feb 9; 25(3): 473–81.

25. Miranda TB, Cortez CC, Yoo CB, Liang G, et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Mol Cancer Ther. 2009 Jun; 8(6): 1579–88.

26. Tan J, Yang X, Zhuang L, Jiang X, et al. Pharmacologic disruption of polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes Dev. 2007; 21(9): 1050–63.

27. Hassani S-N, Totonchi M, Farrokhi A, Taei A, et al. Simultaneous suppression of TGF-β and ERK signaling contributes to the highly efficient and reproducible generation of mouse embryonic stem cells from previously considered refractory and non-permissive strains. Stem Cell Rev. 2012 Jun; 8(2): 472–81.

28. Hassani SN, Totonchi M, Sharifi-Zarchi A, Mollamohammadi S, et al. Inhibition of TGFβ Signaling Promotes Ground State Pluripotency. Stem Cell Rev Reports. 2014 Sep 15; 10(1): 16–30.

29. Rassouli H, Nemati S, Rezaeiani S, Sayadmanesh A, et al. Cloning, expression, and functional characterization of in-house prepared human leukemia inhibitory factor. Cell J. 2013; 15(2): 190–7.

30. Smith ZD, Meissner A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet. 2013; 14(3): 204–20.

31. Boyer L a, Plath K, Zeitlinger J, Brambrink T, et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature. 2006 May 18; 441(7091): 349–53.

32. Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature. 2007 Aug 2; 448(7153): 553–60.

33. Kang Y-K. SETDB1 in Early Embryos and Embryonic Stem Cells. Curr Issues Mol Biol. 2014; 17:1–10.

34. Kosaka Y, Kobayashi N, Fukazawa T, Totsugawa T, et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 2004 Mar; 28(3): 271–7.

35. Pfeifer A, Ikawa M, Dayn Y, Verma IM. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 2140–5.

36. Zhang B, Metharom P, Jullie H, Ellem KA, et al. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2004; 2:6.

37. Xia X, Zhang Y, Zieth CR, Zhang S. Transgenes delivered by lentiviral vector are suppressed in human embryonic stem cells in a promoter-dependent manner. Stem Cells Dev. 2007; 16(1): 167–76.

38. Ma Y, Ramezani A, Lewis R, Hawley RG, et al. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 2003; 21(1): 111–7.

39. Kawabata K, Sakurai F, Yamaguchi T, Hayakawa T, et al. Efficient gene transfer into mouse embryonic stem cells with adenovirus vectors. Mol Ther. 2005 Sep; 12(3): 547–54.

40. Sheik Mohamed J, Gaughwin PM, Lim B, Robson P, et al. Conserved long noncoding RNAs transcriptionally regulated by Oct4 and Nanog modulate pluripotency in mouse embryonic stem cells. RNA. 2010; 16(2): 324–37.

41. Ward CM, Stern PL. The human cytomegalovirus immediate-early promoter is transcriptionally active in undifferentiated mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 2002; 20(5): 472–5.

42. Swindle CS, Klug CA. Mechanisms that regulate silencing of gene expression from retroviral vectors. J Hematother Stem Cell Res. 2002; 11(3): 449–56.

43. Hofmann A, Kessler B, Ewerling S, Kabermann A, et al. Epigenetic regulation of lentiviral transgene vectors in a large animal model. Mol Ther. 2006; 13: 59–66.

44. Friedman J, Cho W-K, Chu CK, Keedy KS, et al. Epigenetic Silencing of HIV-1 by the Histone H3 Lysine 27 Methyltransferase Enhancer of Zeste 2. J Virol. 2011; 85(17): 9078–89.

45. Christman JK. 5-Azacytidine and 5-aza-2’-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 2002; 21(35): 5483–95.

46. Shi Y, Desponts C, Do JT, Hahm HS, et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. Cell Stem Cell. 2008; 3(5): 568–74.

47. Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, Ku M, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 2008; 454(7200): 49–55.