تاثیر حضور پراکسید هیدروژن بر القای برخی متابولیت‌های ثانویه در کالوس گیاه پریوش ((Catharanthus roseus L.

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران

2 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران

چکیده

هدف: دراینتحقیقاثر تنش اکسیداتیو ناشی از حضورپراکسید هیدروژنبرالقای برخی متابولیت‌های ثانویه و همچنین تغییر در محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس گیاه پریوش بررسی شد. مواد و روش‏ها: به‏منظور القا کالوس، برگ گیاه پریوش استریل شد و بر روی  محیط کشت جامد MS قرار گرفت. کالوس‌ها‌‌ با غلظت‌های مختلف پراکسید هیدروژن(1، 5 و10 میکرومولار) به‏مدت 6 روز تیمارشدند. محتوی آلکالوئید کل، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و همچنین توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن مورد سنجش قرار گرفت وداده‌هاباروش‌هایآماریآنالیزواریانسیک‏طرفهتجزیهوتحلیلشدند. نتایج: تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن خارجی بر مقادیر درون سلولی  پراکسید هیدروژن تاثیر معنی‌دار(05/0p<) داشته و محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های تیمار شده با پراکسید هیدروژن به‏مدتششروز نسبت به کنترل افزایش معنیدار نشان داد. مقایسه میانگین آلکالوئید کل، محتوی فلاونوئید و فنل کل نشان داد که تیمار با پراکسید هیدروژن باعث میزان افزایش معنی‌دار (05/0p<) محتوی این ترکیبات نسبت به کنترل شده است. از طرفی تیمار با پراکسید هیدروژن موجب افزایش توان            آنتی اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است. افزایشتوان آنتیاکسیدانتی احیا آهن وابسته به غلظت بود. نتیجه گیری:پراکسید هیدروژن موجب افزایش مقادیر درون سلولی پراکسید هیدروژن شد. متابولیت‌های ثانویه‌ای مانند آلکالوئید کل و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نیز افزایش یافت. بنابراین ممکن است بتوان با اعمال این تنش میزان تولید برخی از آن‌ها را نیز افزایش داد.    

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


 

مقدمه

گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به‏عنوان یکی از مهم‏ترین منابع دارویی کاربرد داشته‌اند (1). پریوش (Catharanthus roeus L.)، گیاهی است دارویی و متعلق به خانواده Apocynaceae که به‏دلیل وجود ترکیبات دارویی و آلکالوئیدها مورد توجه قرار گرفته است (2).

پراکسید هیدروژن با فرمول مولکولی  2(HO)، جرم مولکولی 014/34 گرم بر مول و دانسیته 135/1 گرم بر سانتی‏متر مکعب ترکیبی ساده، با پیوند یگانه (اکسیژن – اکسیژن ) و مایعی روشن و کمی غلیظ‏تر از آب می‌باشد. پراکسید هیدروژن در سال 1818 توسط لویس جاکوس تنارد کشف شد و به‏عنوان یک محصول صنعتی توجه زیادی را جلب کرد (3). منابع اصلی تولید‌کننده پراکسید هیدروژن در سلول‌های گیاهی شامل واکنش‌های زنجیره انتقال الکترون درکلروپلاست ومیتوکندری، واکنش مهلر، آنزیم‌های پراکسیداز و NADPH اکسیداز می‌باشند (4). در برخی از واکنش‌ها پراکسید هیدروژن به‏طور مستقیم و در برخی از طریق واکنش حد واسط مثل اکسیژن و سوپراکسید تولید می‌شود (5). هنگامی‏که اکسیژن یک الکترون را دریافت می‌کند به رادیکال سوپراکسید تبدیل شده که بسیار ناپایدار است و به‏طور خود به‏خودی یا توسط آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز با پروتون واکنش داده و تبدیل به پراکسید هیدروژن می‌شود. پراکسید هیدروژن همچنین از طریق احیای سوپراکسید توسط احیا کننده‏هایی مانند آسکوربات، تیول، فرودوکسین و غیره تولید می‌شود (6). بنابراین سطوح درون سلولی پراکسید هیدروژن ارتباط مستقیم با میزان تولید رادیکال سوپراکسید دارد.

با توجه به نقشی که پراکسید هیدروژن درپیام رسانی دارد لذا می‌تواند باعث افزایش فعالیت و یا القای بیان برخی ترکیبات آنتی‌اکسیدانتی از جمله متابولیت‌های ثانویه شود (7) که این سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی به‏عنوان یک سیستم دفاعی در مقابل انواع واکنش‏گرهای اکسیژن عمل کرده و به سلول کمک می‌کنند تا بهتر بتواند شرایط تنش را تحمل کند. از طرفی نیز می‌توان تحت تنش پراکسید هیدروژن تا حدودی تولید متابولیت‌های ثانویه را نیز افزایش داد که این خود نیاز به تحقیق بیشتر داشته و با توجه به این نکته که مطالعات کمی در مورد بررسی اثر پراکسید هیدروژن بر کشت سلولی گیاه پریوش انجام شده است، لذا در این تحقیق اثر تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن بر کشت کالوس گیاه پریوش مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‏ها

تهیه مواد گیاهی و محیط کشت: از برگ گیاه پریوش به‏منظور القا کالوس استفاده شد. برگ‌های جوان از قسمت راسی گیاه جدا استریل شدند. قطعات برگ پس از شستشو با آب مقطر به‏مدت 15 دقیقه درهیپوکلریت سدیم 5 درصد (شرکت مرک آلمان) قرار داده شدند و سپس مجددا با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو داده شدند. قطعات شستشو داه شده به‏مدت 10 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند و مجددا با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو شدند (8). پس از آن، برگ را به قطعات حدود یک سانتی‌متر برش زده و بر روی محیط کشت جامد Murashige and  Skoog, Sigma-Aldrich, UK) MS) حاوی ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر به‏عنوان منبع کربن و آگار برای جامد کردن محیط کشت باغلظت 8 گرم در لیترو ویتامین‌ها شامل، تیامین با غلظت1/0.میلی‌گرم در لیتر)، پیریدوکسین (با غلظت5/0 میلی‌گرم در لیتر) نیکوتین (با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر) و عناصر ماکرو و میکرو و ترکیب هورمونی کینتین (با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر) و 2-4D   (2,4-Dichloro-phenoxyacetic acid) (با غلظت 5/1 میلی‌گرم در لیتر) بود، قرار داده شدند (کلیه مواد فوق‌الذکر از شرکت Sigma-Aldrich کشور انگلستان تهیه شدند). سپس شیشه‌های حاوی جداکشت‌ها به اتاق کشت  با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند (8) کالوس‌‌ها بعد از سه هفته واکشت و به محیط کشت جدید منتقل شدند و از کالوس‌های واکشت دوم برای تیمار دهی استفاده شد.

سنجش محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی: برای سنجش محتوی پراکسید هیدروژن 5/0 گرم از بافت کالوس در یخ با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید 1/0درصد سائیده شد و مخلوط هموژن در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، با سرعت  g12000، به‏مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 700 میکرولیتر از محلول رویی به 700 میکرولیتر  بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (7pH=) و700 میکرولیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه و میزان جذب در طول موج 390 نانومتر اندازه‌گیری شد. محتوی پراکسید هیدروژن با کمک منحنی استاندارد (x212/0y= با 99/0 R2=) که با مقادیر مشخص پراکسید هیدروژن رسم شده بود سنجیده شد و به‏صورت میکرومول بر گرم وزن تر کالوس گزارش گردید (9).

اندازه‌گیری آلکالوئید کل: میزان آلکالوئید کل با استفاده از روش اسپکتروفتومتری (مدل  T80+ساخت شرکتPG instrument کشور انگلستان) و معرف دراژندروف برای شناسایی آلکالوئیدها محاسبه شد (10). میزان 3 گرم بافت تازه کالوس را با 10 میلی‌لیتر متانول 96 درصد در حضور نیتروژن مایع سائیده و سپس نمونه‏ها به‏مدت 24 ساعت به انکوباتور شیکردار با دور g8/0 و دمای 25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. در مرحله بعد نمونه‌ها در g24000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی به آون 80 درجه سانتی‌گراد برای مدت 1 تا 2 ساعت انتقال داده تا حجم نهایی محلول به 1 میلی‌لیتر تبخیر شود. به عصاره باقیمانده 10 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 5/0 نرمال اضافه گردید. با استفاده از سود 10 نرمال، pH محلول را به  10 رسانده و 10 میلی‌لیتر کلروفرم به آن اضافه و سپس محلول به دکانتور منتقل شد. در این مرحله دو فاز تشکیل شد: فاز اسیدی در بالا و فاز کلروفرمیک حاوی عصاره در پایین تشکیل شد. حجم محلول کلروفرمیک با اتانول 96 درصد به 10 میلی‌لیتر رسانده شد. به 5 میلی‌لیتر از محلول فوق HCl رقیق اضافه تا pH آن بین 2 تا 5/2 تنظیم شود. سپس به محلول حاصل 1 میلی‌لیتر معرف دراژندورف اضافه و این ترکیب به‏مدت 5 دقیقه در  g24000 سانتریوفوژ شد. محلول رویی را دور ریخته و رسوب باقیمانده با اتانول 96 درصد شستشو شد. پس از دور ریختن محلول رویی به رسوب 1 میلی‌لیتر دی‌سدیم سولفید1 درصد اضافه و پس از تکان دادن محلول به‏مدت 5 دقیقه در g24000 سانتریوفوژ شد. در این مرحله پس از حذف محلول روئی به رسوب قهوه‌ای تشکیل شده 2 میلی‌لیتر دی ‌سدیم‌ سولفید 1 درصد اضافه  و مجددا به‏مدت 5 دقیقه در g24000 سانتریوفوژ شد. پس از دور ریختن محلول رویی 2 میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ به  رسوب اضافه و با آب مقطر دو بار تقطیر حجم محلول به 5 میلی‌لیتر رسانیده شد. از محلول فوق 1 میلی‌لیتر برداشته، به آن 5/2 میلی‌لیتر محلول تیوره 3 درصد اضافه و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل T80+PG InstruentUV/Vis.Spectrometer) جذب نمونه‏های تیمار شده در طول موج 435 نانومتر قرائت شد. دستگاه اسپکتروفتومتر با محلول تیوره 3 درصد صفر شد. برای رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف بیسموت (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و غلظت آلکالوئید کل نمونه‌های تیمار شده بعد از رسم نمودار استاندارد توسط فرمول خطی0320/0- x 0291/0y= با 99/0 R2= تعیین شد.

اندازه‌گیری فلاونوئید کل: میزان فلاونوئید با استفاده از روشMarinova ‌ و همکاران (11) محاسبه شد. به تعداد نمونه‌ها لوله آزمایش آماده و به هر کدام از لوله‌ها 1245 میکرولیتر آب مقطر، 75 میکرولیتر محلول سدیم نیترات 5 درصد و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها به‏مدت 6 دقیقه در تاریکی قرار گرفتند. سپس به هر لوله مقدار 150 میکرولیتر محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد  اضافه و برای مدت 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند. در مرحله آخر به هر لوله میزان 500 میکرولیتر سود 1 مولار اضافه و جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 510 نانومتر ثبت شد. از محلول فاقد عصاره جهت صفر کردن دستگاه استفاده شد. برای رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف کاتچین (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و غلظت فلاونوئید در نمونه‌‌های تیمار شده با استفاده از فرمول خطی 041/0+ x0002/0  y=0با  99/ R2= و بر حسب میلی‌گرم کاتچین در گرم وزن تر بافت بیان گردید.

اندازه‌گیری میزان فنل کل

تهیه عصاره فنلی: میزان 1/0 گرم از بافت کالوس با 1 میلی‌لیتر متانول 80 درصد در حضور نیتروژن مایع سائیده شد. سپس به‏مدت 5 دقیقه در  g17000 سانتریفوژ گردید. از محلول شفاف رویی به‏عنوان عصاره در سنجش میزان فنل کل استفاده شد. میزان فنل کل با استفاده از روش Singleton و همکاران (12) مطابق مندرجات زیر تعیین شد. به تعداد نمونه‌های تیماری لوله آزمایش برداشته و به هر کدام مقدار 470 میکرولیتر آب مقطر، 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 500 میکرولیتر سدیم کربنات 1 درصد اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها به‏مدت 3 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند. سپس به هر کدام 500 میکرولیتر فولین سیوکالتیو اضافه و نمونه‌ها به‏مدت 10 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. سپس جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 765 نانومتر ثبت شد. به‏منظور صفر کردن دستگاه از نمونه کنترل استفاده شد. به‏منظور تهیه منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف گالیک اسید (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و مقادیر فنل تام عصاره با استفاده از منحنی استاندارد ( 0016/0 x+ 0213/0 y=  با 989/0 R2= ) بر حسب میلی‌گرم اسید گالیک در گرم وزن تر بافت بیان گردید.

اندازه‌گیری فعالیت آنتی اکسیدانت کل به روش  FRAP( (Ferric Reducing Antioxidant Power: فعالیت آنتی‌اکسیدانتی کل با استفاده از روشBenzie and Strain  (13) تعیین شد. به تعداد نمونه‌ها لوله آزمایش تهیه و به هر کدام 1700 میکرولیتر محلول FRAP، 970 میکرولیتر آب مقطر و 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها برای مدت 10 دقیقه در تاریکی قرار داده شدند. با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر جذب نمونه‌ها در طول موج 593 نانومتر ثبت شد.برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سولفات آهن (FeSO4.7H2O) (شرکت Merck آلمان) استفاده شد. کلیه مراحل تهیه نمونه‌های استاندارد مانند مراحل فوق انجام شد با این تفاوت که به‌جای عصاره از غلظت‌های مختلف سولفات آهن استفاده شد. فعالیت آنتی اکسیدانتی نمونه‌های تیمار شده پس از رسم منحنی استاندارد  با استفاه از فرمول خطی       0277/0+ 0132/0 y=با 99/0R2=  و بر حسب میکرو مول آهن در میلی‌گرم وزن تر بافت μM/mg FW) ) محاسبه شد.

آنالیزهای آماری: آزمایش‏های انجام شده برای هر تیمار در سه تکرار انجام شد. داده‌های به‏دست آمده با استفاده از نرم ‌افزا‌ر آماری SPSS و با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و تستDuncan  آنالیز شدند. در هر اندازه‌گیری ارتباط بین گروه‌ها بررسی و وجود تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0p< در نظر گرفته شد.

 

نتایج

داده‌های حاصل از اندازه‌گیری محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل نشان داد که اثر پراکسید هیدروژن  بر مقادیر درون سلولی این ماده (H2O2) تاثیر معنی‌دار (05/0p<) داشته است (جدول1). محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های تیمار شده با 1، 5 و 10 میکرومولار نسبت به کنترل به‏ترتیب به‏میزان 43/31 ،13/69 و82/44 درصد افزایش داشته است. گرچه محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی، درگروه تیمار شده با غلظت10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با  غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (05/0p<).

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین پراکسید هیدروژن درون سلولی(µM g-1FW) کالوس گیاه پریوش، شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار)  با گروه کنترل. مقادیر به‏صورت ±SD means می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می‌باشند (05/0 (one way ANOVA, Duncan test, p<

H2O2 (µM)

پراکسید هیدروژن درون سلولی (µM g-1FW)

0

482 /0 d ±53/10

1

091/0c±84/13

5

371/0a±81/17

10

781/0b±25/15

 

 

مقایسه میانگین آلکالوئید کل نشان داد که تیمار با غلظت‏های 1، 5 و 10 میکرومولار باعث  افزایش معنی‌دار (05/0p<) محتوی آلکالوئید کل نسبت به کنترل شده است و مقدار آلکالوئید کل، درگروه تیمار شده با  غلظت 10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با  غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (001/0p<) و افزایش در محتوی آلکالوئید کل درگروه های تیمار شده با  1، 5 و10 میکرومولار نسبت به کنترل به‏ترتیب به‏میزان 30/62 ، 38/132 و 98/ 66 درصد نسبت به کنترل می‌باشد  ( نمودار1). علاوه بر این مقایسه میانگین محتوی فلاونوئید نشان داد که تیمار با غلظت‏های 1، 5 و 10 میکرومولار پراکسید هیدروژن موجب افزایش معنی‌دار محتوی فلاونوئید نسبت به کنترل شده است که در این سه غلظت محتوی فلاونوئید نسبت به کنترل به‏ترتیب به‏میزان 79/138 ،05/152 و49/368 درصد افزایش داشته است (نمودار2). اثر پراکسید هیدروژن بر محتوی فنل کل نیز معنی‌دار (05/0p<) بود (جدول 2). مقایسه میانگین محتوی فنل نشان داد تیمار با غلظت‏های 1، 5 و 10 میکرومولار باعث میزان افزایش معنی‌دار محتوی فنل نسبت به کنترل شده است و به‏ترتیب نسبت به کنترل به میزان 79/102 ،40/194 و17/125 درصد افزایش می‌یابد. این در حالی است که محتوی فنل، درگروه تیمار شده با  غلظت 10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با  غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (p<0.05).  از طرفی مقایسه میانگین توان آنتی‌اکسیدانتی نیز نشان داد که تیمار با غلظت 1، 5 و 10 میکرومولار پراکسید هیدروژن موجب افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است. داده‌های جدول مقایسه میانگین بیانگر این واقعیت است که افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی احیای آهن وابسته به غلظت بود و در این سه گروه‌ تیمار شده به‏ترتیب به‏میزان 44/85 ، 14/255 و 44/360 درصد نسبت به کنترل افزایش می‌یابد (جدول2).

 

 

نمودار1: مقایسه میانگین آلکالوئید (mg  g-1FW) کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر به‏صورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار می‌باشند (one way ANOVA, Duncan test, P<0.05)

 

 

نمودار2: مقایسه میانگین فلاونوئید (mg  g-1FW) کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر به‏صورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار می‌باشند (one way ANOVA, Duncan test, P<0.05)

جدول 2: مقایسه میانگین محتوی فنلوآنتی اکسیدان کل کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر به‏صورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می‌باشند(one way ANOVA, Duncan test, p<0.05).

H2O2 (µM)

فنل (mg g-1FW)

آنتی‌اکسیدانت‌کل  (μM  mg-1 FW)

0

060/0d±43/1

018/0d ±680/0

1

042/0 c ±90/2

067/0 c ±261 /1

5

026/0 a ±21/4

181/0b±415/2

10

097/0 b ±22/3

391/0a ±131/3

 

 

بحث

تیمار با پراکسید هیدروژن می‌تواند کانال‌های کلسیمی را فعال کرده و غلظت کلسیم سیتوپلاسمی را افزایش دهد و از طرفی نیز کلسیم سیتوزولی به‏نوبه خود آنزیم NADPH اکسیداز غشایی پلاسمایی را فعال کرده که منجر به انفجار اکسیداتیو و تولید پراکسید هیدروژن می‌شود (14). در تحقیق حاضر، اثر پراکسید هیدروژن بر مقادیر درون سلولی این ماده ( H2O2) معنی‌دار (05/0p<) بود. نتایج تحقیق حاضر در راستای نتایج دیگران بوده است.  Tangو همکاران (15) در تحقیقات خود بر روی گیاه پریوش نشان دادند که 100 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن باعث افزایش معنی‌دار (05/0p<) پراکسید هیدروژن درون‌سلولینسبت به کنترل شده است. از طرفی Tian و همکاران (16) در تحقیقات خود بر روی کالوس گیاه توت فرنگی تحت تیمار با 50 میکرومولار پراکسید هیدروژن، به نتیجه مشابه‌ای دست یافتند. در صورتی‏که نتایج Yu و همکاران (17) بر رویVigna radiata (L.)  نشان داد که پس از تیمار با 200 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن محتوی درون سلولی این ماده کاهش می‌یابد. تفاوت‌ها در نتایج ممکن است بدلیل اختلاف در گونه گیاهی و متعاقبا اختلاف در پاسخ سلولی این گونه باشد.

از طرفی آلکالوئیدها نیز به‏عنوان یک دفاع شیمیایی در پاسخ به تنش‌ افزایش می‌یابند، اما مکانیسم واقعی در این پاسخ سلولی هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است (15). نتایج حاصل از آنالیز داده‌ها در آزمایش حاضر نشان داد که اثر پراکسید هیدروژن بر محتوی آلکالوئید کل در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل معنی‌دار است (05/0p<) و با افزایش غلظت، محتوی آلکالوئید افزایش می‌یابد. نتایج حاضر در تایید نتایج Tang و همکاران (15) بود، آن‏ها نیز در تحقیق خود بر روی گیاه پریوش نشان دادند که تیمار100 میلی‏مولار پراکسید هیدروژن باعث افزایش معنی‌دار (05/0p<) غلظت آلکالوئید وین بلاستین  نسبت به کنترل شده است. از طرفی با توجه به اینکه اهمیت آلکالوئیدها در حفاظت سلول‌های گیاهی تحت تنش مشخص شده است (18). لذا می‌توان گفت که افزایش یا کاهش میزان آلکالوئید کل در یک گیاه متناسب با نوع تنش بوده و تفاوت این نتایج ممکن است به‏دلیل اختلاف در گونه گیاهی باشد.

علاوه بر این پراکسید هیدروژن محتوی فلاونوئید در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل را به‏طور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت افزایش داد. Tumova و همکاران (19) در تحقیق خود بر روی کشت کالوس Ononis arvensis گزارش کردند که  تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن (1/0 تا 1 میلی‏مولار) باعث تولید فلاونوئید شده است. همچنین Hao و همکاران (20) نیز در مطالعه خود بر روی کالوس Ginkgo biloba مشاهده کردند که UV-B از طریق افزایش فعالیت آنزیمNitric Oxide Synthase (NOS) منجر به تولید رادیکال آزاد NO شده که این رادیکال با افزایش فعالیت آنزیمPhenylalanine Ammonium Lyase (PAL) موجب افزایش تولید فلاونوئیدها گردیده است. از طرفی نیز ترکیبات فنلی به‏عنوان شاخص‌های تنش اکسیداتیو محسوب می‌شوند (20)، لذا  انباشتگی انواع ترکیبات فنلی در شرایط تنش می‌تواند به‏عنوان یک نشانه در جلوگیری از تخریب سلولی عمل کرده و در نهایت به افزایش تحمل در برابر  تنش منجر شود (20). ترکیبات فنلی دارای گروه هیدروکسیل هستند که دهنده هیدروژن می‌باشند و این ترکیبات فعالیت رادیکال‌های آزاد را مهار کرده و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی را فعال می‌کنند (21). در این مطالعه پراکسید هیدروژن اثر معنی‌داری بر  محتوی فنل در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل داشت و با افزایش غلظت پراکسید هیدروژن محتوی فنل کل نیز افزایش یافت. مطالعات انجام شده توسط Fang و همکاران(22) بر روی کشت سلولی گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) نشان داده است که غلظت 10 میکرومولار پرکسید هیدروژن می‌تواند به‏عنوان یک القا کننده موثر تجمع متابولیت ثانویه پلی فنلیک (Depside) را در سوسپانسیون سلولی گیاه مریم گلی القا کند. بدین ترتیب افزایش میزان فلاونوئید و فنل کل در گیاه پریوش می‌تواند در راستای پاسخ به تنش حاصل از پراکسید هیدورژن درگیاه پریوش باشد.

مطالعات نشان می‌دهد که بالا بودن ترکیبات فنلی دلیل عمده بالا بودن فعالیت آنتی‌اکسیدانتی نیز می‌باشد، زیرا بر اساس شواهد موجود ارتباط مثبتی بین میزان ترکیبات فنلی و قدرت آنتی‌اکسیدانتی گیاهان وجود دارد (22). قدرت احیاکنندگی ترکیبات موجود در نمونه‏های حاضر با احیا آهن III به آهن II سنجیده شدند (15). احیای آهن اغلب  به‏عنوان شاخص فعالیت الکترون دهی که مکانیزم مهمی در عمل آنتی‌اکسیدانتی مواد فنلی می‌باشد به‏کار می‌رود (22). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن (FRAP) در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل به‏طور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت افزایش یافت. از آنجا که، در تمام گیاهان بین آنتی‌اکسیدانت کل و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی ارتباط مستقیمی وجود دارد (23)، در این تحقیق نیز افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن، با افزایش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی همراه بود. این نتایج در راستای نتایجSharma  -وRamawat  (23) می‌باشد که در تحقیقات خود بر روی گیاه ((Salvadora persica Linn گزارش کردند که تیمار با غلظت 50، 100 و 200 میلی‌مولار نمک طعام به‏طور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت باعث افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است.

 

نتیجه گیری

تیمار کالوس گیاهان مختلف با پراکسید هیدروژن می‌تواند باعث القای پاسخ‏های دفاعی شود (17). بسیاری از مطالعات گزارش کرده‌‌‌‌اند که وقتی گیاه در معرض پراکسید هیدروژن قرار می‌گیرد غلظت آن در درون سلول افزایش می‌یابد (15). چون تیمار با پراکسید هیدروژن می‌تواند کانال‌های کلسیمی را فعال کرده و غلظت کلسیم سیتوزلی را افزایش دهد، کلسیم سیتوزولی نیز به‏نوبه خود آنزیم NADPH اکسیداز غشایی پلاسمایی را فعال کرده و منجر به انفجار اکسیداسیونت و تولید پراکسید هیدروژن شود (15). از طرفی پراکسید هیدروژن در درون سلول به‏عنوان یک پیامبر ثانویه عمل کرده لذا می‌تواند باعث افزایش فعالیت و یا القای بیان برخی ترکیبات آنتی‌اکسیدانت از جمله متابولیت‌های ثانویه شود (24). این سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی به‏عنوان یک سیستم دفاعی در مقابل انواع واکنش‏گرهای اکسیژن عمل کرده و به سلول کمک می‌کنند تا بهتر بتواند شرایط تنش را تحمل کند. از طرفی نیز می‌توان تحت تنش پراکسید هیدروژن تا حدودی تولید متابولت‌های ثانویه را نیز افزایش داد. از آنجا که برخی متابولیت‌های ثانویه می‌توانند در درمان بیماری‌ها انسانی از قبیل سرطان، هپاتیت، فشار خون و غیره موثر باشند و وجود این ترکیبات در پریوش ممکن است بتوان با اعمال این تنش میزان تولید برخی از آن‏ها را نیز افزایش داد که این خود نیاز به تحقیق بیشتر داشته و با توجه به تحقیقات دارویی اخیر برای جایگزینی داروهای شیمیایی توسط گیاهان دارویی سنتی ایجاد پایه علمی برای شناسایی اثرات آن‌ها ، امری لازم است و از طرف این تیم تحقیقاتی پیشنهاد می‌گردد.

 

تشکر و قدردانی

با تشکر از معاونت پژوهشی دانشکده‏ی علوم پایه دانشگاه اراک که امکانات لازم جهت انجام این تحقیق را در اختیار ما قرار دادند.

1.     Zhao J, VerpoorteR. Manipulating indole alkaloid productionby Catharanthus roseus cell cultures in bioreactors: frombiochemical processing to metabolic engineering. PhytochemRev. 2007; 6:435–457.

2.     Yokoyama M, Inomata S. Catharanthus roseus (periwinkle): in vitro culture and highlevel production of Arbutine by biotransformation. Biotech. Agri. Forest. 1998; 41: 67-80.

3.     Bienert P, Schjoerring GJ,   Jahn P. Membrane transport of hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica. 2006; 1758(8) :994–1003.

4.     Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 2002; 7(9): 405-410.

5.     Desikan R, Hancock JT, Neill S J .5 Oxidativestress signalin.Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2003;4(5): 121-149.

 

6.     Sutherland M. W. The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection. Physiol Mol Plant Pathol. 1991; 39(2):79-93.

7.     LambC, Dixon RA. The oxidative burst in plant disease resistance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1997; 48: 251-275.

8.     Saifullah kh.Callus induction and cell suspension culture production of catharanthus roseus for biotransfermation studies of (-)- caryophyllene oxide, Pak. J. Bot. 2012; 43(1): 467-473.

9.     SergievI, Alexieva V, Karanov E. Effect of spermine,atrazine and combination between them on someendogenous protective systems and stress markers in plants. Compt. Rend. Acad. Bulg. Sci,1997; 51:  121-124.

10.Sreevidya N, Mehrotra S. Spectrophotometric Method for Estimation of AlkaloidsPrecipitable with Dragendorff’s Reagent in PlantMaterial. Journal of Aoac International. 2003; 86(6): 1-4.

11.Marinova D, Ribarova F. Atanassova Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables. J. Univ. Chem. Technol. Metallurgy. 2005; 40(3):255-260.

12.SingletonVL,  Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. Analysisoftotal phenols andotheroxidationsubstratesandantioxidantsbymeansofFolin– Ciocalteu. Reagent..MethodsEnzymol. 1999; 299: 152–178.

13.BenzieI, StrainJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ‘Antioxidant Power’: The FRAP assay. Anal. Biochem. 1996; 239(1):70-76.

14.Desikan R,  Reynolds A, Hancock JT, Neill1 SJ. Harpin and hydrogen peroxide both initiate programmed cell death but have ifferential effects on defence gene expression in Arabidopsis suspensioncultures. Biochem. J. 1998; 330: 115-120.

15.TangZL, Yang  Y, Zu X. Variations of vinblastine accumulation and redox stateaffected by exogenous H2O2 in Catharanthus roseus (L.). Plant Growth Regul. 2009; 57:15–20.

16.Tian M, Gu Q, ZhuM.The involvement  of  hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of organogenesis of strawberry callus.plant science. 2003; 165:701-707.

17.YuCW, Murphy TM, Lin CH. Hydrogen peroxideinducedchilling tolerance in mung beans mediated throughABA-independent glutathione accumulation.. - Funct. PlantBiol. 2003; 30: 955-963.

18.Mittler R.Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 2002; 7(9): 405-410.

19.Proceedings of the Fifth Conference on Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries,(5th CMAPSEEC), Brno, Czech Republic, 2-5 September, 2008.

20.Tumová L, Tuma J, Cheel J Dušek J. Oxidative stress and flavonoid production by Ononis arvensis L. culture in vitro. 2008; pp. 24.

21.Hao G, Du X,Zhao F, Shi R, et al. Role of nitric oxide in UV-B-induced activation of PAL and stimulation of flavonoid biosynthesis in Ginkgo biloba callus .Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 97(2): 175-185.

22.He L, Gao Z , Li R. Pretreatment of seed with H2 O2 enhances drought tolerance of wheat (Triticumaestivum L.) seedlings. African Journal of Biotechnology. 2009; 8(22): 6151-6157.

23.Fang Y, Zong-shen Z, Bin Y. Effects of Exogenous Hydrogen Peroxide on Suspension Cell Growth and Secondary Metabolites Accumulation of Salvia miltiorrhiza. Southwest China Journal of Agricultural Sciences.. Journal of Agricultural Sciences. 2011; S 567.53.

24.Sharma V,  Ramawat KG. Salinity-induced modulation of growth and antioxidant activity in the callus cultures of miswak (Salvadora persica(.Biotech. 2013; 3(1): 11–17.

25.Desikan NR, Hancock J. Hydrogen peroxide signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 2002; 5: 388-395.