بررسی ویژگی‏ها و قابلیت‌های سلول‏های درمی کشت شده بستر چنگال موش در ایجاد برهم‌کنش با اپی‏درم هتروتوپیک

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسنده

دانشگاه رازی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کرمانشاه، ایران

چکیده

هدف: در این تحقیق ویژگی‏های مورفولوژیکی، کشت سلولی، ایمونوشیمیایی و القایی سلول‏های درمی چنگال موش صحرایی مورد مطالعه قرار گرفت. مواد و روش‌ها: ابتدا انگشتان موش از محل آخرین مفصل منتهی به چنگال قطع و بخش‌های قطع شده برای مطالعات بافت شناسی آماده شد. همچنین بافت درمی زیر صفحه چنگال استخراج و در شرایط in vitro کشت داده شد. سلول‏های کشت شده در پاساژ 2 و 3 به‏روی لامل متتقل و با آنتی بادی α-smooth muscle actin (ASMA) واکنش داده شدند. در نهایت سلول‏های کشت شده با DiI رنگ شده و به نیمه-فولیکول‌های ویبرسا و گوش پیوند زده شدند. نتایج: سلول‏های درمی چنگال از نظر ویژگی‏های ریخت‌شناسی، کشت سلولی، بیان پروتئین ASMA با پاپیلای درمی فولیکول مو شباهت نشان دادند. این سلول‏ها یک مورفولوژی دو قطبی و دوکی شکل را به نمایش گذاشتند که در یک ماتریکس خارج سلولی غنی از گلیکوزآمینوگلیکان قرار داشتند. اکثریت سلول‏های کشت شده پروتئین ASMA را در سیتوپلاسم خود بیان کردند و این پروتئین با شدت بیشتری در پاهای تیغه‌ای مشاهده شد. با وجود این، برخلاف سلول‏های درمی فولیکول مو این سلول‏ها قادر نبودند اپی‏درم اکتوپیک را برای ایجاد یک زائده پوستی القا کنند. نتیجه‌گیری: قابلیت القایی که در سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو مشاهده شده است قابل تعمیم به سلول‏های درمی سایر ضمائم پوستی از جمله سلول‏های درمی چنگال نیست. از شواهد چنین استنباط می‌شود که عامل القا کننده موجود در سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو در سلول‏های درمی چنگال بیان نمی‌شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

برهم‏کنش بین سلول‏هایی با منشا انتوژنی متفاوت که در نتیجه حرکات سلولی در مجاورت هم قرار می­گیرند یکی از اتفاقات معمول طی تکوین جنین است. این برهم­کنش‏های دو سویه، دقیقا زمان­بندی شده، منظم و زنجیر وار اساس تکوین تعدادی از اندام‏های جنین را  تشکیل می­دهد (1، 2، 3 و 4). مطالعات زیادی روی برهم کنش‏های مزانشیمی-اکتودرمی پوست و ضمائم پوستی (فولیکول مو، فولیکول پر و غدد پستانی) انجام گرفته و در این مطالعات نقش حیاتی این برهم­کنش‏ها در تکوین طبیعی پوست و ضمایم آن نشان داده شده است (12-5). علاوه بر اهمیت این برهم­کنش­ها در طی تکوین جنینی شواهدی وجود دارد که پیشنهاد می‏کند این برهم­کنش‏ها برای رشد و تمایز صحیح اپی­تلیوم در موجود بالغ نیز حیاتی می­باشند (13). در پی این مطالعات چنین مطرح شده که فاکتورهای پیام رسانی وجود دارند که روی هر یک از اپی­تلیوم و مزانشیم عمل کرده و هومئوستازی آن‏ها را تنظیم می­کنند (14).

مطالعه این برهم­کنش‏ها و تاثیرات مستقیم آن در شرایط in vivo و طی فرآیند مورفوژنز سخت و دشوار است چرا که متغیرهای بسیاری در این موضوع دخالت دارند و اینکه نمی­توان به‏آسانی شرایط آزمایش را تحت کنترل قرار داد. از این‏رو، برای درک بهتر ماهیت این برهم­کنش‏ها محققین به تکنیک‏های نوترکیبی مراجعه می­کنند. در این تکنیک‏ها، بافت‏های در حال تکوین درمی –اپی‏درمی از یکدیگر جدا شده و با بافت‏هایی از حیوان هم نوع ولی از ناحیه متفاوتی از بدن (Heterotopic)، حیوان هم‏نوع  ولی متفاوت از نظر تکوین (Heterochronic) و یا حیوانی که در رده متفاوتی قرار دارد (Heterospecific) مجاور می­شوند. این بافت‏های نوترکیب شده سپس یا در شرایط in vitro کشت می­شوند یا روی پرده کوریوآلانتوئیک جوجه قرار می­گیرند و یا به یک میزبان مناسب پیوند می­شوند. چنین آزمایشات نوترکیبی نه تنها کرونولوژی و آبشار وقایع را طی تکوین ضمایم پوستی مشخص می­کند بلکه نقش هر بافت را در این اتفاقات آشکار می­کند (15)

با استفاده از نوترکیبی­های heterospecific که در آغاز بین بافت‏های جنین موش و جنین جوجه انجام شد مشخص شد که ویژگی گونه­ای  (species specificity) ضمایم پوستی در اپی‏درم نهفته است  (16، 17و 18). از این آزمایشات چنین استنتاج می­شد که ظاهرا درم یک نقش تعیین کننده در تکوین ضمایم پوستی ندارد. اما مطالعات بعدی مشخص کرد که درم نیز یک نقش غیرقابل انکاری در این فرآیند دارد. همچنین نشان داده شده است که علاوه بر القای اولیه اپی‏درم، درم در تمام مراحل تشکیل ضمایم پوستی نقش دارد. به‏علاوه، مشخص شده که مورفولوژی و طرح ضمائم پوستی به‏وسیله درم تعیین می‏شود (19). مطالعات انجام شده روی برهم­کنش‏های درمی-اپی‏درمی طی بلوغ نیز پیشنهاد می­کند که حتی در بلوغ نیز درم به‏طور مداوم و موثر روی سرنوشت اپی‏درم تاثیر می­گذارد. این شاهد از انجام نوترکیبی­هایی می‏­آید که بین فولیکول پر و فولیکول مو انجام گرفته است (20).

به‏دنبال کشت سلول‏های پاپیلای درمی حاصل از ضمایم پوستی (مو، پشم و ویبریسا) محققین نشان دادند که این سلول‏ها همچون بافت‏های کامل خود ویژگی القایی را حفظ می­کنند به‏نحوی‏که این سلول‏های کشت شده می­توانستند تولید مو را بر روی پوست گوش القا کنند (21). با وجود این یافته­های جالب توجه، هنوز سوالات بی­جواب متعددی در زمینه برهم­کنش­های درمی-اپی‏درمی وجود دارد. لیکن در این مقاله  سعی می­شود به یک سوال جواب داده شود و آن اینکه سلول‏های درمی مشتق شده از سایر ضمایم اپی‏درمی (در اینجا چنگال موش صحرایی) نیز قابلیت­های القایی مشابه آنچه در سلول‏های درمی فولیکول مو و پر مشاهده می­شود را به نمایش می­گذارند یا خیر.

ناخن در انسان‏ها و چنگال در حیوانات غیر-پریمات نیز یک زائده پوستی محسوب می­شود که در طی مراحل جنینی در نتیجه برهم­کنش‏های درمی-اپی‏درمی ایجاد می­شود. اگرچه، برخلاف فولیکول مو، چنگال و ناخن دارای رشد مداوم بوده و فاقد مرحله استراحت می­باشند ولی در سرتاسر حیاتشان بین این دو شباهت‏هایی وجود دارد. پیشنهاد شده که ناخن و چنگال در واقع شکل تانخورده و باز شده فولیکول مو هستند. همچنین از لحاظ بیوشیمیایی نیز این دو ساختار شباهت زیادی به‏هم نشان می­دهند (22). علی‏رغم این شباهت‏ها بر اساس سابقه تحقیقات نوترکیبی تاکنون پژوهشی بر روی ویژگی‏های القایی بخش درمی ناخن یا چنگال صورت نگرفته است. از این‏رو در این مطالعه علاوه بر بررسی ویژگی‏های سلول‏های درمی چنگال در محیط کشت به این سوال پرداخته می­شود که آیا سلول‏های درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی دارای این قابلیت هستند که در پیوند با اپی‏درم هتروتوپیک (فولیکول مو) تشکیل ضمائم پوستی را  القا کنند؟ و اگر این قابلیت را دارند در نتیجه این نوترکیبی چه زائده پوستی به‏وجود می‏آید؟

مواد و روش‏ها

بافت شناسی: بعد از طی دوره نحوه رفتار با حیوانات و کسب مجوز مربوطه از کمیته اخلاق دانشگاه، به‏منظور دستیابی به دانش و فهم دقیق‏تری از مورفولوژی و محل دقیق قرارگیری سلول‏های درمی در چنگال موش صحرایی نژاد                PVG (inbred Piebald Virol Glaxo)، یک نوزاد موش 4 روزه انتخاب شد. حیوان با دوز بالایی از CO2 کشته و انگشتان دست و پای آن با کمک یک تیغه اسکالپل قطع شد. انگشتان در محلول فرمالین نمکی 4 درصد تثبیت شدند و نمونه­های تثبیت شده متعاقبا به‏طریق معمول برای مطالعات بافت شناسی آماده شد.

جداسازی و کشت سلول‏های درمی از بستر چنگال: برای این بخش موش­هایی با سنین بین 4 تا 30 روز استفاده  شد. حیوانات با دوز بالایی از CO2 کشته و سپس انتهای اندام­های حرکتی آن‏ها با اتانول 70 درصد شستشو داده شد. با استفاده از یک تیغه اسکالپل نوک انگشتان از محل آخرین مفصل منتهی به چنگال قطع گردید (شکل a1) و قطعه‏های جدا شده بلافاصله در یک پتری دیش حاوی MEM و آنتی­بیوتیک­ها (100 U/ml  پنیسیلین، 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر دوز استروپتومایسین، 5/2 میکروگرم بر میلی‏لیتر فونگیزون، همگی تهیه شده از شرکت Gibco) قرار گرفت. در زیر استرئومیکرسکوپ و با استفاده از قیچی­ جراحی ظریف یک برش طولی در طول پوست بخش قطع شده ایجاد شد تا ساختارهای داخلی آشکار گردند. پوست نمونه­ها متعاقبا جدا شده و دور انداخته شد. ساختارهای داخلی قطعه­ها عبارت بودند از استخوان آخرین بند انگشت به‏اضافه بافت‏های مربوط به چنگال که به‏همراه هم به یک ظرف جدید MEM و آنتی­بیوتیک منتقل شد. در اینجا با کمک پنس­های ظریف صفحه کراتینه چنگال به‏آرامی از استخوان جدا و دور انداخته شد. بافت پاپیلای درمی که درست زیر صفحه کراتینه قرار می­گیرند اکنون تنها بافتی بودند که چسبیده به سطح استخوان آخرین بند انگشت باقی مانده بود. اکنون این بافت به‏آرامی با کمک پنس­ و نوک سوزن سرنگ از استخوان جدا شده (شکل b1) و به ظروف کشت 35 میلی‏متر انتقال یافت. این بافت‏ها ابتدا در یک یا دو قطره محیط کشت ] MEM + 20 درصد سرم جنین گاوی (FCS) + آنتی‏بیوتیک­ها[ کشت داده شد.شرایط داخلی انکوباتور برای کشت عبارت بود از دمای 37 درجه سانتی‏گراد، 95 درصد اکسیژن و 5 درصد .CO2 ظروف چهار روز پس از کشت در زیر میکروسکوپ اینورت مورد مشاهده قرار گرفته و پس از دیدن نشانه­ای دال بر چسبیدن بافت‏ها به کف ظرف و شروع رشد سلول‏ها، 2 میلی­لیتر از همان محیط کشت به ظروف اضافه ­شد. پس از ایجاد، رشد و خروج کامل سلول‏ها از بافت‏ها (tissue explants) و همچنین در ادامه کار تا رسیدن به مرحله پاساژ سلول‏ها با محیط کشت ] MEM + 10 درصد سرم جنین گاوی (FCS) + آنتی­بیوتیک­ها[ تغذیه شد (شکل c1).

رنگ آمیزی سلول‏های کشت شده با رنگ حیاتی 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate  یا  DiI

برای آشکار کردن قابلیت القایی سلول‏های درمی حاصل از چنگال در برهم‏کنش با اپی‏درم هتروتوپیک (اپی‏درم فولیکول ویبریسا و اپی‏درم گوش) در شرایط in vivo، ابتدا سلول‏های درمی کشت داده شده بعد از پاساژ 2 و 3 با  رنگ حیاتیDiI رنگ آمیزی شدند (شکل d1). هدف از این‏کار این بود که ما بتوانیم تا بدون آسیب رساندن به سلول‏ها در انتهای کار سرنوشت سلول‏های پیوند شده را در محل پیوند تعقیب کنیم. برای این منظور بعد از تریپسینه ­کردن و سانتریفوژ نمودن سلول‏ها، پلیت سلولی کف لوله سانتریفوژ در یک میلی‏لیتر MEM حاوی 5 میکرومول FM-DiI (مولکولار پروبز، آمریکا) به‏حالت سوسپانسیون درآمد. سوسپانسیون سلولی متعاقبا ابتدا برای مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و بعد برای 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد  انکوبه شد. سلول‏ها سپس در شرایط rpm1800 سانتریفوژ و محلول رویی (supernatant) حاوی رنگ اضافی دور ریخته شد. پلت سلولی با 5 میلی‏لیتر MEM به‏صورت سوسپانسون درآمد و سوسپانسیون دوباره به‏صورت قبل سانتریفوژ شد. در این مرحله پلت سلولی در MEM حاوی 10 درصد  FCS به‏حالت سوسپانسیون درآمد و در همین محیط به ظروف کشت 35 میلی‏متر منتقل شد. ظروف برای مدت 3 روز در شرایط تاریکی و دمای 37 درجه سانتی‏گراد خوابانده شدند. بعد از پایان این مدت محیط کشت سلول‏ها با محیط کشت MEM تنها تعویض شد. ظروف در این محیط برای 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند تا اینکه برای پیوند زدن به‏طریقی که شرح آن در زیر می‏آید آماده شوند.

پیوند سلول‏های رنگ آمیزی شده با DiI به داخل فولیکول ویبریسای قطع شده (فاقد پاپیلای درمی): برای پیوند 2 موش صحرایی با سن 4 ماه به‏عنوان پذیرنده سلول‏های پیوندی انتخاب شدند و محل پیوند فولیکول­های ویبرسا (موهای زبر و درشت پشت لب فوقانی جوندگان و سایر پستانداران) بود. موش‏ها با کمک فلوتن (Mallinckrodt Veterinary Ltd, UK) بی‏هوش شدند. سپس با کمک قیچی و تیغه اسکالپل ظریف پوست ناحیه لب فوقانی از عقب ناحیه­ای که ویبریسا قرار دارند بریده و ناحیه بریده با روشی که با جزئیات در جای دیگر  شرح داده شده است (22) معکوس شد تا فولیکول­ها در معرض قرار گرفتند. فولیکول‏ها سپس به‏طور مجزا از بافت‏های همبند اطراف آزاد شدند و موقعیت آن‏ها بر مبنای فرمول اولیور (23) ثبت شد. عملیات پیوند روی فولیکول‏های بزرگ‏تر که در آخرین ردیف پشتی-شکمی قرار می­گیرند انجام گرفت. فولیکول­ها بر طبق روش معمول و استاندارد برای پذیرش سلول‏های پیوندی آماده شدند (24). به‏طور خلاصه، ابتدا با استفاده از پنس فولیکول‏ها از محل اتصال به سطح پوست گرفته شده و سپس طولی از فولیکول با کمک قیچی ظریفی قطع شدند (شکل a2). محل قطع شدگی درست در بالای محل ورود عصب به دیواره کپسول فولیکول بود و با این‏کار به‏عبارتی نیمه فوقانی فولیکول (شکل b2) از نیمه تحتانی فولیکول (شکل b2) جدا شد. نیمه تحتانی سپس دور انداخته شد (ناحیه تحتانی همان محلی است که سلول‏های پاپیلای درمی خود فولیکول در آن قرار می­گیرند). سپس رشته ویبرسای موجود در نیمه فوقانی و به‏جا مانده فولیکول قطع شده از فولیکول کنده ­شد (شکل c2) تا با این‏کار فضای لازم برای جا دادن سلول‏های پیوندی مهیا شود. پس از آماده شدن نیمه فولیکول­های پذیرنده به‏سراغ ظروف کشت سلول‏های درمی چنگال که با DiI رنگ شده بودند رفته و بعد از دور ریختن محیط کشت روی سلول‏ها، تک­لایه سلولی روی کف ظرف با کمک یک تیغه لاستیکی تراشیده شده (e1) و به‏صورت یک توده (clamp) جمع آوری شد. این توده سلولی سپس به‏وسیله پنس به فضایی که در انتهای نیمه فولیکول­ها قرار داشت و از کندن رشته ویبرسا ایجاد شده بود منتقل شد (شکل d2). به‏طور کلی تعداد 9 نیمه فولیکول به این طریق سلول‏های درمی رنگ شده با DiI را دریافت نمودند. بعد از تزریق سلول‏ها به این نیمه فولیکول­ها، پوست این ناحیه به‏حالت اول برگردانده شده و بریدگی ایجاد شده بخیه زده ­شد. موش­ها سپس به‏هوش آورده شده و به قفس­های مجزا منتقل شدند. ذکر این نکته ضروری است که پس از به‏هوش آمدن، این حیوانات مشکلی در خوردن و آشامیدن نداشتند. بعد از 20 روز از عملیات پیوند شدن، موش­های میزبان کشته شده و نیمه فولیکول‏های دریافت کننده پیوند جدا و به‏طور فوری با مایع tissue-tek (میلز، آمریکا) قالب گیری و با نیتروژن مایع فریز شدند. با استفاده از میکروتوم کرایوستات (برایت، انگلستان) برش‏های 6 میکرومتری تهیه و بر روی لام قرار داده شدند. سپس به‏طور سریع برش­ها در زیر میکروسکوپ فلورسنس مجهز به فیلتر فلورسنس رودامین و همچنین عدسی­های فازکنتراست مورد مشاهده قرار گرفتند.

 

 

شکل 1: مراحل آماده سازی و پیوند سلول‏های پاپیلای درمی چنگال به نیمه فولیکول ویبریسا. محل قرار گیری بافت پاپیلای درمی در چنگال (1a)، خارج کردن بافت پاپیلا (1b)، کشت بافت در محیط کشت (1c)، رنگ آمیزی سلول‏های کشت شده با DiI (1d)، پیوند سلول‏ها به نیمه بالایی نیمه‏ فولیکول ویبریسا.دو نیمه کردن فولیکول ویبریسا (2a) دور انداختن نیمه پائینی فولیکول (2b)، کندن رشته مو از نیمه بالایی فولیکول (2c)، پذیرش سلول‏های درمی چنگال به فضای برجای مانده از محل رشته مو (2d). 

 

 

پیوند زدن سلول‏های رنگ آمیزی شده با1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (DiI) به‏داخل زخم­های ایجاد شده در لاله گوش: تعداد 3 موش بالغ با کمک فلوتن به‏طور سبک بی‏هوش شده و لاله گوش‏های آن‏ها  با الکل 70 درصد شستشو داده شد. سپس با در دست گرفتن گوش‏ها با کمک یک تیغه اسکالپل شماره 11 یک زخم طولی کوچکی به‏طول 3 تا 4 میلی­متر در مرکز گوش ایجاد شد. سپس یک سر سوزن سرنگ از طریق این زخم به‏داخل درم عبور داده شد تا فضای لازم برای سلول‏های پیوندی را ایجاد کند. حال هر گونه خون و ترشحات دیگر زخم و اطراف آن با کمک دستمال استریل پاک شد تا کار برای پیوند سلول‏های درمی رنگ شده با DiI آماده گردد. برای پیوند زدن این سلول‏ها دوباره به همان طریقی که در قسمت قبل شرح داده سلول‏ها از کف ظروف تراشیده شده و توده سلولی به‏دست آمده با کمک پنس­ ظریفی به‏داخل فضای ایجاد شده در زخم گوش جاسازی شد. حال محل زخم برای چند دقیه­ای به‏حال خود رها شد تا لایه سطحی سلول‏های پیوندی و ترشحات خونی پوست خشک شود. سپس به موش‏ها اجازه داده شد تا به‏هوش آیند و به قفس­های خود منتقل شوند. 7 تا 10 روز بعد از پیوند زدن، حیوانات مذکور کشته شده و بافت محل زخم بعد از جدا سازی به روش آن‏چه برای فولیکول­ها ذکر شد برای بررسی­های بافتی آماده شد.

نتایج

بافت شناسی

 چنگال در نتیجه برهم­کنش‏های مداوم و پیوسته­ای که در انتهای پشتی انگشتان اتفاق می­افتد تولید می­شود. بخش درمی یا پاپیلای چنگال با ماتریکس اپی‏درمی (مکان تولید سلول) که در بالای انتهای دیستال آخرین بند انگشت قرار دارد برهم­کنش می‏کند. پاپیلای درمی چنگال ویژگی‏ها و مشخصاتی را به نمایش می­گذارند که در سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول موی در حال رشد دیده می‏شود. به این ترتیب که پاپیلا با سلول‏های شبه‏ فیبروبلاستی اشغال می­شود که در یک ماتریکس خارج سلولی فراوان پراکنده­اند (شکل 2). ماتریکس خارج سلولی این پاپیلا به‏خوبی با آبی آلسین رنگ می­گیرد که نشانه این است که این ماتریکس غنی از ترکیبات گلیکوزآمینوگلیکان می­باشد. درست در بالای این پاپیلای درمی اپی­تلیومی قرار دارد که در واقع ادامه­ای از اپی‏درم پوست است که لایه‏های سلولی آن همچنان‏که به‏طرف سطح حرکت می­کنند دچار تمایز می­شوند. این سلول‏ها در مسیر حرکت به سطح بزرگتر، پهن­تر و طویل‏تر شده و هسته خود را از دست می­دهند. آن‏ها سرانجام صفحه ضخیم چنگال را می­سازند که از سلول‏های متراکم کراتینه شده تشکیل می­گردد.

 

 

شکل 2: ساختار بافت­شناسی چنگال موش صحرائی 4 روزه: (A) بزرگنمائی پائین از انتهای انگشت. چنگال به‏طور اساسی از 2 بخش اپی‏درمی (پیکان) و درمی (d) تشکیل می­شود. استخوان آخرین بند انگشت (b) هنوز استخوانی نشده و شامل سلول‏های غضروفی است. (B) بزرگنمائی بالاتر از همان ناحیه. بافت درمی یا پاپیلای چنگال (پیکان) از سلول‏هایی که در ماتریکس غنی از گیکوزآمینوگلیکان قرار دارند تشکیل می­شود. از این بافت درمی برای کشت سلولی استفاده شد.رنگ آمیزی: آبی آلسین- هماتوکسیلین-پونسوای S کورتیس. خط نشانه در A برابر با 100 میکرومتر و در B برابر 50 میکرومتر. 

 

کشت سلولی

ظروف کشت سلول‏های پاپیلای درمی چنگال سه روز بعد از انجام کشت مورد مشاهده قرار گرفتند. در این زمان سلول‏ها از تمام جهات شروع به خروج از پیرامون قطعه­های بافتی (tissue explants) کرده بودند. با وجود بعضی تغییرات، این سلول‏ها در حالت کلی کوچک و دوکی شکل بودند. در ابتدا هیچ تفاوتی از نظر اندازه و تراکم بین سلول‏های مجاور قطعه­های بافتی و سلول‏های حاشیه­ای وجود نداشت (شکل A3). با این‏حال، بعد از گذشت 2 تا 3 روز، سلول‏های مجاور بافت‏ها متراکم­تر از سلول‏های نواحی حاشیه­ای ظاهر می­شدند (شکل B3). سلول‏های حاشیه­ای دارای پاهای تیغه­ای متعددی بودند که اشاره به این داشت که فعالانه در حال حرکت و مهاجرت هستند. قابلیت تکثیر سلول‏های پاپیلای درمی بالا بود و سلول‏های در حال تقسیم به فراوانی در محیط کشت دیده می­شدند (شکل C3). در نتیجه این سرعت تکثیر بالا و مهاجرت فعال سلول‏ها، فرآیند گسترش سلولی در اطراف قطعات بافتی سریع بود و به تبع آن سلول‏ها در زمان کوتاهی (طی دو هفته) تمام فضای کف ظروف کشت را می­پوشاندند (شکل D3). این ویژگی حتی بعد از پاساژ سلول‏ها در آن‏ها حفظ می­شد به‏طوری‏که آن‏ها طی فقط چند روز بعد از پاساژ به‏حالت تک لایه پیوسته یا کانفلوئنت (confluent) می­رسیدند. در حالت کانفلوئنت، سلول‏ها مجتمع شده و توده­های سلولی متراکم (clumps) ایجاد می­کردند ولی این توده­های سلولی از لحاظ بزرگی به اندازه آن‏چه در مورد توده­های سلول‏های پاپیلای فولیکول مو دیده شده (21) نمی­رسیدند (شکل D3).

 

 

شکل 3: میکروگرا‏ف‏های فاز-کنتراست از سلول‏های پاپیلای درمی چنگال در محیط کشت. (A) سلول‏های درمی خارج شده از قطعه­های بافتی 4 روز پس از شروع کشت. سلول‏ها عمدتا دوکی شکل بوده و دارای پاهای تیغه­ای مشخص هستند. (B) بعد از 7 روز از شروع کشت سلول‏های مجاور قطعه‏های بافتی متراکم­تر از سلول‏های پیرامونی مشاهده می­شوند. (C) سلول‏های در حال تقسیم متعددی (پیکان) در میان سلول‏های درمی محیط کشت وجود داشت. (D) در مرحله کانفلوئنت سلول‏های درمی تشکیل مجتمع­ها و توده­های کوچکی از سلول‏ها (پیکان) را می­دادند. خط نشانه در A، B و C برابر 25 میکرومتر، در D برابر با 150 میکرومتر. 

 

 

 

 

نشان‏دار کردن سلول‏های کشت شده یا آنتی‏بادی ASMA

برای آشکار کردن سایر ویژگی‏های سلول‏های پاپیلای درمی چنگال، این سلول‏ها بعد از پاساژ 2 و 3 با آنتی­بادی ASMA نشان‏دار شدند. تقریبا 85 تا 90 درصد این سلول‏ها با این آنتی­بادی نشان‏دار و این ترکیب در تمام میکروفیلامنت‏های سیتوپلاسمی بیان گردید (شکل 4). با این وجود شدت رنگ گرفتن فیلامنت‏های موجود در پاهای تیغه­ای بیشتر از بقیه سیتوپلاسم بود. همچنین  این آنتی‏بادی در سلول‏های پهن و پراکنده با شدت بیشتری نسبت به سلول‏های کوچک و متراکم ظاهر می­شد.

 

 

شکل 4: رنگ آمیزی ایمونوفلورسنس از سلول‏های درمی چنگال در محیط کشت با آنتی بادی ASMA. اکثریت سلول‏ها این پروتئین اسکلت سلولی را در سیتوپلاسم (به‏ویژه در پاهای تیغه­ای) بیان می‏کنند ولی بیان این پروتئین در سلول‏های پهن (پیکان بزرگ) شدیدتر از سلول‏های کوچک و متراکم (نوک پیکان) است. خط نشانه برابر 50 میکرومتر.  

 

 

توانایی برهم­کنشی سلول‏های درمی پاپیلای چنگال

 به‏منظور ارزیابی قابلیت­های برهم­کنشی، سلول‏های کشت شده چنگال ابتدا با DiI رنگ شده و سپس به‏داخل زخم­های ایجاد شده در لاله گوش و یا نیمه بالایی فولیکول ویبریسا موش صحرایی وارد شد. بررسی­های بافت­شناسی گوش­های دریافت کننده سلول در 7 تا 10 روز پس از وارد نمودن سلول‏ها نشان داد که ناحیه پذیرنده سلول به‏دلیل گسیختگی بافت‏ها به‏راحتی از نواحی اطراف قابل تشخیص است (شکل A5). اما هیچ‏گونه ساختار بافتی در محل سلول‏های وارد شده مشاهده نشد. برای پی بردن به موقعیت و مکان سلول‏های کاشته شده، برش­های بافتی تهیه شده از گوش میزبان زیر میکروسکوپ فلورسانس مجهز به فیلتر رودامین مورد مشاهده قرار گرفتند. سلول‏های کاشته شده پاپیلای چنگال عمدتا به‏صورت توده­های مجتمعی در عمق بافت گوش وجود داشتند، هر چند که تعدادی از این سلول‏ها نیز به‏طور پراکنده در پیرامون محل زخم دیده می­شدند (شکل B5). اما، این سلول‏ها در ساختمان و یا در ارتباط با هیچ ساختار بافتی (از قبیل فولیکول مو و یا غیره) مشاهده نشدند. علاوه براین، هیچ اثری از سلول‏های درمی وارد شده در ساختار بافت‏های میزبان و ضمائم آن مشاهده نشد.

همچنین بررسی نیمه‏ فولیکول‏های ویبریسای دریافت کننده سلول‏های پاپیلای چنگال بعد از 20 روز از آزمایش مشخص کرد که قسمت تحتانی این نیمه فولیکول‏ها ظاهرا با کمک همکاری سلول‏های پیوندی التیام یافته و یک بافت جوش‏گاهی در این ناحیه شکل گرفته است. اما از این نیمه فولیکول‏ها هیچ ساختاری (از قبیل رشته مو و ...) منشا نگرفته بود (شکل C5). مشاهدات بافت­شناسی نیز نشان داد که هیچ نشانه­ای از ترمیم فولیکول و ایجاد مو یا تشکیل یک زائده پوستی دیگر در این نیمه فولیکول‏ها مشاهده نمی­شود. بررسی برش‏های تهیه شده از این نیمه فولیکول‏ها زیر میکروسکوپ فلورسانس تایید کرد که هرچند تعدادی از سلول‏های رنگ شده به‏طور پراکنده در بخش فوقانی این فولیکول‏ها دیده می­شوند لیکن بخش اصلی سلول‏های پیوند شده هنوز در انتهای تحتانی فولیکول­ها، یعنی همان جایی که سلول‏ها به آ ن وارد شدند، باقی مانده­اند (شکل D5).

 

 

شکل 5: میکروگراف‏های فاز-کنتراست و فلورسنس از بافت‏های دریافت کننده سلول‏های پاپیلای درمی کشت شده. (A) برش بافتی از ناحیه­ای از گوش که سلول‏های درمی رنگ شده با DiI را دریافت کرده بود. هیچ نشانه­ای از تشکیل ساختار پوستی در محل پیوند دیده نمی شود. محل وارد کردن سلول‏ها (der)، موقعیت زخم ایحاد شده (پیکان). (B) تصویر گرفته شده از محل پیوند با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس. همان‏طور که مشاهده می‏شود سلول‏های درمی چنگال (رنگ قرمز) هنوز هم در محل پیوند مشاهده می­شوند. (C) نیمه فولیکول دریافت کننده سلول‏های درمی نیز نشانه­ای از ایجاد برهم­کنش بین سلول‏های پیوندی و اپی‏درم بافت میزبان (پیکان) در آن دیده نمی­شود. (D) مشاهده نیمه فولیکول دریافت کننده سلول نیز نشان داد که بعد از گذشت 2 روز هنوز نیز سلول‏های درمی (رنگ قرمز) در محل پیوند مشاهده می­شوند. خط نشانه در A برابر 25 میکرومتر، در B و C برابر 100 میکرومتر و در D برابر با 50 میکرومتر.

                                                 

 

بحث

در این پژوهش بررسی بافت­شناسی چنگال نشان داد این ساختار نیز همچون سایر ضمائم پوستی از دو بخش درمی و اپی‏درمی تشکیل می­شود و در نتیجه برهم­کنش همین دو بخش است که به‏طور ممتد صفحه کراتینی چنگال و یا ناخن در طول عمر حیوان  رشد می‏کند. این برهم­کنش نه تنها در دوره جنینی که در تمام دوره بلوغ ادامه دارد. فاکتورهای متعددی شناسایی شده که در این برهم­کنش میان درم و اپی‏درم دخالت دارند (25). تحقیقات انجام شده اهمیت نقش فاکتور رونویسی LIM 1B را در تشکیل چنگال (و همچنین اندام حرکتی) در جنین موش نشان داده است. این فاکتور همچنین در ایجاد قطبیت پشتی-شکمی اندام حرکتی در حال نمو نقش دارد (26). چنین تصور می­رود که LIM 1B نقش خود را از طریق مسیر اسپوندین به‏انجام می‏رساند. اسپوندین­ها خانواده­ای از پروتئین­ها هستند که در ارتباطات درون سلولی مشارکت دارند. نشان داده شده که برای مثال، اسپوندین 4 در تعیین فعالیت سیستم پیام رسانی Wnt/بتا کتنین دخالت دارد و این مسیر نیز به‏نوبه خود در شروع فرآیند تشکیل چنگال نقش بازی می­کند (27 و 28). موش‏هایی که در تولید اسپوندین دارای نقص هستند انواعی از ناهنجاری‏ها از جمله نداشتن چنگال را به نمایش می­گذارند (29). عقیده بر این است که در ضمائم پوستی اسپوندین موجود در سلول‏های درمی در القا اپی‏درم رویی و شروع فرآیند نمو این ضمائم نقش دارد و نشان داده شده که سلول‏های درمی که فاقد اسپوندین هستند (فیبروبلاست) این خاصیت القایی را بروز نمی­دهند (30). علاوه بر اسپوندین ژن Akt نیز در تشکیل چنگال اهمیت دارد. موش‏های ترنسژنیکی که واجد تغییراتی در این ژن هستند فاقد چنگال می­باشند. محصول ژن Akt یک پروتئین کیناز سرین/ترئونین است که در پیام رسانی سلولی نقش دارد (31). برخلاف اسپوندین که در بافت مزانشیمی وجود دارد و مسئول برهم­کنش بین مزانشیم و اکتودرم است، Akt در اپی­تلیال قرار دارد و تصور می­شود یک نقشی در عمل‏کرد پروتئین ریخت زای استخوان یا Bone morphgenic protein (BMP) بازی می­کند. این پروتئین علاوه بر اینکه در تشکیل چنگال دخالت دارد یک نقش حمایتی در نمو چنگال بازی می­کند، ضمن اینکه در قابلیت ترمیم آخرین بند انگشت انسان در دوره نوزادی نیز نقش دارد (32). بنابراین چنین به‏نظر می­رسد که این ارتباطات دوجانبه (اپی‏درم-درم) لازمه تشکیل چنگال است و اگر اختلالی در این ارتباطات به‏وجود آید نتیجه آن ایجاد عدم تشکیل چنگال و یا ناهنجاری‏های همچون هیپوپلاستیک چنگال می­شود (33).

مطالعات ایمونوهیستوشیمی انجام شده وجود ترکیبات متعددی را در بخش اپی‏درمی و درمی چنگال نشان داده است. انواعی از کراتین‏های نرم (soft)، کراتین 10-1، و کراتین­های سخت (hard)، کراتین 14، 16، 17، 31، 32، 81، 85 و 86 در بخش اپی‏درمی چنگال یافت شده است (34 و 35). همچنین در بخش درمی نیز مولکول‏های مختلفی بیان می­شود. در این تحقیق نشان داده شد که سلول‏های درمی در یک ماتریکس غنی از گلیکوزآمینوگلیکان (جزئی از ساختار پروتئوگلیکان‏ها) وجود دارند.گزارش شده که سلول‏های مزانشیمی بستر چنگال واجد ورسیکان (versican) هستند و این یک پروتئوگلیکان کوندروئیتین سولفات است که عضوی از خانواده لکتیکان­ها (lecticans) می­باشد (36). همچنین مشخص شده که در بخش درمی ویمنتین، دسمین و مهار کننده فعال کننده پلاسمینوژن نوع 2 ( plasminogen activator inhibitor  type 2) به‏شدت بیان می­شود  (26 و 37). در این پژوهش نشان داده شد که سلول‏های درمی چنگال در محیط کشت پروتئین ASMA بیان می­کنند و این مشاهده در راستای مطالعه­ای است که نشان داده سلول‏های درمی با آنتی­بادی HHF35 به‏شدت واکنش نشان می­دهند. آنتی­بادی مذکور به‏طور اختصاصی به اکتین متصل می­شود. پروتئین اکتین به‏همراه سایر پروتئین‏ها ضمن فراهم آوردن حمایت مکانیکی برای سلول در اعمال مختلف سلولی همچون انقباض، چسبندگی و حرکت دخالت دارد (38). در بافت‏های یوکاریوت‏ها سه نوع ایزوفرم اکتین ( آلفا، بتا. گاما) وجود دارد. در حالی‏که اکتین بتا به‏طور غیرافتراقی در تمام سلول‏های یوکاریوت وجود دارد، اکتین آلفای قلبی، اکتین آلفای اسکلتی و اکتین آلفای ماهیچه صاف (ASMA) به‏عنوان اکتین خاص-بافت در نظر گرفته می‏شوند. البته باید توجه داشت که علاوه بر سلول‏های ماهیچه صاف ASMA در سایر سلول‏ها نظیر میوفیبروبلاست، میواپی­تلیال و فیبروبلاست و سایر سلول‏هایی که خاصیت انقباضی دارند یافت می‏شود (39 و 40). بیش از چند دهه است که مشخص شده سلول‏های فیبروبلاست بافت همبند نیز فعالیت انقباضی شبه ماهیچه­ای از خود نشان می‏دهند. گزارش­هایی وجود دارد که نشان می‏دهد انقباض فیبروبلاست‏ها در بافت همبند یک نقش کلیدی در بسته شدن زخم‏ها در جریان التیام جراحت پوست بازی می‏کند و تایید شده که این رفتار انقباضی فیبروبلاست‏ها  ناشی از وجود ASMA در آن‏ها می­باشد (41). نقش ASMA در سلول‏های درمی بستر چنگال احتمالا اعمال نیروی انقباضی در جهت آرایش و سازمان‏بندی سلول‏های کراتینی چنگال یا ناخن و همچنین راندن بافت ساخته شده به‏سمت بیرون می­باشد، چیزی مشابه وظیفه­ای که برای این پروتئین در دیگر ساختار پوستی یعنی غده پستانی مشخص شده است. گزارشی وجود دارد که  ASMA موجود در سلول‏های میواپی‏تلیال غده پستانی در انقباض این سلول‏ها و آزاد سازی شیر از سلول‏های لومینال دخالت دارد (42). ولی اینکه این پروتئین در چنگال نیز دقیقا نقش انقباضی دارد یا در اعمال دیگر نیز مشارکت دارد یا خیر احتیاج به شواهد و مدارک بیشتری دارد.

نتایج حاصل از کشت سلولی در این مطالعه نشان داد که سلول‏های درمی چنگال از لحاط ویژگی‏های رشد مشخصات فیبروبلاست‏ها را به نمایش می­گذارند. اما اینکه آن‏ها برخلاف فیبروبلاست‏ها (که معمولا تجمع سلولی تشکیل نمی­دهند) همچون سلول‏های پاپیلای درمی تجمع سلولی (aggregation) مختصری در مرحله کانفلوئنت را به‏نمایش می­گذارند (21) این احتمال را مطرح کرد که سلول‏های درمی چنگال ممکن است ویژگی‏های مشابهی با سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو داشته باشند. با بهره­گیری و اتکا به این احتمال در این تحقیق قابلیت­های سلول‏های درمی حاصل از چنگال در برهم­کنش با سلول‏های اکتودرمی ضمایم دیگر (هتروتوپیک) مورد بررسی قرار گرفت، چرا که قبلا نشان داده شده بود که سلول‏های پاپیلای درمی و غلاف درمی فولیکول مو قادر به القا اپی‏درم اکتوپیک هستند (43 و 44). لیکن نتایج حاصل از پیوند سلول‏های درمی چنگال به مجاورت اپی‏درم اکتوپیک در مطالعه حاضر حاکی از این بود که قطع نظر از تعداد دفعات پاساژ، سلول‏های کشت شده درمی چنگال قادر به القای اپی‏درم در سایر ضمایم پوستی نیستند و به‏نظر می­رسید فاقد قدرت القایی هستند. به‏علاوه این مشاهده که توده سلول‏های پیوند شده حتی تا موقع برداشت هنوز هم در محل پیوند وجود داشتند تایید می‏کرد که عدم القای اپی‏درم هتروتوپیک ناشی از پراکنده شدن سلول‏ها و عدم وجود تعداد کافی از سلول‏ها برای القا نبوده است. بنابراین، در مقایسه با ویژگی‏های القایی پاپیلای درمی فولیکول مو که در مطالعات قبلی نشان داده شده است (45)، مطالعه حاضر مشخص کرد که این ویژگی سلول‏های درمی به‏طور فراگیر در تمام ضمائم پوستی دیده نمی­شود یا اگر بخواهیم دقیق­تر صحبت کنیم حداقل در مورد سلول‏های درمی چنگال دیده نمی­شود. گزارش شده که آنچه باعث هویت سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو و قابلیت آن‏ها برای شروع مورفوژنز  مو می‏شود فاکتور shh است که از طریق حلقه تنظیمی نوگین/shh نقش خود را باز می­کند (46). از فاکتورهای مطرح دیگر در اعطای قابلیت القایی به سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو BMP،  TGF-β2 و wnt است (50-47). اینکه آیا دلیل عدم قابلیت القایی در سلول‏های درمی چنگال به‏دلیل فقدان این فاکتورها است دقیقا مشخص نیست چرا که تاکنون تحقیقی در این رابطه بر روی این سلول‏ها انجام نگرفته است و انتظار می­رود که در پژوهش­های آینده این موضوع آشکار گردد.

 

نتیجه گیری

نتایج این آزمایش نشان داد که سلول‏های پاپیلای درمی چنگال از نظر ویژگی‏های مورفولوژیکی، کشت سلولی و بیان اکتین آلفای عضله صاف شباهت‏هایی را با سلول‏های پاپیلای درمی فولیکول مو نشان می­دهند. لیکن با وجود این شباهت‏ها، این سلول‏ها مانند همتایان خود در فولیکول مو  و بافت همبند گوش قادر به القای اپی‏درم هتروتوپیک و ایجاد یک زائده پوستی جدید نمی­باشند.

1. Marionnet C, Pierrard C, Vioux-Chagnoleau C, Sok J, et al. Interaction between fibroblasts and kerationocytes in mprphogenesis of dermal epidermal junction in a model of reconstructed skin. J. InV. Dermatol. 2006; 26(5): 971-979.
2. Watt FM, Fujiwara H. Cell-extracellular matrix interactions in normal and diseased skin. Col Spring Harbor Perspectives in Biology. 2011; 3(4): 1-15.
3. Sawyer RH, Rogers L, Washington L, Glenn TC. Evolutionary origin of feather epidermis. Developmental Dynamics. 2005; 232: 256-267.
4. Thangapazhan RL, DarlingTN, Meyerle J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. Int. J. Mol. Sci. 2014; 15(5): 8407-8427.
5. Mackenzie IC. Epithelial-mesenchymal interactions in the development and maintenance of epithelial tissues. In The Keratinocyte Handbook, Edited by IM. Leigh, EB. Lane & FM. Watt. 1994; CambridgeUniversity Press, pp. 243-257.
6. Olivera-Martinez I, Viallet JP, Michon F, Pearton DJ, et al. The different steps of skin formation in vertebrates. Int. J. Dev. Biol. 2004; 48: 107-115.
7. Bitgood MJ, McMahon AP. Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell-cell interaction in the mouse embryo. Dev. Biol. 1995; 172(1): 126-138.
8. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 2007; 445(7130): 834–842.
9. Sennett R, Rendl M. Mesenchymal-epithelial interactions during hair follicle morphogenesis and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 2012; 23(8): 917–927.
10. Paus R, Foitzik K, Welker P, Bulfone-Paus S, et al. Transforming growth factor-b receptor type I and II expression during murine hair follicle development and cycling. J. Invest. Dermatol. 1997; 109: 518-526.
11. Liu S, Zhang H, Duan E. Epidermal development in mammals; Key regulators, signals from beneath and stem cells. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14(6): 10869-10895.
12. Sakakura T. Epithelial-mesenchymal interactions in mammary gland development and its perturbation in relation to tumorigenesis. In Understanding breast cancer. Edited by M. A. Rich, J. C. Hager & P. 1983; Furmanski, Marcel-Dekker Inc., New York, pp. 261-284.
13. Fusenig NE. Epithelial-mesenchymal interactions regulate keratinocyte growth and differentiation in vitro. In The Karatinocyte Handbook. Edited by I. M. Leigh, E. B. Lane and F.
 
M. Watt, 1994; CambridgeUniversity Press, pp. 71-94.
14. Villone D, Fritsch A, Koch M, Bruncker-Tuderman L, et al. Supramolecular interactions in dermo-epidermal junction zone. J. Biol. Chem. 2008; 283(36): 24506-24513.
15. Dhouailly D. Dermo-epidermal interactions during morphogenesis of cutaneous in amniotes. Front. Matrix. Biol. 1977; 4: 86-121.
16. Coulombre JL, Coulombre AJ. Metaplastic induction of scales and feather in the corneal anterior epithelium of the chick embryo. Dev. Biol. 1971; 25: 464-478.
17. Kollar EJ. The induction of hair follicles by embryonic dermal papillae. J. Invest. Dermatol. 1970; 55: 374-378.
18. Dhouailly D. Dermo-epidermal interactions between birds and mammals: differentiation of cutaneous appendages. J. Embryol. Exp. Morphol. 1973; 30(3): 587-603.
19. Sengel P. Epidermal-dermal interactions. In Biology of the integument. II. Vertebrates. Edited by J. Bereiter-Hahn, AG. Maltoltsy & KS. Richarts, 1986; Springer Verlag, Berlin, pp. 374-408.
20. Cohen J. Transplantation of hair papillae. Sympos. Zool. Soc. Lond.1964; 12: 83-96
21. Jahoda CAB, Oliver RF. The growth of vibrissa dermal papilla cells in vitro. Br. J. Dermatol. 1981; 105: 623-627.
22. Dawber RPR, De Berker D, Baran R. Science of the nail apparatus. In Diseases of the nails and their management, Edited by R. Baran & RPR. Dawber, 1994; Blackwell Scientific Publications, pp 1-34.
23. Oliver RF. Whisker growth and regeneration in the hooded rat. Ph.D. thesis, 1965; University of Birmingham, UK.
24. Gharzi A. Comparison of Structural, Cell Culture and Inductive Features of Feather and Hair Follicles Components. J. Cell & Tissue (JCT), 2013; 4(2); 205-216.
25. Chen D, Jarrell A, Guo C, Lang, R, et al. Dermal beta-catenin activity in response to epidermal Wnt ligands is required for fibroblast proliferation and hair follicle initiation. Development. 2012; 139(8): 1522–1533.
26. De Berker DAR, Baran, R. Science of nail apparatus. In Baran’s and Dawker’s of the nails and their management, fourth edition, Edited by R. Baran, DAR. De Berker, 2012, John Wiley and Sons, Ltd, pp.1-50.
27. Blaydon DC, Ishii YO, Toole EA, Unsworth HC, et al. The gene encoding R-spondin 4 (RSPO4), a secreted protein implicated in Wnt signaling, is mutated in inherited anonychia. Nat Genet. 2006; 38(11): 1245 – 1247.
28. Ishii Y, Wajid M, Bazzi H, Fantauzzo KA, et al. Mutations in R-spondin 4 (RSPO4) underlie inherited anonychia. J. Invest. Dermatol. 2008; 128(4): 867 – 870.
29. Aoki M, Kiyonari H, Nakamura H, Okamoto H. R-spondin2 expression in the apical ectodermal ridge is essential for outgrowth and patterning in mouse limb development. Dev Growth Differ. 2008; 50(2): 85– 95.
30. Blaydon DC, Philpott MP, Kelsell DP. R-spondins in cutaneous biology: nails and cancer. Cell Cycle. 2007; 6(8): 895 – 897.
31. Segrelles C, Moral M, Lorz C, Santos M, et al. Constitutively active Akt induces ectodermal defects and impaired bone morphogenetic protein signaling. Mol Biol Cell. 2008; 19(1): 137 – 49.
32. Han M, Yang X, Lee J, Allan CH, Muneoka K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 2008; 315(1): 125 -135.
33. Baran R, Juhlin L. Bone dependent nail formation. Br J Dermatol. 1986; 114(3): 371-375.
34. De Berker D, Wojnarowska F, Sviland L, Westgate GE, et al. Keratin expression in the normal nail unit: markers of regional differentiation. Br. J. Dermatol. 2000; 142(1): 89 -96.
35. Okazaki M, Yoshimura K, Fujiwara H, Suzuki Y, et al. Induction of hard keratin expression in non-nail-matrical keratinocytes by nail-matrical fibroblasts through epithelial-mesenchymal interactions . Plast. Reconstr. Surg. 2003; 111: 286-290.
36. Lee DY, Yang JM, Mun GH. Onychofibroblasts induce hard keratin in skin keratinocytes in vitro. Br. J. Dermatol. 2009; 161(4): 960-962.
37. Lavker RM, Risse B, Brown H,  Ginsburg D, et al .Localisation of plasminogen activator inhibitor type 2 (PAI–2) in hair and nail: implications for terminal differentiation . J Invest Dermatol. 1998; 110: 917 – 922.
38. Furumura M, Ishikawa H. Actin bundles in human hair follicles as revealed by confocal microscopy. Cell Tissue Res.1996; 283: 425-434.
39. Kinner B, Gerstenfeld LC, Einhorn TA, Spector M. Expression of Smooth Muscle Actin in Connective Tissue Cells Participating in Fracture Healing in a Murine Model. Bone. 2002; 30(5): 738- 745.
40. Bello IO, Alanen K, Salo T. Alpha-smooth muscle actin within epithelial islands is predictive of ameloblastic carcinoma. Oral oncology. 2009; 45(9): 760-765.
41. Martin P. Wound healing- aiming for perfect skin regeneration. Science.1997; 276(5309): 75-81.
42. Widelitz RB, Velmaat JM, Mayer JA, Foley J, et al. Mammary glands and feathers: Comparing two skin appendages which help define novel classes during vertebrate evolution. Semin. Cell Develop. Biol. 2007; 18(2): 255–266.
43. Horne KA, Jahoda CAB, Oliver RF. Whisker growth induced by implantation of cultured dermal papilla cells in the adult rat. J. Embryol. Exp. Morphol. 1986; 97: 111-114.
44. Horne KA, Jahoda CAB. Restoration of hair growth by surgical implantation of follicular dermal sheath. Development. 1992; 116(3): 563-571.
45. Jahoda CAB, Oliver RF. Dermal papilla and the growth of hair. In Hair and hair diseases. Edited by CE. Orfanos and R. Happle, 1990; Springer-Verlag, Berlin, pp. 19-44.
46. Woo WM, Zhen HH, Oro AE. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 2012; 26: 1235–1246.
47. Inoue K, Aoi N, Yamauchi Y, Sato T, et al. TGF-β2 is specifically expressed in human dermal papilla cells and modulates hair folliculogenesis. J. Cell. Mol. Med. 2009; 13: 4643–4656.
48. Enshell-Seijffers D, Lindon C, Kashiwagi M, Morgan BA. beta-catenin activity in the dermal papilla regulates morphogenesis and regeneration of hair. Dev. Cell. 2010; 18: 633–642.
49. Kishimoto J, Burgeson E, Morgan BA. Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla. Genes Dev. 2000; 14: 1181–1185.
50. Rendl M, Polak L, Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 2008; 22: 543–557.