مطالعه تجربی اعمال متقابل بین بافت بلاستما با ماتریکس سه بعدی مشتق شده از بافت استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی گاو در شرایط in vitro

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش فیزیکی، می‏تواند کنترل کننده رفتارهای سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت سلولی نیز باشد. مطالعه رفتار سلولی در ماتریکس های سه بُعدی می‏تواند از نظر بُعد، معماری و قطبیت سلولی ریز محیطی مشابه با شرایط in vivo فراهم کند. در اینجا از ماتریکس خارج سلولی مشتق شده از استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی گاو به عنوان بستری سه بُعدی برای مطالعه مهاجرت و قطبیت سلول‏های بافت بلاستمایی استفاده گردید.
مواد و روش‏ها: برای حذف سلول‏ها از ماتریکس خارج سلولی، از روش فیزیکی و شیمیایی سلول زدایی شامل فریز- ذوب  سریع و شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده گردید. سپس ماتریکس های سه بُعدی تهیه شده با حلقه بافت بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی در شرایط in vitro، در روز های مختلف کشت داده شد.
نتایج: با استفاده از رنگ آمیزی‏های بافتی، حذف سلول‏ها از بافت تائید شد. آنچه که بعد از کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اتفاق افتاد، چسبندگی، قطبیت و مهاجرت سلول‏های بافت بلاستما در این ماتریکس بود.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان می‏دهد کشت بافت بلاستما که دارای سلول‏های پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد، می‏تواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایط in vitro فراهم نماید.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                             مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

      جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 62-53

 

مطالعه تجربی اعمال متقابل بین بافت بلاستما با ماتریکس سه بعدی مشتق شده از بافت استخوان اسفنجی

 و غضروف مفصلی گاو در شرایط in vitro

 

امین توسلی. M.Sc1، فهیمه شهابی پور M.Sc.1، ناصر مهدوی شهریPh.D. 1و2 مریم مقدم متین. Ph.D1و2،

مسعود فریدونی. Ph.D 1

 

1- دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2- دانشگاه فردوسی مشهد، پژوهشکده فناوری زیستی، گروه سلولی و مولکولی

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: mahdavin@um.ac.ir

تاریخ دریافت: 27/10/ 1389                               تاریخ پذیرش: 20/1/1390

 


چکیده

هدف: ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش فیزیکی، می‏تواند کنترل کننده رفتارهای سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت سلولی نیز باشد. مطالعه رفتار سلولی در ماتریکس های سه بُعدی می‏تواند از نظر بُعد، معماری و قطبیت سلولی ریز محیطی مشابه با شرایط in vivo فراهم کند. در اینجا از ماتریکس خارج سلولی مشتق شده از استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی گاو به عنوان بستری سه بُعدی برای مطالعه مهاجرت و قطبیت سلول‏های بافت بلاستمایی استفاده گردید.

مواد و روش‏ها: برای حذف سلول‏ها از ماتریکس خارج سلولی، از روش فیزیکی و شیمیایی سلول زدایی شامل فریز- ذوب  سریع و شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده گردید. سپس ماتریکس های سه بُعدی تهیه شده با حلقه بافت بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی در شرایط in vitro، در روز های مختلف کشت داده شد.

نتایج: با استفاده از رنگ آمیزی‏های بافتی، حذف سلول‏ها از بافت تائید شد. آنچه که بعد از کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اتفاق افتاد، چسبندگی، قطبیت و مهاجرت سلول‏های بافت بلاستما در این ماتریکس بود.

نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان می‏دهد کشت بافت بلاستما که دارای سلول‏های پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد، می‏تواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایط in vitro فراهم نماید.

واژگان کلیدی: ماتریکس خارج سلولی، غضروف مفصلی، سدیم دودسیل سولفات، قطبیت سلولی

 

 

 

 

 


مقدمه

در بافت‏های پستانداران، سلول ها فقط با یکدیگر در ارتباط نیستند، بلکه با یک ساختار حامی بنام ماتریکس خارج سلولی (Extracellular matrix) نیز در ارتباط می‏باشند(1). ECM شامل ترکیبات مختلفی از جمله پروتئین‏های کلاژن،           پلی ساکارید هیالورونان، پروتئوگلیکان‏ها و همچنین پروتئین‏های چسبنده‏ای می‏باشد که به پروتئین‏های گیرنده سطح سلولی و سایر اجزای ماتریکس چسبیده و به ماتریکس قدرت و استحکام می‏بخشند. سلول‏های هر بافت قادر به برهم کنش با ECM اطراف خود می باشند و این برهم کنش بین ECM و سلول‏های یک بافت در جهت گیری و رفتار سلول ها نقش اساسی بازی می‏کند. بر هم کنش سلول های بافت با ECM، علاوه بر فراهم نمودن ساختار سه بعدی (3D) مناسب، مسیرهای پیام رسانی را برای رفتارهای سلولی از قبیل چسبندگی، مهاجرت، تمایز و تکثیر سلولی فراهم می سازد که این برای فرآیندهایی از قبیل، تکوین بافت، ترمیم زخم، پاسخ های ایمنی و پیشبرد سرطان مهم است (2). برای مطالعه فرآیندهای بیولوژیکی فوق نیاز به بررسی سلول ها در شرایط in vitro است اما رشد سلول‏ها بر روی محیط دو بعدی (2D) ظرف کشت از نظر مورفولوژی، بر هم کنش سلول ـ سلول و سلول ـ ماتریکس و رشد فیزیولوژیکی و طبیعی با محیط in vivo سه بعدی بافت تفاوت هایی دارد (3-4). بنابراین استفاده از مدل 3D بهتر می‏تواند ریز محیط‏های بافت های زنده را جهت بررسی رفتارهای سلولی تداعی کند. تا کنون داربست های 3D بی‏شماری به عنوان جانشین‏های ECM جهت مطالعه رفتار و برهم کنش سلولی مورد استفاده قرار گرفته‏اند. این داربست‏ها متشکل از مولکول‏های طبیعی و یا پلیمرهای سنتزی می باشند، اما آن‏ها نقص‏هایی از جمله خاصیت هیدروفیلیسیته پائین، عدم اجازه کنترل چسبندگی سلول‏ها، معماری مصنوعی بافت داربستی و عدم کنترل سختی مکانیکی دارند (5).

همانطورکه می‏دانیم بافت های موجودات زنده از سلول‏های هسته‏دار در یک ECM فشرده که تشکیل شبکه ای 3D از مولکول‏های الیافی را داده اند تشکیل شده است (6و7). لذا می‏توان از ECM بافت‏های موجودات زنده جهت بررسی رفتار سلول‏ها در هنگام برهم کنش با آن در شرایط in vitro استفاده کرد. برای این کار از روش های سلول زدایی جهت حذف تاثیر سلول‏های بافت از ECM می‏توان بهره برد، تا در نهایت تنها ECM از بافت باقی بماند و بتوان از آن به عنوان داربست استفاده نمود (8، 9، 10و 11)

بجز سوبسترا، تعیین نوع منبع سلولی نیز نقش مهمی در مطالعه رفتار سلول‏ها در هنگام برهم کنش با سوبسترا دارد، و معمولاً منبع سلول‏هایی که جهت بررسی رفتارهای سلولی استفاده می‏شود سلول‏های فیبروبلاستی، بنیادی و یا سرطانی می‏باشند (8-11). اما برای شبیه سازی هر چه بیشتر شرایط حاکم بر سلول‏ها در شرایط in vivo می‏توان از کشت بافت‏های پویا مانند بافت‏هایی که در پدیده ترمیم در جانوران پرسلولی نقش دارند، استفاده نمود. مطالعات نشان داده است، طی روند ترمیم، بافتی به نام بلاستما که دارای سلول‏هایی با قابلیت تکثیر و تمایز، مشابه سلول های جنینی تشکیل می‏شود و قادرند در شرایط   in vivo به انواعی از سلول‏های تخصص یافته تمایز یابند    (12-14). یکی از بهترین مثال‏های تشکیل بافت بلاستما در پستانداران، جایگزینی همه بافت‏ها پس از ایجاد سوراخ در لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی است (15-17).

هدف از انجام این تحقیق در مرحله اول، تهیه داربست‏های 3D مشتق شده از ECM استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی استخوان ران گاو بود. برای این کار از سلول‏زدایی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اپی‏فیز ران گاو به منظور تهیه داربست ECM استفاده گردید. در بخش دوم این تحقیق، بر هم کنش بین ECM های 3D تهیه شده، با بافت بلاستمای حاصل از لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش ها

آماده سازی داربست سه بعدی مشتق شده از ECM: ابتدا استخوان طویل ران گاو بلافاصله پس از قربانی شدن تهیه شد. سپس از غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی اپی فیز ران گاو قطعات استوانه ای شکلی به قطر 2 میلی‏متر جدا گردید. نمونه های حاصل توسط سرم فیزیولوژی شستشو شده و سپس در دمای 4- درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند، تا مرحله فیزیکی سلول زدایی آغاز گردد. سپس نمونه ها از فریزر خارج گشته و بعد از ذوب شدن در دمای آزمایشگاه، با سرم فیزیولوژی نمونه‏ها چند بار شستشو داده شدند. در مرحله بعد جهت              snap freezing (فریز کردن آنی) به مدت 2 دقیقه در ازت مایع قرار گرفت و سپس بمدت 10 دقیقه در سرم فیزیولوژی با دمای 37 درجه سانتی‏گراد ذوب گردید. این مرحله 5 مرتبه تکرار شد و با بافر فسفات (PBS) شستشو داده شد. مرحله بعد، روش شیمیایی سلول زدایی بود. بطوریکه ابتدا نمونه ها بمدت 3 ساعت با شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS, Merck) 5/2 درصد به آرامی هم زده شدند. در انتها نمونه‏ها با بافر PBS بمدت نیم ساعت شستشو گردید.

جهت استریل کردن و پاک کردن SDS از روی نمونه ها، داربست ها آماده شده توسط قیف مولی پر استریل در سه مرحله استریل و سم زدایی گردید. برای این کار ابتدا توسط الکل 75 درصد نمونه ها شستشو داده شدند، سپس برای از بین رفتن اثر الکل 75 درصد از آب مقطر استریل استفاده گردید. نمونه‏ها در مرحله بعد توسط سرم فیزیولوژی نیز استریل شدند تا اثر آب مقطر بر روی داربست‏ها باقی نماند. در آخرین مرحله نمونه‏ها به              مدت 10 دقیقه در محیط کشت DMEM                        (Dulbecco’s modified Eagle medium, Gibco)      همراه با 15درصد سرم جنینی گاو FBS                                     (Fetal bovine serum, biosera) در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد با CO2 5 درصد قرار گرفتند.

 

تهیه بافت بلاستما: در اجرای این پژوهش جهت تهیه حلقه بلاستما از لاله گوش خرگوش سفید نژاد نیوزلندی جنس نر   8-6 ماهه و با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه واکسن و سرم سازی رازی مشهد تهیه گشته بود، استفاده گردید. جهت تهیه حلقه ایی از بافت بلاستما، ابتدا با استفاده از کرم موبر موهای سطح پشتی و شکمی لاله گوش حذف گردید. و بعد از بی حسی موضعی لاله گوش توسط محلول لیدوکائین 10درصد، سوراخ‏هایی با قطر 2 میلی‏متر با پانچر مخصوص انجام گرفت، موقعیت سوراخ ها با توجه به سیستم عروقی موجود بر روی لاله گوش، بین شریان مرکزی و وریدهای محیطی قسمت میانی گوش انتخاب شدند. بعد از دو روز، پانچ دوم در اطراف سوراخ‏های پانچ شده اول با قطر 4 میلی‏متر انجام گرفت تا حلقه بلاستما از لاله گوش جدا گردد. بعد از جداسازی حلقه بلاستما، جهت آلودگی زدایی 7 بار با سرم فیزیولوژی استریل در زیر هود لامینار شستشو داده شد تا آماده ورود به محیط کشت گردد.

 

مونتاژ داربست  ECM با بافت بلاستما: بعد از تهیه و آلودگی‏زدایی ECM و بافت بلاستما، داربست‏های ECM با بافت بلاستما مونتاژ شده و کشت داده شدند. برای این کار هر یک از داربست های ECM غضروفی و استخوان اسفنجی در میان حلقه بافت بلاستما در شرایط استریل مونتاژ گشت و در ظروف شش خانه‏ای کشت قرار گرفتند و در هر خانه ظرف کشت میزان 2 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM همراه با 15 درصد FBS و µl 100 آنتی‏بیوتیک پنی‏سیلین/ استرپتومایسین ریخته شد، سپس به انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد با CO2 5 درصد منتقل گردید. نمونه ها در 4، 10، 20 و 30 روز بعد از کشت مورد بررسی قرار گرفتند. 

 

مطالعات بافت شناسی: بعد از فیکس کردن، آب گیری و قالب گیری با پارافین برش‏هایی با قطر 7 میکرون صورت گرفت. جهت رنگ آمیزی ابتدا برش‏ها دِپارافینه و آب‏دهی شد. سپس با رنگ‏های هماتوکسیلین- ائوزین (H&E)، آبی تولوئیدین، پیکروفوشین و پیکروسیروس رِد رنگ آمیزی گردید. از رنگ آمیزی H&E جهت نشان دادن سلول زدایی از بافت‏های غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی و همچنین بررسی برهم کنش با بافت بلاستما استفاده گردید. رنگ آبی تولوئیدین برای نشان دادن محتوی پروتئوگلیکان‏های ECM غضروف مفصلی استفاده شد. همچنین پیکروسیروس رِد بعنوان رنگ اختصاصی برای تعیین محتوای کلاژن داربست‏های ECM مورد استفاده قرار گرفت.

 

نتایج

نتایج حاصل از این تحقیق، در دو بخش نتایج تهیه داربست ECM، مشتق شده از غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی استخوان ران گاو و همچنین بررسی برهم کنش بین ماتریکس‏های تهیه شده با بافت بلاستمایی در شرایط in vitro ارائه می گردد.

 

سلول زدایی از بافت غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی:

پس از انجام فرایند سلول زدایی، تصویر ماکروسکوپی وجود خلل و فرج در ماتریکس استخوان اسفنجی را نشان می‏دهد، همچنین بافت سلول زدایی شده غضروف مفصلی نیز در تصویر B شکل 1 نشان داده شده است (شکل 1).

مطالعه سلول زدایی غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی توسط رنگ آمیزی H&E نشان می‏دهد که نمونه‏های تحت تیمار سلول زدایی نسبت به نمونه کنترل کاملاً فاقد سلول شده است (شکل‏های 2 و 3). رنگ آمیزی پیکروسیروس رِد که جهت ارزیابی کیفی کلاژن بافت‏ها بکار می‏رود و توسط میکروسکوپ پلاریزان عکس‏برداری شده، نشان می‏دهد فیبریل‏های کلاژن در بعد از فرآیند سلول زدایی در ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی حفظ شده است.

رنگ آبی تولوئیدین با رنگ آمیزی پروتئوگلیکان‏ها و گلیکوزآمینوگلیکان‏های ECM بافت غضروف مفصلی نشان می‏دهد در قبل و بعد از سلول زدایی این ترکیبات حفظ شده است (شکل 3، C و D).

بررسی برهم کنش بین داربست ECM با بافت بلاستما:

بعد از مونتاژ ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی در درون حلقه بلاستمایی  و قرار گیری در محیط کشت در روزهای4، 10، 20 و 30 بعد از کشت، ناحیه دارای هم بافت بلاستمایی و هم ECM که ایجاد بر  هم کنش در آن فسمت امکان‏پذیر بود، مورد بررسی قرار گرفت (شکل‏های 4، 5، 6 و 7).

 

 

 

شکل 1. تصویر ماکروسکوپی از ماتریکس سه بعدی تهیه شده از ECM استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی سلول زدایی شده. A) پس از فرایند سلول زدایی، خلل و فرج فراوان در داربست استخوانی کاملا مشخص می باشند. B) بافت غضروف مفصلی پس از سلول زدایی. (دید استرمیکروسکوپ، درشتنمایی 10X)

 

 

 

 

شکل2. نمونه استخوان اسفنجی کنترل و سلول زدایی شده. A) بافت سلول دار استخوان اسفنجی به همراه سلول های استئوبلاست پراکنده شده در سطح ترابکولا و سلول های مغز استخوان در فضاهای بین تیغه های ترابکولا (درشتنمایی 40X).  (B بافت سلول زدایی شده استخوان اسفنجی با رنگ آمیزی H&E (درشتنمایی 40X). C) بافت سلول دار استخوان اسفنجی به همراه رشته های کلاژن در رنگ آمیزی با پیکروسیروس رِد (درشتنمایی (100X.  (Dبافت سلول زدایی شده که دارای رشته های کلاژن باقی مانده پس از فرایند سلول زدایی می باشد (درشتنمایی (100X.

 

 

شکل3. نمونه های غضروف مفصلی کنترل و سلول زدایی شده. A) رنگ آمیزی H&E نشان می دهد در غضروف مفصلی کندروسیت ها در ماتریکس غضروف بصورت پراکنده وجود دارند. B) نمونه سلول زدایی شده، خالی کندروسیت ها مشخص است. C) نمایی کلی از بافت غضروف مفصلی با رنگ آمیزی آبی تولوئیدین. D) عدم تغییر رنگ ماتریکس لاجوردی نشان دهنده عدم از دست رفتن پروتئوگلیکان های ماتریکس غضروف است. E) تصویر بافت غضروفی با میکروسکوپ پلاریزان. F) رنگ قرمز آجری و درخشنده نشان دهنده پیکروسیروس رد که توسط میکروسکوپ پلاریزان گرفنه شده است، وجود فیبریل های کلاژن در ماتریکس غضروف بعد از سلول زدایی می باشد (درشتنمایی 100X).

 

 

 

 

 

شکل4.  مطالعه برهم کنش بین بافت بلاستمایی و داربست استخوان اسفنجی در روز دهم پس از کشت. A) رنگ آمیزی H&E، چسبندگی برخی از سلول های بافت بلاستمایی را در اطراف تیغه های ترابکولا قابل مشاهده است که با فلش ها نشان داده شده اند (درشتنمایی (100X.  (Bپیکان‏ها نشان دهنده شروع هجوم سلول ها از بافت بلاستمایی به داربست استخوانی می باشد (درشتنمایی (100X.

 

 

 

شکل5.  مطالعه برهم کنش بین بافت بلاستمایی و ECM استخوان اسفنجی در روز بیستم پس از کشت. A) نفوذ بیشتر سلول ها به داخل داربست استخوان اسفنجی نشان داده شده است (درشتنمایی (100X.  (B چسبندگی تعدادی از سلول ها در حاشیه ترابکولای استخوانی قابل مشاهده است (درشتنمایی (400X. C). تصویر بزرگ شده B، فلش ها دو سلول چسبیده به تیغه ترابکولای بافت استخوانی که دارای قطبیت هستند را نشان می دهند (درشتنمایی .(1000X

 

شکل 6. مقطع عرضی از حلقه بلاستما با ECM غضروفی (بزرگنمایی 40X). در شکل A تخریب بافت ECM با فلش مشخص شده است (درشتنمایی 200X). در شکل B عده ایی از سلول ها نفوذ کرده اند در حالی که یک سلول به حاشیه ECM متصل شده است (درشتنمایی 400X). شکل C تشکیل استطاله های سیتوپلاسمی و هجوم سلول ها را از بافت بلاستما به داخل ECM غضروفی نشان می دهد (درشتنمایی 1000X).

 

شکل 7. نمایش نفوذ سلول های بلاستمایی به درون بافت ECM غضروفی در روز های 20 و 30 بعد از کشت. در شکل A و B نمایی کلی از توده سلول های در حال نفوذ به ECM غضروفی در روز 20 بعد از کشت قابل مشاهده می باشد (درشتننمایی A 40X و B درشتنمایی 200X). در شکل C مسیر نفوذ سلول ها از بافت بلاستمایی در ECM غضروفی و شکاف ایجاد شده در روز 30 بعد از کشت قابل مشاهده می باشد (درشتنمایی 100X). در بزرگ نمایی بیشتر آثار سلول های تخریب شده در میان شکاف ایجاد شده مشاهده می شود (تصویر D، درشتنمایی 200X).   

 

 

بحث 

همانطوریکه می‏دانیم هر بافت شامل دو جزء سلول ها و ECM است، پس در تهیه ماتریکس های مشتق شده از ECM، عمل اصلی برداشتن سلول‏ها از بافت و باقی ماندن ECM است. ماتریکس‏های ECM شامل مولکول‏های عملکردی و ساختاری ترشح شده توسط سلول‏های هر بافت و اندام است، بنابراین ترکیب بندی و توزیع ترکیبات ECM به منبع بافت بستگی دارد. ECM که ماده تشکیل دهنده این داربست‏هاست از انواعی از بافت‏ها من جمله دریچه‏های قلبی، رگ‏های خونی، پوست، لایه زیر موکوسی روده کوچک (SIS)، مثانه، تاندون و لیگامندها مشتق شده است (18).

در این پژوهش ابتدا لازم بود با عملیات سلول‏زدایی داربستی مشتق شده از ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی گاو بدست آید. لذا از دو روش فیزیکی و شیمیایی برای این کار استفاده شد. برای انجام مرحله فیزیکی سلول زدایی، ابتدا نمونه‏ها در فریزر 4- درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. استلال این کار این بود که بیشتر حجم سلول‏ها از آب تشکیل شده است و به این دلیل که تشکیل بزرگترین کریستال‏های یخ در این دما صورت می‏گیرد، غشاء سلول‏ها (چه غشاء سیتوپلاسمی و چه غشاء های داخلی) بر اثر ایجاد این کریستال‏های حجیم یخ می‏ترکد. بنابراین می‏توان انتظار داشت که در این دما، تمامی سلول‏ها با قرار گرفتن متناوب، دچار تغییر و تخریب در غشاء هایشان می شوند. 

سپس با قرار دادن نمونه‏ها در ازت مایع، باعث تخریب هر چه بیشتر غشاءها و خارج شدن محتویات اندامک‏های سلولی و همچنین آسیب به پروتئین‏های سلولی می‏گردد. البته بدلیل ساختار فیبری و محکم پروتئین‏های ECM می‏توان انتظار داشت که تاثیر این تغییرات دمای روی ECM بسیار ناچیز باشد (8).

در پروژه حاضر از SDS بعنوان ماده سلول زدا در مرحله شیمیایی سلول زدایی استفاده شد. از این رو  مطالعات انجام گرفته نشان می‏دهد که شوینده یونی SDS بهترین ماده شیمیایی سلول زدا برای بافت‏های مختلف می‏باشد. مطالعات بافت‏شناسی و ارزیابی تست‏های مکانیکی مشخص کرده است که در غلظت‏های 2 درصد تا 3 درصد از این ماده، بهترین نتایج سلول زدایی مشاهده می‏گردد. از طرفی غلظت‏های بیشتر SDS باعث حذف پروتئوگلیکان‏ها از ماتریکس غضروفی می‏شود. SDS با توجه به ساختار دوگانه دوستش (دارای یک سر آنیونی آب دوست و یک دم دوازده کربنه اشباع آب گریز) می‏تواند با غشاء‏های سلولی بر هم کنش داده و سبب لیز شدن غشاء سلولی و غشاء هسته گردد (19). همچنین SDS در سلول‏ها باعث unfold شدن پروتیئن‏های سلولی و بدین ترتیب از بین رفتن آن‏ها می‏گردد (20). در تحقیق حاضر رنگ آمیزی های اختصاصی از قبیل آبی تولوئیدین، نشان دهنده حفظ پروتئوگلیکان های ECM غضروف و پیکروسیروس رِد که جهت ارزیابی کیفی کلاژن ECM غضروف و استخوان اسفنجی است، حاکی از حفظ ترکیب ECM در قبل و بعد از فرآیند سلول زدایی است (شکل های 2 و 3).

در حالت طبیعی بعد از پانچ گوش خرگوش، رشد اپی تلیوم گوش خرگوش نژاد نیوزلندی بصورت رشد بطرف مرکز می باشد (16) و این باعث ترمیم سوراخ ایجاد شده در گوش خرگوش در شرایط in vivo می گردد. در اینجا از این خاصیت در لاله گوش خرگوش استفاده شد و بعد از قرار دادن در مجاورت داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی در بین حلقه بافت حلقه بلاستمایی، برهم کنش آن ها در روزهای مختلف بررسی گشت.

مطالعه در روز چهارم بعد از کشت نشان داد که در آن روز هیچ سلولی به داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی نفوذ نکرده است (شکل نشان داده نشده است). اما در روز دهم بعد از کشت، قرار گرفتن سلول هایی در مرز بین بافت بلاستما و داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی نفوذ سلول های بافت بلاستما، مشهود بود. همچنین در این روز سلول های بافت بلاستما با ایجاد استطاله هایی سعی در تخریب داربست ECM غضروف مفصلی و نفوذ به آن را داشتند. (شکل 6). اما سوال این است که چه عاملی سبب تخریب داربست در هنگام نفوذ سلول ها به آن می شود. طبق مطالعات انجام شده بر روی سلول های توموری در حال تهاجم، یکی از دلایل تخریب ECM در هنگام مهاجرت سلول‏ها، متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) هستند. جالب این جاست که یکی از فاکتورهای لازم  در فعال کردن MMPs، پاهای کاذب تهاجمی (invadopodia) در سلول‏های توموری است. در حقیقت بیان MMPs در سلول‏های توموری و همچنین سلول‏های استرومایی اطراف تومور برای متاستاز و تهاجم توموری لازم هستند (21). علاوه بر این سلول‏های بافت بلاستما در داربست  ECM  استخوان اسفنجی بیشتر به حاشیه ترابکولارها متصلند (شکل 4).

روز 20ام بعد از کشت با تخریب و نفوذ بیشتری از سلول‏های بافت بلاستمایی در درون داربستECM  غضروف مفصلی همراه است. نکته قابل توجه در این روز تشکیل توده‏های سلولی در درون داربست است (شکل 7). همانطوری که اشاره شد بر اثر تاثیر سلول‏های بافت بلاستما داربست غضروفی تخریب شده است اما مطالعات Reing و همکاران در سال 2009 نشان می‏دهد که محصولات تخریب داربست نیز دارای فعالیت کموتاکتیکی و میتوژنیک برای سلول های پیش ساز چند توان هستند. بنابراین همانطوریکه بافت بلاستما باعث تخریب داربست غضروفی می‏گردد، تجزیه داربست نیز می تواند عاملی برای تکثیر سلول‏های بافت بلاستما گردد (22). در این روز تغییر شکل سلول‏های بافت بلاستما و کشیده شدن آن‏ها در حالت چسبیده به تیغه‏های استخوان اسفنجی نیز اهمیت دارد (شکل 5). تحقیقات نشان داده است که حرکت سلول‏ها توسط گرادیانی از پیام‏های شیمیایی هدایت می‏شود و از طرفی دیگر برهم کنش‏های فیزیکی بین سلول و سوبسترا نیز در این نوع حرکت می‏توانند نقش داشته باشند. از طرفی طی فرایند استخوان سازی داخل غضروفی، سلول‏های استئوبلاست با آرایشی ردیفی و منظم در اطراف تیغه های استخوانی قرار می‏گیرند (23). در این تحقیق هم در روزهای 10 و 20 پس از کشت آرایش ردیفی سلول ها در اطراف تیغه‏های استخوانی مشاهده گردید که شروع فرایند احتمالی استخوان سازی می‏باشد (شکل های 4 و 5) .  

در روز 30ام بعد از کشت عملاً سلول‏ها وارد شده به داربست بسیار کم هستند و یا حداقل سلول‏ها کاملاً مورفولوژی روزهای 10ام و 20ام را از دست داده‏اند (شکل 7، C و D). این امکان وجود دارد در این روز، سلول‏های بافت بلاستمایی توانایی زیست خود را از دست داده باشند. اما حرکت سلول‏های بافت بلاستما در روز سی‏ام پس از کشت به داربست استخوان اسفنجی بیشتر بوده و همزمان این سلول‏ها چسبندگی به اطراف تیغه‏های ترابکولا را نیز نشان دادند (شکل نشان داده نشده است).

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از بخش اول این تحقیق، یعنی بحث سلول زدایی و تشکیل داربست 3D از ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی گاو نه تنها می‏تواند سوبسترایی 3D جهت بررسی رفتار سلولی باشد، بلکه می‏تواند آغازی در جهت خلق بافت‏های جایگزین غیر ایمنوژنیک در مهندسی بافت باشد. همچنین در بخش دوم این تحقیق نشان داده شد، استفاده از بافت بلاستما که در هنگام زخم در برخی از موجودات تشکیل می‏گردد و دارای ویژگی های سلول‏های جنینی است، می‏تواند در بررسی رفتار سلول‏ها در شرایط مختلف بافتی، مدل مناسبی باشد. بطوریکه در این تحقیق رفتارهایی همچون چسبندگی، تکثیر، قطبیت و حتی مرگ سلولی قابل مشاهده بود.

 

تشکر و قدردانی

پژوهشگران بر خود لازم می‏دانند مراتب سپاس و امتنان خود را از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد بخاطر تامین بخشی از هزینه‏های این تحقیق که از محل گرانت پژوهشی مربوط به فرم شماره 2 بنام "مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربست‏های سه بعدی ( Bioscaffoldیا (3D matrix به منظور کاربرد در مهندسی بافت" فراهم گردیده ابراز نماید.

 

1.   Yamada KM, Cukierman E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 2007 Aug 24;130(4):601-10.

2.   Even-Ram S, Yamada KM. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 2005 Oct;17(5):524-32.

3.   Birgersdotter A, Sandberg R, Ernberg I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Semin Cancer Biol. 2005 Oct;15(5):405-12.

4.   Nelson CM, Bissell MJ. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 2006;22:287-309.

5.   Kim BS, Mooney DJ. Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering. Trends Biotechnol. 1998 May;16(5):224-30.

6.   Holmbeck K, Szabova L. Aspects of extracellular matrix remodeling in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 2006 Mar;78(1):11-23.

7.   Discher D, Dong C, Fredberg JJ, Guilak F, Ingber D, Janmey P, et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Ann Biomed Eng. 2009 May;37(5):847-59.

8.   Omae H, Zhao C, Sun YL, An KN, Amadio PC. Multilayer tendon slices seeded with bone marrow stromal cells: a novel composite for tendon engineering. J Orthop Res. 2009 Jul;27(7):937-42.

9.   Hazgui S, Bonnet N, Cutrona J, Nawrocki-Raby B, Polette M, Chouchane L, et al. 3D culture model and computer-assisted videomicroscopy to analyze migratory behavior of noninvasive and invasive bronchial epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2005 Dec;289(6):C1547-52.

10. Yang Q, Peng J, Guo Q, Huang J, Zhang L, Yao J, et al. A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2008 May;29(15):2378-87.

11. Cukierman E, Pankov R, Yamada KM. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 2002 Oct;14(5):633-9.

12. Corcoran JP, Ferretti P. RA regulation of keratin expression and myogenesis suggests different ways of regenerating muscle in adult amphibian limbs. J Cell Sci. 1999 May;112 ( Pt 9):1385-94.

13. Brockes JP, Kumar A. Plasticity and reprogramming of differentiated cells in amphibian regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002 Aug;3(8):566-74.

14. Tsonis PA. Regeneration in vertebrates. Dev Biol. 2000 May 15;221(2):273-84.

15. Goss RJ, Grimes LN. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 1975 Aug;146(4):533-42.

16. Gardiner DM, Muneoka K, Bryant SV. The migration of dermal cells during blastema formation in axolotls. Dev Biol. 1986 Dec;118(2):488-93.

17. Mahdavi-Shahri NN, F. Kheirabadi, M. Babaie, S. Sadeghie, F. Azarniya, M. The Ultera Structure Study of Blastema in Pinna Tissues of Rabbits with Transmission Electron Microscope. J Biol Sci. 2008;8:993-1000.

18. Badylak SF, Freytes DO, Gilbert TW. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 2009 Jan;5(1):1-13.

19. Elder BD, Eleswarapu SV, Athanasiou KA. Extraction techniques for the decellularization of tissue engineered articular cartilage constructs. Biomaterials. 2009 Aug;30(22):3749-56.

20. Otzen DE. Protein unfolding in detergents: effect of micelle structure, ionic strength, pH, and temperature. Biophys J. 2002 Oct;83(4):2219-30.

21. Hofmann UB, Eggert AA, Blass K, Brocker EB, Becker JC. Expression of matrix metalloproteinases in the microenvironment of spontaneous and experimental melanoma metastases reflects the requirements for tumor formation. Cancer Res. 2003 Dec 1;63(23):8221-5.

22. Reing JE, Zhang L, Myers-Irvin J, Cordero KE, Freytes DO, Heber-Katz E, et al. Degradation products of extracellular matrix affect cell migration and proliferation. Tissue Eng Part A. 2009 Mar;15(3):605-14.

23. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006 Jul;27(19):3675-83.