بیان القایی ژن گزارشگرGFP در رده سلولی LMH با استفاده از ناقلین لنتی ویروسی القا پذیر

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، دپارتمان سلولهای بنیادی و پزشکی ترمیمی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

3 کارشناس ارشد ژنتیک، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

-

چکیده

هدف: با تلفیق سیستم االقایی تتراسیکلین (Tet-inducible system) و ناقلین لنتی ویروسی، القا بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلول‏های پرندگان مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‏ها: ژن EGFP تحت کنترل سیستم‏ Tet-ON قرار گرفت و بیان آن در سلول‌های کبدی جوجه رده LMH بررسی شد. ابتدا باکتری‏های مستعد با ناقل لنتی ویروسی القایی حامل EGFP به‏همراه یک ناقل دوم که فعال کننده Tet (Tet-transactivator) به‏نام rtTA-M2 را حمل می‏کرد ترانسفورم شده و ذخیره ماکسی پرپ خالصی از هریک از این‏دو DNA پلاسمیدی فراهم شدند. سپس با روش رسوب DNA-فسفات کلسیم سلول‏های LMH با ذخیره هردو پلاسمید ترانسفکت شد. در مرحله بعد، غلظت‏های سریالی از آنالوگ Tet یعنی داکسی سیکلین را به محیط کشت سلول اضافه نمودیم به‏‏طوری‏که با افزایش غلظت DOX، بیان EGFP بیشتر القا گردید. نتایج: افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش بیان را به دنبال داشت. در 24 ساعت اول بعد از ترانسفکشن بیان به‏ترتیب برای غلظت‏های 0 ، 01/0 ، 1/0 و 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر داکسی سایکلین 4/0، 2/6 ، 3/10و 16 درصد و در 24 ساعت دوم به‏ترتیب 4/6 ، 26 ، 3/28 و7/29بود.با این .جود، افزایش بیش از حد غلظت داکسی سایکلین باعث مرگ سلول‌ها گردید. نتیجه گیری:  تلفیق سیستم‏های القایی Tet با منشا باکتریایی و لنتی ویروس‏های نوترکیب مرتبط با انتقال ژن به سلول‏های انسانی می‏تواند باعث القا ژن در سلول‏های پرندگان شود. غلظت القا کننده بر میزان القا بیان ترانسژن تاثیر مستقیم می‏گذارد.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


                                          

 مقدمه

رده سلول­هایLMH در سال 1997 در پی تیمار سلول­ها با دی­اتیل نیتروزآمین تثبیت گردید  (1). این رده سلولی از سلول‏های سرطانی کبد جوجه نژاد لگهورن جدا شده‏اند.   LMH-2A رده دیگری از سلول­های کبدی جوجه می­باشند و دارای ژن گیرنده استروژن است که با تکنیک ترانسفکت در این رده سلولی تثبیت شده است. سلول­های کبدی جوجه مدل‏های بسیار خوبی برای مطالعه متابولیسم در کبد هم می­باشد. همچنین سلول­های اولیه کشت شده کبد جوجه از قابلیت سنتز  و ترشح پروتئین­های پلاسما برخوردارند (2).

برای تنظیم بیان یک ژن که عموما تحت کنترل یک پروموتر القا شونده یا مهار شونده قرار می­گیرد می­توان تاثیر میزان بیان آن ژن را بر روی عمل‏کرد سلول مطالعه کرد و یا میزان بیان آن را به مقدار دلخواه افزایش داده و اثر آن را بر روی سلول مطالعه کرد. همچنین با تلفیق سیستم­های القایی با پروموترهای اختصاصی می­توان زمان و مکان بیان یک ژن را کنترل کرد. سیستم‏های القائی Tet در سال 1992 توسعه پیدا کرد (3). این سیستم به‏طور گسترده برای تنظیم بیان یک ژن در لاین‏های مختلف سلولی و همین‏طور تعدادی از ارگان‏ها در شرایط آزمایشگاهی استفاده می‏شود (4-7). سیستم­های وابسته به Tet از جمله بهترین و پرکاربردترین سیستم­های بیان کنترلی ژن می‏باشند چرا که القا کننده­ها و یا مهار کننده­های سیستم که می‏تواند Doxycycline و یا Tetracyclin  باشد هیچ اثر سمی بر روی سلول­ها ندارد (8) .سیستم‏های وابسته به تتراسایکلین به دو نوع روشن (Tet-On) و خاموش (Tet-Off) تقسیم می­شوند (3 و 9). در این سیستم‏ها پروموتر به گونه­ای طراحی شده است که افزودن عامل ضد باکتریایی Doxycycline و یا Tetracyclin به محیط سلول­ها باعث القا و یا مهار بیان ژن هدف می­شد. در این سیستم­ها از پروتئین مهار کننده تتراسایکلین (TetR) در باکتری Ecoli  استفاده می‏شود که با پروتئین فعال‏سازی رونویسی VP16 هرپس ویروس  ترکیب شده و پروتئین تنظیمی  TetR/VP16 (tTA ) را ایجاد می­کند (10). علاوه بر tTA پروتئین­های تنظیمی دیگری مانندrtTA که نوع جهش یافته­ای از tTA بوده و همچنین rtTA-M2 و tTS را می‏توان نام برد (11) که پروتئین تنظیم کننده آخر در واقع یک پروتئین خاموش کننده می‏باشد. برای بیان کنترل شده­ی ژن هدف، ژن مزبور در پایین دست یک پروموتر هیبرید قرار می­گیرد به‏طوری که این پروموتر از جایگاه اتصال برای TetR به‏نام تتراسیکلین اپران برخوردار است و بلافاصله بعد از آن توالی Minimal CMV قرار می­گیرد. در سیستم Tet off افزودن Dox به محیط سلول­ها باعث اتصال به پروتئین ترکیبی TetR/VP16  شده  و در نتیجه تغییر شکل و توقف  رونویسی و بیان ژن هدف می­گردد، این در حالی است که سیستم Tet on  که نوع جهش یافته سیستم Tet off می­باشد، دقیقا عکس این  سیستم عمل می­کند و وجود Dox در محیط باعث القا بیان ژن هدف می­شود (12).

شکل­های دیگری از سیستم­های تنظیمی بیان ژن پروتئین با نام tTS که  یک پروتئین خاموش کننده می­باشد، به این‏صورت است که در حالت عدم حضور Dox در محیط به tetO متصل شده و مانع رونویسی از ژن هدف می­شود اما با اضافه شدن Dox به محیط این آنتی بیوتیک با اتصال به tTS باعث ایجاد تغییراتی در ساختار tTS شده و آنرا از tetO جدا می‏کند.  در این لحظه پروتئین تنظیمی rtTA به tetO متصل شده و رونویسی انجام می­گیرد. استفاده از tTS  باعث بهبود در عمل‏کرد کنترلی سیستم­های  القایی شده است (13). در مطالعه جاری به‏منظور کنترل بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلول‏های رده LMH از ناقل القایی TIGHT PNL-TRE- استفاده گردید.

 

مواد و روش‌ها

آماده سازه ناقل های ویروسی: ناقلین مورد استفاده در این بررسی شامل یک سیستم القایی Tet-on  با القا پذیری به‏وسیله داکسی سایکلین به‏نام  PNL-TRE-TIGHT و یک ناقل تولید کننده پروتئین ترکیبی (پروتئین تنظیمی) rtTA-M2 به‏نام PNL-rtTA-M2  بودند (شکل 1). تمامی ناقلین مطابق روش استاندارد به سویه Top10  از باکتری Ecoli ترانسفورم شدند و برای انتخاب باکتری­های ناقل پلاسمید هدف، باکتری‏ها در محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک مورد نظر کشت داده شدند. سپس یک تک کلون از باکتری رشد کرده برداشته شد و در ابتدا در 2 میلی‏لیتر به‏مدت 8 ساعت در انکوباتور شیکر  کشت داده شد. سپس یک میلی‏لیتر از آن برای تهیه مینی پرپ استفاده شد و پس از تهیه مینی پرپ و تست آنزیمی برای اطمینان از صحت کلونی‏ها، بقیه محیط کشت به 200 میلی‏لیتر محیط  تلقیح شده و به‏مدت 16 ساعت در انکوباتور شیکر کشت داده شد. با استفاده از کیت QIAGEN (شرکت QIAGEN، آلمان) ماکسی پرپ پلاسمیدها تهیه شد.

 

 

شکل 1: شمایی خطی از ناقل لنتی ویروسی  Tet-ON  و ناقل تولید کننده پروتئین ترکیبی rtTA-M2

 

 

کشت سلول‏های LMH: سلول­های رده  LMH به‏صورت کشت شده در فلاسک T25 خریداری گردید. سلول­ها در انکوباتور قرار داده شد و بعد از پر شدن فلاسک سلول، برای تهیه ذخیره سلولی و آماده کردن سلول برای مرحله ترانسفکشن به پلیت 24 خانه و فلاسک‏های T25 دیگر  پاساژ داده شدند. به‏دلیل چسبندگی پایین سلول­های رده LMH، کف فلاسک­ها و پلیت‏های مورد استفاده با ژلاتین 1/0 درصد پوشانده شد. کشت سلول‏هایLMH  در محیط Waymouth MB 752/1 (از شرکتGIBCO) با FBS 10 درصد و 100 میگروگرم بر میلی‏لیتر پنی‏سیلین و 100 میگروگرم بر میلی‏لیتر استرپتومایسین انجام شد. برای آماده کردن سلول برای مرحله ترانسفکشن، سلول­ها در پلیت های 24 خانه کشت داده شدند. تعداد 100 هزار سلول  در هر خانه از پلیت­های 24 خانه کشت داده  شد و سلول‏ها در انکوباتور CO2 در 37 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 24 ساعت انکوبه شدند.

ترنسفکشن سلول های LMH: بعد از اینکه سلول­ها 50 تا 60 درصد پلیت را پرکردند مرحله ترانسفکشن سلول­ها انجام گرفت. ترانسفکشن سلول­ها با پلاسمیدهای ویروسی با روش رسوب DNA- فسفات-کلسیم و به‏کمک محلول HEPES انجام شد. در این مرحله سازه PNL-TRE-TIGHT به‏همراه ناقل PNL-rtTA-M2  که تولید کننده پروتئین ترکیبی rtTA می­باشد ترانسفکت هم‏زمان شد. برای عمل ترنسفکشن بعد از ترکیب 5/0 میکروگرم DNA  ناقل اول و 5/0 میکروگرم ناقل دوم با آب و CaCl2  این ترکیب به‏صورت قطره قطره به‏ترکیب 2X HEPES   که در حال ورتکس شدن بود اضافه شد. سپس به‏مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و بعد از افزودن آن به محیط سلول­هایی که 24 ساعت قبل آماده شده بود سلول‏ها برای مدت 7 تا 8  ساعت در انکوباتور CO2  انکوبه شد. برای القای بیان ژن گزارشگر ابتدا استوک­های Doxycyclin  با مقادیر 01/0، 1/0 و 1 میکروگرم تهیه شد.  بعد از حدود 7 ساعت محیط سلول­ها تعویض شد و  حدود 10 میکرولیتر از استوک­های تهیه شده به محیط­های کشت سلولی اضافه شد. میزان بیان ژن گزارشگر EGFP هم در حضور و هم در غیاب DOX، 24 و 48 ساعت بعد از افزودن داکسی­سایکلین در زیر میکروسکوپ فلوئورسنت مورد بررسی قرار گرفت.

تصویر برداری با میکروسکوپ فلوروسنس و محاسبه میزان بیان و شدت بیان EGFP: حدود24 ساعت و 48 ساعت پس از افزودنDOX  به محیط کشت، سلول­ها برای بررسی میزان بیان و عکس‏برداری سلول­ها در زیر میکروسکوپ فلوروسنس بررسی شد و از بخش­های مختلف هر چاهک عکس گرفته شد تا در محاسبات و آنالیز میزان بیان EGFP استفاده گردد. تمام تصاویر با بزرگ‏نمایی 10 برابر و از بخش‏های مختلف چاهک‏های در نظر گرفته شده برای هر غلظت تهیه شد. تصاویر گرفته شده برای شمارش سلول­ها با استفاده از نرم افزارGrid cell counter  و برآورد درصد سلول‏های بیان کننده ژن EGFP، مورد استفاده قرارگرفت. برای محاسبه درصد بیان ژن گزارشگر EGFP از فرمول زیر استفاده شد:

 

EGFP = میانگین تعداد سلول­های بیان کنندهEGFP  در 5 تا 7 میدان میکروسکوپی

CV= میانگین تعداد سلول­های موجود در 5 تا 7 میدان میکروسکوپی

برای آنالیز شدت بیان از دو ابزار 3D surface plot و        ROI manager در نرم افزار Image J استفاده شد. قبل از آنالیز هر تصویر، ابتدا با استفاده از ابزار Subtract background از منوی Process روی تصویر ویرایش به‏عمل آمد تا میزان Background به حداقل رسد و تصاویر یکنواخت‏تر حاصل شود. سپس تصاویر با استفاده از ابزار Interactive 3D surface plat آنالیز شد و میزان EGFP intensity محاسبه گردید. این ابزار با اندازه گیری ارزش پیکسلی در تمام نقاط تصویر، نقاط بیان کننده ژن و شدت بیان را می‏سنجد به ‏طوری‏که به‏رنگ سیاه ارزش پیکسلی صفر و به‏رنگ سفید بیشترین ارزش پیکسلی یعنی 255 اختصاص می‏دهد. به این ترتیب با توجه به تعداد نقاط بیان کننده و شدت بیان در نقاط بیان کننده، تصاویر به‏وسیله نرم افزار آنالیز شده و خروجی به‏صورت سه بعدی به نمایش گذاشته می‏شود. بنابراین با توجه به شدت بیان EGFP در هر سلول، رنگ فلورسنت از حالت سبز تیره تا سبز روشن متمایل به سفید متغیر بوده که این امر ارزش پیکسلی را برای هر نقطه بیان کننده ژن EGFP متفاوت می‏کند. 

برای دریافت خروجی عددی از تصاویر تعریف شده برای نرم افزار Image J از ابزار ROI manager استفاده شد. برای اینکار تصویر تمام سلول‏های EGFP+  با استفاده از ابزار Point انتخاب و به پنجره  ROI manager اضافه شد. سپس با گزینه Measure در  پنجره  ROI manager میزان شدت بیان EGFP در سلول‏های EGFP+ به‏دست آمد. میانگین­های Intensity جمع آوری شد و داده‏ها با استفاده از نرم افزار SAS آنالیز شد. مقایسه میانگین داده‏های Intensity با استفاده از آزمون مقایسه میانگین‏ها در نرم افزار SAS آنالیز شد

 

نتایج

القاپذیری سیستم بیانی در  حضور آنتی بیوتیک

در مقاطع زمانی 24 و 48 ساعت از سلول‏های ترانسفکت شده در زیر میکروسکوپ فلورسنس عکس‏برداری به‏عمل آمد. مشاهده چشمی این تصاویر نشان می‏دهد که با افزایش غلظت و زمان حضور DOX در محیط کشت سلول درصد سلول‏های EGFP+  بیشتر می‏شود شکل (2). شمایی از روند افزایشی درصد سلول‏های بیان  کننده EGFP  و تاثیر پارامتر زمان القا و غلظت القاگر را در سلول‏های LMH نشان می‏دهد

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپی سلول­های بیان کننده EGFP. مشاهده چشمی این تصاویر نشان می‏دهد که تعداد سلول‏های EGFP+ با افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان القا بیان ژن در رده سلولی LMH رو به فزونی می‏رود. تمام تصاویر با بزرگ‏نمایی 10 برابر  از سلول‏ها تهیه شد.

 

 

تاثیر دو پارامتر زمان القا و غلظت DOX بر افزایش تعداد سلول‏های القا شده

شمارش میدانی سلول‏ها در زیر میکروسکوپ فلورسنس نشان داد که به موازات افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان القا، تعداد سلول‏های بیان کننده ترانسژن EGFP نیز افزایش می‏یابد (شکل 3). بر طبق این نمودار درصد سلول‏های مثبت در 24 ساعت اول با یک مقدار نسبتا ثابت در حال افزایش بوده ولی در 24 ساعت دوم افزایش سریعی در این میزان ایجاد شده است. در نمونه‏های 24 ساعته، درصد سلول‏های مثبت به EGFP به‏موازات افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش پیدا کرده است. ولی در 48 ساعت به‏تدریج آهنگ افزایش کند می‏شود، به‏طوری که از غلظت 1/0 تا 1 تغییر چندان محسوسی به‏چشم نمی­خورد. بیان ژن گزارشگر در سلول­های کنترل 24 ساعت بعد از ترانسفکشن حدود 4/0 درصد و به‏ترتیب برای 01/0، 1/0 و 1 میکروگرم بر میکرولیتر داکسی سایکلین حدود 2/6 ، 34/10 ، 16 درصد محاسبه شد. سلول‏ها برای 24 ساعت دیگر در انکوباتور ذخیره شد تا میزان بیان ژن بعد از 48 ساعت بررسی شود. نتایج حاصله در 48 ساعت بعد ترانسفکشن نشان ­داد که بیان ژن با افزایش مقدار داکسی سایکلین و مدت زمان بیشتر بالا می­رود، به‏طوری‏که بیان در 24 ساعت دوم برای گروه شاهد به 4/6 درصد رسید و برای گروه­های آزمایشی 01/0 ، 1/0 و 1 میکروگرم بر میکرولیتر داکسی سایکلین به‏ترتیب به 26 ، 3/28 و 7/29 افزایش یافت.

 

 

شکل 3: افزایش درصد سلول‏های بیان کننده ژن گزارشگر EGFP با افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان حضور القاگر داکسی سایکلین در محیط کشت سلولی. برای محاسبه درصد سلول‏های بیان کننده ژن EGFP، تعداد سلول‏های بیان کننده EGFP در تعداد مشخصی از میادین میکروسکوپی (5 تا 7 میدان ) به‏کمک نرم افزار Grid cell counter   شمارش و میانگین گرفته شد. عدد حاصله بر میانگین تعداد کل سلول‏های موجود در همان میادین میکروسکوپی تقسیم و سپس در 100 ضرب شد. بررسی‏ها به‏صورت جداگانه برای 24 و 48 ساعت بررسی شد.

 

 

تناسب مستقیم بین میزان بیان با میزان پیکسلهای فلورسنت

تصاویر میکروسکوپی سلول‏ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت بعد از ترانسفکشن و القای ژن EGFP و انکوباسیون برای مدت 24 و 48 ساعت پس از القا با القاگر بیان جمع آوری شد. تصاویر حاصله بعد از ویرایش با ابزار Subtract background با ابزارInteractive 3D surface plat آنالیز شد. نتایج این آنالیز که در شکل (4) منعکس شده است، نشان دهنده افزایش در درصد بیان EGFP و افزایش شدت بیان ژن EGFP  و افزایش تعداد سلول‏های بیان کننده ژن گزارشگر EGFP به‏موازات افزایش زمان القا و دوز داکسی سایکلین می‏باشد.

برای سنجش کمی تغییرات بیانی، تصاویر سلولی با ابزار Subtract background و ابزار  Interactive 3D surface plot آنالیز شد و داده‏های به‏دست آمده با استفاده از نرم افرار SAS با روش مقایسه میانگین‏ها آنالیز شد. نتایج به‏دست آمده تفاوت معنی‏دار میانگین­های  شدت بیان را در دوزهای مختلف داکسی سایکلین و مدت زمان القا بیان ژن در سطح 001/0 نشان می­دهد. (001/0p<) (شکل 5).

 

 

 

 

شکل 4: آنالیز پیکسلی تصاویر سلول‏ها بعد از ترانسفکشن و القا ژن EGFP. تصاویر سلولی پس از القا بیان با دوزهای مختلف داکسی سایکلین به‏مدت 24 ساعت و 48 ساعت جمع آوری شد. این تصاویر بعد از ویرایش با ابزار  subtract background نرم افزار ImageJ در نهایت با ابزارInteractive 3D surface plat همان نرم افزار آنالیز شد. (ستون مدرج در کنار هر تصویر بیانگر میانگینintensityPixel برای هر نقطه نورانی می­باشد). برای آنالیز، تعداد مشخصی از میدان‏های میکروسکوپی (5 تا 7 میدان ) برای هر غظت 24 و 48 ساعت بعد از القا بیان به نرم افزار Image J وارد شده تا میزان ارزش پیکسلی موجود در هر نقطه از تصویر را اندازه‏گیری و به‏صورت سه بعدی و به شکل تصاویر بالا به نمایش بگذارد.

 

DOX

(µL/mL)

0

0.01

0.1

1

***

*

#

**

#

x

**

#

x

#

#

شکل 5: شدت بیان EGFP بعد از ترانسفکشن و القا بیان ژن گزارشگر در دوزهای مختلف داکسی سایکلین. برای به‏دست آوردن شدت بیان، از ابزار Subtract background و ابزار  ROI manager استفاده شد. سپس داده‏های و اعداد خام  که نشانگر شدت بیان (Pixel Intensity) به‏صورت کمی بود به نرم افزار SAS وارد شد و میانگین شدت بیان تمام نقاط انتخاب شده اندازه گیری و مقایسه میانگین ها برای تمام تصاویر برای غلظت‏ها مختلف انجام شد. علایم نمودار تفاوت معنی‏دار بین گرو‏ه‏ها را به‏شرح زیر نشان می‏دهد: علامت (*) تفاوت بین دو مقطع زمانی 24 و 48 ساعت برای هر غلظت معین DOX، علامت (#) تفاوت بین هر غلظت از DOX با معادل زمانی خود در کنترل بدون DOX، علامت (X) تفاوت بین هر یک از دو غلظت DOX معادل 0.1 µL/mL و 1 µL/mL باغلظت 0.01µL/mL. 

 

 

 

بحث

تنظیم بیان ژن یکی از بخش­های مهم در تحقیقات سلولی و ژن درمانی می­باشد، به‏طوری‏که کنترل بیان ژن و تولید سطح مشخصی از پروتئین هدف در سلول و یا بافت هدف و یا متوقف کردن بیان ژن در سلول و القا بیان آن در زمان خاص تاثیر زیادی در مطالعات بیولوژیکی و تکوینی دارد. با ترکیب این سیستم‏ها با پروموتر های اختصاصی می‏توان زمان و مکان ژن هدف را به‏طور هم‏زمان کنترل نمود.

در این مطالعه، کاربرد سیستم القایی تتراسیکلین (Tet-ON) بر روی سلول‏های پرندگان رده LMH مطالعه شد و نشان داد که چنین سیستم پروکریوتی علاوه بر عمل‏کرد در سلول‏های پستانداران، می‏تواند در سلول‏های طیور نیز به‏خوبی کار کند. القاگر بیان در این سیستم­ها داکسی سایکلین (DOX) بود که آنالوگ تتراسیکلین با سمیت کمتر بوده و در غلظت­های مختلف باعث ایجاد سطوح بیانی مختلف برای ژن هدف می­شود (14).

نتایج حاصل شده در این بخش نشان داد که سلول‏های ترانسفکت شده LMH با ناقلین القایی بعد از افزودن DOX شروع به بیان کردند و افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش بیان را به‏دنبال داشت. به‏طوری‏که با افزایش سریالی غلظت DOX القا بیان ژن هم در 24 ساعت اول بعد از ترانسفکشن و هم در 24 ساعت دوم به‏صورت خطی افزایش پیدا کرد. این نتایج با گزارشات اولیه بر روی سیستم بیانی Tet و القا آن به‏وسیله DOX هم‏خوانی دارد (3). در این پژوهش، به‏جای اکتیواتور اولیه (rtTA)، از نسخه جهش یافته آن به‏نام rtTA-M2 استفاده شد که از نظر القای بیان و خاموش سازی نشت بیان بر نسخه اولیه برتری آشکار دارد (11).

تغییر ملایم گروه­های آزمایشی تیمار شده با غلظت­هایی 01/0، 1/0، 1 داکسی­سایکلین در 48 ساعت دوم می­تواند به‏دلیل قابلیت ترانسفکشن 30 درصدی سلول­های LMH باشد که باعث شد که در بیان القایی ژن EGFP در 24 ساعت دوم یک روند روبه رشد کم و بیان حدود 30 درصد مشاهده شود.

بیان 4/0 درصد و 4/6 درصد در سلول­های شاهد،  به‏دلیل Background  و نشت بیان ژن در زمان خاموشی سیستم و عدم حضور القاگر در محیط می‏باشد. برای حذف این بیان پایه در سازه‏های القایی سیستم های جدیدتر با بیان پایه‏ای و یا نشتی کمتر در بیان ژن ایجاد شده است. از جمله سیستم‏های جدید می‏توان به پروموتر هیبرید TRE3G (شرکت ClonTech) اشاره کرد که دارای نشتی بیان بسیار پایین به سیستم‏های قبلی می‏باشد. بیان پایه­ای و یا نشتی موجود در سازه القایی لنتی ویروسی و وجود یک فعالیت پایه در   Minimal CMV Promoter می‏تواند به‏خاطر توالی‏های خاص و توالی‏های مسئول سیگنال دهی و افزایش نسخه برداری از ناحیهLTR  در ژنوم ویروسی باشد (15).

تحمل سلول‏های پستاندار در برابر تیمار با DOX نسبتا بالاست ولی بی‏نهایت نیست. با این وجود در مورد سلول‏های LMH، با افزایش غلظت DOX و گذشت زمان بیشتر از مرحله تیمار سلول­ها با DOX، سلول­ها شروع به از بین رفتن نمودند و درصد تلفات سلول رو به افزایش گذاشت. بنابراین نتایج ما نشان دا که سلول‏های LMH قادر نیستند غلظت‏هایی از DOX که برای سلول‏های پستاندار قابل تحمل بود را تحمل نمایند. در مجموع، سازه­های القایی به‏همراه DOX باعث می‏شوند که سیستم­های نسخه برداری درون سلول بیشتر به‏سمت مکانیسم بیان القایی هدایت شده و سلول از یک وضعیت بیان نرمال در یک شرایط غیر طبیعی قرار گیرد و سیستم­های القایی همانند یک تله برای ماشین نسخه برداری سلول عمل می­کند و این امر باعث مرگ سلول می­شود.

آزمایشگاه ما یک مطالعه سیستماتیک را بر روی میزان نشت و القای بیان در سیستم Tet آغاز کرده است که طی آن پروموترهای القا شونده متنوعی به‏کار برده شده است. این پروموترها شامل پروموتری قدرتمند از آدنوویروس‏ها می‏باشد (16). پروموتری که در آن نمان و فواصل عناصر پاسخگو به Tet تغییر یافته است (17) و پروموتری که متحمل تغییر در توالی‏های تکراری TetO شده است (8). نتایج مقدماتی این مطالعه نشان می‏دهد که میزان نشت بیان ناخواسته را می‏توان به حداقل میزان ممکن رساند ولی میزان القا نیز ممکن است هم‏زمان کاهش پیدا کند. بنابراین بسته به اینکه چه ترانسژنی و برای چه منظوری القا می‏شود، یکی از این سیستم‏ها را می‏توان مورد استفاده قرار داد، ولی امکان مهار صددرصدی نشت بیان ممکن است هیچ‏وقت حاصل نشود. بدین جهت باید در به‏کارگیری این سیستم‏ها برای ژن‏هایی که محصولات سمی را کد می‏کنند با احتیاط عمل کرد.

نتیجه گیری

مطالعه حاضر نوعی امکان سنجی برای کاربرد سیستم القایی Tet در رده سلولی LMH به‏عنوان نماینده سلول‏های مربوط به طیور محسوب می‏شود. این مطالعه نشان داد که سیستم القایی مزبور برای القای بیان ترانس‏ژن‏ها در سلول‏های فوق به‏خوبی عمل می‏کند و القا نیز به‏طور مطلوب صورت می‏گیرد به‏شرط آن‏که غلظت‏های بالای DOX مورد نیاز نباشد.

 

تشکر و قدردانی

کلیه مراحل این تحقیق در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری انجام گرفت. از مسئولین پژوهشکده پزشکی پژوهشگاه تقدیر می‏شود.

1. Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa T, Establishment and Characterization of a Chicken Hepatocellular Carcinoma Cell Line, LMH1. Cancer Res. 1987; 47(16): 4460-4464.

3. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 1992; 89(12): 5547–5551.

4. Bejar R, Yasuda R, Krugers H, Hood K, et al. Transgenic calmodulin-dependent protein kinase II activation: dose-dependent effects on synaptic plasticity, learning, and memory. J Neurosci. 2002; 22(13): 5719 – 5726.

5. Harding TC, Geddes, BJ, Noel JD, Murphy D, et al. Tetracycline-regulated transgene expression in hippocampal neurons following transfection with adenoviral vectors. J Neurochem 1997; 69(6): 2620– 2623.

6. Malleret G, Haditsch U, Genoux D, Jones MW, et al. Inducible and reversible enhancement of learning, memory, and long-term potentiation by genetic inhibition of calcineurin. Cell. 2001; 104: 675–686.

7. Ralph GS, Bienemann A, Harding TC, Hopton M, et al. Targeting of tetracycline-regulatable transgene expression specifically to neuronal and glial cell populations using adenoviral.vectors. NeuroReport. 2000; 11(9): 2051– 2055.

8. Pluta K, Luce MJ, Bao L, Agha-Mohammadi S, et al. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 2005; 7(6):803-17.

9. Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Muller G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995; 268: 1766−1769.

10. Kikuchi G, Yoshida T. Function and induction of the microsomal heme oxygenase. Mol Cell Biochem 1983; 53/54: 163–183, 1993.

11. Urlinger S, Baron U, Thellmann M, Hasan MT, et al. Exploring the sequence space for tetracyclinedependent transcriptional activators: Novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97(14): 7963–7968.

12. Mark L. Conditional control of Gene expression in the mouse. Macmillan Magazines Ltd. 2001; 2: 743- 755.

13. Zhou Z, Tao Z, Chun G, Robert J, et al. Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems systems: advances and application in transgenic animal modeling. Seminars in Cell & Developmental Biology. 2002; 13: 121-128.

14. Haberman R, McCown T,  Samulski R.  Inducible long-term gene expression in brain with adeno-associated virus gene transfer. Gene Therapy. 1998; 5: 1604-1611.

15. Gardaneh M, O’Malley KL. Rat tyrosine hydroxylase promoter directs tetracycline-inducible foreign gene expression in dopaminergic cell types. Mol Brain Res. 2004; 126(2): 173-80.

16. Massie BCouture FLamoureux LMosser DD, et al. Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with a tetracycline-regulatable expression cassette. J Virol. 1998; 72(3): 2289-96.