نقش کیتوزان در افزایش تولید فلاونولیگنان‏ها در کشت ریشه‏های مویین خار مریم (Silybum marianum)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، بخش فیزیولوژی مولکولی، کرج، ایران

2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، تهران.، ایران

-

چکیده

هدف: اثرات غلظت‏های مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم) به‏عنوان الیسیتور، بر رشد و تولید سیلی‏مارین و شاخص‏های بیوشیمیایی در ریشه‏های مویین گیاه خار مریم بررسی شد. مواد و روشها: غلظت‏های مختلف کیتوزان (0، 5، 10، 20 و 30 میلی‏گرم در 50 میلی‏لیتر محیط کشت) به محیط کشت ریشه‏های مویین خار مریم (30 روزه) اضافه شد و نمونه برداری 12 ، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از تیمار انجام شد. مقدار سیلی‏مارین، فعالیت آنزیم‏های گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و میزان H2O2 در نمونه‏ها اندازه‏گیری شد. نتایج: بیشترین وزن خشک 48 و 96 ساعت پس از اعمال 10 میلی‏گرم کیتوزان در محیط کشت مشاهده شد. تجمع سیلی‏مارین نیز به‏طور قابل ملاحظه‏ای از 37/0 در نمونه‏های شاهد، به  mg g-1 DW19/1 در نمونه‏های تیمار شده رسید، که 4/1 برابر بیشتر از نمونه‏های کنترل بود. گایاکول پراکسیداز به‏وسیله کیتوزان فعال شد و 120 ساعت پس از تیمار به بیشترین میزان خود رسید ∆OD g-1 FW min-1) 86/21(، که 2/2 برابر بیشتر از کنترل  بود. روند افزایشی فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز تا 96 ساعت پس از اعمال ادامه پیدا کرد (∆ODg-1 FW 14/5). نتیجه گیری: نتایج نشان داد که این الیسیتور، باعث افزایش تجمع سیلی‏مارین می‏شود. افزایش فعالیت آنزیم‏ها در نتیجه افزایش مهار رادیکال‏های آزاد اتفاق می‏افتد و مبین واکنش به تنش‏های اعمال شده توسط کیتوزان است.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گیاه خار مریم (Silybum marianum) بومی مناطق مدیترانه‏ای است، اما به‏صورت وحشی در اکثر مناطق جهان رویش دارد (1). این گیاه در بسیاری از مناطق شمالی و غربی ایران مشاهده می‏شود (2). میوه‏های رسیده گیاه، بخش دارویی آن را تشکیل می‏دهد. گیاه خار مریم چندین قرن به‏عنوان گیاه دارویی در درمان بیماری‏های کبدی مورد استفاده قرار گرفته است. دانه‏های خشک حاوی 1 الی 4 درصد سیلی‏مارین هستند. سیلی‏مارین ترکیبی از سه فلاونولیگنان می‏باشد، که شامل سیلیبین، سیلی دیانین و سیلی کریستین  و تاکسی فولین به‏عنوان پیش ساز می‏باشد (3).

گیاهان دارویی مهم‏ترین منبع تولید دارو هستند. زیست فناوری، ابزار مهمی برای گزینش، ازدیاد و حفظ ژنوتیپ‏های گیاهان دارویی محسوب می‏شوند. تولید متابولیت‏های ثانویه در شرایط آزمایشگاهی خصوصا کشت سوسپانسیون سلولی در گیاهان دارویی زیادی گزارش شده است و بیورآکتورها نقش کلیدی در تولید صنعتی متابولیت‏های ثانویه در بیوتکنولوژی گیاهان دارویی ایفا می‏کنند. همچنین مهندسی متابولیت یک روش بسیار قدرتمند در افزایش تولید متابولیت‏های ثانویه می‏باشد (4). کشت ریشه‏های مویین بر پایه آلوده سازی گیاه با Agrobacterium rhizogenes در دو دهه اخیر به‏عنوان روشی مناسب برای تولید متابولیت‏های ثانویه بسیار رایج شده است. متابولیت‏های ثانویه تولید شده توسط ریشه‏های مویین که نتیجه آلوده کردن گیاه توسط A. rhizogenes به‏دست می‏آیند، مشابه متابولیت‏های تولید شده در گیاه مادری می‏باشند و مقادیر آن‏ها برابر و یا بیشتر از گیاه مادری است. در طول مراحل آلوده کردن گیاه با A. rhizogenes بخشی از DNA تحت عنوان T-DNA که در پلاسمید القا کننده ریشه یا پلاسمید  Riواقع شده است، به سلول‏های گیاهی منتقل می‏کند و در نتیجه ژن‏های در بردارنده این بخش مشابه ژن‏های اندوژن سلول‏های گیاهی تکثیر پیدا می‏کنند (5).

بزرگ‏ترین مزیت ریشه‏های مویین، توان بالای تولید متابولیت‏های ثانویه در مقایسه با گیاهان مادری است. بسیاری از متابولیت‏های ثانویه با ارزش که در شرایط طبیعی در ریشه سنتز می‏شوند، اغلب در ارتباط با تمایز ریشه هستند و حتی در مواردی متابولیت‏های ثانویه‏ای که فقط در قسمت‏های هوایی یک گیاه تجمع می‏یابند، قادر به سنتز و تجمع در کشت ریشه‏های مویین نیز می‏باشند (6).

الیسیتورها منابع مختلفی از عوامل زیستی یا شیمیایی هستند که می‏توانند سبب تغییرات فیزیولوژیکی در موجود زنده شوند. محرک‏ها در سلول گیاهی سبب ارسال پیام‏های شیمیایی می‏شوند که در نتیجه آن پاسخ‏های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی را در پی خواهد داشت. محرک‏ها به ترکیبات و دیواره سلولی حمله می‏کنند و در پی پاسخ به پیام محرک، سیستم دفاعی گیاه فعال می‏شود و برخی از عوامل نظیر کانال‏های یونی کلسیم، پروتئین‏های متصل شونده به GTP، اسیدی شدن سیتوپلاسم، قلیایی شدن خارج سلول، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، سالیسیلیک اسید، اکسید نیتریک، تولید جاسمونیک اسید، تولید اتیلن و بیان ژن‏های دفاعی فعال می‏شوند که نتیجه آن تجمع متابولیت‏های ثانویه می‏باشد (7، 8، 9 و 10).

از جمله الیسیتورهای کاربردی می‏توان کربوهیدرات‏های قارچی، عصاره مخمر، متیل جاسمونات و کیتوزان را نام برد. متیل جاسمونات موثرترین الیسیتور برای تولید تاکسول (Taxol) درTaxus chinensis  و جینسنوئید (Ginsenoside) در Panax ginseng می‏باشد (11).

کیتوزان (Chitosan) مشتق اصلی کیتین و فرم داستیله شده آن می‏باشد که در نتیجه داستیلاسیون آلکالین کیتین حاصل می‏شود . همچنین کیتوزان به‏طور طبیعی در برخی از قارچ‏ها تولید می‏گردد که میزان آن بسیار کمتر از میزان کیتین می‏باشد (12 و 13). Vasconsuelo و همکاران (14) نشان دادند، استفاده از کیتوزان به‏عنوان محرک، باعث افزایش تولید آنتراکوئینون در گیاه Rubia tinctorum می‏شود.         Abdul rahman و همکاران (15)، گزارش کردند که استفاده از محرک کیتوزان سبب افزایش تجمع لیمونن و لینالول در کشت سلول گیاه Citrus Grandis می‏شود. بر اساس تحقیقات انجام شده توسطPutalun  و همکاران (16)، نشان داده شد که کیتوزان باعث افزایش تولید آرتمیزینین در گیاه        Artemisia annua L. می‏شود. Falcon-Rodriguez و همکاران (17)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش فعالیت سه آنزیم دفاعی پراکسیداز، فنیل آلانین آمونیولیاز و گلوکاناز، در برگ‏ها و ریشه گیاه Nicotiana tabacum می‏شود. اسماعیل زاده و همکاران (18) افزایش تولید لیگنان و فنیل پروپانویید را در کشت سوسپانسیون سلولیLinum album تیمار شده با کیتوزان و کیتین  گزارش نمودند.

یکی از مسیرهای پاسخ دفاعی سلول گیاهی در برابر پاتوژن یا

محرک، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال است. در برخی از کشت‏های سلول گیاهی نشان داده شده است که، ROS موجب تجمع متابولیت‏های ثانویه شده و در برخی دیگر تاثیری ندارد. در برخی از گیاهان پس از تیمار، الیسیتور با میانجی‏گری O2-و H2O2 سبب تجمع متابولیت‏های ثانویه می‏شود. ROS شامل یون سوپراکسید (O2-) و پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدروکسیل است و به‏وسیله اکسید کردن رنگدانه‏های فتوسنتزی، چربی‏های غشایی، پروتئین‏ها و اسید های نوکلئیک باعث خسارت‏های اکسید کننده می‏شود. بنابراین گیاه نیاز به یک سیستم دفاعی ضد اکسید کننده دارد (9، 10، 19 و20).

نتایج پژوهش‏های قبلی نشان داده است که کشت ریشه‏های مویین گیاه خار مریم قادر به تولید فلاونولیگنان‏ها یا سیلی‏مارین می‏باشد. همچنین مشخص شد که به‏کارگیری الیسیتورهای مختلف موجب افزایش تولید سیلی‏مارین می‏شود (21 و 22).  تعیین بهترین الیسیتور به‏عنوان محرک افزایش تولید متابولیت‏ها در شرایط In vitro و همچنین ساز و کار اثر آن الیسیتور، دارای اهمیت فراوانی می‏باشد. لذا این پژوهش به‏منظور بررسی اثرات غلظت‏های مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم) به‏عنوان الیسیتور، بر رشد و تولید سیلی‏مارین در ریشه‏های مویین گیاه خار مریم و نیز فعالیت آنزیم‏های پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز انجام شد.

 

مواد و روش‏ها

مواد گیاهی مورد استفاده: ریشه‏های مویین گیاه خارمریم از تحقیق در حال انجام در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران تهیه شد (21).

کشت ریشه‏های مویین: به‏منظور کشت ریشه‏های مویین از ریشه‏های 28 روزه، شش قطعه یک سانتی‏متری تهیه شد و در ظروف ارلن مایر 100 میلی‏لیتری حاوی 50 میلی‏لیتر محیط موراشیج و اسکوگ (MS) کشت شد (5 و23).

تهیه محلول مادرکیتوزان: گام اول در آماده سازی کیتوزان، هیدرولیز این ماده زیستی می‏باشد. برای همین منظور، مقدار 2 گرم کیتوزان با وزن مولکولی کم، به‏صورت جداگانه، در داخل هاون ریخته شد و توسط ازت مایع خرد شد. سپس کیتوزان به‏وسیله 80 میلیلیتر اسید کلریدریک 37 درصد در بن ماری و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به‏خوبی حل شد. کیتوزان پس از هیدرولیز، به‏وسیله یک قیف و پشم شیشه صنعتی، در ارلن حاوی 800 میلی‏لیتر آب مقطر سرد (4 درجه سانتی‏گراد)، فیلتر شد. در تمام مدت فیلتراسیون، ارلن باید در ظرف حاوی یخ و روی هم زن مغناطیسی قرار گیرد. محلول به‏دست آمده به‏مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. بعد از 24 ساعت، محلول را با کاغذ صافی و پمپ خلا فیلتر شد. لایه‏های نقش بسته روی فیلتر، کلوئیدهای کیتوزان می‏باشند (13). این رسوب‏ها توسط تیغ اسکالپل جمع آوری شده و در درون 500 میلی‏لیتر محیط MS فاقد هورمون ریخته شده و سپس اتوکلاو می‏شود. غلظت‏های 0،  5، 10، 20 و 30 میلی‏گرم کیتوزان به ارلن‏های حاوی 50 میلی‏لیتر محیط کشت دارای ریشه‏های مویین 30 روزه اضافه شد. به‏منظور تعیین بهترین غلظت از کیتوزان نمونه برداری 96 ساعت پس از تیمار انجام شد. به جهت تعیین اثر زمان کشت آزمایش با به‏کارگیری بهترین غلظت از کیتوزان تکرار شد و نمونه برداری در زمان‏های 12، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از اعمال تیمار انجام شد.

استخراج و مطالعه کمی و کیفی فلاونولیگنان‏ها از ریشه‏های مویین گیاه خارمریم: ریشه‏های برداشت شده در زمان‏های مورد نظر به‏وسیله کاغذ خشک کن، خشک شدند، در فویل قرار داده شده و در دستگاه فریز درایر در دمای 60- درجه سانتی‏گراد به‏مدت 48 ساعت خشک شدند. پس از خشک شدن کامل نمونه‏ها وزن خشک آن‏ها اندازه گیری و یادداشت شد (24). چربی زدایی نمونه‏ها توسط پترولیوم بنزن در دمای 40 درجه سانتی‏گراد انجام شد، نمونه‏ها در دستگاه فریز درایر خشک شده و جهت عصاره گیری از آن‏ها 10 میلی‏لیتر متانول استفاده گردید و نمونه‏ها به‏مدت 8 ساعت در دمای 40 درجه سانتی‏گراد در داخل بن ماری قرار گرفتند. سپس محلول‏های متانولی جهت تغلیظ به دستگاه فریز درایر با دمای 60 درجه سانتی‏گراد، انتقال داده شدند. پودر زرد رنگ حاصله در نتیجه تغلیظ در متانول حل شد و به حجم 1 میلی‏لیتر رسانده شد و پس از رساندن به حجم مورد نظر نمونه‏ها فیلتر شده و جهت بررسی دقیق کمی ترکیبات، به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تزریق شدند (25). اندازه‏گیری سیلی‏مارین توسط دستگاه HPLC (Knauer) شامل پمپ 1001 K، دتکتور UV (280 نانومتر)، ستون C18، حلال‏های آب و استونیتریل (50:50)، نرم افزار ChromGate انجام شد. حداقل 20 میکرولیتر از نمونه‏های استخراج شده که به حجم 1 میلی‏لیتر رسانده شده بودند به دستگاه تزریق شدند و با جریان یک میلی‏لیتر در دقیقه از ستون Nucleosil C18 به قطر ذرات 5 میکرومتر و ابعاد 6/4 Ï150 میل‏متر عبور کرده و در طول موج 280 نانومتر اندازه‏گیری و شناسایی شدند. کل زمان هر تجزیه 10 دقیقه بود. زمان خروج منحنی‏های مربوط به ترکیبات فلاونولیگنان‏ها با سیلی‏مارین استاندارد (سیگما) مقایسه شده و مقادیر هر یک بر اساس منحنی استاندارد سیلی‏بین، محاسبه شد (26 و 27).

سنجش میزان H2O2 در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم: میزان 05/0 گرم بافت گیاهی خشک شده توسط خشک کن در دمای 60- درجه سانتی‏‏گراد و در خلا وزن شد. نمونه‏ها در ویال 2 میلی‏لیتری ریخته و پودر شد. دو میلی‏لیتر بافر فسفات 1/0 مولار (5/6= pH) به ویال‏های حاوی نمونه پودر شده، اضافه شد و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد همگن شد. ویال‏ها در دمای درجه سانتی‏گراد به‏مدت 25 دقیقه با دور g 6000 سانتریفیوژ شدند. 1 میلی‏لیتر از فاز رویی برداشته شده و به آن 330 میکرولیتر محلول 20 درصد حجمی اسید سولفوریک حاوی 1/0 درصد تتراکلرید تیتانیوم افزوده شد. محلول به‏دست آمده به‏مدت 15 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‏گراد و با دور g 6000 سانتریفیوژ شد. فاز رویی جدا شد. میزان جذب در طول موج 410 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری قرائت شد. با استفاده از فرمول A=εbc غلظت H2O2 هر نمونه، محاسبه و بر حسب وزن خشک گزارش شد (9 و 10).

A = جذب خوانده شده توسط دستگاه ، ε (ضریب جذب) = 28/0  µmol-1cm-1، c , H2O2 =غلظت،b (طول کووت) = 1 cm     

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD): سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز به‏روش چانس و مهلی (28) اندازه گیری شد. به مخلوط واکنشی (بافر فسفات پتاسیم 100 میلی­مولار (7= pH) به‏میزان 250 میکرولیتر، گائیکول (Guaiacol) 10 میلی­مولار محلول در آب دوبار تقطیر به‏میزان 250 میکرولیتر (56 میکرولیتر گوئیکول به‏وسیله آب دوبار تقطیر به حجم50 میلی­لیتر رسانده شد،  H2O270 میلی‏مولار محلول در فسفات پتاسیم 100 میلی­مولار (7 = pH) به‏میزان 34 میکرولیتر (60 میکرولیتر به‏وسیله بافر 100 میلی‏مولار فسفات پتاسیم به حجم 10 میلی‏لیتر رسانده شد، آب دوبار تقطیر استریل شده به‏میزان 466 میکرولیتر) 20 میکرولیتر از عصاره آنزیمی در یک کووت شیشه­ای 1 میلی­لیتری ریخته شده و با قرار گرفتن در دستگاه اسپکتروفتومتر، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در طـول موج

470 نانومتر و در مدت زمان واکنش 180 ثانیه اندازه­گیری شد.

سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز(APX): فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به‏روش ناکانو و اسدا (1987) اندازه‏گیری شد. فعالیت این آنزیم بر اساس میزان تجزیه شدن H2O2، در طول موج 290 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی cm-1 mM-1 8/2 تعیین شد (29). 850 میکرولیتر از آسکوربات 5/0 میلی­مولار به‏همراه 150 میکرولیتر از H2O2، 2 میلی­مولار را درون کووت ریخته و از آن به‏عنوان بلنک دستگاه در طول موج 290 نانومتر استفاده می­شود. 20 میکرولیتر از عصاره آنزیمی به مخلوط واکنشی فوق اضافه و فعالیت آنزیم APX در مدت 180 ثانیه قرائت شده و منحنی فعالیت آنزیم در مدت زمان 180 ثانیه و بر حسب Abs/min ترسیم شد.

آنالیز آماری:  داده‏ها با حداقل 3 تکرار انجام شد. برای مقایسه میانگین‏ها از تستDuncan  استفاده شد. آنالیز آماری توسط نرم افزار SAS نسخه 9.1 انجام شد.

 

نتایج

بررسی اثر غلظت‏های مختلف کیتوزان بر میزان بیوماس ریشه و سیلی‏مارین

شکل 1، تغییرات وزن خشک و تجمع سیلی‏مارین را 96 ساعت پس از اعمال تیمار با غلظت‏های مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم)، نشان می‏دهد. همان‏طور که نشان داده شد، در مقایسه با کشت تیمار نشده (22/0 گرم)، بیشترین میزان وزن خشک، 96 ساعت پس از تیمار (41/0 گرم) در کشت‏های تیمار شده با 10 میلی‏گرم کیتوزان، ثبت شد که 15/3 برابر شاهد بود. درحالی‏که مقدار وزن خشک در تیمارهای با غلظت‏های 5، 20 و 30 میلی‏گرم در لیتر به‏ترتیب، 38/0، 39/0 و 25/0 گرم، گزارش شد. افزودن کیتوزان با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر، 96 ساعت پس از تیمار، منجر به افزایش قابل ملاحظه‏ای در میزان انباشتگی سیلی‏مارین از 37/0 در نمونه‏های شاهد به 19/1 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک در ریشه‏های مویین شد. به‏طوری‏که اختلاف معنی‏داری در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (شکل 1 و جدول 1). این در حالی است که میزان سیلی‏مارین در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 5 ، 20 و 30 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان، 96 ساعت پس از تیمار، به‏ترتیب 92/0، 56/0 و 66/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک، مشاهده شد.

تغییرات فلاونولیگنان‏ها در ریشه‏های تیمار شده با غلظت‏های مختلف کیتوزان

مطالعه بیوسنتز فلاونولیگنان‏ها در ریشه‏های تیمار شده با غلظت‏های مختلف کیتوزان، میزان سیلیبین، ایزوسیلیبین، سیلی کریستین، سیلی دیانین و تاکسی فولین در نمونه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان، 96 ساعت پس از تیمار به ترتیب 1/0، 092/0، 48/0، 34/0 و 41/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک، مشاهده شدند، که به‏ترتیب 55/5، 6/4، 11/،3 61/2، و 31/9 برابر شاهد بودند (جدول 2). هرچند، اثر تحریکی 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان پس از 96 ساعت به تاکسی فولین، سیلیبین و ایزوسیلیبین نسبت داده می‏شوند که به‏ترتیب 3/9، 5/5 و 6/4 برابر بیشتر از کنترل افزایش نمودند و اختلاف معنی‏داری در سطح احتمال 1 درصد نشان دادند (جدول 1).

 

 

شکل 1: تغییرات وزن خشک و میزان سیلی‏مارین در ریشه‏های تیمار شده با غلظت‏های مختلف کیتوزان (0، 5، 10، 20 و 30 میلی‏گرم در لیتر) 96 ساعت پس از اعمال تیمار (SE ±)

 

جدول 1: خلاصه جدول تجزیه واریانس غلظت‏های مختلف تیمار کیتوزان با وزن مولکولی کم (0، 5، 10، 20 و 30 میلی‏گرم بر لیتر) بر برخی صفات در کشت ریشه‏های مویین خارمریم.

صفات

درجه آزادی (df)

مجموع مربعات (SS)

میانگین مربعات

(MS)

F

ضریب تغییرات (CV)

وزن خشک

29

3172/0

0109/0

ns26/5

21/13

تاکسی فولین

29

6999/0

0241/0

*64/1

67/165

سیلی کریستین

29

6652/0

0229/0

**03/12

46/21

سیلی دیانین

29

3845/0

0132/0

**97/14

55/19

سیلی بین

29

0304/0

0010/0

**02/11

64/30

ایزوسیلی بین

29

0241/0

0008/0

**23/9

58/41

سیلی‏مارین

29

1756/4

1439/0

**23/64

22/10

پراکسید هیدروژن

29

29/120

1481/4

**19/916

44/1

آنزیم پراکسیداز

29

06/719

7954/24

**63/5775

5642/0

آنزیم آسکوربات پراکسیداز

29

1716/71

4541/2

**04/542

7525/1

ns : عدم وجود اختلاف معنیدار، *: معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، **: معنی دار در سطح احتمال 1درصد.

 

تاثیر کیتوزان (10 میلی‏گرم در لیتر) بر وزن خشک و بیوسنتز سیلی‏مارین در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم در زمان‏های مختلف

اثر زمان‏های مختلف استفاده از کیتوزان بر رشد ریشه و محتوای سیلی‏مارین در شکل 2 نشان داده شده است. وزن خشک ریشه‏های مویین تیمار شده با 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان پس از 12 ساعت (33/0 گرم) نزدیک به کنترل (39/0 گرم)، کمی کاهش نشان داد. میزان وزن خشک پس از گذشت 24 ساعت تغییر چندانی نکرد (33/0 گرم). وزن خشک با افزایش تا 38/0 گرم پس از 48 ساعت دنبال شد، که بیشتر از وزن خشک کنترل (3/0 گرم) در همان زمان بود. وزن خشک پس از گذشت 72 ساعت تفاوت معنی‏داری نداشت (35/. گرم)، اما پس از گذشت 96 ساعت مجددا افزایش پیدا کرد و به 41/0 گرم رسید (شکل A2).

تغییرات بیوسنتز سیلی‏مارین در ریشه‏های شاهد و تیمار شده در زمان‏های مختلف در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم،  در شکل B2 نشان داده شده است. تولید سیلی‏مارین پس از 12، 24 و 48 ساعت به‏ترتیب 27/0 ، 33/0 و 24/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک بود. میزان سیلی‏مارین در ریشه‏های مویین، 72 ساعت پس از تیمار با 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان، 51/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک گزارش شد که 19/1 برابر میزان نمونه‏های شاهد در همان زمان بود. میزان تجمع سیلی‏مارین پس از گذشت 96 ساعت به 19/1 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک گزارش شد که 1/3 برابر نمونه شاهد در همان زمان بود (37/0 میلی‏گرم بر گرم ون خشک) و 120 ساعت پس از تیمار کاهش پیدا کرد (8/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک) و 9/1 برابر نمونه‏های شاهد گزارش شد (4/0 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک).

 

 

 

B

شکل 2: تغییرات وزن خشک (A) و تولید سیلی‏مارین (B) در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم و شاهد در زمان‏های مختلف (12، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت) در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم (SE ±)

 


تغییرات فلاونولیگنان‏ها در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم شاهد و تیمار شده با کیتوزان در زمان‏های مختلف

بیشترین میزان تاکسی فولین، سیلی کریستین، سیلی دیانین، سیلی بین و ایزوسیلیبین در محیط تیمار شده با 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان و 96 ساعت پس از تیمار حاصل آمد که به‏ترتیب 95/3، 58/3، 02/3، 11/7 و 13/7 برابر بیشتر از ریشه‏های تیمار نشده بودند.

 

 

جدول 2: تغییرات فلاونولیگنان‏ها در ریشه‏های مویین گیاه خارمریم تیمار شده با غلظت‏های مختلف کیتوزان با وزن مولکولی کم (0، 5، 10، 20 و 30 میلی‏گرم در لیتر) 96 ساعت پس از اعمال تیمار (SE ±Mean )

غلظت کیتوزان

(mg/ 50ml culture)

فلاونولیگنان(  mg g-1DW)

تاکسی فولین

سیلی کریستین

سیلی دیانین

سیلی بین

ایزوسیلی بین

 

0

002/0±044/0

006/0±154/0

01/0±13/0

004/0±018/0

007/0±020/0

 

5

003/0±15/0

09/0±27/0

01/0±30/0

004/0±053/0

002/0±032/0

10

4/0±41/0

05/0±48/0

02/0±34/0

007/0±1/0

004/0±092/0

20

01/0±077/0

06/0±27/0

03/0±13/0

006/0±031/0

006/0±021/0

30

008/0±072/0

05/0±26/0

05/0±18/0

007/0±041/0

005/0±027/0

 

 

 اثر کیتوزان (10 میلی‏گرم در لیتر) بر تغییرات فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت و میزان پراکسید هیدروژن

میزان تخریب اکسیداتیو القا شونده توسط کیتوزان به‏وسیله اندازه‏گیری فعالیت گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پرکسیداز و پراکسید هیدروژن، بررسی شد. گایاکول پراکسیداز به‏وسیله کیتوزان فعال شد و 120 ساعت پس از تیمار به بیشترین میزان خود رسید ∆OD g-1 FW min-1) 86/21( که 2/2 برابر بیشتر از کنترل (∆OD g-1 FW min-1 86/9) بود (شکل 3).

روند افزایشی آنزیم آسکوربات پراکسیداز در شکل 4 نشان داده شده است. فعالیت آنزیم پس از گذشت 12 ساعت به ∆OD g-1 FW 52/3 رسید و این روند افزایشی تا 96 ساعت پس از اعمال ادامه پیدا کرد (∆ODg-1 FW 14/5) و 120 ساعت پس از اعمال تیمار مجدداً کاهش پیدا کرد (∆ODg-1 FW 97 /3).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز 96 ساعت پس از افزودن 10 میلی‏گرم بر لیتر کیتوزان، اندازه گیری شد، تا تعیین شود چگونه کیتوزان انباشتگی سیلی‏مارین را در کشت ریشه‏های مویین، تحریک می‏نماید. بیشینه ∆OD g-1 FW min-1 54/7، 96 ساعت پس از تحریک برای فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ثبت شد که 86/2 برابر آن در ریشه‏های تیمار نشده بود    (∆OD g_1 FW min-1 63/2) (شکل 4).

شکل 5 تغییرات محتوای پراکسیدهیدروژن را در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان پس از تیمارهای زمانی مختلف را نشان می‏دهد. میزان پراکسید هیدروژن 12 ساعت پس از اعمال تیمار µmol g-1 DW 8/9 گزارش شد. 24 و 48 ساعت پس از اعمال تیمار میزان پراکسید هیدروژن کاهش پیدا کرده و پس از آن مجددا افزایش پیدا کرد و 96 ساعت پس از اعمال تیمار به µmol g-1 DW 81/10 رسید و پس از آن مجددا کاهش پیدا کرد (µmol g-1 DW 12/9) (شکل 5).

 

 

 

شکل 3: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم در ریشه‏های شاهد و تیمار شده در زمان‏های مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)

 

 

شکل4: تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان (وزن مولکولی کم) در ریشه‏های شاهد و تیمار شده در زمان‏های مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)

 

 

شکل 5: تغییرات میزان پراکسید هیدروژن در ریشه‏های تیمار شده با غلظت 10 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان (وزن مولکولی کم) در ریشه‏های شاهد و تیمار شده در زمان‏های مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)

 

 

بحث

کیتوزان فرم داستیله کیتین است که از دیواره سلولی قارچ، اسکلت خارجی سخت پوستان، کوتیکول حشرات و برخی جلبک‏ها به‏دست می‏آید. این ترکیب زیستی قابل تجزیه بوده و کاملا غیر سمی است. گزارش شده است که کیتوزان و مشتقات آن توانایی القای پاسخ‏های دفاعی در گیاهان را دارد. همچنین Uthairatanakij و همکاران (30)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش بازدهی محصول می‏شود. غلظت کیتوزان و درجه داستیلاسیون کیتوزان اثرات متغیری روی گیاه خواهد داشت.

در این تحقیق کیتوزان با وزن مولکولی کم باعث افزایش وزن خشک ریشه‏های مویین خار مریم شد.بررسی اثر کیتوزان با وزن مولکولی کم بر تولید سیلی‏مارین نشان داد که این ماده زیستی سبب افزایش تولید این متابولیت ثانویه در گیاه خار مریم شد، به‏طوری‏که میزان تجمع سیلی‏مارین پس از گذشت 96 ساعت به 19/1 میلی‏گرم بر گرم وزن خشک رسید که 2/3 برابر نمونه شاهد بود.

Vasconsuelo و همکاران (14) نشان دادند که ساز و کارهای سیگنالینک اعمال شده توسط کیتوزان، سبب افزایش آنتراکوئینون ها در گیاه Rubia tinctorum L. شد. این محققان نشان دادند که اثر این الیسیتور ممکن است از طریق فعال سازی آبشار PLC/PKC باشد. گفته می‏شود علاوه بر MAP کینازها یا پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژن‏ها، PKC نیز در فعالیت ناشی از کیتوزان در سلول دخیل است.

همچنین Putalun و همکاران (16)، نشان دادند که، کیتوزان باعث تولید آرتمیزین در ریشه‏های مویین گیاه          Artemisia annua. می‏شود، بهطوریکه میزان تولید این متابولیت ثانویه، پس از گذشت 6 روز و 150 میلی‏گرم در لیتر کیتوزان، 6 برابر افزایش پیدا کرد. همچنین در این تحقیق نشان داده شد که کیتوزان باعث افزایش رشد ریشه‏های مویین تیمار شده توسط کیتوزان می‏شود که با یافته‏های ما کاملا مطابقت دارد.

بررسی روند تغییرات H2O2 در ریشه‏های تیمار شده با کیتوزان با وزن مولکولی کم افزایش 96 ساعت پس از اعمال تیمار نشان داد. با تجمع افزایش H2O2، میزان فعالیت آنزیم‏های ضد اکسنده افزایش یافت به‏طوری‏که بیشترین فعالیت آنزیم POD، 96 ساعت پس از اعمال تیمار و فعالیت آنزیم APX نیز 96 ساعت پس از اعمال تیمار به بالاترین مقدار رسید که مشابه با نتایج Flcon-Rodriguez و همکاران (17) در مطالعه روی گیاه Nicotiana tabacum، تیمار شده با کیتوزان بود. همچنین Flocco  و همکاران (31)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه‏های مویین گیاه     Armoracia lapathifolia می‏شود.

درک مسیرهای پیام رسانی یکی از قدم‏های لازم در جهت توجیه اثرات الیسیتورها می‏باشد. الیسیتورها ابتدا توسط گیرنده‏های گیاهی فعال می‏شوند و سپس خود سبب فعال‏سازی فاکتورهای مربوطه می‏شوند. مانند کانال‏های یونی، پروتئین‏های متصل شونده به GTP و پروتئین کینازها. فعال شدن فاکتورهای مربوطه باعث فرستادن پیام محرک به‏داخل سلول و به‏راه افتادن واکنش های فرودست می‏شود. مانند فسفوریلاسیون و دفسفوریلاسیون برگشت پذیر پروتئین‏های غشای سلولی و پروتئین‏های سیتوزولی، افزایش کلسیم درون سلولی، دپلاریزه شدن غشای سلولی، خروج یون‏های پتاسیم و کلر و ورود یون‏های هیدروژن، قلیایی شدن محیط خارج سلول و اسیدی شدن سیتوپلاسم، فعال شدن پروتئین های MAPکیناز، NADPH اکسیداز و تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS)، بیان اولیه ژن‏های دفاعی، تولید اتیلن و جاسمونات، بیان نهایی ژن‏های دفاعی و در پایان تولید متابولیت‏های ثانویه. مسیر پیام رسانی محرک‏ها، شبکه‏ای پیچیده با واکنش‏های متوالی جهت به‏راه اندازی سیستم دفاعی موثر و کارآمد می‏باشد.

Sanchez- Sampedro  و همکاران (32)، با مطالعه روی کشت سلولی و تولید سیلی‏مارین دریافتند که حذف یون کلسیم از محیط کشت می‏تواند به افزایش تولید سیلی‏مارین در سوسپانسیون سلولی کمک کند.

 

نتیجه گیری

نتایج به‏دست آمده مبین این مسئله است که استفاده از کیتوزان با وزن مولکولی کم باعث افزایش تجمع و تولید سیلی‏مارین می‏شود که از نقطه نظر صنعتی قابل توجه است. نتایج نشان داد که در حضور کیتوزان با وزن مولکولی کم میزان فعالیت آنزیم‏های دفاعی افزایش یافت. با توجه به اینکه شناسایی حد واسط‏های بین الیسیتور و تولید متابولیت‏های ثانویه و وقایع درون سلولی در این مرحله  از تحریک و کاربرد نتایج در مطالعات مهندسی متابولیت به‏منظور افزایش تولید متابولیت‏های ثانویه با ارزش گیاهان دارویی بسیار موثر می‏باشد، توصیه می‏شود با مطالعات دقیق تر عواملی حاضر در مسیر سیگنالی موثر در افزایش بیوسنتز این متابولیت‏ها شناسایی شوند.

 

تشکر و قدردانی

بدین‌وسیله از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران که حمایت مالی این طرح پژوهشی (شماره 88024- 05- 05- 12) را به‏عهده داشت، قدردانی می‌شود.

1. Shokrpour M, Mohammadi SA, Moghaddam M, Ziai SA, et al. Variation in flavonolignan concentration of milk thistle (Silybum marianum) fruits grown in Iran. J herbs Spices Med Plants. 2007; 13(4): 55-69.

2. Radjabian T, Rezazadeh Sh, Fallah huseini H. Analyziz of Silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from Iran by HPLC. Iranian J Sci Technol. 2008; 32: 141-146.

3. Wynn SG, DVM. Silybum marianum milk thistle. Altern Med Rev. 1999; 4(4): 272-274.

4. Tripathi L, Nath Tripath J. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop J Pharm Res. 2003; 2(2): 243-253.

5. Karuppusamy S. A review on trends in production of secondry metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell culture, J Med Plants Res. 2009; 3(13): 1222-1239.

6. Khalili M, HasanlooT, Safdari Y. Hydrogen peroxide acts as a secondary messenger for production of silymarin in Ag+ elicited Silybum marianum hairy roots cultures. J Med Plants By-products. 2014;3(1): 35- 40.

7. Blume B, Nqrnberger T, Nass N, Scheel D. Receptor-mediated increases in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defence in parsley. Plant cell. 2000; 12(8): 1425-1440.

8. Ebel J, Mithoefer A. Early events in the elicitation of plant defense. Planta. 1998; 206: 335-348.

9. Zaho J, Sakai K. Multiple signaling pathways mediate fungal elicito-induced β-thujaplicin biosynthesis in Cupressus iusitanica cell culture. J Exp Bot 2003; 55(383): 647-656.

10. Zaho J, Sakai K. Peroxidase are involved in the biosynthesis and biodegradation of thujaplicin in fungal elicitor-treated Cupressus lusitanica suspension cultures. New Phytol. 2003; 159(3): 719-731.

11. Esmaeilzadeh bahabadi S, Sharifi M. Increasing the Production of Plant Secondary Metabolites, Using Biotic Elicitors. J Cell  Tissue . 2013; 4(2): 119-128.

12. Baker LG, Specht CA, Donlin MJ, Lodge JK. Chitosan the Deacetylated Form of chitin is Necessary For cell wall Integrity in Cryptococcus neotormans. Eukaryotic Cell. 2007; 6(5): 855-867.

13. Dinesh K, Singh Alok R. Ray Biomedical Aplications of Chitin, and their derivatives. Journal of Macromolecular Science, Part C: Polym Rev. 2000; 40(11): 69–83.

14. Vasconsuelo A, Giulietti AM, Boland R. Signal transduction events mediating chitosan stimulation of anthraquinone synthesis in Rubia tinctorum. Plant Sci. 2004; 53: 405-413.

15. Abdul Rahman NN, Zakaria Z, Abdul Kadir MO. Influence of elicitor availability on Limonene and Linalool accumulation from Citrus Grandis cell cultures, Malaysian J Pharm Sci. 2003; 1: 39-49.

16. Putalun W, Luealon W, De-Eknamkul W, Tanaka H, et al. Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of Artemisia annua L., Biotechnol Let. 2007; 29: 1143-1146.

17. Falcon- Rodriguez AB, Cabrera JC, Ortega E, Martinez-Tellez MA. Concentration and physicochemical properties of chitosan derivatives determine the induction of defence responses in roots and leaves of Tobacco (Nicotiana tabacum) plants. American J Agricul Biol Sci. 2009; 4(3): 192-200.

18. Esmaeilzadeh S, Sharifi M, Safaei N, Behmanesh M. Enhancement of lignan and phenylpropanoid compounds production by chitosan and chitin in Linum album cell culture. Iranian J Plant Biol. 2012; 4 (11):13-26.

 

19. Rudrappa T, Neelwarne B, Lakshmanan V, Aswanthanarayana SR, et al. Elicitation of peroxidase activity in genetically transformed root cultures of Beta vulgaris L., Electronic J Biotechnol. 2006; 9: 5-10.

20. Davies KJA. Protein damage and degradation by oxygen radicals, I. General aspects., J Biol Chem. 1987; 262: 9895-9901.

21. Hasanloo T, Sepehrifar R, Rahnama H, Shams MR. Evaluation of the yeast-extract signaling pathway leading to silymarin biosynthesis in Milk thistle hairy root culture. World J Microb Biot. 2009; 25: 1901- 1909.

22. Khalili M, Hasanloo T, Kazemi Tabar SK, Rahnama H. Influence of exogenous salicylic acid on flavonolignans and lipoxygenase activity in the hairy root cultures of Silybum marianum. Cell Biol Int. 2009; 33: 988-994.

23. Murashige T, Skoog F. A revised medium for for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant. 1962; 15: 473-497.

24. Rahnama H, Hasanloo T, Shams MR, Sepehrifar R. Silymarin production by hairy root culture of Silybum marianum (L.) Gaertn. Iranian J Biotech. 2008; 6: 113-118.

25. Hasanloo T, Sepehri R. Evaluation of silymarin extraction from Silybum marianum (L.) Gaertn seeds by water Quat. J Plant Sci Resc. 2008; 2: 1-8.

26. Titel G, Wagner H. High-performance liquid chromatographic separation of silymarins and their determination in a raw extract of Silybum marianum. J chromatogr. 1997; 26: 499-501.

27. Hasanloo T, Khavari-Nejad RA, Majidi E, Ziai SA, et al. Determination of flavonolignan of dried fruits of Silybum marianum L. Gaertn collected from different areas of Iran by spectrophotometer, TLC and HPLC. J Med Plant. 2005; 85: 25-32.

28. Chance B, Maehly AC. Assay of catalases and peroxidases. In Methods in enzymology. Academy Press. 1995; 764–775.

29. Nakano Y, Asada K. Purification of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts; its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant and Cell Physiol. 1987; 28(1): 131.

30. Uthairatanakij A, Teixeira da Silva JA, Obsuwan K. Chitosan for improving orchid production and quality. Orchid Sci Biotechnol. 2007; 1: 1-3.

31. Flocco CG, Pitta-Alvarez S, Giulietti AM. Effect of chitosan and Acetic acid on the Peroxidase component of Hairy root cultures of Armoracia lapathifolia. Appl Biochem and Biotechnol. 2003; 110(3): 175-183.

32. Sanchez-Sampedro MA, Fernandez-Tarrago J, Corchete P. Enhanced silymarin accumulation is related to calcium deprivation in cell suspension cultures of Silybum marianum L. Gaertn, Plant Physiol. 2005; 162(10): 1177-1182.