افزایش تولید بتا-کاروتن و گلیسرول در کشت سلولی Dunaliella salina توسط امواج فراصوت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه پیام نور، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تهران، ایران

2 دانشگاه شاهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر امواج فراصوت بر رشد و برخی شاخص‌های فیزیولوژیکی در کشت جلبک تک سلولی Dunaliella salina  بود. مواد و روش‌ها: امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلو هرتز و توان  W/Cm35، به کشت‏های سلولی در روز چهاردهم واکشت در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار اعمال شد. مدت زمان تابش امواج فراصوت به سلول‏ها 0، 5/2، 5 و 10 دقیقه بود. شاخص‌های مورد اندازه‌گیری عبارت بود از: رشد سلولی، پروتئین کل، رنگیزه‌های فتوسنتزی، پتانسیل آنتی‌اکسیدانتی، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، مقدار ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها، قندهای محلول، بتا-کاروتن  و گلیسرول. نتایج: نتایج نشان داد که با افزایش مدت زمان تابش امواج فراصوت رشد سلولی و مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی کاهش یافت. در مقابل مقدار پروتئین کل، پتانسیل آنتی‌اکسیدانتی، پراکسیداسیون لیپیدهای‌غشایی، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها، بتا-کاروتن و گلیسرول افزایش یافت. بیشترین میزان بتا-کاروتن  و گلیسرول به‏عنوان متابولیت‌های مهم در حالت تیمار 10 دقیقه تابش امواج فراصوت به‏دست آمد که به‏ترتیب 3/12 و 5/13 میلی‏گرم در لیتر بود. نتیجه‌گیری: به‌نظر می‏رسد امواج فراصوت با تحریک سلول‏ها و القای پاسخ‌های دفاعی و متابولیت ثانوی، باعث افزایش مقدار بتا-کاروتن و گلیسرول در سلول‏ها گردید.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


 

مقدمه

امروزه متابولیت‌های به‏دست آمده از سلول‏های جلبکی و گیاهی منبع ترکیبات مهم دارویی، بهداشتی، طعم دهنده‌های طبیعی، عطرها و رنگ‌ها می‌باشند. استفاده از کشت سلولی در تولید متابولیت‌ها در شرایط آزمایشگاهی مورد توجه قرار دارد. تولید متابولیت­های سلولی با خصوصیات اقتصادی از طریق کشت سلولی در شرایط آزمایشگاهی، فواید زیادی در مقایسه با استخراج این ترکیبات تحت شرایط طبیعی دارد. کنترل دقیق شاخص­های مختلف، سبب می‌شود که کیفیت مواد حاصل در طول زمان تغییر نکند، درحالی‏که در شرایط طبیعی مرتب تحت تاثیر شرایط آب و هوایی و آفات و بیماری‏ها قرار دارد (1).

القای تولید و تجمع متابولیت­های ثانوی در سلول‏ها بخشی از پاسخ­های دفاعی می­باشد که توسط الیسیتورها یا محرک‏ها صورت می­گیرد. از ­این­رو تیمار سلول‏های جلبکی و گیاهی با چنین عواملی یکی از روش­های سودمند برای افزایش تولید متابولیت­ها در کشت سلولی می­باشد (1). اخیرا مطالعات پراکنده­ای روی اثرات زیستی امواج فراصوت در کشت سلول گیاهی صورت گرفته اما در خصوص اثرات تحریک کنندگی آن در تولید متابولیت­ها در سلول‏های جلبکی اطلاعات چندانی وجود ندارد. افزایش بیوسنتز متابولیت­های ثانویه در سلول‏های گیاهی توسط امواج فراصوت با انرژی کم، گزارش شده است (2 ،3 و 4) و مشخص شده است که این افزایش در بیوسنتز متابولیت ثانوی بیشتر ناشی از القای فعالیت فیزیولوژیک سلول‏ها توسط فراصوت می‏باشد. به­همین دلیل امواج فراصوت با شدت و انرژی کم به‏عنوان الیسیتور فیزیکی یا غیر زیستی مد نظر قرار می‏گیرد.

مطالعات نشان داده است که فراصوت با شدت زیاد برای ترکیبات زیستی مخرب بوده و غشای سلول‏ها را تخریب کرده و مولکول­های زیستی نظیر آنزیم‏ها و DNA را غیر فعال می‏سازد (5). از طرف دیگر نشان داده شده است که فراصوت با شدت و انرژی کم، طیف وسیعی از اثرات زیستی غیر کشنده داشته که از اهمیت بالقوه­ای در بیوتکنولوژی برخوردار است. یکی از گسترده­ترین اثرات غیر مخرب فراصوت روی سلول‏های زنده، افزایش در نفوذپذیری غشا است که جذب ترکیبات خارجی و دفع فراورده­های درون­سلولی را توسط سلول‏ها افزایش می­دهد. گزارش‌هایی مبنی بر تغییر در بیان ژن، افزایش فعالیت آنزیم‌ها و هورمون‌های خاص توسط تابش امواج فراصوت به سلول‏ها وجود دارد (6 ، 7 ، 8 و 9). امواج فراصوت کاربردهای فراوانی در کشاورزی دارد و از جمله این کاربردها می‌توان به تیمار بذرهای گیاهان برای کاهش فاصله رشدی، کاهش و حذف آفات و بیماری‌ها و استفاده از آن در مهندسی ژنتیک و انتقال ژن اشاره کرد.

جلبک سبز تک سلولی Dunaliella salina از تولیدکنندگان مهم در دریا و دریاچه­های نمکی فوق اشباع است (10 و 11). از ترکیب­های مهم درون سلولی این جلبک می‏توان به انواع کاروتنوئیدها، گلیسرول، پروتئین و ویتامین­ها اشاره نمود. بخش عمده این ترکیب­ها دارای خاصیت ضداکسیدانتی و ضدسرطانی می‏باشند (12 و 13).

در زیست فناوری بر روش­های تولیدی جایگزین برای افزایش محصولات طبیعی تمرکز زیادی وجود دارد. یکی از روش­هایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیت­های اولیه و ثانوی سلول‏ها مورد توجه قرار دارد، روش کشت سلولی است. دست­ورزی کشت‏های سلولی با الیسیتورها یکی از استراتژی­های مهم جهت القای متابولیت­های ارزشمند در بیوتکنولوژی است. درارتباط با تاثیر عوامل فیزیکی از جمله امواج فراصوت بر سلول‏های جلبک D. salinaمطالعه­ای تاکنون صورت نگرفته است. بنابراین در این تحقیق سعی بر آن ­است تا با تابش امواج فراصوت بر سلول‏های این جلبک در محیط کشت تعلیقی، مقدار رشد و تولید متابولیت­ها از جمله بتا-کاروتن و گلیسرول مورد مطالعه قرار گیرد.

 

مواد و روش‏ها

شرایط کشت و رشد: مقدار 10 میلی‌لیتر از سوسپانسیون سلولی در شرایط استریل به 100 میلی‏لیتر از محیط کشت مایع جانسون استریل، با غلظت نمک دو مولار NaCl و اسیدیته 5/7 در ارلن مایرهایی با حجم 250 میلی‌لیتر افزوده شد به‏طوری‏که تعداد سلول‏ها در هر ارلن‌ مایر تقریبا 103×300 در هر میلی‏لیتر از سوسپانسیون جلبکی بود. سوسپانسیون‌های تهیه شده جلبکی در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و به‏مدت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بر روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه تحت تابش نور فلورسنت با شدت 2500 لوکس قرار گرفتند. بعد از گذشت 2 هفته که کشت‏های جلبکی در اواسط مرحله خطی دوره رشد خود قرار گرفتند، تیمار فراصوت اعمال شد.

تیمار سلول‏ها با امواج فراصوت: برای به‏کارگیری امواج فراصوت در دامنه­های کیلوهرتز پایین، از یک سیستم حمام اولتراسونیک (FALC Instruments, Italy) با فرکانس 40 کیلو هرتز و پهنای باند 320 هرتز به­صورت پیوسته مطابق روش Rezae و همکاران (14) استفاده گردید. امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلو هرتز و توان  W/cm35، در مدت زمان­های 0، 5/2، 5 و 10 دقیقه در روز چهاردهم واکشت سلول‏ها به کشت‏های سلولی در قالب طرح کاملا تصادفی و در سه تکرار اعمال شد. سطح آب در داخل حمام اولتراسونیک حدودا یک سانتی‏متر بالاتر از سطح محیط کشت درون ارلن­ها بود. کشت­های سلولی به‏مدت دو هفته در انکوباتور در دمای 5/0 ±25 درجه سانتی‌گراد و به‏مدت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بر روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه تحت تابش نور فلورسنت با شدت 2500 لوکس قرار گرفتند.

اندازه­گیری رشد و شاخص­های بیوشیمیایی رشد: توسط سمپلر از هر نمونه جلبکی مقدار کمی برداشته شد و روی لام مخصوص شمارش (لام نئوبار) ریخته شد و زیر میکروسکوب با بزرگنمایی 10 سلول‏ها شمارش شد. تعداد سلول‏های موجود در 10 مربع از این لام شمارش شده و میانگین آن ثبت گردید. از آنجائی‏که سلول‏ها متحرک بودند سلول‏های موجود در نمونه قبلا توسط بلور ید بی‏حرکت شدند .

کلروفیل و کاروتنوئید کل: مقدار کلروفیل a و b، کلروفیل کل (a+b) و کاروتنوئیدها با استفاده از روش اسپکتروفتومتری اندازه­گیری شد. 5 میلی‏لیتر از سوسپانسیون جلبکی به‏مدت 10 دقیقه با 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی دور ریخته شد. بر روی رسوب سلولی باقی مانده 5 میلی‏لیتر استون 85 درصد ریخته شد و بعد از هم‏زدن در تاریکی به‏مدت 5 دقیقه قرار داده شد. مخلوط حاصل مجددا به‏مدت 10 دقیقه با دور 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان جذب نور محلول رویی در طول موج‌های 663 و 644 و 452 نانومتر به‏کمک اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. به‏کمک رابطه­های زیر میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئید بر حسب میلی‏گرم در میلی‏لیتر به‏دست آمد (15).

C chla = 10.3 × E633 - 0.918 × E644

C chlb = 19.7 × E644 - 3.87 × E633

C car = 4.20 × E452.5 - 0.0264 × C chl.a - 0.496 × C chl.b

 

ترکیبات فنلی: پنج میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی سانتریفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ مایع رویی در ظرف جداگانه برای اندازه‌گیری میزان ترکیبات فنلی خارج سلولی نگه‏داری شد. مقدار 25/1 میلی‏لیتر از معرف Folin-cicolteu رقیق شده (10/1 ‌) و 1 میلی‏لیتر کربنات سدیم 7 درصد به رسوب سلولی و 5/0 میلی‏لیتر از مایع رویی نمونه­ها اضافه شد. نمونه‌ها  به‏مدت نیم ساعت در حرارت 45 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. بعد نمونه‌ها به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در انتها میزان جذب مایع رویی در طول موج 765 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد و مقدار کل ترکیبات فنلی با استفاده از استاندارد اسید سالیسیک تعیین شد.

 

پروتئین: مقدار پروتئین به­روش برادفورد (16) اندازه­گیری گردید. برای تعیین غلظت پروتئین‌های سلول‌ جلبک، 1 میلی‌لیتر از کشت سلولی نمونه‏برداری شد. نمونه‌ها به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. به رسوب سلولی بافر فسفات سدیم 100 میلی مولار (8/6pH= ) اضافه شد. برای متلاشی شدن سلول‏های جلبک و تسهیل در خروج پروتئین‌های داخل سلول‏ها، سوسپانسیون‌های سلولی به‏مدت 15 دقیقه در معرض امواج فراصوت با فرکانس40 کیلوهرتز قرار داده شد. پس از انجام سانتریفیوژ به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه، 100 میکرولیتر از محلول رویی برداشته شد و به آن 1 میلی‌لیتر محلول برادفورد اضافه شد. مقدار جذب نمونه­ها در طول موج 595  نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) قرائت شد و در انتها با استفاده از نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی غلظت پروتئین نمونه‌ها به‏دست آمد.

 

فلاونوئیدکل: برای سنجش فلاونوئیدها ابتدا 5/1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی با سرعت 6000 هزار دور در دقیقه به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس مایع رویی دور ریخته شد. به سلول‏های باقی مانده به نسبت 99 به 1 اتانول و اسید کلریدریک اضافه گردید. نمونه­ها به­مدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. سپس نمونه‌ها به‏مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از خنک شدن، نمونه‌ها به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. میزان جذب نمونه‌ها توسط اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر خوانده شد و مقدار فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد آپی­ژنین محاسبه شد (17).

 

قندهای محلول: یک میلی‏لیتر از سوسپانسیون­های جلبکی با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد و به سلول‏های جلبکی باقی مانده 5/0 میلی‌لیتر فنل 5 درصد و 5/2 میلی‌لیتر اسیدسولفوریک 98 درصد اضافه گردید. نمونه‏ها به­مدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. منحنی استاندارد با استفاده از غلظت‌های مختلف گلوکز ترسیم گردید. جذب نوری نمونه­ها و استانداردها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) در طول موج 490 نانومتر اندازه‌گیری شد (18).

 

آنتوسیانین کل: 3 میلی‏لیتر از سوسپانسیون­های سلولی به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد و 3 میلی‏لیتر متانول اسیدی (شامل متانول و اسید کلریدریک به نسبت 99 به 1) به آن اضافه شد. نمونه­ها به­مدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. سپس نمونه‌ها به‏مدت 15 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی نمونه‌ها برداشته شد و نمونه­ها به‏مدت یک شب در تاریکی قرار داده شدند و در انتها جذب آن‏ها در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین، از ضریب خاموشی Cm-1M-133000 استفاده شد (19).

 

تعیین سطح پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی: مقدار آسیب به غشا‌ها با اندازه‌گیری مقدار مالونیل دی آلوئید (MDA) به‏عنوان فرآورده‌ نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تعیین شد. پنج میلی‏لیتر از سوسپانسیون جلبکی به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و به نمونه‌ها 3 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد اضافه شد. پس از هم­زدن نمونه‌ها آن‏ها به‏مدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با قدرت 100 و فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفتند. سپس نمونه‌ها به‏مدت 15 دقیقه با  rpm12000 سانتریفیوژ شدند. پس از اتمام سانتریفیوژ، 1 میلی‌لیتر از هر کدام از نمونه‌ها  برداشته شده و به آن‏ها 1 میلی‌لیتر تیوباربیتوریک اسید 25/0 درصد اضافه شد و سپس به‏مدت نیم ساعت نمونه‌ها در دمای 100 درجه­سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از سرد شدن نمونه‌ها، در طول موج های 532 و 600 نانومتر مقدار جذب توسط اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) اندازه‌گیری گردید و مقدار MDA به کمک ضریب خاموشی /mM/cm 155 محاسبه گردید (20).

 

پتانسیل آنتی­اکسیدانتی: دو میلی‏لیتر از سوسپانسیون­های سلولی به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. به رسوب سلولی 2 میلی‏لیتر اتانول اضافه شد. نمونه­ها به­مدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. به نمونه‌ها  8/0 میلی‏لیتر DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 3/0 میلی‏مولار اضافه شد. بعد از گذشت نیم ساعت و انجام واکنش میزان پتانسیل آنتی‏اکسیدانتی سلول‏ها در طوح موج 517 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. درصد فعالیت آنتی‏اکسیدانتی طبق فرمول زیر محاسبه شد:

12AA%=100-Aظ†ظ…ظˆظ†ظ‡-Aط¨ظ„ط§ظ†ظƒ أ—100Aظƒظ†طھط±ظ„'>

محلول بلانک: 8/0 میلی‏لیتر اتانول + 2 میلی‏لیتر از نمونه و محلول کنترل: 8 /0 میلی‏لیتر DPPH + 2 میلی‏لیتر اتانول. A: جذب نور

بتا-کاروتن: از سوسپانسیون سلولی هرکدام از نمونه‌های جلبک 1 میلی‏لیتر به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و به نسبت 2 به 1 هگزان و اتانول به رسوب باقی مانده اضافه شد. به‏مدت 1 دقیقه نمونه‌ها با ورتکس شدیداً هم­زده شدند و سپس مجددا به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه نمونه‌ها سانتریفیوژ گردید. با جدا کردن فاز رویی (هگزان) و خواندن جذب در 450 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) میزان بتا-کاروتن سلول‏ها از طریق فرمول زیر به­دست آمد.

β-Carotene (µg/ml) = 25.2 × A450

 

گلیسرول: پنج میلی‌لیتر از نمونه جلبکی به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی پس از سانتریفیوژ دور ریخته شد، به این ترتیب گلیسرولی که از قبل درون نمونه بوده خارج گردید. به سلول‏های باقی مانده به­میزان 2 میلی‏لیتر از محیط کشت جانسون اضافه شد. چند ثانیه نمونه­ها به‏آرامی تکان داه شد، سپس میزان 200 میکرولیتر نمونه جلبکی جدا و به آن 1 میلی‏لیتر پریودات و 5/2 میلی‏لیتر استیل­استن افزوده گردید و به­آرامی تکان داده شد. سپس به‏مدت 20 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها مجددا به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس ­از ­آن میزان جذب نور مایع ­رویی در طول موج 410 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد و به­وسیله رسم منحنی استاندارد غلظت گلیسرول محاسبه شد (21).

نتایج

رشد سلولی و محتوی پروتئین

طبق نتایج به­دست آمده میزان رشد سلول‏ها با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه نسبت به گروه شاهد تفاوت معنی­داری داشت، به­طوری­که با افزایش زمان تابش تا زمان ده دقیقه از میزان رشد سلول‏ها کاسته شد و کمترین رشد سلولی در زمان 10 دقیقه تابش امواج فراصوت مشاهده شد. در خصوص مقدار پروتئین محلول نیز با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان10 دقیقه، افزایش معنی‏داری نسبت به گروه شاهد مشاهده شد. به‏طوری‏که بیشترین میزان پروتئین محلول مربوط به تیمار 10 دقیقه تابش امواج  فراصوت بود (شکل 1).

 

 

 

 

شکل 1: تغییرات میزان رشد (A) و میزان پروتئین (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina   (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) می­باشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنی­دار بودن تفاوت­ها در سطح 01/0 P است).

 

 

رنگیزه­های فتوسنتزی

 در تحقیق انجام شده افزایش زمان تابش امواج فراصوت باعث کاهش میزان کلروفیل a، کلروفیلb وکلروفیل­کل و همچنین تا­حدودی کاروتنوئیدها شده، به­این‏صورت­که میزان کاروتنوئیدها تا زمان پنج دقیقه تابش فراصوت کاهش داشت و با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 10دقیقه میزان کاروتنوئید افزایش یافت (شکل 2).

قندهای محلول و پراکسیداسیون لیپیدها

در این آزمایش با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 10 دقیقه مقدار قندهای محلول نسبت به گروه شاهد دارای اختلاف معنی­دار بود و افزایش داشت (شکل 3) در خصوص میزان پراکسیداسیون لیپیدها نیز با افزایش مدت زمان تابش امواج روند افزایشی مشاهده گردید و بیشترین آن در زمان ده دقیقه تابش اندازه­گیری شد (شکل 3).

تولید آنتوسیانین­ها و پتانسیل آنتی­اکسیدانتی

تیمار امواج فراصوت باعث القای تولید ترکیبات آنتوسیانینی در کشت­های سلولی شد. به­طوری‏که با گذشت زمان به­تدریج بر میزان تولید آن‏ها به­صورت معنی­دار نسبت به گروه شاهد افزوده شد. بیشترین مقدار این ترکیبات در زمان ده دقیقه تابش امواج فراصوت اندازه‏گیری شد. در تحقیق حاضر درصد پتانسیل آنتی­اکسیدانتی با افزایش زمان تابش امواج فراصوت به­عنوان یک الیسیتور و محرک سلول‏ها افزاش یافت. بیشترین پتانسیل آنتی­اکسیدانتی نیز در مدت زمان تابش ده دقیقه امواج مشاهده شد (شکل 4).

 

 

 

شکل2: تغییر در میزان کلروفیل a  (A)،کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و کاروتنوئیدها (D) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی کشت سلولی جلبک D. salina . (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی­دار بودن تفاوت‏ها در سطح 01/0P است).

 

شکل3: تغییر در میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی (A) و قندهای محلول (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina  (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی‏دار بودن تفاوت­ها در سطح 01/0 P است).

 

 

شکل4: تغییر در میزان  آنتوسیانین‏ها (A) و پتانسیل آنتی­اکسیدانی (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina  . (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) می­باشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنی­دار بودن تفاوت­ها در سطح 01/0P است).

 

 

تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی

تیمار امواج فراصوت باعث القای تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در کشت­های سلولی گردید. به­طوری‏که با گذشت زمان به­تدریج بر میزان تولید آن‏ها به­صورت معنی­دار نسبت به گروه شاهد افزوده شد. هر دو نوع ترکیبات فنلی با افزایش مدت زمان تابش امواج با یک روند صعودی و معنی­دار نسبت­به کنترل افزایش نشان دادند. البته بیشتر ترکیبات فنلی تولید شده از نوع درون سلولی بود. در خصوص فلاونوئیدها نیز در هر سه طول موج اندازه­گیری شده، افزایش معنی‏دار نسبت به کشت­های کنترل در کلیه مدت زمان‏های تابش مشاهده شد. بیشترین مقدار تولید این ترکیبات در زمان ده دقیقه تابش امواج بود (شکل 5).

تولید گلیسرول و بتا-کاروتن

در این تحقیق مشاهده شد که با افزایش مدت زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه، میزان گلیسرول و بتا-کاروتن اندازه­گیری شده سلول‏های جلبک نسبت به کشت­های شاهد افزایش معنی­داری داشت که بیشترین مقادیر آن‏ها به­ترتیب 3/12 و 5/13 میلی­گرم در لیتر بود که در مدت زمان تابش ده دقیقه اندازه‏گیری شد (شکل 6).

 

 

شکل 5: تغییر در میزان ترکیبات فنلی (A) و فلاونوئیدی (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina   (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ±SD (انحراف معیار) می­باشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنی‏دار بودن تفاوت‏ها در سطح 01/0 P است).

 

 

شکل 6: تغییر در میزان گلیسرول (A) و بتا کاروتن (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina   (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی­دار بودن تفاوت­ها در سطح 01/0 P است).

 

 

بحث

در ارتباط با اثر امواج فراصوت بر سلول گزارش شده است که افزایش مدت زمان تیمار امواج فراصوت با کاهش رشد و زنده مانی در سلول‏های گیاهی همراه بود (22). Wang و همکاران (3) نیز مشاهده نمودند که تابش امواج فراصوت به سلول‏های سرخدار (Taxus yunnanensis) منجر­به کاهش محسوس درصد زنده بودن سلولی شد. ازطرفی تابش کوتاه­مدت فراصوت اثر معنی­داری روی تولید ذیتوده در کشت سلولی سرخدار (Taxus chinensis) نداشت (23). به­کارگیری فراصوت در خصوص کشت­های تعلیقی سبب ایجاد وقایع هیدرودینامیکی پر انرژی نظیر حفره­زایی آکوستیک و جریانات میکروسکوپی می‏شود که باعث آسیب­های مکانیکی و تنش برشی به سلول‏ها می­شود (23). بنابراین احتمال وجود تنش­های مکانیکی در اثر امواج فراصوت وجود داشته که رشد سلول‏ها را تحت تاثیر قرار می­دهد. نتایج نشان داد که با گذشت زمان و تحت اثر تیمار تا حدودی تولید پروتئین سلولی القا گردید. در خصوص اثرات بیوسنتزی امواج فراصوت در سلول گزارشاتی وجود دارد. مشاهده شده است که این امواج با شدت پائین، بیوسنتز پروتئین­ها را در سلول‏ها و پروتوپلاست‏های چغندرقند افزایش داد (24). همچنین امواج فراصوت به‏عنوان یک الیسیتور باعث تحریک ژن‏ها شده و به­دنبال ­آن منجر­ به افزایش پروتئین‌ها و آنزیم‌های سیگنال­دهی و تولید متابولیت‌های ثانوی شده، به­صورتی که با تابش امواج فراصوت بر سلول‏های بنیادی گل داوودی محتوای RNA افزایش یافت و در پی ­آن محتوای پروتئین محلول نیز افزایش یافت و بین میزان RNA و پروتئین ضریب هم­بستگی 98 درصد وجود داشت (26،25،3 و 27).

به­علت وجود تنش­های مکانیکی در اثر امواج فراصوت ساختمان مولکولی کلروپلاست­ها نیز ممکن است تخریب شود، و همین عامل می‏تواند دلیل خوبی برای کاهش میزان کلروفیل باشد. همچنین کاروتنوئیدها به­عنوان یکی از رنگیزه­های کلیدی و مهم سیستم آنتی‏اکسیدانتی (27) گروه بزرگی از مولکول‌های ایزوپرونوئیدی هستند که توسط اندام‌های فتوسنتزی ساخته می‌شوند (28) اما آن‏ها به تخریب اکسیداتیو بسیار حساس هستند، به­طوری­که در این آزمایش با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 5 دقیقه از میزان ترکیبات کاروتنوئید به‏طور معنی‏داری نسبت به گروه شاهد کاسته شد. اما در زمان تابش 10 دقیقه امواج فراصوت مجددا میزان کاروتنوئید افزایش یافت و بدون داشتن تفاوت معنی‏دار با گروه شاهد هر دو گروه به یک­ میزان و دارای بیشترین مقدار بودند (شکل 3) که این واقعه را می­توان این­گونه توجیه کرد که تابش امواج فراصوت در زمان بیشتر به‏عنوان یک تنش اکسیداتیو برای سلول به‏شمار می­رود و سلول با افزایش میزان کاروتنوئید درون سلولی خود به‏عنوان آنتی­اکسیدانت به مقابله با تنش می­پردازد. برطبق نتایج به‏دست آمده توسط Chen  و همکاران (25) تابش امواج فراصوت بر سلول‏های جلبک Porphyridium ceruentum  باعث افزایش 27 درصد در میزان کاروتنوئید سلول‏ها شد (25).

نتایج به­دست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که با افزایش زمان تابش امواج فراصوت، میزان مالون­دی­آلدهید اندازه‏گیری شده در سلول‏های جلبکD. salina   افزایش یافت (شکل 4). امواج فراصوت با انرژی کم در کشت سلولی تعلیقی سرخدار چینی  (T. chinensis) باعث القای پراکسیداسیون لیپید گردید (29) و همچنین در تحقیقات Rezae و همکاران (14) مشخص شد که امواج فراصوت به‏همراه متیل جاسمونات باعث افزایش در تولید مالون­دی­آلدهید در سلول‏های فندق شد. ایجاد گونه­های فعال اکسیژن در استرس­های مختلف می‏تواند باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا شده که افزایش مالون­دی­آلدهید به‏عنوان محصول نهایی این اکسیداسیون نشان دهنده تخریب و افزایش نفوذپذیری غشای سلول‏ها است (30). آنزیم پراکسیداز به­عنوان گیرنده و جمع کننده پراکسیدها عمل کرده و از اثرات مخرب این مولکول­ها می­کاهد (31 و 32). گونه­های فعال اکسیژن دارای نقش‏های دوگانه می­باشند، این گونه­ها علاوه بر آسیب به گیاه می‏توانند با القای مسیرهای سیگنال باعث فعال شدن واکنش‏های دفاعی در گیاه شده و درنتیجه باعث افزایش تولید متابولیت­های ثانوی شوند (33). در تحقیقی که توسط         Wu & Lin (34) انجام شد تابش امواج فراصوت بر سلول‏ها ، باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در داخل و خارج سلول‏ها و      به­دنبال آن افزایش مالون­دی­آلدهید شد. همچنین در جای دیگر افزایش محتوای مالون­دی­آلدهید و یک افزایش 6/48 درصدی در نشت الکترولیت­ها در سلول‏های جلبک قرمز           (Cruentum porphyridium)، پس از تابش امواج فراصوت مشاهده شد (27). افزایش ترکیبات آنتی­اکسیدانتی به­عنوان بخشی از پاسخ‏های دفاعی سلول‏ها محسوب می­شود که اثر امواج فراصوت بر تولید و افزایش ترکیبات آنتی­اکسیدانتی در تحقیقات گذشته نیز اثبات شده است (33 ،35 و 36).

ترکیبات فنلی گروه بزرگی از مواد طبیعی گیاهی شامل فلاونوئیدها، تانن‏ها و آنتوسیانین و غیره می‌باشند. این مواد منافع قابل توجهی در زمینه مواد غذایی، شیمی، داروسازی و پزشکی دارند. همچنین سلول‏ها با افزایش ترکیبات فلاونوئیدی و آنتوسیانین در شرایط استرس، از اثرات مخرب گونه­های فعال اکسیژن می­کاهد (37). مطالعات ارتباط مثبتی بین مقدار ترکیبات آنتوسیانینی و فعالیت آنتی اکسیدانتی را نشان داده‏اند (38). به­طوری‏که در تحقیقات گذشته مشخص شده، بسیاری از ترکیبات فنلی به­طور موثر رادیکال‌های گروه هیدروکسیل و پروکسیل را حذف کنند و از اکسید شدن چربی‌ها ممانعت به‏عمل آورند (39). این ترکیبات آنتی­اکسیدانت‏های نیرومندی تحت شرایط تنش می‌باشند و این خاصیت به­دلیل ساختار اسکلتی و گروه فنل این متابولیت‌ها می‌باشد. گروه‌های هیدروکسیل آزاد متصل به حلقه آروماتیک به­وسیله جاروبگری رادیکال‌ها و سایر مکانیسم‌ها مانند فروکشی اکسیژن یکتایی از آسیب اکسیداتیو، سلول‏ها را حفظ کرده و همچنین با جلوگیری از عمل لیپواکسیژناز از اکسیداسیون لیپید جلوگیری می‌کنند. سلول با استفاده از مکانیسم­های آنزیمی و غیر آنزیمی می‏تواند غلظت گونه­های فعال اکسیژن را کاهش دهد و از این طریق از اثرات مخرب آن بکاهد. القای تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی با توجه به افزایش میزان پراکسید هیدروژن و مالون­دی­آلدیید در سلول‏ها جهت محافظت از اجزای سلولی، اسیدهای چرب غیر اشباع، پروتئین‏ها، کربوهیدرات‏ها و اسیدهای نوکلئیک که از اهداف مهم گونه­های فعال اکسیژن  بوده و پیشگیری از اختلالات متابولیکی و سلولی می­باشد (40). درخصوص اثرات امواج فراصوت بر ترکیبات فنلی در گذشته مطالعات اندکی صورت گرفته ازجمله این‏که امواج فراصوت باعث افزایش تولید ترکیبات فنلی در بادام زمینی شد (41).Wu  و همکاران (34) نیز نشان دادند که فراصوت باعث افزایش تولید ترکیبات فنلی در کشت سلولی جینسینگ شد. همچنین Rezae و همکاران (14) مشاهده کردند که در سلول‏های فندق قرار گرفته در معرض امواج فراصوت ترکیبات فنلی افزایش داشت.

در تحقیق حاضر با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه، میزان گلیسرول اندازه­گیری شده سلول‏های جلبک افزایش یافت. در واقع امواج فراصوت به­عنوان الیسیتوری برای تحریک سلول‏ها جهت تولید گلیسرول بیشتر می­باشد. امواج فراصوت باعث افزایش تولید گلیسرول در سلول‏های گیاهان روغنی شده که می­تواند برای سوخت‌های زیستی کاربرد داشته باشد (42) و همچنین روغن‌های گیاهی را افزایش می‏دهد (43). در این تحقیق مشاهده شد که با افزایش زمان تابش امواج فراصوت میزان بتا-کاروتن سلول‏ها نیز افزایش یافت. افزایش فعالیت ترکیبات آنتی‌اکسیدانتی از جمله بتا-کاروتن به­عنوان سریع‌ترین واحدهای مقابله کننده در برابر حمله اکسیژن‌های فعال در شرایط استرس گزارش شده است (44). هماهنگ با یافته­های این تحقیق، افزایش بیوسنتز متابولیت­های ثانوی در سلول‏های گیاهی توسط امواج فراصوت با انرژی کم، گزارش شده (2،4 و14) و مشخص شده است که این افزایش در بیوسنتز متابولیت ثانویی صرفا ناشی از اثرات فیزیکی و مکانیکی نبوده بلکه بیشتر ناشی از القای فعالیت فیزیولوژیک سلول‏ها توسط امواج فراصوت می­باشد.

 

نتیجه گیری

در این تحقیق مشاهده شد که به­کارگیری امواج فراصوت، باعث القای متابولیت ثانوی ازجمله ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانین­ها، بتا-کاروتن و گلیسرول و همچنین افزایش پتانسیل آنتی­اکسیدانتی شد. همچنین به­نظر می­رسد امواج فراصوت با تحریک سلول‏ها و القای پاسخ­های دفاعی و متابولیت ثانوی، باعث افزایش مقدار بتا-کاروتن  و گلیسرول در سلول‏ها گردید. با توجه به­اینکه امکان به­کارگیری این تکنیک در دست­ورزی­های بیوتکنولوژیک تولید ترکیبات سلولی بسیار راحت و ارزان است، استفاده از آن می­تواند کمک شایانی به بالا بردن تولید ترکیبات مهم نماید که یکی از موانع مهم در مسیر تجاری سازی تولید متابولیت‏ها است.

1. Dornenburg H, Knorr D. Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures. Enzyme Microb Tech . 1995; 17(8): 674–684.

2. Wu J, Lin L. Ultrasound-induced stress responses of Panax ginseng cells: enzymatic browning and phenolics production. Biotechnol Prog. 2002; 18: 862–866.

3. Wang JW, Zheng LP, Wu JY, Tan RX. Involvement of nitric oxide in oxidative burst, phenylalanine ammonia-lyase activation and taxol production induced by low-energy ultrasound in Taxus yunnanensis cell sUSpension cultures. Nitric Oxide. 2006; 15(4): 351-358.

4. Safari M, Ghanati F, Hajnoruzi A, Rezaei A, et al. Maintenance of membrane integrity and increase of taxanes production in hazel (Corylus avellana L.) cells induced by low-intensity ultrasound. Biotechnol Lett. 2012; 34(6): 1137–41.

5. Frizzell L.A. Biological effects of acoustic cavitation. In Suslick, KS, (eds). Ultrasound, its chemical, physical and biological effects. VCH publishers, Inc. Germany; 1988; 287–303.

6. Unger C, Thomas P, McCreery R, Sweitzer H. Ultrasound enhances gene expression of liposomal transfection. Invest Radio. 1997; 32: 723-727.

7. Barton S, Bullock C, Weir D. The effects of ultrasound on the activities of som glycosidase enzymes of industrial importance, Enzyme Microb Technol. 1996; 18: 190-194.

8. Schmidt P, Rosenfeld E, Millner R, Schellenberger A. Effects of ultrasound on the catalytic activity of matrix-bound glucoamylase. Ultrasonics.  1987; 25: 295-299.

9. Crisosto C. Optimum procedures for ripening stone fruit. Management of Ripening Fruit (Univ. of California, Davis). Postharvest Horticulture Series. 1996; 9: 28-30.

10. Garcia F, Freile-pelegrin Y, Robledo D. Physiological characterization of Dunaliella sp. (Chlorophyta, Volvocales) from Yucatan, Mexico. BioresourceTechnol. 2007; 98(7): 1359-1365.

 

11. Hosseini Tafreshi A, Shariati M. Dunaliella biotechnology: methods and applications. J Appl Microbiol. 2009; 107(1): 14-35.

12. Gomez PI, Barriga A, Cifuentes AS, Gonzalez MA. Effect of salinity on the quantity and quality of carotenoids accumulated by Dunaliella salina accumulated (strain ONC-007) and Dunaliella bardawil (ATCC30861) chlorophyta. Biol Res . 2003; 36(2): 185-192.

13. Poppel GV, Goldbohm RA. Epidemiologic evidence for beta-caroten and cancer prevention. Am J Clin Nutr. 1995; 62: 1393-1402.

14. Rezaei A, Ghanati F, Behmanesh M. Ultrasound potentiated salicylic acid-induced physiological effects and production of taxol in hazelnut (Corylus avellana L.) cell culture. Ultrasound Med Bio l. 2011; 37(11): 1938–1947.

15. Frank G. Wegmann K. Physiology and biochemistry of glycerol biosynthesis In Dunaliella. Biol Zbl. 1979; 93: 707-723.

16. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-254.

17. Djeridane A, Yousfi M, Nadjemi B, Boutassouna D, et al. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds. Food Chem. 2006; 97: 654–660.

18. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers FA, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem.1956; 28: 350-356.

19. Masukasu H, Karin O, Kyoto H. Enhancement of anthocyanin biosynthesis by sugar in radish (Raphanus sativus) hypocotyls. Plant Sci. 2003; 164(2): 259 - 265.

20. De Vos CHR, Schat H, De Waal MAD, Vooijs R, et al. Increased resistance to copper-induced damage of the root plasma membrane in copper tolerant Silene cucubalus. Physiol Plant. 1991; 82: 523–528.

21. Hadi MR, Shariati M. Afsharzadeh S. Microalgal biotechnology: carotenoid and glycerol production by the green algae Dunaliella isolated from the Gave-Khooni salt marsh, Iran. Biotechnol Bioproc Eng. 2008; 13(5): 540-544.

22. Liu YY, Yoshikoshi A, Wang BC, Sakanishi A. Influence of ultrasonic stimulation on the growth and proliferation of Oryza sativa Nipponbare callus cells. Colloid Surf B: Biointerf. 2003; 27(4): 287–293.

23. Wu J, Lin L. Enhancement of taxol production and release in Taxus chinensis cell cultures by ultrasound, methyl jasmonate and in situ solvent extraction. Appl Microb Biotechnol. 2003; 62: 151–155.

24. Joersbo M, Brunstedt J. Sonication: a new method for gene transfer to plants. Physiol Plant. 1992; 85: 230-234.

25. Chen B, Huang J, Wang J, Huang L. Ultrasound effects on the antioxidative defense systems of Porphyridium cruentum. Colloid Surf B: Biointerf. 2008; 16(1): 88–92.

26. Liu YY, Wang BC, Zhao HC. Alternative stress effects on the Ca2+ distribution in the Chrysanthemum callus cells. Colloids Surf B: Biointerf. 2001; 22(3): 245–249.

27. Wang XJ, Wang BC, Jia Y, Huo DQ, et al. Effect of sound stimulation on cell cycle of chrysanthemum (Gerbera jamesonii). Colloids Surf B: Biointerfaces. 2003; 29: 103-107.

28. Simkin AJ, Moreau H, Kuntz M, Pagny G, et al. An investigation of carotenoid biosynthesis in Coffea canephora and Coffea arabica. J Plant Physiol. 2008; 165(10): 1087-1106.

29. Wu J, Ge X. Oxidative burst, jasmonic acid biosynthesis, and taxol production induced by low-energy ultrasound in Taxus chinensis cell suspension cultures. Biotechnol Bioeng. 2004; 85(7): 714-721.

30. Wang SY. Methyl jasmonate reduces water stress in strawberry. Plant Growth Regul. 1999; 18(3): 127-134.

31. Plazek A, Zur I. Cold-induced plant resistance to necrotrophic pathogens and antioxidant enzyme activities and cell membrane permeability. Plant Sci. 2003; 164(6): 1019-1028.

32. Zhou R, Li Y, Yan L, Xie J. Effect of edible coatings on enzymes, cell-membrane integrity, and cell-wall constituents in relation to brittleness and firmness of Huanghua pears (Pyrus pyrifolia Nakai, cv. Huanghua) during storage. Food Chem. 2011; 124: 569–575.

33. Dat J, Vandenabeele S, Vranova E, Van Montagu M, et al. Duel action of the active oxygen species during plant stress responses, Cell Mo. Life Sci .2000; 57: 779-795.

34. Wu J, Lin L. Ultrasound-induced stress responses of Panax ginseng cells: enzymatic browning and phenolics production. Biotechnol Prog. 2002; 18: 862–866.

35. Holková I, Bezáková L, Bilka F, Balazová A, et al. Involvement of lipoxygenase in elicitor-stimulated sanguinarine accumulation in Papaver somniferum suspension cultures. Plant Physiol Biochem. 2010; 48: 887-892.

36. Komaraiah P, Kishor PBK, Carlsson M, Magnusson KE, et al. Enhancement of anthraquinone accumulation in Morinda citrifolia suspension cultures. Plant Sci. 2005; 168: 1337–1344.

37. Plazek A, Zur I. Cold-induced plant resistance to necrotrophic pathogens and antioxidant enzyme activities and cell membrane permeability. Plant Sci. 2003; 164(6): 1019-1028.

38. Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Sci. 2004; 74(17): 2157–2184.

39. Boscaiu M, Sanchez M, Bautista I, Donat P, et al. Phenolic compounds as stress markers in plants from gypsum habitats. Bull UASVM Hort. 2010; 67: 44-49.

40. Martinez-Cayuela M. Oxygen free radicals and human disease. Biochimie. 1995; 77: 147–161.

41. Sales JM, Resurreccion AVA. Phenolic profile, antioxidants, and sensory acceptance of bioactive-enhanced peanuts using ultrasound and UV. Food Chem. 2010; 122: 795–803.

42. Fukuda H, Hama S, Tamalampudi S, Noda H. Whole-cell biocatalysts for biodiesel fuel production. Trends Biotechnol. 2008; 26(12): 668-673.

43. Siatis NG, Kimbaris AC, Pappas CS, Tarantilis PA, et al. Improvement of biodiesel production based on the application of ultrasound: monitoring of the procedure by FTIR spectroscopy. JAOCS. 2006; 83: 53-57.

44. Kasperczyk S, Dobrakowski M, Kasperczyk J, Ostałowska A, et al. Beta-carotene reduces oxidative stress, improves glutathione metabolism and modifies antioxidant defense systems in lead-exposed workers. Toxicol Appl Pharm. 2014; 1: 36-41.