اثر حفاظتی روغن سیاه دانه بر سمیت القاء شده توسط بیس فنول آ بر بافت بیضه موش بالغ NMRI

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کدپستی 8349-8-38156

2 دانش آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر حفاظتی روغن سیاه دانه به‏عنوان یک آنتی اکسیدانت بر بافت بیضه موش‏های تیمار شده با بیس فنول A بود‏.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه 24 سر موش نر بالغ NMRI به چهار گروه (6=n) : کنترل‏، بیس فنول A (mg/kg/day 200)‏، روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5) و بیس فنول A + روغن سیاه دانه تقسیم شدند. 34 روز پس از تیمار دهانی با اندازه‌گیری وزن موش، بیضه راست خارج و فیکس شد. پارامترهای مورفومتریک بافت بیضه پس از انجام برش گیری، پاساژ بافتی و رنگ آمیزی Heidenhain's Azan ، توسط روش استریولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت.
 نتایج : میانگین حجم لوله‏های منی‏ساز، ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی، قطر و ضخامت غشا پایه لوله‏های منی‏ساز‌، تعداد سلول‏های اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد و دراز، اسپرماتوگونی و سلول‏های سرتولی در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری نشان داد (05/0 P<). افزایش میانگین حجم لوله‌های منی‌ساز و تعداد سلول‌های سرتولی در گروه بیس فنول A + روغن سیاه دانه در حد گروه کنترل بود اما میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت و اسپرماتید گرد و دراز در این گروه نسبت به گروه بیس فنول A دارای افزایش معنی‌داری شد (05/0P<).
 نتیجه گیری: مصرف هم‏زمان روغن سیاه دانه و بیس فنول A از اثرات نامطلوب بیس فنول A بر بافت بیضه موش بالغ جلوگیری نمود.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

بیس‌فنول A (BPA)  یک ماده زنواستروژن است که در تولید مونومرهای پلی‌کربنات و رزین‌های اپوکسی و پلیمرهای سبک ولی سخت استفاده می‏شود مثل‏: شیشه کودکان، ظروف، شیشه‌های شیر، بطری‌های آب معدنی، روکش رنگی مواد ساختمانی (1و2). بیس فنول A می‏تواند از طریق بسته بندی مواد غذایی مثل ظروف پلاستیکی پلی کربناته و قوطی‏های نوشیدنی وارد مواد غذایی شده و در نهایت وارد بدن شود (3). انسان‏ها ازطریق رژیم غذایی خود، استنشاق گرد و غبار خانگی و پوست در معرض بیس فنول A هستند (4).     

آزمایشات انجام گرفته در هر دو محیط آزمایشگاهی و موجود زنده نشان داده که BPA به‏عنوان یک ماده شیمیایی تخریب کننده اندوکرین (EDC) عمل می‏کند (5). مشابه با استروژن‏های دیگر BPA می‏تواند به رسپتور‏های استروژنی متصل شود و از عمل آندروژن‏ها ممانعت کند. شواهد نشان می‏دهد که بیس فنول A می‏تواند روی تکامل گنادها، غدد ضمیمه و اسپرماتوژنز تاثیر بگذارد، که این اثر به‏وسیله عمل مستقیم بر روی برهم‏کنش‏های بین سلول‏های سرتولی و رده سلول‏های زایگر ایجاد می‏شود (6 و 7). تحقیقات نشان داده که قرار گرفتن جوندگان در معرض بیس فنول A در دوران بارداری، باعث اختلال در عمل‏کرد غدد درون ریز و سیستم تولید مثلی نوزادان نر و ماده می‏شود (8). مشاهده شده که BPA باعث افزایش سطح گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و لیپید پراکسیداسیون دربافت بیضه رت‏های بالغ نیز می‏شود (9). بیس فنول A همچنین موجب کاهش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانتی مثل سوپر اکسید دیسموتاز‏، کاتالاز و گلوتاتیون می‏گردد و باعث ایجاد استرس اکسیداتیو و آسیب بافتی در بیضه‏، مغز‏، کبد‏، کلیه و دیگر اندام‏ها می‏شود. افزایش استرس اکسیداتیو در بیضه لیپید پراکسیداسیون غشا را نیز به‏دنبال خواهد داشت (10 و 11).

گیاه سیاه دانه با نام علمی (Nigella sativa) یک گیاه سالانه و بومی جنوب و جنوب غربی آسیاست. از دانه گیاه سیاه دانه چهار نوع آلکالوئید به‏نام‏های nigellicine, nigellidine, nigellimine-N-oxide, nigellone استخراج شده است‏. تیموکوینون، دی تیموکوینون‏، تیموهیدروکوینون و تیمول مواد موثره اصلی در عصاره آبی دانه گیاه هستند (15-12). این گیاه طیف گسترده‏ای از خواص پزشکی را دارد که شامل اثرات ضد میکروب‏، ضد تومو‏ر، ضد ویروس‏، ضد التهاب و آنتی اکسیدانت می‏باشد (16). تحقیقات نشان داده است که بیشتر فعالیت بیولوژیکی دانه این گیاه مربوط به تیموکوینون (TQ)، یعنی جز اصلی روغن فرار دانه گیاه سیاه دانه است. هم روغن و هم اجزای تشکیل دهنده سیاه دانه و به‏ویژه تیموکوینون دارای خواص آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی است و خواص ضد التهاب آن از طریق سرکوب واسطه‏های التهابی مانند پروستاگلندین‏ها و لکوترین‏ها اعمال می‏شود (17 و 18). اسیدهای چرب غیر اشباع در روغن سیاه دانه فعالیت آنزیم –β هیدروکسی استروئید دهیدروژناز را تحریک می‏کند، این آنزیم، در مسیر سنتز تستوسترون نقش دارد. همچنین سیاه دانه به‏عنوان آنتی اکسیدانت روی بیضه، غدد ضمیمه، اپی‏دیدیم و اسپرم اثر می‏گذارد و از آسیب رادیکال‏های آزاد جلوگیری می‏کند (19، 20 و 21). این مطالعه به‏منظور تعیین اثر روغن سیاه دانه بر اثرات بیس فنول A روی بافت بیضه موش بالغ نژاد NMRI انجام شد .

 

مواد و روش‏ها

 این مطالعه تجربی روی 24 سر موش نر بالغ نژاد NMRI با وزن تقریبی 3±32 گرم خریداری شده از انستیتو پاستور ایران در دانشگاه اراک طی سال 1393 انجام شد.

موش‏ها در خانه حیوانات و در شرایط استاندارد شامل دمای 2±21 درجه سانتی‏گراد، نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و دسترسی آزادانه به آب و غذا نگه‏داری شدند. سپس حیوانات به‏طور تصادفی در 4 گروه 6 تایی شامل کنترل، بیس فنول A (mg/kg/day 200)، روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5)+ بیس فنول A (mg/kg/day 200) گروه‏بندی و به‏صورت دهانی تیمار شدند.

بیس فنول A، از شرکت (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) و روغن سیاه دانه از پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی کرج خریداری و مورد استفاده قرار گرفت.

 سایر مواد شیمیایی مورد استفاده از شرکت Merck آلمان تهیه شد. دوز بیس فنول A بر اساس دوزهای مورد استفاده در تحقیقات قبلی با پیامدهای آسیب شناختی بر روی سیستم تناسلی موش نر NMRI انتخاب شد (22) و دوز روغن سیاه دانه (23) نیز بر همین اساس انتخاب شد. مدت زمان قرارگیری در معرض بیس فنول A، 34 روز بود که زمان مورد نیاز برای تکمیل یک دوره کامل اسپرماتوژنز است (24) و تیمار با روغن سیاه دانه نیز به‏همراه تیمار با بیس فنول A انجام گردید.

در پایان دوره تیمار ابتدا موش‏ها وزن و سپس با استفاده از دی اتیل اتر بی‏هوش شدند و پس از تشریح، بیضه راست آن‏ها خارج و پس از تمیز کردن وزن شد و حجم بیضه با استفاده از روش غوطه ورسازی (Immersion) (25) برآورد گردید. سپس برای انجام ثبوت بافتی در محلول ثبوتی اصلاح شده داویدسون (26) به‏مدت یک هفته با دو بار تعویض محلول ثبوتی قرار داده شد. لازم به‏ذکر است که تمامی اصول بهداشتی در نگه‏داری و معدوم سازی حیوانات بر اساس پروتکل اخلاقی انجام شد.

از روش Orientator برای به‏دست آوردن برش‏های IUR (هم‏شکل و هم‏سان تصادفی) استفاده شد (27). به این منظور، بیضه‏ها به‏طور تصادفی در ساعت فی(ф) که به نه قسمت مساوی تقسیم شده بود؛ قرار داده شد. سپس با انتخاب یک عدد تصادفی از یک تا نه بیضه در امتداد عدد انتخاب شده برش زده شد. نتیجه این برش ایجاد دو قطعه از بیضه بود. قطعه اول بر روی ساعت تتا که به 9 قسمت نابرابر تقسیم شده بود؛ طوری قرار گرفت که سطح برش خورده در طول محور 0-0 ساعت تتا (θ) قرار گرفت. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و برشی موازی در امتداد عدد انتخاب شده، زده شد. ادامه برش‏ها به‏صورت موازی و مساوی با برش اول زده شد و قطعه دوم به اندازه 90 درجه چرخانده شد تا سطح برش خورده مماس بر محور 0-0 ساعت تتا قرار گرفت. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و برش‏ها به‏موازات عدد انتخاب شده تهیه شدند (27). اسلایدهای تهیه شده از هر بیضه با حفظ جهت، پاساژ بافتی داده شد و پس از تهیه قالب‏های پارافینی توسط میکروتوم (Leitz 1512) مقاطع با ضخامت 5 و 20 میکرومتر تهیه و با روش رنگ آمیزی هایدن هان آزان رنگ آمیزی شد.

به‏منظور محاسبه چروکیدگی با استفاده از تروکار به‏صورت تصادفی سه قطعه گرد از برش‏های IUR به‏دست آمده از بیضه هر موش ایجاد شد. سپس دو قطر عمود بر هم اندازه گیری و میانگین شعاع آن محاسبه شد و به‏عنوان شعاع قبل از تثبیت بافتی در نظر گرفته شد. پس از تثبیت بافتی، پردازش بافت (پاساژ بافتی)، برش گیری و رنگ آمیزی مجددا اندازه‏گیری قطر قطعات همانند بالا انجام شد و میانگین شعاع حاصله به‏عنوان شعاع پس از تثبیت در نظر گرفته شد. مقدار چروکیدگی در هر بیضه برآورد شد (28). برای به‏دست آوردن حجم واقعی بیضه، مقدار چروکیدگی از حجم حاصل از روش غوطه ورسازی کم شد.

به‏منظور محاسبه حجم لوله‏های منی‏ساز و بافت بینابینی، با استفاده از روش نمونه‏گیری تصادفی منظم، به‏طور میانگین 5 میدان دید از هر برش 5 میکرومتری به‏وسیله قرار دادن تصادفی پروب نقطه‏ای بر روی هر میدان دید، مورد بررسی قرار گرفت. کل نقاط برخورد کرده از پروب با کل میدان دید انتخاب شده و به همین ترتیب نقاط برخورد کرده با لوله‏های منی‏ساز و بافت بینابینی شمارش گردید و دانسیته حجمی هر یک از آن‏ها محاسبه شد (28).

برای محاسبه میانگین قطر لوله‏های منی‏ساز از میکروسکوپ Olympus DP12 مجهز به یک دوربین و از فریم مخصوص شمارش استفاده شد. برای این کار از میدان‏های دید مربوط به محاسبه طول لوله‏های منی‏ساز عکس گرفته شد و قطر عمود بر محور طولی حدود 130 تا 150 لوله منی‏ساز با استفاده از نرم افزار موتیک (Motic image 2000) اندازه گیری شد (29).

برای محاسبه ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی با استفاده از ابژکتیو با بزرگ‏نمایی 10 به‏طور متوسط 5 میدان دید از هر برش 5 میکرومتری بافت بیضه مربوط به هر موش مورد مطالعه قرار گرفت. برای به‏دست آوردن دانسیته حجمی اپی‏تلیوم زایشی، کل نقاط برخورد کرده از پروب با تصویر بافت بیضه مربوط به‏هر میدان دید شمارش و سپس تعداد کل نقاط برخورد کرده با اپی‏تلیوم زایشی نیز شمارش شد و بر مجموع نقاط برخورد کرده با بافت بیضه تقسیم شد. بدین ترتیب دانسیته حجمی اپی‏تلیوم زایشی به‏دست آمد. سپس دانسیته سطح اپی‏تلیوم زایشی محاسبه شد (28).

به‏منظور محاسبه میانگین ضخامت غشا پایه لوله‏های منی‏ساز از روش اندازه‏گیری هارمونیک (Harmonic) استفاده شد (30). 24 تا 26 میدان دید از همه اسلایدهای 5 میکرومتری بافت بیضه هر موش با استفاده از ابژکتیو با بزرگ‏نمایی 100 و روش تصادفی منظم انتخاب شد. سپس یک پروب که دارای خطوط موازی و مساوی (خطوط ایزوتروپیک) بود؛ بر روی عکس‏های گرفته شده از مقطع بیضه انداخته شد و از محل برخورد خطوط پروب با غشا داخلی غشاء پایه یک خط عمود بر خط مماس غشا خارجی کشیده شد و سپس طول این خط توسط نرم افزار موتیک اندازه گیری شد و میانگین ضخامت غشاء پایه محاسبه گردید.

به‏منظور محاسبه طول لوله‏های منی‏ساز حدود 5 میدان دید (فریم، با سطح 6300 میکرومتر مربع) از هر برش 5 میکرومتری با استفاده از ابژکتیو با بزرگ‏نمایی 10 انتخاب شد و به‏طور میانگین 130 تا 150 لوله منی‏ساز در بیضه هر موش با استفاده از فریم شمارش (unbiased counting frame) شمارش گردید (28و27). دانسیته طولی لوله‏های منی‏ساز محاسبه شد (28). برای به‏دست آوردن طول کل لوله‏های منی‏ساز، دانسیته طولی در حجم نهایی بیضه ضرب شد (28).

برای محاسبه تعداد انواع سلول‏ها از روش optical dissector و از فریم مخصوص شمارش استفاده شد (28 و 31). برای این‏کار با استفاده از ابژکتیو با بزرگ‏نمایی 100 از همه برش‏های 20 میکرومتری بیضه هر موش تعدادی فریم (سطح هر فریم،460میکرومتر مربع) برای شمارش انواع سلول‏ها، انتخاب شد و میکروکیتور (ND 221 B, Heidenhain, Germany)برای شمارش مورد استفاده قرار گرفت. سپس دانسیته عددی انواع سلول‏ها محاسبه گردید. برای محاسبه تعداد کل انواع سلول‏های مورد نظر، عدد حاصل در حجم کل بیضه مربوطه ضرب شد.

آنالیز آماری:داده‏های حاصل توسط نرم افزار SPSS-16 و روش آنالیز واریانس یک‏طرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و تفاوت میانگین‏ها در سطح کمتر از 05/0 معنی‏دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

 از مقایسه میانگین حجم کل بیضه موش‏ها در بین گروه‏های مختلف موش اختلاف آماری معنی‏داری مشاهده نشد، اما میانگین حجم لوله‏های منی‏ساز (mm3) در گروه بیس فنول A نسبت به سایر گروه‏ها کاهش معنی‏داری را نشان داد (01/0 p<). همچنین در گروه تیماری هم‏زمان روغن سیاه دانه با بیس فنول A‏، نسبت به گروهی که فقط بیس فنول A دریافت کرده بودند اختلاف معنی‏داری مشاهده شد (006/0p<)(جدول 1).

میانگین طول لوله‏های منی‏ساز در بین چهار گروه تفاوت آماری معنی‏داری نشان نداد. این در حالی است که کاهش آماری معنی‏داری در میانگین قطر لوله‏های منی‏ساز (001/0p<)، ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی (01/0 p<) و میانگین ضخامت غشا پایه لوله‏های منی‏ساز (01/0 p<) در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل دیده شد. افزایش پارامترهای فوق در گروه هم‏زمان روغن سیاه دانه با بیس فنول A نسبت به گروه بیس فنول A معنی‏دار نبود (جدول2).

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین حجم کل بیضه (mm3)‏، حجم لوله‏های منی‏ساز (mm3) و حجم بافت بینابینی (mm3) در گروه‏های مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).

گروه‏ها

میانگین حجم لوله‏های منی‏ساز (mm3)

میانگین حجم کل بیضه (mm3)

میانگین حجم بافت بینابینی

(mm3)

کنترل

بیس فنول A

بیس فنول A+ روغن سیاه دانه

روغن سیاه دانه

a13/5±60/56

b22/7±41/45

a72/4±84/58

a07/7±14/58

a91/6±55/72

a66/8±86/63

a57/4±43/75

a91/7±58/73

 

a89/1±95/15

a76/1±45/18

a84/1±59/16

a35/2±44/15

 

جدول 2: مقایسه میانگین طول (m) ، قطر (μm)، ضخامت غشاء پایه (μm) و ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی لوله‏های منی‏ساز (μm) در گروه‏های مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A(mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).

گروه‏ها

ضخامت غشا پایه لوله‏های منی‏ساز (μm)

قطر لوله‏های

منی‏ساز (μm)

طول لوله‏های

منی‏ساز (m)

ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی لوله‏های منی‏ساز (μm)

کنترل

بیس فنول A

بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه

روغن سیاه دانه

a36/0±83/4

b35/0±14/4

ab41/0±56/4

a14/0±87/4

a86/5±77/200

b81/6±93/185

ab99/7±42/191

a75/6±15/197

a15/0±81/1

a24/0±65/1

a24/0±94/1

a36/0±86/1

a97/4±76/59

b83/2±58/48

ab75/9±58/54

a63/4±75/58

 

 

کاهش معنی‏داری در میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوگونی (003/0p<)، سرتولی (01/0p<)، اسپرماتوسیت (001/0p<)، اسپرماتید دراز (001/0p<) و اسپرماتید گرد (001/0p<) در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل مشاهده شد . از طرفی میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوسیت ، اسپرماتید دراز و گرد و سرتولی(در حد گروه کنترل) در گروه تیماری هم‏زمان با بیس فنول A و روغن سیاه دانه دارای افزایش معنی‏داری نسبت به گروه بیس فنول A بود (03/0p<). ‏علاوه بر این میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوسیت و اسپرماتید دراز و گرد نسبت به گروه کنترل نیز دارای تفاوت معنی‏داری بود (002/0p<). میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوگونی در گروه تیماری هم‏زمان با روغن سیاه دانه و بیس فنول A دارای اختلاف معنی‌داری با گروه کنترل نبود (جدول 3).

میانگین وزن بدن موش و وزن بیضه نیز پس از اتمام دوره تیمار در بین گروه‏های مختلف اختلاف آماری معنی‏داری نشان نداد (جدول 4).

 

 

جدول3: مقایسه میانگین تعداد انواع سلول‏های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید(گرد و دراز)، سرتولی (106×) در گروه‏های مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).

گروه‏ها

میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتید گرد 106×

میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتید دراز 106×

میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوسیت 106×

میانگین تعداد سلول‏های اسپرماتوگونی 106×

میانگین تعداد سلول‏های سرتولی 106×

کنترل

بیس فنول A

بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه

روغن سیاه دانه

a79/1±1/40

b18/1±1/28

c47/1±8/32

a51/3±0/39

a79/1±4/39

b21/1±7/27

c07/1±5/33

a07/3±2/38

a76/1±5/21

b17/7±6/12

c79/1±5/17

a95/1±3/21

a41/0±5/5

b52/0±5/4

ab39/0±2/5

a37/0±3/5

a32/0±86/3

b47/0±20/3

a21/0±80/3

a34/0±79/3

 

جدول 4: مقایسه میانگین وزن بیضه (میلی‏گرم) و وزن موش (گرم) در گروه‏های مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A(mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).

گروه‏ها

میانگین وزن موش در پایان تیمار(گرم)

میانگین وزن اولیه موش(گرم)

میانگین وزن بیضه (میلی‏گرم)

کنترل

بیس فنول A

بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه

روغن سیاه دانه

a93/0±63/34

a05/3±33/34

a77/6±53/34

a54/2±63/33

a22/3±85/32

a64/1±32/32

a12/3±80/32

a80/3±46/29

a72/14±33/108

a11/12±33/93

a16/8±33/113

a02/16±67/111

 

 لوله‌های منی‌ساز در گروه کنترل اسپرماتوژنز طبیعی داشته‏، اپی‏تلیوم زایشی لوله‌ها شکل طبیعی خود را حفظ کرده و سلول‌ها دارای نظم و ترتیب و  به‏‌هم پیوستگی بود (شکل A-1). در بیضه‌های موش‌های گروه بیس‌فنول ‌آ آتروفی لوله‌های منی‌ساز مشاهده شد( شکل B-1). همچنین در گروه بیس‌فنول‌آ+روغن سیاه دانه اکثر تغییرات تخریبی ایجاد شده به‏وسیله بیس‌فنول‌آ با تجویز روغن سیاه دانه تا حدودی برگشت و تعدیل یافته بود (شکل C-1). در گروه روغن سیاه‌دانه نیز ساختار لوله‌های منی‌ساز و ضخامت اپیتلیوم زایشی تقریبا مشابه گروه کنترل بود (شکل D-1).

 

 

 

 

شکل 1: بافت بیضه موش‏های بالغ در گروه‏های مختلف، تیمار شده با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5)، (برش‌های 5 میکرومتری، رنگ آمیزی هایدن­هان­آزان، بزرگ‏نمایی ×200)، (A) اپی‏تلیوم زایشی در گروه کنترل، (B) کاهش ضخامت اپی‏تلیوم زایشی و بی­نظمی اپی‏تلیوم زایشی در گروه تیمار شده با بیس‌فنول‌آ، (C) نمای لوله‌های منی‌ساز در گروه تیمار شده با بیس‌فنول ‌آ +روغن سیاه ‌دانه، (D) اپی‏تلیوم زایشی در گروه تیمار شده با روغن سیاه دانه.

 

 

بحث

در این مطالعه تیمار موش‏های بالغ با بیس فنول A به‏مدت 34 روز باعث کاهش حجم لوله‏های منی‏ساز، کاهش قطر، ارتفاع و ضخامت غشا پایه لوله‏های منی‏ساز، کاهش تعداد سلول‏های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید دراز و گرد و سرتولی گردید.

از جمله دلایلی که می‏توان برای اثرات بیس فنول A بر بافت بیضه ذکر کرد، اثر استرس اکسیداتیوی آن است. BPA باعث افزایش سطح رادیکال‏های آزاد (ROS) و لیپید پراکسیداسیون و کاهش فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانتی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون در بافت بیضه می‏شود (32). بافت بیضه به‏دلیل دارا بودن درصد بالای اسیدهای چرب غیر اشباع در غشا سلول‏هایش و درجه بالای متابولیسم و تکثیر سلولی در این بافت، به استرس اکسیداتیو بسیار حساس می باشد که این مساله نشان دهنده پر اهمیت بودن ظرفیت آنتی اکسیدانتی بافت بیضه است (33). بنابراین اثرات مشاهده شده در این مطالعه را می‏توان تا حدی ناشی از اثرات استرس اکسیداتیوی BPA دانست. نتایج مطالعه حاضر کاهش معنی‏داری را در قطر و ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی لوله‏های منی‏ساز نشان داد. در مطالعه Atsushi و همکارانش (34) بر روی موش‌های ICR والد که با دوزهای µg/kg/day 100 و mg/kg/day 5 از BPA تیمار شدند، کاهش قطر لوله‏های منی‏ساز در نوزادان نر آن‏ها دیده شد. همچنین Tan و همکارانش (35) نشان دادند که بیس فنول A بر اسپرماتوژنز رت‏ها اثر می‏گذارد. آن‏ها به رت‏های نر از 23 تا 53 روز بعد از تولد ، دوز mg/kg bw 100 از بیس فنول A را به‏صورت گاواژ دادند و مشاهده کردند که بیس فنول A باعث دژنره شدن اپی‏تلیوم زایشی می‌شود. بیس فنول A کاهش سطح هورمون تستوسترون، اختلال در اسپرماتوژنز و کم شدن لایه‏های اپی‏تلیوم زایشی را موجب می‏شود (36 و 37). بنابراین تغییر در سطح این هورمون نیز خود ممکن است دلیلی بر کاهش قطر لوله‏های منی‏ساز در بیضه موش‏های تیمار شده با بیس فنول A باشد. ROS ایجاد شده به‏وسیله بیس فنول A نیز می‏تواند باعث لیپید پراکسیداسیون اپی‏تلیوم زایشی شود و قطر لوله‏های منی‏ساز را کاهش دهد (38). کاهش در ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی در موش‏های تیماری با بیس فنول A نیز نشان دهنده کاهش تعداد سلول‏های جنسی در اپی‏تلیوم زایشی و آزاد سازی زود هنگام اسپرماتیدهای نابالغ به لومن است . BPA با آسیب زدن به ارتباطات بین سلول‏های سرتولی در مناطق ES (Ectoplasmic Specialization) منجر به بی ثباتی سد خونی- بیضه‏ای و در نهایت باعث از دست رفتن اسپرماتوسیت‏ها، اسپرماتیدها و آزاد سازی زود هنگام اسپرماتوزوآ به‏داخل لومن می‏شود (7 و 39). بنابراین احتمال می‏رود BPA از این طریق موجب کاهش ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی شده باشد .

با توجه به این که غشا پایه نیز از جنس پروتئین می‏باشد (40)، این احتمال وجود دارد که بیس فنول A با تاثیر بر روی پروتئین‏های غشا پایه باعث کاهش ضخامت آن شده باشد .

نتایج حاضر کاهش معنی‏داری را در حجم لوله‏های منی‏ساز نشان داد. در این مورد Takahashi و Oishi (41) نیز آتروفی لوله‏های منی‏ساز را در موش‏های بالغ پس از تیمار با بیس فنول A گزارش کردند که با یافته‏های مطالعه حاضر هم‏راستا است. در مطالعه حاضر حجم بیضه در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل تغییر معنی‏داری نشان نداد. احتمال دارد که دوز بیس فنول A و طول مدت تیمار در مطالعه حاضر برای القا تغییرات آناتومیکی بزرگ در بیضه موش‏ها کافی نبوده باشد. نتایج نشان داد که در پایان دوره تیمار در وزن بدن و بیضه حیوانات گروه بیس فنول A کاهشی صورت نگرفت که با مطالعات پیشین در این ارتباط سازگار است.

 تعدادی پروتئین مانند occludin ، zonula occludens-1 ، N-cadherin و connexin 43 در اتصالات بین سلولی در رده سلول‏های سرتولی وجود دارد که بیس فنول A می‏تواند منجر به کاهش بیان ژن یا تغییر جایگاه آن‏ها بر روی غشا شود (42). از این طریق به این اتصالات آسیب وارد کند و اسپرماتوژنز را دچار اختلال نماید. برخی مطالعات نیز در محیط in vitro نشان داده که BPA موجب آپوپتوز سلول‏های سرتولی می‏شود (43 و 44).

در کل با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق و نتایج دیگران می‏توان کاهش سلول‏های اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد و دراز و سرتولی را به چند دلیل مربوط دانست. 1) بر هم خوردن تعادل هورمون های جنسی 2) از آن‏جایی که سلول‏های جنسی در یک محیط تولید شده توسط سلول‏های سرتولی زندگی می‏کنند (45)، لذا با از بین رفتن سلول‏های سرتولی شرایط مناسب برای زندگی سلول‏های جنسی نیز از بین می‏رود. 3) افزایش آپوپتوزیس 4) القا استرس اکسیداتیو.

در مطالعه حاضر روغن سیاه دانه در گروه بیس فنول A + روغن سیاه دانه باعث شد که کاهش در حجم لوله‏های منی‏ساز در حد گروه کنترل بهبود یابد. همچنین قطر، ضخامت غشا پایه و ارتفاع اپی‏تلیوم زایشی لوله‏های منی‏ساز هم در گروه بیس فنول A+ روغن سیاه دانه نسبت به گروه بیس‌فنول‌آ افزایش داشت اما این تفاوت معنی‏دار نبود. این یافته با گزارشات پیشین هم سو است. نقش روغن سیاه دانه در دستگاه تولید مثلی و بنابراین در تولید مثل به‏وسیله کاهش پراکسیداسیون لیپیدی به اثبات رسیده است. این احتمال وجود دارد که روغن سیاه دانه باعث افزایش سطح گلوتاتیون و گروه‏های تیول شده و این گروه‏ها با خنثی کردن رادیکال‏های آزاد باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و استرس اکسیداتیو شوند (19 و 46).  بنابراین با توجه به مطالب ذکر شده در مورد اثرات حفاظتی روغن سیاه دانه بر بافت بیضه، دور از انتظار نیست که این روغن موجب بهبود پارامترهای فوق در مطالعه حاضر شده باشد.

 

نتیجه‏گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که بیس فنول A قادر به القا سمیت در بافت بیضه موش بالغ است و روغن سیاه دانه به‏‏عنوان یک آنتی اکسیدانت توانست اثرات نامطلوب آن را بر بافت بیضه جبران کند. با توجه به نتایج این مطالعه و مطالعات دیگران می‏توان نتیجه گرفت که اثرات نامطلوب بیس فنول A بر بافت بیضه موش بالغ عمدتا به‏دلیل القا استرس اکسیداتیو توسط این آلاینده بر بافت بیضه است. در نتیجه می‌توان پیشنهاد داد که روغن سیاه دانه را به‏عنوان یک آنتی اکسیدانت در برابر سمیت بیضوی ایجاد شده بر اثر بیس فنول A استفاده کرد.

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل پایان نامه آقای مهدی آزادپور برای اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست سلولی تکوینی از دانشکده علوم پایه دانشگاه اراک بود و با حمایت مالی حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک به انجام رسیده است. در ضمن از کمک‏های ارزشمند خانم نادری و همچنین آقای مهدی نوده فراهانی در این مطالعه صمیمانه سپاسگزاری می‏شود.

1. Neha P, Ramte jJ. Verma.Qurcetin Allevia tes BisphenolA-Induced Changes in Nucleic asid and Protein Contents  in mice. Acta poloniae Pharmaceutica- Drug Research. 2011; 6: 867-873.

2. Kenichi K, Muneyuki M, Rui-Sheng W, et al. Effects of in Utero and Lactational Exposure to Bisphenol A on Somatic Growth and Anogenital Distance in F1 Rat Offspring .Industrial Health. 2002; 40: 375-381.

3. Murmu S, ShrivastavaVK. Protective Action of an Anti-oxidant (Vitamin-C) Against Bisphenol-toxicity in Cirrhinus mrigala(Ham.).Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 2011; 11: 25-29.

4. Vandenberg LN, Colborn T, Hayes TB, Heindel JJ, et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses Endocr Rev. 2012; 33(3): 378-455.

5. Welshons WV, Nagel SC, Vom Saal FS. Large effecys from small exposures. Endocrine mechanisms mediating effects of bisphenol A at levels of human exposure Endocrine. suppl . 2006; 6 :56-69.

6. Okada A, Kai O. Effect of estradiol – 17 beta and bisphenol A administred chronically to mice trought pregnancy and lactation on the male pup,s reproductive system . Asian Journ of Andrology . 2008; 4: 271-276.

7. Toyama Y, Yuassa S. Effects of bneonatal administration of 17 beta estradiol , beta estradiol 3 benzoate or BPAon mouse and rat spermatogenesis . Reprod Toxicol . 2004; 2: 181-188.

8. Markey CM, Luque EH, Munoz DM, Sonnenschein C, et al. In utero exposure to bisphenol A alters the development and tissue organization of the mouse mammary gland. Biol Reprod. 2001; 65(4): 1215–1223.

9. Aydoğan M, Korkmaz A, Barlas N, Kolankaya D. Pro-oxidant effect of vitamin C coadministration with bisphenol A, nonylphenol, and octylphenol on the reproductive tract of male rats. 2010; 33(2): 193-203.

10. Hassan Z, Elobeid MA, Virk P, Omer SA, et al. Bisphenol A Induces Hepatotoxicity through Oxidative Stress in Rat Model. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2012; 1 :1-6.

11. Sutiakova I, Kovalkovicova N, Tulenkova M, Sutiak V. Bisphenol A and ITS Potential Toxic effects on living Organisms. Journal of Microbiology,Biotechnology and Food Sciences. 2012; 2(2): 526-535.

12. Nadkarni K. Crocus sativus, Nigella sativa. In: Nadkarni KM editor. Indian materia medica. Bombay, India: Popular Prakashan. 1976; 386–411.

13. El-Dakhakhny M. Studies on the Egyptian Nigella sativa L: IV. Some pharmacological properties of the seeds’ active principle in comparison to its dihydro compound and its polymer. Arzneimittelforschung. 1965; 15(10): 1227-1229.

14. Morikawa T, Xu F, Kashima Y, Matsuda H, et al. Novel dolabellanetype diterpene alkaloidswith lipid metabolism promoting activities from the seeds of Nigella sativa. Org Lett. 2004a; 6: 869-872.

15. Morikawa T, Xu F, Ninomiya K, Matsuda H, et al. Nigellamines A3, A4, A5, and C, new dolabellane-type diterpene alkaloids, with lipid metabolism-promoting activities from the Egyptian medicinal food black cumin. Chem Pharm Bull. 2004b; 52: 494-497.

16. Smsamshariat H. Herb and natural remedies Isfahan : Mashal publ Inst.1988; 544-547.

17. Osama A, Badary OA, Ashraf B, Abdel-Naim, et al. The influence of thymoquinone on doxorubicin – induced hyperlipidemic nephropathy in rats. Toxicology. 2000; 143: 219-226.

18. Salem ML. Immunomodulatory and therapeutic properties of the Nigella sativa L. seed. Int Immunopharmacol. 2005; 5(13-14) : 1749-1770.

19. Bashandy S. Effect of Fixed Oil of Nigella Sativa on Male Fertility in Normal and Hyperlipidemic Rats.

 

International Journal of Pharmacology. 2007; 3(1): 27-33.

20. Mohammad MA, Mohamad M, Dradka H. Effects of Black Seeds (Nigella Sativa) on Spermatogenesis and Fertility of Male Albino Rats. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 2009; 4(2): 386-390.

21. Tawfeek FKH, Ahmed SM, Kakel SJ. Effect of Nigella sativa Oil Treatment on the Sex organs and Sperm Charactors in Rats Exposed to Hydrogen Peroxide. Mesopotamia J. of Agric. 2006; 34(1):1-7.

22. Takahashi O, Oishi S. Testicular toxicity of dietarily or parenterally administered bisphenol A in rats and mice. Food and Chemical Toxicology. 2003; 41(7): 1035-1044.

23. Begum NA, Dewan ZF, Nafar N, Mamun MI. Effect of n-Hexane extract  of nigella sativa on gentamicin induced nephrotoxicity in rat . Bangladesh J pharmacol. 2006; 1: 16-20.

24. Kluin P, Kramer M, de Rooij D. Spermatogenesis in the Immature Mouse Proceeds Faster Than in the Adult. Int J Androl. 1982; 5(3): 282-294.

25. Mandarim-de-Lacerda CA. Stereological tools in biomedical research. An Acad Bras Cienc. 2003; 75(4): 469-486.

26. Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol Pathol. 2002; 30(4): 524-533.

27. Mouton PR. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. Baltimore: The Johns Hopkins University Press; 2002: 103-105.

28. Soleimani Mehranjani M, Noorafshan A, Momeni HR, Abnosi MH, et al. Stereological study of the effects of vitamin E on testis structure in rats treated with paranonylphenol. Asian J Androl. 2009; 11(4): 508-516.

29. Dalgaard M, Pilegaard K, Ladefoged O. In utero exposure to diethylstilboestrol or 4-n-nonylphenol in rats: number of sertoli cells, diameter and length of seminiferous tubules estimated by stereological methods. Pharmacol Toxicol. 2002; 90(2): 59-65.

30. Ferrando RE, Nyengaard JR, Hays SR, Fahy JV, et al. Applying stereology to measure thickness of the basement membrane zone in bronchial biopsy specimens. J Allergy Clin Immunol. 2003; 112(6): 1243-1245.

31. Peng B, Zhang RD, Dai XS, Deng XZ, et al. Quantitative (stereological) study of the effects of vasectomy on spermatogenesis in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Reproduction. 2002; 124(6): 847-56.

32.Chitra KC, Latchoumycandane  C, Mathur PP. Induction of oxidative stress by bisphenol A in the epididymal sperm of rats. 2003; 185: 119–127.

33.Elshaari FA, Fatum AE, Sheriff DS. Spermatozoa-an unique representation of Oxygen-Antioxidant paradox. Acta Medica Medianae. 2010; 49(1): 48-53

34. Atsushi Ok, Osamu K. Effects of estradiol-١٧β and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups’ reproductive system. Asian Journal of Andrology. 2008; 10: 271–276.

35. Tan B, Kassim N, Mohd M. Assessment of Pubertal Development in Juvenile Male Rats after Sub-Acute Exposure to Bisphenol a and Nonylphenol. Toxicology Letters. 2003; 143(3): 261-270.

36.Gurmeet K, Rosnah I, Normadiah MK, Das S, et al. Detrimental Effects of Bisphenol A on Development and Functions of The Male Reproductive System in Experimental Rats. EXCLI Journal. 2014; 13: 151-160.

37. Jin P, Wang X, Chang F. Low dose bisphenol A impairs spermatogenesis by suppressing reproductive hormone production and promoting germ cell apoptosis in adult rats. Journal of Biomedical Research. 2012; 27(2): 135-144.

38.Sharma P, Kalita JC. Estrogenic Effects of Bisphenol-A and Octylphenol on Reproductive Health of Male Albino mice. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives. 2013; 4(1): 188-194.

39. Anahara R, Yoshida M, Toyama Y, Maekawa M, et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, Bisphenol A, and diethylstilbestrol decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. Histol. Cytol. 2006; 69(2): 101–107.

40. Paulsson M. Basement membrane proteins: Structure, assembly and cellular interactions. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992; 27(1-2): 93-127.

41.Takahashi O, Oishi S. Testicular toxicity of dietarily 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane (bisphenol A) in F344 rats. Developmental toxicology. 2001;75(1): 42-51.

42. Wetherill Y, Akingbemi B, Kanno J, Mclachlan J. In Vitromolecular Mechanisms of Bisphenol a Action. Reproductive Toxicology. 2007; 24(2): 178-198.

43.Hughes PJ, McLellan H, Lowes DA, Kahn SZ, et al. Estrogenic alkylphenols induce cell death by inhibiting testis endoplasmic reticulum Ca(2þ) pumps. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 277: 568–574.

44. Iida H, Maehara K, Doiguchi M, M ori T, et al. Bisphenol Ainduced apoptosis of cultured rat Sertoli cells. Reprod. Toxicol. 2003; 17: 457–464.

45. Boekelheide K, Fleming SL, Johnson KJ, Patel SR, et al. Role of Sertoli cells in injury-associated testicular germ cell apoptosis. Proc Soc Exp Biol Med. 2000; 225: 105-115.

46. Burits M, Bucar F. Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil. Phytother Res. 2000; 14(5): 323-328.