اثر عصاره آبی-الکلی دانه زغال‏ اخته بر بازخوانی حافظه و برخی پارامترهای سرم در موش‏‏های سوری نر آلزایمری شده

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156

2 دانشجوی دکتری، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

3 دانش آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

-

چکیده

هدف: در تحقیق حاضر، تاثیر عصاره دانه زغال ‏اخته بر یادگیری و حافظه و برخی پارامترهای سرم در موش‏های سوری نر آلزایمری بررسی شد.  مواد و روش‏ها: 48 سر موش‏ با وزن تقریبی 25 تا 30 گرم به 6 گروه تقسیم شدند: سالین-سالین، STZ – سالین،  STZ- عصاره دانه زغال ‏اخته(25، 50 و 75 میلی گرم بر کیلوگرم) ، سالین-دوز موثر عصاره دانه زغال اخته. جهت ایجاد بیماری آلزایمر از تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین (3 میلی‏گرم بر کیلوگرم) استفاده شد و میزان حافظه و یادگیری از طریق آزمون احترازی غیرفعال ارزیابی شد. کلیه گروه‌ها به‏مدت 3 هفته عصاره دانه زغال ‌اخته و یا سالین را به‏شکل داخل صفاقی دریافت کردند، سپس وارد آزمون‏های یادگیری شدند. در پایان تمام حیوانات کشته و خون‏گیری از بطن راست انجام گرفت. میزان گلوکز، تری‌گلیسیرید و کلسترول تام در سرم اندازه‌گیری شد. همچنین در طول دوره تیمار وزن‌گیری از موش‌ها در ابتدای هر هفته‌ انجام شد. داده‏ها توسط آنالیز واریانس یک‏طرفه و تست توکی و یا آنالیز واریانس با اندازه‏گیری‏های مکرر بررسی شد. نتایج: تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین به‏طور معنی‏داری منجر به تخریب حافظه شد (001/0>p). عصاره دانه زغال‏اخته در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم بازخوانی حافظه را بهبود بخشید (001/0>p) و منجر به کاهش معنی‏دار سطح گلوکز و تری‏گلیسیرید سرم شد (01/0>p) اما بر میزان کلسترول تام تاثیر معنی‏داری نداشت (05/0<p). کاهش وزن تنها در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی‏دار بود (01/0>p).  نتیجه گیری: احتمالا زغال اخته با کاهش میزان فاکتورهای خطرساز در خون و تنظیم سوخت و ساز گلوکز و چربی‏ها، موجب تقویت حافظه در بیماری‏های تخریب کننده عصبی مانند آلزایمر می‏شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


 

مقدمه

بیماری آلزایمر نوعی بیماری نورودژنراتیو پیشرونده غیرقابل برگشت و تدریجی است که موجب اختلال حافظه، کاهش عمل‏کرد­های شناختی و توانایی­های فکری، همچنین تغییرات رفتاری می­گردد (1و2). در آلزایمر  نوع دیر‏رس (اسپورادیک) که تقریبا ۹۰ تا ۹۵ درصد از موارد بیماری آلزایمر را تشکیل می‏دهد وراثت نقش چندانی نداشته و معمولا در دهه ششم زندگی مشخص می‏شود. در این نوع  کاهش بارزی در استفاده از گلوکز مغزی همراه با کاهش مداوم انرژی در دسترس مغز مشاهده می‏شود. این ناهنجاری به‏علت اختلال در عملکرد سیگنال‏های نورونی انسولین (مقاومت انسولینی) ایجاد می‏شود. کاهش غلظت انسولین در مغز بیماران آلزایمری پس از مرگ و در مایع مغزی- نخاعی آنان مشاهده شده است (3).

استرپتوزوتوسین(STZ) در تزریق درون مغزی در دوز زیر دیابتی در جوندگان با ایجاد آسیب­های استرس ­اکسیداتیو از طریق ایجاد مقاومت به انسولین و کاهش گلوکز و در نتیجه انرژی در دسترس مغز هم‏چنین ایجاد پروتئین بتا ­آمیلویید و رادیکال­های آزاد موجب بروز نقص در حافظه و اختلالات شناختی مشابه بیماری آلزایمر اسپورادیک در این حیوانات می‏­‏گردد (4). تحقیقات نشان دادند که تزریق داخل بطنی STZ با مهار سنتز  ATPو استیل‏کوآنزیم ‏A و در‏ نتیجه سنتز استیل‏کولین موجب آسیب عمل‏کردهای شناختی شده و فعالیت آنزیم استیل‏کولین‏ترانسفراز در هیپوکامپ موش‏های آلزایمری شده کاهش می‏یابد (5). مطالعات نشان داده‏اند عوامل آنتی اکسیدانت می‏توانند در تخفیف بیماری آلزایمر موثر باشد (6).

زغال اخته با نام علمی Cornus mas L. از خانواده Cornaceae و جز گیاهان دولپه‏ای درختی است. زغال اخته حاوی مقادیر کمی گلوکز و ساکارز بوده اما مقادیر زیادی آهن، کلسیم، ویتامین‏هایB2 ,B1 ,E ،C ، اسیدفولیک و فلاونوئیدها است. زغال ‏اخته حاوی بیش از 10 درصد تانن، قند، پکتین، اسیدهای آلی و رنگدانه‏هاست. آنتوسیانین موجود در زغال‏اخته ازگروه فلاونوئیدها می‏باشد (7). فلاونوئیدها دارای اثرات فارماکولوژیک گوناگونی از جمله خاصیت آنتی ‏اکسیدانتی، ضد آلرژی، ضد باکتریایی، ضد سرطان، کاهنده چربی و کلسترول، مهار تجمع پلاکتی و ضد دیابت می‏باشد (8 و 9). آنتی ‏اکسیدانت‏های زغال اخته شامل بوتیل هیدروکوانیل، هیدروکسی تولوئن بوتیرات و هیدروکسی آنیزول بوتیرات است (10 و 11). زغال اخته در میان میوه‏های مصرفی متداول دارای بالاترین سطح پلی فنول می‏باشد. پلی ‏فنول‏های موجود در زغال اخته باعث کاهش کلسترول و حفظ (Low Density Lipoprotein) LDL خون می‏گردد. تحقیقات نشان می‏دهد آنتوسیانین‏ها می‏توانند باعث کاهش بیماری‏هایی مانند آترواسکلروز، بیماری قلبی‏ ‏عروقی، سرطان و دیابت گردند. زغال اخته دارای سطح بالایی از آنتوسیانین‏هاست. آنتوسیانین‏های موجود در زغال ‏‏اخته شامل دلفینیدین 3-1- بتاگالاکتوپیرانوزوئید و پلارگونیدین 3-1 و گالاکتوپیرانوزوئید می‏باشد (9 و 12).

در دوران حاضر کمی­ تحرک و رژیم غذایی نامناسب درمیان افراد جامعه به میزان قابل­توجهی منجر به شیوع سندرم متابولیک شده است.  در این‏حالت بیماری­‌های قلبی- عروقی و دیابت نوع II افزایش می‏یابد. در نتیجه شرایط برای مرگ سلول‏ها خصوصا در سیستم عصبی فراهم آمده و این یکی از دلایل اصلی افزایش آلزایمر حتی در سنین پایین در جوامع امروزی می­باشد. با افزایش سن امید به زندگی، تعداد افراد مسن نیز افزایش یافته است، در این افراد علاوه بر شرایط زندگی، سن نیز زمینه را برای بروز آلزایمر فراهم می‏نماید. اگرچه برای این بیماری درمان قطعی وجود ندارد اما می‏توان از سرعت شروع و پیشرفت آن کاست.­ یک راه حل ساده استفاده از آنتی ­اکسیدانت­ها به‏عنوان سرکوب‏کننده‏های رادیکال­های آزاد و افزایش حساسیت سلول­ها به انسولین می­باشد. علاوه بر آن با توجه به این‏که لیپیدها یکی از سوبستراهای لازم برای عمل رادیکال‏های آزاد می­باشند، به‏نظر می­رسد اگر این ترکیب کمتر در دسترس رادیکال آزاد باشد، عوارض ناشی از استرس اکسیداتیو نیز کمتر خواهد شد.

 با توجه به این‏که زغال ­اخته منبع غنی از فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها است، در این پژوهش به بررسی اثر عصاره دانه زغال‏اخته بر به‏خاطرآوری حافظه در موش‏های نر آلزایمری شده با استرپتوزوتوسین پرداخته شد. همچنین تاثیر این عصاره بر کاهش وزن و پارامترهای خونی نظیر گلوکز، تری­گلیسیرید، کلسترول که همگی از عوامل خطر ساز در سندروم متابولیک و بروز بیماری­های سیستم عصبی هستند مورد بررسی قرار گرفت.              

مواد و روش‌ها

حیوانات آزمایشگاهی و شرایط نگه‏داری: در این تحقیق از 48 سر موش‌های کوچک آزمایشگاهی نر، نژاد NMRI (وزن تقریبی25 تا 30 گرم) استفاده شد. حیوانات در حیوان­خانه تحقیقاتی دانشگاه اراک تکثیر و تا رسیدن به وزن مناسب نگه‏داری می­شدند. در طول نگه‏داری آب و غذای کافی در اختیار موش‏ها قرار ­گرفت. حیوانات در محیطی با دمای 2 ± 22 درجه سانتی‏گراد و با دوره روشنایی- تاریکی 12 ساعته نگه‏داری می‌­شدند. آزمایش‏های مورد نظر در زمان معینی از روز انجام ‏گرفت. هشت حیوان در هر گروه تجربی قرار داشت و هر حیوان فقط یک بار آزمایش شد. تمامی آزمایش­ها طبق موازین اخلاقی کار با حیوانات و بر طبق دستورالعمل­های نگه‏داری و استفاده از حیوانات انجام گرفت.

داروها: از کتامین هیدروکلراید و زایلزین (تهیه شده از شرکتWOERDAN- هلند)  به‏عنوان داروهای بی‏هوشی و به‏صورت درون‏صفاقی استفاده شد. پودر استرپتوزوتوسین (تهیه شده از شرکت سیگما- آلمان) به‏صورت محلول در سالین با غلظت مورد نظر تزریق شد. برای تهیه دوزهای مختلف دانه زغال اخته عصاره مورد نظر در سالین حل شد. استرپتوزوتوسین(3 میلی‏گرم بر کیلوگرم) به‏صورت درون بطن‏مغزی (3 میکرولیتر در هر بطن) و عصاره دانه زغال اخته به‏صورت درون صفاقی(25، 50 و 75 میلی گرم بر کیلوگرم) تزریق شد.

تهیه عصاره هیدروالکلی دانه زغال اخته: میوه زغال اخته از منطقه الموت قزوین تهیه و به‏کمک فلور رنگی ایران شناسایی شد (13). پس از جدا کردن دانه‏ها از میوه، به100 گرم دانه کاملا خرد و آسیاب شده زغال اخته مقدار 104 میلی‏لیتر متانول  80 درصد اضافه شد. ارلن محتوی محلول را به ملایمت به‏صورت چرخشی هم زده و به‏مدت 2 دقیقه روی هیتر با دمای 80  درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. سپس روی آن‏را با نسکوفیلم پوشانده شده و به‏مدت 24 ساعت زیر هود قرار داده شد. عصاره رویی جدا و به تفاله‏ها 104 میلی‏لیتر متانول 80 درصد اضافه و مراحل فوق تکرار شد. در روز سوم محتویات رویی تفاله‏ها به آرامی به ظرف محتوی عصاره‏های قبلی اضافه شده و به ارلن حاوی تفاله 50 میلی‏لیتر متانول 80 درصد اضافه و بعد از گذشت 72 ساعت محلول رویی تفاله‏ها به ارلن حاوی عصاره دانه اضافه گردید. در انتها عصاره‏ها به دستگاه روتاری با دمای ْ40 درجه سانتی‏گرادو سرعت40 متر بر ثانیه اضافه شد. بعد از اتمام تبخیر 61/20 گرم عصاره با استفاده از 50 میلی‏لیتر اتانول 70 درصد جمع‏آوری و به‏داخل ظرف درب‏دار دیگری منتقل شد. به‏کمک نرمال سالین دوزهای مختلف از این عصاره تام  تهیه شد.

روش جراحی و کانول گذاری در بطن‏های جانبی: ابتدا هر موش بر اساس وزن به‏وسیله تزریق داخل صفاقی مخلوطی از ترکیب کتامین هیدروکلراید (100 میلی‏گرم بر کیلوگرم) و زایلزین(10 میلی‏گرم بر کیلوگرم) بی‏هوش شد. مختصات بطن‏های جانبی بر اساس اطلس پاکسینوس و فرانکلین به‏دست آمد (4/0 میلی‏متر به‏سمت عقب از برگما، 1 میلی‏متر در طرفین شکاف ساژیتال و 7/0میلی‏متر به‏طرف پایین از سطح جمجمه). در سطح جمجمه محل کانول گذاری توسط مته دندانپزشکی تا پرده مننژ سوراخ شد. کانول‏های راهنما به‏طول 5 میلی‏متر از سرسوزن 22 گیج تهیه شده و به‏صورت دو طرفه در محل‏های سوراخ شده، حدود 1 میلی‏متر بالاتر از ناحیه مورد نظر به‏کمک آکریل دندانپزشکی ثابت شد.

روش تزریق درون مغزی: برای تهیه کانول تزریق، سر سوزن 27 گیج دندان‌پزشکی که یک میلی‏متر بلندتر از کانول راهنما بریده شده، به رابط پلی اتیلنی و سرنگ هامیلتون استفاده گردید. تزریق درون بطنی با حجم 3 میکرولیتر در روز اول و سوم جراحی انجام شد. در پایان آزمایش‏های مربوطه برای ارزیابی صحت عملیات و درستی مختصات محل جراحی و تزریق، مقدار 1 میکرولیتر از محلول 1 درصد آبی متیلن بلو به‏صورت دو طرفه تزریق شده، مغز حیوان از جمجمه خارج و در محلول فرمالین 10 درصد به‏مدت یک هفته ثابت شد. برش‏گیری در ناحیه تزریق و برسی توزیع رنگ در فضای بطن‏های جانبی بیانگر میزان صحت کانول گذاری بود.  داده‏های حیواناتی که محل کانول گذاری آن‏ها  خارج از این ناحیه بود از آنالیز‏ها حذف شد.

دستگاه سنجش حافظه: جهت سنجش حافظه و یادگیری از دستگاه step-down استفاده شد (14). این دستگاه از جعبه‏ای به ابعاد 40 12أ—'> 30 12أ—'> 30 سانتی‏متر تشکیل شده است. کف دستگاه پوشیده از میله‏های موازی با قطر 3/0 و به فاصله  مساوی 1 سانتی‏متر از هم است. همچنین یک سکوی مکعبی چوبی به ابعاد 4 12أ—'> 4 12أ—'> 4 سانتی‏متر در قسمت میانی کف دستگاه روی میله‏های فلزی قرار دارد. این جعبه به دستگاه مولد جریان الکتریکی متصل است. هنگامی‏که دستگاه روشن می‏شود یک جریان الکتریکی با مشخصات 1 هرتز، 8 ثانیه و 50 میلی ولت در میله‏های فلزی برقرار می‏شود.

یادگیری اجتنابی غیر فعال: یادگیری اجتنابی غیر فعال به‏روش «پایین آمدن از سکو» (Step down) برای بررسی حافظه در موش‏های آزمایشگاهی در دو روز پشت سر هم انجام شد. روز اول یا روز آموزش شامل آموزش دادن حیوانات در دستگاه می‏باشد، روز دوم یا روز آزمون شامل بررسی یا تست میزان حافظه‏ی حیوانات آموزش دیده است

1 - هر موش با احتیاط کامل روی سکوی دستگاه قرار گرفت. به‏محض آن‏که حیوان از مکعب چوبی پائین آمده و چهار پای حیوان روی میله‏های فولادی قرار می‏گرفت، به‏مدت 8 ثانیه به پاهای حیوان شوک الکتریکی وارد می‏شد. پس از آن موش از دستگاه خارج و به قفس نگه‏داری منتقل شد. مراحل آموزش بین 8 صبح تا 2 بعد از ظهر انجام ‏گرفت.

2 - برای ارزیابی و اندازه گیری اثر داروها، جلسه آزمون 24 ساعت بعد از آموزش بوده و از نظر روش مشابه جلسه آموزش است با این تفاوت که در این مرحله حیوان شوک نمی‏گیرد. به‏محض این‏که موش هر چهار پای خود را از سکو جدا کرده و پائین می‏آمد زمان یادداشت می‏شود. مدت زمانی که طول می­کشد تا حیوان به‏طور کامل از سکو پایین بیاید، تاخیر در پایین آمدن از سکو (Step-downlatency) نام دارد. حداکثر زمان آزمون 300 ثانیه است و در صورتی‏که حیوان در طول این مدت از سکو پایین نمی­آمد از دستگاه خارج و زمان تاخیر برای حیوان 300 ثانیه در نظر گرفته می­شد.

آزمایش‏های انجام شده: حیوانات به سه گروه کلی گروه کنترل، گروه آلزایمری و گروه‏های دریافت کننده عصاره تقسیم شدند. در تزریق درون مغزی در گروه کنترل از سالین و در مابقی گروه‏ها از STZ (3 میلی‏گرم بر کیلوگرم) به‏میزان 3 میکرولیتر در هر بطن استفاده شد(1 و 20 و 25). در تزریق درون صفاقی گروه کنترل و گروه آلزایمری سالین و گروه‏های دریافت کننده عصاره، عصاره دانه زغا­ل اخته را در در دوزهای 25، 50 و 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏مدت 21 روز به‏طور پیوسته با فاصله زمانی 24 ساعت دریافت نمودند. گروه کنترل مثبت در تزریق درون مغزی سالین (میلی‏گرم بر کیلوگرم) و در تزریق درون صفاقی عصاره دانه زغال اخته را در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم دریافت کرد. پس از اتمام تیمار یعنی در روزهای 22و 23 هر دوره، مراحل آموزش و آزمون حافظه انجام شد. در تمام گروه‏های آزمایشی حیوانات در ابتدای هر هفته وزن­کشی شدند و به محض اتمام تست­های رفتاری، حیوانات به‏ترتیب در داخل دسیکاتور حاوی پنبه آغشته به کلروفرم قرار

گرفته، به محض متوقف شدن تنفس و قبل از متوقف شدن ضربان قلب، قفسه سینه حیوان باز و به‏کمک سرنگ 2 میلی‏لیتر از بطن راست حیوان خون‏گیری انجام می­شد. سپس خون در داخل میکروتیوپ ریخته شده و به‏کمک سانتریفیوژ 2 مرحله‏ای با دور g 16000  به‏مدت 10 دقیقه، سرم جدا و در داخل میکروتیوپ دیگری ریخته شد. میکروتیوپ­ها در داخل فریزر 80- درجه سانتی‏گراد قرار گرفته و برای بررسی گلوکز، تری‏گلیسیرید و کلسترول تام به آزمایشگاه سینا در شهر اراک منتقل شدند.

آنالیزهای آماری: از نظر آماری، همه­ی نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار استاندارد (SEM) بیان شدند. جهت تعیین وجود اختلاف معنی­دار بین گروه­های آزمایش رفتاری از آزمون آماری kruskal wallis و آنالیز Mann-Whitney’s  استفاده شد. همچنین جهت تعیین وجود اختلاف معنی­دار بین پارامترهای خونی در گروه‏های آزمایشی، از روش آنالیز واریانس (Anova)  یک‏طرفه و به‏دنبال آن آزمون توکی(Tukey-test)  استفاده گردید. داده‏های وزن، توسط نرم افزاز SPSS و آنالیز تحلیل واریانس با اندازه گیری‏های مکرر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در این بررسی سطح  05/0p< معنی‏دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

اثرتزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین بر روی حافظه اجتنابی غیر فعال

آزمون آماری kruskal wallis نشان داد که تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین با دوز 3 میلی‏گرم بر کیلوگرم در روز های اول و سوم پس از جراحی تاخیر در پایین آمدن از سکو را به‏طور معنی‏داری کاهش می‏دهد که به معنی تخریب حافظه است]0001/0< p ،496 /11 = (1) [H. آنالیز باMann-Whitney’s  نشان داد که STZ، تاخیر در پایین آمدن از سکو یا به اصطلاح میزان حافظه را در 24 ساعت بعد کاهش داده است (001/0 p<) (نمودار1).

اثر تزریق دوزهای مختلف عصاره دانه زغال‏اخته  در به‏خاطرآوری موش‏های آلزایمری شده با استرپتوزوتوسین

تجویز مقادیر مختلف عصاره دانه زغال­اخته به‏صورت درون‏صفاقی با دوزهای 25 و 50 و 75  میلی‏گرم بر کیلوگرم از 21 روز پیش از آموزش (شروع آن از یک روز قبل از جراحی) و تزریق استرپتوزوتوسین با دوز 3 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت درون‏مغزی در روز اول و سوم جراحی، حافظه را با نسبت‏های مختلف در مقایسه باگروه STZ  بهبود ‏بخشید. آزمون آماری kruskal wallis  نشان داد که تیمار با مقادیر مختلف عصاره دانه زغال­اخته تاخیر در پایین آمدن از سکو را به‏طور معنی­داری افزایش می‏دهد]01/0< p ،926 /13 = (3) [H که به‏معنی بهبود  حافظه است. آنالیز با Mann-Whitney’s نشان داد بیش‏ترین تاثیر مربوط به دوز  50 میلی‏گرم بر کیلوگرم می‏باشد (01/0 p<) (نمودار 2).

 

 

نمودار1: اثر استرپتوزوتوسین بر حافظه اجتنابی غیر فعال. این نمودار کاهش تاخیر در پایین آمدن از سکو را در موش‏‏های سوری­های آلزایمری شده با استرپتوزوتوسین نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد. گروه STZ این ماده را با دوز 3 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت داخل بطنی با حجم 3 میکرولیتر در هر بطن در روز اول و سوم پس از جراحی  و سالین را از یک روز قبل از جراحی به‏صورت داخل صفاقی دریافت کردند. گروه کنترل در تزریق داخل مغزی و صفاقی سالین 12 '> دریافت کردند (001/0 (***p<0

 

 

نمودار2: اثر دوز­های مختلف عصاره دانه زغال­اخته در بهبود حافظه‏ی موش­های آلزایمری شده با استرپتوزوتوسین. این نمودار نشان­دهنده مقایسه گروه STZ با گروه­های آزمایشی است که به­طور هم‏زمان عصاره دانه زغال­اخته را به‏صورت داخل‏صفاقی و استرپتوزوتوسین را به‏صورت داخل بطن‏مغزی دریافت نمودند. تزریق درون صفاقی عصاره دانه به‏طور معنی­داری موجب بهبود حافظه یعنی افزایش تاخیر در پایین آمدن از سکو می‏شود. این بهبود در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم نسبت به سایر دوز­ها مشخص­تر می­باشد(05/0 *p< و 01/0 (**p<0

 

اثر تزریق دوز موثر عصاره دانه زغال­اخته بر به‏خاطرآوری حافظه

آزمون آماری kruskal wallis  نشان داد که تجویز عصاره دانه زغال‏اخته به‏صورت درون صفاقی با دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم باعث بهبود حافظه نسبت به گروه­ کنترل و گروه دریافت کننده STZ شد ]001/0 P< ، 625/15= (3) [H .

آنالیز با Mann-Whitney’s نشان داد این بهبود حافظه نسبت به گروه­ کنترل معنی­دار نبوده (05/0<p) ولی نسبت به گروه دریافت کننده استرپتوزوتوسین معنی­دار است (001/0p<)

(نمودار 3).

اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته بر سطح گلوکز سرم

آزمون آماری تحلیل واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی توکی نشان داد که تجویز درون صفاقی مقادیر مختلف عصاره دانه زغال‏اخته از 21 روز قبل از تهیه نمونه سرم، سبب کاهش گلوکز موجود در سرم شد. این تزریق تنها در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت معنی‏داری سبب کاهش گلوکز موجود در سرم شد ]001/0 p< ، 830/15 = ( 15، 3) [F(نمودار 4).

 

 

نمودار3: اثر دوز50 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره دانه زغال­اخته به تنهایی در مقایسه با گروه­های کنترل،STZ   و گروهی که عصاره دانه زغال­اخته را به‏صورت داخل صفاقی با دوز50 میلی‏گرم بر کیلوگرم و STZ  را به‏صورت داخل بطنی دریافت کرده اند. این نمودار نشان می­دهد که دوز  50 میلی‏گرم بر کیلوگرم به تنهایی حافظه را نسبت به گروه STZ افزایش می دهد (001/0(p<0

 

 

نمودار4: اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته در کاهش غلظت گلوکز موجود در سرم. تزریق داخل صفاقی عصاره دانه زغال­اخته در دوز­های  50 و 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم نسبت به گروه کنترل و STZ سبب کاهش گلوکز می­گردد ولی این کاهش تنها در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی­دار بود (001/0(***p<0.

 

اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته بر سطح ذرات چربی سرم

الف) تری­گلیسیرید: آزمون آماری تحلیل واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی توکی نشان داد که تجویز درون صفاقی مقادیر مختلف عصاره دانه زغال‏اخته از 21 روز قبل از تهیه نمونه سرم، در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت معنی­داری سبب کاهش سطح تری‏گلیسیرید موجود در سرم شد ]001/0 , p<

 607/34= ( 15، 3) [F  (نمودار 5، الف).

ب)کلسترول: آزمون آماری تحلیل واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی توکی نشان داد که تجویز درون‏صفاقی مقادیر مختلف عصاره دانه زغال­اخته از 21 روز قبل از تهیه نمونه سرم، تاثیر معنی­داری بر کاهش سطح کلسترول موجود در سرم نداشت ]05/0< p ،250/0=  ( 15، 3) [F(نمودار5، ب).

 

 

 

 

نمودار5: الف): اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته در کاهش غلظت تری­گلیسیرید موجود در سرم. این نمودار نشان می­دهد که تزریق داخل صفاقی عصاره دانه زغال­اخته در طی 21 روز تیمار در تمام دوز­ها نسبت به گروه­های کنترل و STZ سبب کاهش تری­گلیسیرید می‏شود ولی این کاهش تنها در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی­دار بود (001/0(***p<0 ب): اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته بر غلظت کلسترول موجود در سرم. این نمودار نشان می­دهد که تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف  عصاره دانه زغال­اخته نسبت به گروه­های کنترل و STZ  تاثیری معنی­داری بر سطح کلسترول تام در سرم ندارد ( 05/0<p).

 

 

اثر تزریق داخل صفاقی دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته بر وزن بدن

آزمون آماری اندازه­گیری­های تکراری (Measures Repeated) نشان داد که تجویز درون‏صفاقی مقادیر مختلف عصاره دانه زغال ­اخته در طول مدت 21 روزه تیمار نسبت به گروه­های کنترل و STZ سبب کاهش وزن در تمام دوزها گردید. اما این کاهش وزن تنها در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی‏دار بود (جدول 1).

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین 12آ±'> خطای معیار وزن بر حسب گرم در طول هفته­های تیمار بین گروه­های کنترل، STZ، گروه STZ + دوزهای مختلف عصاره دانه زغال اخته و دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره دانه زغال­اخته به تنهایی در طی 3 هفته تیمار. این جدول همچنین نشان می­دهد که تزریق داخل صفاقی عصاره دانه زغال‏اخته، در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم به تنهایی و همراه با STZ سبب کاهش معنی­دار در وزن موش­ها نسبت به گروه­های کنترل و STZ می‏گردد‏(01/0**p< و 001/0(***p<0

 

هفته سوم

هفته دوم

هفته اول

گروه

65/37±42/2

59/31±85/2

7/30±95/2

Control

94/36±34/2

1/34±34/2

84/30±91/2

STZ

11/30±74/0

14/29±16/2

24/31±79/1

STZ +25

***2/27±86/4

***375/27±87/3

05/29±84/2

STZ +50

59/28±15/4

05/30±67/3

46/32±95/2

STZ +75

           ** 89/25±65/0

**82/27±38/1

09/32±34/1

Dose 50

 

 

بحث

الگوهای رفتاری متعددی برای سنجش حافظه و یادگیری در حیوانات آزمایشگاهی وجود دارد. از این بین مدل یادگیری اجتنابی مهاری به‏صورت گسترده در بسیاری از مطالعات فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی، جهت بررسی حافظه بلند­مدت همچنین اثر نوروترانسمیتر­ها مورد استفاده قرار می‏گیرد (15 و 16).

بر اساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر، تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین (3 میلی‏گرم بر کیلوگرم) با حجم 3 میکرولیتر در هر بطن در روز اول و سوم جراحی بعد از 21 روز، باعث تخریب حافظه در موش های سوری نر شد (نمودار 1). مطالعات صورت گرفته در گذشته نیز یافته ما را تایید می­کند (17 و 18 و 19).

تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین موجب بروز مقاومت انسولینی، کاهش میزان انرژی در دسترس سلول­های عصبی و افزایش میزان گلوگز در مغز می­گردد (20). به‏دنبال مقاومت انسولینی و کاهش انرژی در دسترس با اختلال در تولید پروتئین­های پیش­ساز آمیلویید منجر به تجمع پلاک­های ­آمیلوییدی می‏گردد (21). تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین از یک طرف موجب کاهش فعالیت پروتئین کینازC  و ایجاد استرس اکسیداتیو و از طرف دیگر افزایش سطح کلسیم درون سلولی می­شود. در چنین شرایطی میزان کاسپاز 3 در قشر و هیپوکامپ افزایش یافته و آپوپتوز سلول­های عصبی رخ می­دهد (22).

در این پروژه برای جبران اثرات منفی ناشی از تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین بر بازخوانی حافظه از دوزهای مختلف عصاره دانه زغال­اخته (25، 50 و 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم) استفاده شد که منجر به تغییرات معنی­دار در روند بهبود حافظه گردید. در این میان تاثیر دوز  50 میلی‏گرم بر کیلوگرم نسبت به سایر دوز­ها بیش‏تر بود (نمودار 2).

مطالعات مشابه نتایج حاصل از این بررسی را تایید می‏کنند. رژیم­های غذایی غنی از فلاونوئیدها می‏تواند تاثیر مثبتی بر مغز و اختلالات تخریب نورونی نظیر آلزایمر و پارکینسون داشته باشد (23 و 24 و 25). تیمار موش‏های سوری ماده بالغ، پس از دو هفته با بلوبری (26 و 27 و 28). ، عصاره انگور قرمز (29) و چای سبز  منجر به بهبود حافظه می‏شود. استفاده از عصاره ژینکوبیلوبا در موش‏های سوری ترانسژنیک سبب بهبود حافظه فضایی شد (30).

به‏نظر می‏رسد که فلاونوئیدها موجب حفاظت از نورون­ها در برابر آسیب ناشی از نوروتوکسین­ها و عوامل التهاب­زای سیستم عصبی شده همچنین دارای توانایی بالقوه در بهبود حافظه و یادگیری و عمل‏کردهای شناختی می­باشند. در مرحله اول این ترکیبات منجر به رگ­زایی و نوروژنز خصوصا در هیپوکامپ و مهار آپوپتوزیس ناشی از گونه‏های نوروتوکسیک می‏شوند (31و 32). فلاونوئیدها همچنین با اثر بر پروتئین کینازها، لیپید کینازها (PI3/Akt)( phosphoinositide-3-kinase–protein kinase /Akt) و مسیر MAP کینازها ((Mitogen Activated Protein kinases موجب بهبود ارتباطات نورونی در مناطق شکنج دندانه‏ای و CA3 هیپوکامپ و بهبود ارتباطات نورونی و به‏دنبال آن منجر به بهبود LTP  (Long Term Potentiation) می‏شوند (33 و 34). این ترکیبات روی مسیر ERK/CREB (cAMP response element-binding protein/ Extracellular signal-regulated kinases) اثر کرده و آن را فعال می­کنند. زغال­اخته منبع غنی از فلاونوئیدها است (7). لذا به‏نظر می‏رسد که اثرات عصاره دانه زغال اخته بر بهبود حافظه و یادگیری ناشی از ترکیبات پلی فنولی و فلاونوئیدهای موجود در این عصاره باشد.

همچنین تزریق داخل صفاقی عصاره دانه زغال­اخته  سبب کاهش میزان گلوکز در سرم می­گردد. این کاهش در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی­دار است (001/0p<) استفاده از عصاره Cornus officinalis از خانواده زغال ‏اخته در رت‏های دیابتی شده نشان داد که مصرف خوراکی این عصاره موجب کاهش میزان گلوکز خون می‏گردد (35). تحقیقات نشان داده است که عصاره الکلی این گیاه سبب افزایش بیان ژن مربوط به GLUT4(Glucose Transporter 4) می‏شود (35).‏ استفاده از پلی ­فنول Rutin باعث کاهش معنی‏دار سطح گلوکز ناشتا و هموگلوبین گلیکوزیله شد (36). استفاده از کامفرول تهیه شده از برگ درخت گل ابریشم یا Bauhinia forficata در رت‏های دیابتی شده با آلوکسان سبب کاهش قند خون و در رت­های سالم سبب افت گلوکز موجود در خون می­گردد (37). آنتوسیانین‏ها موجب کاهش مقاومت به انسولین و بهبود تنظیم­ کننده­های گلوکز می‏شوند (38) از طرف دیگر آنتی ­اکسیدانت‏های گیاهی خاصیت شبه انسولینی دارند و جذب گلوکز را در بافت­های محیطی افزایش می‏دهند (39). همچنین آنتی ­اکسیدانت‏ها از طریق اثر بر سلول­های بتای جزایر لانگرهانس موجب افزایش جذب گلوکز و تولید انسولین بیشتر می­گردند (40 و 41).

بر اساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر، تزریق داخل صفاقی عصاره دانه زغال ­اخته  با دوزهای 25، 50 و 75 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن  به‏مدت 21 روز سبب کاهش میزان تری­گلیسیرید در سرم می­گردد. این کاهش در دوز  50 میلی‏گرم بر کیلوگرم معنی­دار  می­باشد‏( (001/0p<) (نمودار 4).  اما تغییر معنی داری در سطح کلسترول تام در هیچ یک از گروه‏ها مشاهده نشد (05/0p <) (نمودار 5).‏ مطالعات انجام شده در گذشته نیز، نتایج متفاوتی را نشان می‏‏دهد (42 و 43و 44و 45 و 46 ).

به‏طور خلاصه ترکیبات پلی ‏فنولی و فلاونوئیدها از طریق اثر بر سطح آنزیم­های گوارشی دخیل در هضم چربی­ها مانند لیپاز پانکراسی و فسفولیپاز  A2 سبب کاهش هضم و در نهایت جذب چربی­ها می­گردد. این ترکیبات موجب کاهش سطح تری­گلیسیرید موجود در خون می‏‏شوند. فلاونوئیدها از طریق اثر کاهشی بر میزان فعالیت و سطح آنزیم­های کبدی دخیل در بیوسنتز لیپیدها و افزایش سطح فعالیت ترکیبات موثر در مسیر بتا اکسیداسیون اسیدهای چرب، سبب کاهش تولید اسیدهای چرب و تری­گلیسیرید و افزایش دفع کلسترول از طریق مدفوع می‏گردند.

از طرفی این ترکیبات با  افزایش بیان  PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) و کاهش بیان PPARα  در کبد باعث کاهش تری‏گلیسریدها می‏شوند. این شرایط از یک‏طرف موجب افزایش نفوذپذیری سلول­ها به تری­گلیسیرید و افزایش تولید HDL(High Density Lipoprotein) می­­گردد و از طرف دیگر موجب افزایش میزان برداشت کلسترول در ماکروفاژ­ها می‏گردد. همچنین این ترکیبات با افزایش بیان و مقدار آنزیم پارا اکسوناز در کبد، با کاهش اکسیداسیون HDL سبب افزایش مقدار آن در خون می­گردد.

زغال ‏اخته با داشتن ترکیبات آنتی ‏اکسیدانتی قادر به کاهش استرس ‏اکسیداتیو و ایجاد تغییرات بیوشیمیایی در خون می‏باشد. آنتوسیانین‏های موجود در عصاره دانه این گیاه قادر به القای تغییرات متابولیک مطلوب در جهت تنظیم فعالیت آنزیم‏های کبدی و کاهش سطح گلوکز و چربی خون می‏باشند. پژوهش‏ها نشان داده است که افزایش تری‏گلیسیرید داخل سلولی منجر به افزایش غیر مستقیم میزان VLDP (Density protein Very Low) می‏گردد. پس هر عاملی که بتواند سطح تری‏گلیسیرید خون را افزایش دهد منجر به افزایش VLDP خواهد شد. در عین حال غلظت تری‏گلیسیرید و HDL در سرم خون رابطه عکس دارد. (10). در این پژوهش عصاره دانه زغال ‏اخته توانست میزان تری‏گلیسیرید سرم را به‏طور معنی‏داری کاهش دهد اما بر میزان کلسترول تام اثر معنی‏داری نداشت. در واقع کاهش تری‏گلیسیرید منجر به کاهش VLDP اما افزایش HDL شده است و در مجموع کلسترول تام تغییری نکرده است. نتیجه حاصل به‏خوبی با نتایج سایر تحقیقات هم‏خوانی دارد.

براساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر، وزن موش‏های سوری در طول دوره تیمار در هر سه دوز کاهش یافته است ولی این کاهش در دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم به تنهایی (05/0p<) و همراه با STZ معنی­دار می باشد (01/0p <) (جدول 1). نتایج حاصل از مطالعات گذشته نیز این کاهش وزن را تایید می­کنند(47).

با توجه به مکانیسم­های بیان شده در مورد کاهش گلوکز و ذرات چربی خون انتظار کاهش وزن دور از ذهن نیست. مطالعات نشان می‏دهند که بین چاقی و سطح حافظه و یادگیری رابطه وجود دارد. افزایش بافت چربی از طریق افزایش اینترلوکین 1β سبب کاهش میزان حافظه و یادگیری می­گردد. در افراد چاق یکی از گیرنده­های مهم هیپوکامپی دخیل در حافظه و یادگیری (NMDA) کاهش می‏یابد (48).

به‏نظر می‏رسد که آنتوسیانین‏‏ها و ترکیبات فلاونوئید­ی از نظر بافت­شناسی سبب کوچک شدن سلول‏های چربی و دژنره شدن چربی­ها در سلول‏های کبدی شده و از نظر مولکولی سبب تنظیم افزایشی ژن­های مربوط به بتا ­اکسیداسیون اسیدهای چرب و تنظیم کاهشی ژن­های مربوط به سنتز اسیدهای چرب در سلول‏های کبدی می­گردد (47).

 بنابراین این ترکیبات احتمالا از طریق کاهش هضم و جذب چربی­های موجود در رژیم غذایی، افزایش اکسیداسیون اسیدهای چرب در کبد، کاهش تولید بافت چربی به‏خصوص چربی سفید دور شکم و اثراتش در کوچک کردن سلول­های چربی، همچنین کاهش میزان گلوکز موجود در خون، افزایش متابولیسم گلوکز در سلول‏ها سبب کاهش وزن می­گردد. عصاره دانه زغال‏اخته نیز به دلیل داشتن ترکیبات فوق توانست منجر به کاهش وزن در موش‏های سوری تحت تیمار شود.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از بررسی یادگیری اجتنابی مهاری نشان داد که

تجویز عصاره دانه زغال­اخته (25، 50 و 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم) به‏مدت 21 روز به‏طور معنی­داری زمان تاخیر در پایین آمدن از سکو را نسبت به گروه آلزایمری شده با STZ افزایش داده، منجر به کاهش میزان گلوکز و تری‏گلیسیرید سرم و کاهش وزن شد اما بر میزان کلسترول تام اثر معنی‏داری نداشت. مقادیر بالای پلی فنول، آنتوسیانین و ترکیبات آنتی اکسیدانتی این عصاره را دارای توان بالقوه درجهت بهبود حافظه داشته و ترکیبات آنتی‏اکسیدانتی آن قادر به کاهش استرس‏اکسیداتیو و ایجاد تغییرات بیوشیمیایی در خون می‏باشد. آنتوسیانین‏های موجود در این گیاه با تنظیم فعالیت آنزیم‏های کبدی، کاهش سطح گلوکز و چربی خون، دژنره کرددن چربی­ها در سلول‏های کبدی و تنظیم افزایشی ژن­های مربوط به بتا­اکسیداسیون اسیدهای چرب و تنظیم کاهشی ژن­های مربوط به سنتز اسیدهای چرب در سلول‏های کبدی اثر نموده‏اند. این ترکیبات احتمالا از طریق کاهش هضم و جذب چربی‏های موجود در رژیم غذایی، افزایش اکسیداسیون اسیدهای چرب در کبد، کاهش تولید بافت چربی به‏خصوص چربی سفید دور شکم، کاهش میزان گلوکز موجود در خون و افزایش متابولیسم گلوکز در سلول ها سبب کاهش وزن می‏شود.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش حاصل طرح تحقیقاتی با شماره 47/92 و با حمایت مالی حوزه‏ی معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک انجام شده است. در این خصوص از مسئولین مربوطه تشکر به‏عمل می‏آید.

  1. Rai S, Kamat PK, Nath C, Shukla R. A Study on Neuroinflammation and Nmda Receptor Function in Stz (Icv) Induced Memory Impaired Rats. J Neuroimmunol. 2013; 254(1-2): 1-9.
  2. Rafii MS, Aisen PS. Recent Developments in Alzheimer's Disease Therapeutics. BMC Med. 2009; 7; 7.
  3. NagasakoAkazome Y, Kanda T, Ohtake Y, Shimasaki H, et al. Apple Polyphenols Influence Cholesterol Metabolism in Healthy Subjects with Relatively High Body Mass Index. J Oleo Sci. 2007; 56(8): 417-28.
  4. Williams RJ, Spencer JP. Flavonoids, Cognition, and Dementia: Actions, Mechanisms, and Potential
 

Therapeutic Utility for Alzheimer Disease. Free Radic Biol Med. 2012; 52(1): 35-45.

  1. Ling L. Streptozocin. free radical and radiation biology program. 2001; 22(777): 1-10.
  2. Matsui T, Ueda T, Oki T, Sugita K, et al. alpha-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins. 1. Survey of natural pigments with potent inhibitory activity. J Agric Food Chem. 2001; 49(4): 1948-51.
  3. Shors TJ, Townsend DA, Zhao M, Kozorovitskiy Y, et al. Neurogenesis May Relate to Some but Not All Types of Hippocampal-Dependent Learning. Hippocampus. 2002; 12(5): 578-84.
  4. Ghahreman, A. Colored Flora Iranica. Tehran: Tehran University co: 1358- 87 9.  
  5. Gould E, Reeves AJ, Graziano MS, Gross CG. Neurogenesis in the Neocortex of Adult Primates. Science. 1999; 286(5439): 548-52.
10. Lannert H, Hoyer S. Intracerebroventricular Administration of Streptozotocin Causes Long-Term Diminutions in Learning and Memory Abilities and in Cerebral Energy Metabolism in Adult Rats. Behav Neurosci. 1998; 112(5): 1199-208.

11. Serteser A, Kargioglu M, Gok V, Bagci Y, et al. Antioxidant Properties of Some Plant Growing Wild in Turkey. Grasas Y Aceites. 2009; 60(2): 147-154.

12. Jeremy P. The interactions of flavonoids within neuronal signalling pathways. Genes Nutr. 2007; 2(3): 257-273.

13. Ghosh D, Konishi T. Anthocyanins and Anthocyanin-Rich Extracts: Role in Diabetes and Eye Function. Asia Pac J Clin Nutr. 2007; 16(2): 200-8.

14. Jayaprakasam B, Olson LK, Schutzki RE, Tai MH, et al. Amelioration of Obesity and Glucose Intolerance in High-Fat-Fed C57bl/6 Mice by Anthocyanins and Ursolic Acid in Cornelian Cherry (Cornus Mas). J Agric Food Chem. 2006; 54(1): 243-8.

15. Passamonti S, Vrhovsek U, Vanzo A, Mattivi F. Fast Access of Some Grape Pigments to the Brain. J Agric Food Chem. 2005; 53(18): 7029-34.

16. Wein S, Behm N, Petersen RK, Kristiansen K, et al. Quercetin Enhances Adiponectin Secretion by a Ppar-Gamma Independent Mechanism. Eur J Pharm Sci. 2010; 41(1): 16-22.

17. Agrawal RE, Tyagi R. Shukla CN. Insulin Receptor Signaling in Rat Hippocampus: A Study in Stz (Icv) Induced Memory Deficit Model. Eur Neuropsychopharmacol. 2011; 21(3): 261-73.

18. Kocyigit M, Ozhatay N. Wild Plants Used as Medicinal Purpose in Yalova( Northwestturkey). Turkish J Pharm. 2006; 3(2): 91-103.

19. Michalik L, Auwerx J, Berger JP, Chatterjee VK, et al. International Union of Pharmacology. Lxi. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors. Pharmacol Rev. 2006; 58(4): 726-41.

20. Rasoolijazi H, Joghataie MT, Roghani M, Nobakht M. The Beneficial Effect of (-)-Epigallocatechin-3-Gallate in an Experimental Model of Alzheimer's Disease in Rat: A Behavioral Analysis. Iran Biomed J. 2007; 11(4): 237-43.

21. Yamabe N, Kang KS, Goto E, Tanaka T, et al. Beneficial effect of Corni Fructus, a constituent of Hachimi-jio-gan, on advanced glycation end-product-mediated renal injury in Streptozotocin-treated diabetic rats. Biol Pharm Bull. 2007; 30(3): 520-6.

22. Duthie GG, Duthie SJ, Kyle JA. Plant Polyphenols in Cancer and Heart Disease: Implications as Nutritional Antioxidants. Nutr Res Rev. 2000; 13(1): 79-106.

23. Commenges D, Scotet V, Renaud S, Jacqmin-Gadda H, et al. Intake of Flavonoids and Risk of Dementia. Eur J Epidemiol. 2000; 16(4): 357-63.

24. Roza JM, Xian-Liu Z, Guthrie N. Effect of Citrus Flavonoids and Tocotrienols on Serum Cholesterol Levels in Hypercholesterolemic Subjects. Altern Ther Health Med. 2007; 13(6): 44-8.

25. Williams R, Spencer J. Flavonoids. cognition and dementia: actions, mechanisms and potential therapeutic utility for Alzheimer’s disease. Free Radical Bio Med. 2011; 127(3): 210-213.

26. Andres-Lacueva CB, Shukitt-Hale RL, Galli O, Jauregui RM, et al. Anthocyanins in Aged Blueberry-Fed Rats Are Found Centrally and May Enhance Memory. Nutr Neurosci. 2005; 8(2): 111-20.

27. Kamalakkannan N, Prince PS. Antihyperglycaemic and Antioxidant Effect of Rutin, a Polyphenolic Flavonoid, in Streptozotocin-Induced Diabetic Wistar Rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2006; 98(1): 97-103.

28. Mufson EJ, Counts SE, Perez SE, Ginsberg SD. Cholinergic System During the Progression of Alzheimer's Disease: Therapeutic Implications. Expert Rev Neurother. 2008; 8(11): 1703-18.

29. Querfurth HW, LaFerla FM. Alzheimer's Disease. N Engl J Med. 2010; 362(4): 329-44.

30. Tahmasebi S, Heidarien N, Mohagerani HR. Effects of Crataegus Aronia  on Passive Avoidance Learning in Wistar Male Rats. Journal of Cellular and Molecular Biotechnology News. 2013: 79-86.

31. Kalt W, Blumberg JB, McDonald JE, Vinqvist-Tymchuk MR, et al. Identification of Anthocyanins in the Liver, Eye, and Brain of Blueberry-Fed Pigs. J Agric Food Chem. 2008; 56(3): 705-12.

32. Mehla J, Pahuja M, Gupta YK. Streptozotocin-Induced Sporadic Alzheimer's Disease: Selection of Appropriate Dose. J Alzheimers Dis. 2013; 33(1): 17-21.

33. Gunstad J, Paul RH, Cohen RA, Tate DF, et al. Obesity Is Associated with Memory Deficits in Young and Middle-Aged Adults. Eat Weight Disord. 2006; 11(1): e15-9.

34. Srivastava RA, Jahagirdar R, Azhar S, Sharma S, et al. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Alpha Selective Ligand Reduces Adiposity, Improves Insulin Sensitivity and Inhibits Atherosclerosis in Ldl Receptor-Deficient Mice. Mol Cell Biochem. 2006; 285 (1-2): 35-50.

35. Zou Y, Lu Y, Wei D. Hypocholesterolemic Effects of a Flavonoid-Rich Extract of Hypericum Perforatum L. In Rats Fed a Cholesterol-Rich Diet. J Agric Food Chem. 2005; 53(7): 2462-6.

36. Kaneto H, Kajimoto Y, Miyagawa J, Matsuoka T, et al. Beneficial Effects of Antioxidants in Diabetes: Possible Protection of Pancreatic Beta-Cells against Glucose Toxicity. Diabetes. 1999; 48(12): 2398-406.

37. Drapeau E, Mayo W. Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis". Proc Natl Acad Sci USA,2003; 100(24): 14385–87.

38. Milbury PE, Kalt W. Xenobiotic Metabolism and Berry Flavonoid Transport across the Blood-Brain Barrier. J Agric Food Chem. 2010; 58(7): 3950-6.

39. Wenk GL. An Hypothesis on the Role of Glucose in the Mechanism of Action of Cognitive Enhancers. Psychopharmacology. 1989; 99(4): 431-8.

40. Khalili M, Hamzeh F. Effects of Active Constituents of Crocus Sativus L., Crocin on Streptozocin-Induced Model of Sporadic Alzheimer's Disease in Male Rats. Iran Biomed J. 2010; 14 (1-2): 59-65.

41. Yamahara J, Mibu H, Sawada T, Fujimura H, et al. Biologically Active Principles of Crude Drugs. Antidiabetic Principles of Corni Fructus in Experimental Diabetes Induced by Streptozotocin (Author's Transl). Yakugaku Zasshi. 1981; 101(1): 86-90.

42. Cha JY, Cho YS, Kim I, Anno T, et al. Effect of Hesperetin, a Citrus Flavonoid, on the Liver Triacylglycerol Content and Phosphatidate Phosphohydrolase Activity in Orotic Acid-Fed Rats. Plant Foods Hum Nutr. 2001; 56 (4): 349-58.

43. Izquierdo I, McGaugh JI. Behavioural pharmacology and its contribut-ion to the molecular basis of memory consolidation. Behav Pharmacol. 2000 ; 11:517-34.

44. Nasri S,  The Effect of Resveratrol Flavonoid on Learning and Memory in Passive Avoidance and Y Maze in Diabetic Rat. ISMJ. 2012; 17 (1): 11-20.

45. Seeram NP, Schutzki R, Chandra A, Nair MG. Characterization, Quantification, and Bioactivities of Anthocyanins in Cornus Species. J Agric Food Chem. 2002; 50(9): 2519-23.

46. Stackman RWEckenstein FFrei BKulhanek D, et al.  Prevention of age-related spatial memory deficits in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease by chronic Ginkgo biloba treatment. Exp Neurol. 2003; 184(1): 510-20.

47. Aoki F, Honda S, Kishida H, Kitano M, et al. Suppression by Licorice Flavonoids of Abdominal Fat Accumulation and Body Weight Gain in High-Fat Diet-Induced Obese C57bl/6j Mice. Biosci Biotechnol Biochem. 2007; 71(1): 206-14.

48. Huong DT, Takahashi Y, Ide T. Activity and Mrna Levels of Enzymes Involved in Hepatic Fatty Acid Oxidation in Mice Fed Citrus Flavonoids. Nutrition. 2006; 22(5): 546-52.