نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: مطالعه حاضر به بررسی اثرات سایتوتوکسیک گیاه رزماری (Rosmarinus officinalis) روی سلولهای سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رتهای نژاد SD پرداخته است.
مواد و روشها: 10 میلیگرم از کارسینوژن DMBA به رت های گروه تیمار خورانده شد. پس از ایجاد تومورها، جهت تعیین نوع تومور و بررسی هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت. جهت تهیه سلول از روش خرد کردن تومور استفاده شد. از برگهای خشک رزماری با استفاده از متانول به روش digestion عصاره گیری شد. سپس عصاره فیلتر شده و مقداری از آن کنار گذاشته و مابقی آن توسط حلال های غیرقطبی هگزان، دی کلرومتان و اتیل استات شستشو داده شد تا مواد غیرقطبی آن جدا شود. ﻋﻤﻞ ﺣﺬف ﺣـﻼل ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از دﺳﺘﮕﺎه تبخیرکننده چرخشی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓت. از تاکسول و هریک از عصارهها 5 غلظت تهیه شده و بر روی سلولها اثر داده شد و توانایی زیستی سلولها به دو روش جذب تریپان بلو و رنگ سنجی MTT ارزیابی شد.
نتایج: عصارهی الکلی رزماری و تاکسول برروی سلولهای سرطانی دارای اثرات سمی قابل توجهی بودند ولی عصاره آبی خواص ضدسرطانی بسیار ضعیفی داشت.
نتیجه گیری: عصاره الکلی رزمای به صورت وابسته به دز قادر به از بین بردن سلول های سرطانی بوده و خواص سایتوتوکسیک آن قابل مقایسه با داروی تاکسول است. همچنین مدل سرطان پستان القایی یک مدل مناسب برای انجام آزمایشاتی از این دست میباشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of Cytotoxic Effects of Taxol and Rosemary Extracts on Cancerous Cells Derived From DMBA-induced Breast Cancer in SD Rats
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to evaluate the cytotoxic effects of rosemary (Rosmarinus officinalis) extracts on cancerous cells derived from DMBA induced mammary tumor in SD rats.
Materials and methods: Treatment group were gavaged by DMBA (10mg/kg) dissolved in 1ml sesame oil. After tumor development, a part of tissue samples were used for pathological studies using H&E staining to determine the type of the tumor. Cancerous cells were prepared after breaking the tissue using mechanical method. Dried leaves of Rosemary were extracted using digestion method with the help of methanol and filtrated by filter paper. One part of extract was kept away, and to separate the non polar compounds, the rest of the extract was washed with non polar solvents (hexane, dichloromethane, ethyl acetate). Then the solvents were removed by rotary evaporator and then the desirable dilutions of extracts as well as Taxol were prepared. After 24 hours treatment of the cells with the extract and taxol the cell viability was evaluated by Trypan blue dye exclusion and MTT colorimetric assay.
Results: Alcoholic extract and Taxol showed significant cytotoxic effects on cancerous cells but the effect of aqueous extract was weaker.
Conclusion: according to this study alcoholic extract of Rosemary had a dose dependent cytotoxic effect on cancerous cells which was comparable to Taxol cytotoxicity. Moreover these data demonstrated that the induced breast cancer in rat is an appropriate model to simulate human breast cancer.
کلیدواژه‌ها [English]
- Cell viability
- DMBA
- Mammary tumors
- Rosemary extracts
- Taxol
مقاله پژوهشی مجله علمی سلول و بافت (علمی - پژوهشی)
جلد 2، شماره 2، تابستان 1390، 126-117
بررسی خواص ضد سرطانی تاکسول و عصاره های الکلی و آبی رزماری بر سلول های سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رت های نژاد SD
احمد همتا *1، پیوند پروینی 2
1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156
2- دانش آموخته کارشناسی ارشد زیست شناسی تکوینی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: a-hamta@araku.ac.ir
تاریخ دریافت: 14/4/1390 تاریخ پذیرش: 15/8/1390
چکیده
هدف: مطالعه حاضر به بررسی اثرات سایتوتوکسیک گیاه رزماری (Rosmarinus officinalis) روی سلولهای سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رتهای نژاد SD پرداخته است.
مواد و روشها: 10 میلیگرم از کارسینوژن DMBA به رت های گروه تیمار خورانده شد. پس از ایجاد تومورها، جهت تعیین نوع تومور و بررسی هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت. جهت تهیه سلول از روش خرد کردن تومور استفاده شد. از برگهای خشک رزماری با استفاده از متانول به روش digestion عصاره گیری شد. سپس عصاره فیلتر شده و مقداری از آن کنار گذاشته و مابقی آن توسط حلال های غیرقطبی هگزان، دی کلرومتان و اتیل استات شستشو داده شد تا مواد غیرقطبی آن جدا شود. ﻋﻤﻞ ﺣﺬف ﺣـﻼل ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از دﺳﺘﮕﺎه تبخیرکننده چرخشی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓت. از تاکسول و هریک از عصارهها 5 غلظت تهیه شده و بر روی سلولها اثر داده شد و توانایی زیستی سلولها به دو روش جذب تریپان بلو و رنگ سنجی MTT ارزیابی شد.
نتایج: عصارهی الکلی رزماری و تاکسول برروی سلولهای سرطانی دارای اثرات سمی قابل توجهی بودند ولی عصاره آبی خواص ضدسرطانی بسیار ضعیفی داشت.
نتیجه گیری: عصاره الکلی رزمای به صورت وابسته به دز قادر به از بین بردن سلول های سرطانی بوده و خواص سایتوتوکسیک آن قابل مقایسه با داروی تاکسول است. همچنین مدل سرطان پستان القایی یک مدل مناسب برای انجام آزمایشاتی از این دست میباشد.
واژگان کلیدی: تاکسول، تومورهای پستان، زیستایی سلولها، عصاره رزماری، DMBA
مقدمه
طبق آمار منتشر شده از سوی وزارت بهداشت و درمان در حال حاضر سرطان پستان شایع ترین سرطان در میان زنان کشور به شمار میرود و دومین سرطان کشنده پس از سرطان ریه است. کارشناسان می‌گویند از هر هشت زن ایرانی، یک نفر شانس ابتلا به سرطان پستان را داراست و حدود یک چهارم کل سرطانهای زنان در کشور مربوط به سرطان پستان میباشد (1). بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی بردن به مکانیسمهای ایجاد سرطان و ابداع روشهای درمانی مؤثرتر را آشکار میسازد.
سرطان پستان را میتوان در رتها توسط انواع مختلفی از عوامل نظیر هورمونها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود اما یکی از پرکاربرد ترین روشهای القا سرطان پستان در رت استفاده از نوعی ماده شیمیایی به نام 7و12 دی متیل بنزانتراسن میباشد که یک هیدروکربن آروماتیک چندحلقهای است که به وفور در دود تنباکو یافت میشود (2).
با توجه به پیچیدگی مکانیسم و وجود عوامل متعدد در ایجاد سرطان تا کنون درمان قطعی برای این بیماری یافت نشده است اما امروزه از روشهای درمانی برای درمان سرطان پستان استفاده میشود. با این حال وجود عواملی مانند تنوع پروسههای پاتولوژیک و مکانیسمهای مقاومت به درمان انتخاب مناسب ترین و کارآمدترین نوع درمان را برای هر یک از بیماران مشکل ساخته است و این امر لزوم انجام آزمایشات in vitro drug sensitivity/resistance را روشن میسازد. این آزمایشات قادرند شناخت و آگاهی نسبی در باره اثر عوامل مختلف مورد استفاده در درمان استاندارد را پیش از انجام آزمایشات in vivo فراهم کنند. به عبارت دیگر این روش به انکولوژیستها کمک میکند تا بتوانند داروهای مناسبی را برای شیمی درمانی بیماران برگزینند. همچنین از این روش برای انتخاب رژیمهای شیمی درمانی بالقوه مؤثرتر و نیز جلوگیری از سمیت بالقوه داروهای غیر مؤثر استفاده میشود (3).
مواد گیاشیمیایی ( (phytochemicalsکه قابلیت کاهش میزان بروز تعدادی از تومورها را دارا می باشند به صورت روزافزون رو به افزایش است و از این میان مشتقات غذایی از این نظر که تقریباً غیرسمی میباشند مورد توجه خاصی قرار دارند. با این حال شواهد علمی محدودی که در رابطه با مکانیسم عمل و عوارض احتمالی استفاده از این ترکیبات وجود دارد از ورود آنها به مسیر اصلی مراقبتها و درمانهای پزشکی جلوگیری نموده است (3). تا به امروز مشخص شده که بسیاری از گیاهان رایج دارای خواص یا حفاظت کننده در برابر سرطان کموپروتکتیو chemoprotective)) میباشند، از جمله این گیاهان میتوان به اعضای گونه Allium (سیر و پیاز و موسیر)، اعضای خانواده نعناعیان (ریحان، نعناع، آویشن و رزماری)، اعضای خانواده Zingiberaceae (زنجبیل و زردچوبه) اشاره نمود. این گیاهان منابعی غنی از فیتوکمیکالهای کموپروتکتیو مانند فیتواسترولها، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، ترپنوئیدها و ... میباشند که این مواد به عنوان آنتی اکسیدانت عمل کرده و رادیکالهای آزاد را جاروب میکنند و موجب تحریک سیستم ایمنی بدن میشوند و همچنین تشکیل DNA adducts با کارسینوژنها را مهار نموده و علاوه بر این مسیرهای متابولیک مرتبط با گسترش سرطان را مهار میکنند (4).
رزماری نیز یکی از گیاهانی است که خاصیت آنتی اکسیدانتی بالایی دارد. اما چیزی که به تازگی و در یکی دو دهه اخیر مورد توجه محققان قرار گرفته است خواص ضد سرطانی و آنتی کارسینوژنیک آن میباشد. از آنجا که سرطان یک بیماری پیچیده و مولتی فاکتوریال است، یافتن مدل مناسبی که بتوان آن را جایگزین مدل انسانی نمود همواره یکی از آرمانهای محققان بوده است. در این پژوهش از مدل موش صحرایی استفاده شده است که قادر به تقلید شرایط تومورهای انسانی تا حد بسیار زیادی میباشد و بنابراین می تواند مدل مناسبی برای مطالعه اثر داروهای ضدسرطان به شمار آید. با بررسی دادههای به دست آمده از این مطالعه به این موضوع پی خواهیم برد که آیا استفاده از مدل موشی سرطان پستان میتواند مدل جایگزین مناسبی برای مدل انسانی باشد و اینکه آیا عصارههای الکلی و آبی (فاقد عوامل غیرقطبی) رزماری قادر به از بین بردن سلولهای سرطانی هستند؟ و اگر این گونه است میزان اثر بخشی آنها در مقایسه با داروی رایج تاکسول به چه میزان است؟
مواد و روشها
برای انجام این پژوهش رتهای مادهی بالغ از نژاد Sprague dawley با میانگین وزنی (10 150گرم (از موسسه‌ی سرم سازی رازی خریداری شده و در شرایط 12 ساعت تاریکی و12 ساعت روشنایی و حرارت 3 ± 22 درجهی سانتیگراد و دسترسی آزاد به آب و غذا، در قفس‌های مخصوص در اتاق حیوانات نگهداری شوند.
دوز دارو و روش تیمار: حیوانات به 3 گروه تقسیم شده و به گروه اول (10=n) به عنوان گروه کنترل 1 میلی لیتر روغن کنجد به گروه دوم (10=n) به عنوان گروه تیمار 1 میلی لیتر محلول حاوی10 میلیگرم DMBA (Sigma، آلمان) که در 1 میلی لیتر روغن کنجد حل شده بود و به گروه آخر (10=n)، بعنوان گروه تیمار 2 محلول حاوی 20 میلی گرم DMBA که در1 میلی لیتر روغن کنجد حل شده بود بوسیله گاواژ داده شد. این دارو2 بار در طول 2 هفته و در روز مشخص به گروه تیمار خورانده شد. پس از پایان دوره تیمار و رسیدن تومور به اندازه لازم حیوانات توسط دی اتیل اتر بیهوش و محل تشریح استریل گردید سپس تومور بطور کامل خارج شده و به زیر هود لامینار منتقل شد (شکل1). یک سوم تومور به منظور تهیه مقاطع بافتی، برای مطالعه پاتولوژیک در فرمالین 10درصد قرار داده شد و دو سوم باقیمانده جهت کشت سلول مورد استفاده قرار گرفت. لازم به ذکر است که تمامی اصول بهداشتی در نگهداری و معدوم سازی حیوانات بر اساس پروتکل کمیته اخلاق پزشکی مصوب 28/5/1385 ( مطابق با پروتکل هلسینکی 1975 ) در این پژوهش رعایت شد.
مطالعه هیستوپاتولوژیکی: نمونه به دست آمده از تومور به مدت 48 تا 72 ساعت در فرمالین10 درصد قرار داده شد و در ادامه مراحل پاساژ بافتی (به اختصار آبگیری با درجات صعودی الکل، شفاف سازی با زایلین و قالب گیری در پارافین مذاب) بر روی قطعات تومور انجام گرفت. سپس با استفاده از میکروتوم (Leitz 1512) از قالب ها برش هایی به ضخامت 3 میکرومتر تهیه شده و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین روی برشها انجام گرفت. در نهایت لامها با میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین مورد مطالعه و عکس برداری قرار گرفتند.
شکل 1: تومور خارج شده از رت تیمار شده با DMBA
تهیه سلولهای منفرد از بافت تومور: برای تهیه سلول از بافت تومور، تومورها به زیر هود لامینار انتقال داده شده و سپس از قسمتهای داخلی تر قطعاتی بریده و به فالکونهای حاوی 10 میلیلیتر HBSS (Gibco، آلمان) استریل انتقال داده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقیماندۀ تومور با اسکالپل به ذرات بسیار ریز خرد شد (chopping) و سوسپانسیون حاصله به فالکون منتقل شده و با دور rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. پس از آن محلول رویی دور ریخته شد و به رسوب ته فالکون 5 میلیلیتر محیط کشت DMEM (Gibco، آلمان) حاوی10درصد FBS (Gibco، آلمان) اضافه گشت. پس از پیپتاژ کردن، 5/1 تا 2 میلی لیتر از مخلوط همگن شده به فلاسک‌های T25 منتقل شده و حجم محیط داخل فلاسک به 5 میلیلیتر رسانده شد. سپس فلاسک به انکوباتور CO2 دار (Memmert، آلمان) با دمای 37 درجه سانتیگراد منتقل گردید. پس از گذشت 24 ساعت محیط رویی فلاسک تخلیه و 5 میلیلیتر محیط کشت تازه به فلاسک افزوده گشت. تعویض محیط و پاساژ سلولها هرچند روز یکبار و در صورت نیاز انجام گرفت و این کار تا پاساژ هفتم تکرار شد.
تهیه عصاره های گیاهی: حدود 2 کیلوگرم برگ و سرشاخههای تازه گیاه رزماری چیده شده و در محیطی خنک و به دور از نور آفتاب خشک شد. سپس حدود 500 گرم برگ خشک رزماری آسیاب و غربال شد تا پودر یک دستی حاصل شود. 100 گرم از پودر در ظرف مناسبی ریخته شده و حدود 250 میلی لیتر متانول خالص به آن افزوده شد و به مدت 24 ساعت بر روی شیکر با دمای 40 تا 50 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس مخلوط به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی صاف و عصاره به دست آمده در یک ظرف دردار شیشهای ریخته و در جایی دور از نور نگهداری شد. مجدداً روی تفاله باقی مانده 250 میلیلیتر متانول خالص ریخته شده و ظرف حاوی تفاله مجدداً به مدت 24 ساعت بر روی شیکر با دمای 40 تا 50 درجه سانتیگراد قرار داده شد. مقدار مورد نیاز از عصاره متانولی برداشته شد و بقیه آن در دستگاه تبخیرکننده چرخشی قرار گرفت تا حلال آن کاملاً تبخیر شده و رسوب آن باقی بماند. روی رسوب حاصله 200 میلیلیتر آب مقطر (حاوی 5 تا 10 درصد متانول به منظور کمک به انحلال رسوب) ریخته شد و پس از حل کردن رسوبات در آن ظرف محتوی مخلوط به مدت 24 ساعت در یخچال قرار گرفت. سپس با کاغذ صافی صاف شد. برای ارزیابی نقش ضد سرطانی ترکیبات قطبی و محلول در آب رزماری، عصاره به دست آمده با استفاده از سه حلال هگزان، دی کلرومتان و اتیل استات (Merck، آلمان) (که قادر به جدا نمودن ترکیبات غیرقطبی میباشند) شستشو داده شد و تفاله باقی مانده به عنوان عصاره حاوی مواد قطبی مورد استفاده قرار گرفت. عصاره آبی در حمام آب گرم با دمای 40 تا 45 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا حلال آن کاملاً تبخیر شود و رسوب خشکی برجا بماند. سپس غلظت های مورد نیاز از هر یک از عصارهها با حل کردن مقدار مورد نیاز از پودر عصاره در محیط کشت فاقد سرم و گذراندن آن از فیلتر (milipore) با قطر منافذ 22/0 میکرومتر تهیه شده و تا زمان استفاده در یخچال و برای مدت طولانی تر در فریزر نگهداری شد.
سنجش توانائی زیستی سلولی با استفاده از رنگ آمیزی تریپان بلو: تعداد 6 10 × 1 سلول در هر ویال پلیت 6 خانه کشت داده شد و سپس پلیت به مدت 24 ساعت به منظور اتصال سلولها به کف پلیت در انکوباتور قرار گرفت. محیط رویی سلولها خارج و محیط فاقد سرم حاوی غلظتهای 25/1، 5/2، 5، 10، 20 نانومول بر لیتر از تاکسول (Ebewe pharma اتریش) به هر چاهک اضافه و پلیت به انکوباتور منتقل گردید. پس از 24 ساعت، تمام خانههای پلیت تریپسین زنی شد. سپس با اضافه کردن محیط کشت کامل، تریپسین غیر فعال شده و به نسبت 1:1 تریپان بلو 4/0 درصد (Sigma، آلمان) به هر خانه اضافه و پلیت به مدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. شمارش سلولها با استفاده از لام نئوبار (در خانههای متعلق به شمارش گلبولهای سفید) انجام گرفت. سلولهای آبی رنگ به عنوان سلولهای مرده و سلولهای بی رنگ به عنوان سلولهای زنده در نظر گرفته شد. سپس با استفاده از فرمول زیر، درصد حیات سلولها در هر غلظت محاسبه گشت.
100 × = توانایی زیستی سلولها
سنجش تترازولیوم(MTT) : اساس این تست شکسته شدن نمک زرد رنگ تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهای زنده و تولید بلورهای بنفش رنگ و نا محلول فورمازان است. هرچه تعداد سلولهای زنده بیشتر باشد شدت رنگ تولید شده نیز بیشتر خواهد بود (و برعکس). برای انجام این تست تعداد 104سلول در هر چاهک پلیت 96 خانه کشت و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محیط رویی خارج و هر چاهک دو بار توسط PBS- شسته شد. سپس 100 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم حاوی غلظت های 0، 25/1، 5/2، 5، 10، 20 نانومول بر لیتر از تاکسول به هر چاهک پلیت اضافه و پلیت به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن محیط هر چاهک با 100 میکرولیتر محیط فاقد سرم تازه جایگزین گردید. به هریک از چاهک ها 10 میکرولیتر محلول MTT (Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma، آلمان) با غلظت 5 میلی گرم بر میلی لیتر اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه گشت. سپس محیط رویی هر چاهک تخلیه و به منظور حل شدن بلورهای فورمازان 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکسایدDMSO به هر یک از آنها اضافه و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و در مکانی تاریک قرار داده شد. سپس محتوای هر چاهک از پلیت به یک چاهک دیگر منتقل و جذب نوری (OD) هر چاهک در طول موج 492 نانومتر با استفاده از دستگاه ELISA-reader قرائت و درصد حیات سلولها با استفاده از فرمول زیر، در مورد هر غلظت محاسبه گردید:
|
100× |
OD نمونه |
= توانایی زیستی سلولها |
|
OD کنترل |
تمامی مراحل فوق برای عصاره الکلی (با غلظتهای 100، 200، 400، 800 و 1200 میکروگرم بر میلیلیتر) و عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی (با غلظتهای 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلی لیتر) تکرار شده و نتایج ثبت گردید.
آنالیز آماری دادهها:برای بررسی اثر دوزهای مصرفی تاکسول، عصارۀ آبی، عصارۀ الکلی بر توانایی زیستی سلولهای سرطان پستان القا شده در موش صحرایی، دادههای به دست آمده توسط روش آماری Univariate و تست Duncan مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و تفاوت میانگین ها در سطح 05/0 P<معنی دار در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج حاصل از مطالعه ی هیستوپاتولوژیک
برشهای تهیه شده از بافتهای توموری توسط متخصص هیستوپاتولوژی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس اطلاعات هیستوپاتولوژیکی تمامی خصوصیات مرفولوژیک مشاهده شده در برشها مؤید وجود بافت تومورال بدخیم بود. همانطور که در شکل 2-a و 2-b سلول های سرطانی در حال تکثیر مشاهده میشود، در بافت تومورال، فضاهای غده مانند تغییرشکل یافتهای دیده میشود که به وسیله یک ردیف از سلولهای اپیتلیال توموری احاطه شدهاند و تمایل دارند به بافت غده ای توموری تمایز یابند. هردوی مشخصات مزبور از نشانههای تشخیصی آدنوکارسینوما میباشد. علاوه بر این چنان که در شکل 2- c مشاهده میشود سلولهای سرطانی دارای هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی میباشند، این در حالی است که در هیچ یک از اعضای گروه کنترل هیچ گونه بافت توموری مشاهده نشد.
شکل 2: a) برشی از تومور که در آن پیکان ها نشان دهنده فضاهای غده مانند متعدد می باشند ( عدسی شیئیx20 ) b)پیکان ها تکثیر سلول های سرطانی را در یک مجرا (که با } نشان داده شده است) نشان می دهد (عدسی شیئیx40 )، c) سلول های سرطانی با هسته های مشخص و هستک های بزرگ (پیکان ها) (عدسی شیئیx100 ). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
نتایج سنجش توانایی زیستی سلولها بر اساس رنگ آمیزی تریپان
مقایسه میانگین توانایی زیستی سلولهای سرطانی پس از گذشت 24 ساعت اختلاف معنیداری میان تمام گروه غلظتهای 1 تا 5 برای هر یک از مواد مذکور به این شرح است: به ترتیب گروههای 1 تا 5 جدول دوزهای 25/1، 5/2، 5، 10 و 20 نانومول بر لیتر از تاکسول، دوز های 100، 200، 400، 800 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره الکلی و دوزهای 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلیلیتر از عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی.
بر اساس این نتایج غلظتی که بتواند رشد سلولها را 50 درصد مهار کند (IC50) برای هر یک از ترکیبات مذکور بدین شرح بود:
تاکسول: دوز 72/12 نانومول بر لیتر. عصاره الکلی: دوز 677 میکروگرم بر میلیلیتر.
عصاره آبی: از آنجا که با افزایش دوز عصاره از 5000 میکروگرم بر میلی لیتر به بالا قابلیت حیات سلولها افزایش قابل ملاحظه و معنی داری پیدا کرد بنابراین سمی ترین دوز عصاره آبی معادل 4000 میکروگرم بر میلیلیتر درنظر گرفته شد.
به طور کلی میتوان گفت مقایسه دادههای به دست آمده از سنجش قابلیت حیات سلولهای سرطانی تحت تیمار با تاکسول و عصارهها با دادههای به دست آمده از گروه کنترل، تفاوت معنیداری (05/0P<) نشان داد.
جدول1: مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی سلولهای سرطانی پس از تیمار با دوزهای مختلف تاکسول، عصارۀ آبی، عصارۀ الکلی در زمان 24 ساعت که به روش رنگ آمیزی تریپان بلو اندازه گیری شده است. مقادیر به صورت ±SDmeans بوده و تفاوت میانگینها در سطح 05/0P< معنیدار در نظر گرفته شده است. میانگین های با کد حرفهای متفاوت در هر ستون دارای تفاوت معنی دار میباشند(ANOVA, one way, Duncan test).
|
عصاره الکلی |
عصاره آبی |
تاکسول |
ماده دوز |
|
52/1±a51/94 33/1±b01/71 10/2±c92/64 48/2±d67/56 20/4±e17/48 09/2±f03/26 |
03/1±a75/94 82/1±a25/92 42/3±ab46/90 44/3±bc70/84 76/2±c23/82 45/2±ab73/86 |
97/0±a71/94 96/3±b54/80 05/3±b82/76 77/0±c50/66 07/3±d58/53 81/1±e40/34 |
0 1 2 3 4 5 |
میانگین توانائی زیستی سلولهای سرطانی در گروه های تیمار شده با تاکسول و عصاره الکلی نسبت به یکدیگر اختلاف معنیداری نداشت، اما میانگین توانائی زیستی سلولهای تیمار شده با این گروهها دارای اختلاف معنیداری نسبت به گروه تیمار با عصاره آبی بود (05/0Univariate, P<). این نتایج نشان داد که دوز تیمار و توانایی زیستی سلولهای سرطانی دارای اثرات متقابل میباشند، به صورتیکه با افزایش میزان دوز، قابلیت حیات سلولها کاهش معنیداری پیدا میکند. البته این مسئله درمورد عصاره آبی به طور کامل صدق نمیکرد زیرا همانطور که قبلاً نیز اشاره شد، با افزایش میزان دوز عصاره آبی از 4000 میکروگرم به بالا نه تنها کاهشی در میزان زیستایی سلولها مشاهده نشد بلکه درصد حیات آنها در سطح معنیداری افزایش یافت.
نتایج سنجش توانایی زیستی سلول ها به روش MTT
از مقایسه داده های به دست آمده از سنجش درصد حیات سلولهای سرطانی تیمار شده با تاکسول، عصاره آبی و عصاره الکلی، مشخص شد که تفاوت میانگین درصد حیات سلولها در دوزهای متفاوت و زمان 24 ساعت در گروه های تیمار نسبت به گروه کنترل در سطح 05/0P<معنی دار بود. میانگین زیستی سلولهای سرطانی در گروه های تیمار شده با تاکسول و عصاره الکلی نسبت به یکدیگر اختلاف معنیداری نداشت، اما میانگین زیستی سلولهای تیمار شده با این دو گروه اختلاف معنیداری نسبت به گروه تیمار با عصاره آبی نشان داد (05/0Univariate, P<).
همانند نتایج به دست آمده از آزمون تریپان بلو، نتایج تست MTT نیز مؤید این مطلب بود که دوزهای بالاتر از 4000 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره آبی نه تنها موجب کاهش قدرت زیست سلولهای سرطانی نشده، بلکه قابلیت حیات آنها را در سطح معنیداری افزایش داده است. این نتایج همچنین نشان داد که دوز مصرفی دارای اثر متقابل بر توانایی زیستی سلولهای سرطانی میباشد به این معنا که با افزایش دوز، درصد حیات سلولها به صورت معنی داری کاهش مییابد (جدول2).
غلظتهای 1 تا 5 برای هر یک از گروهها در جدول به این شرح است: به ترتیب از گروه 1 تا 5 دوزهای 25/1، 5/2، 5، 10 و 20 نانومول بر لیتر از تاکسول، دوزهای 100، 200، 400، 800 و 1000 میکروگرم بر میلیلیتر از عصاره الکلی و دوزهای 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلیلیتر از عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی.
میزان IC50 محاسبه شده برای هریک از ترکیبات مورد استفاده بدین شرح بود:
تاکسول: دوز 11/10 نانومول بر لیتر. عصاره الکلی: دوز 664 میکروگرم بر میلیلیتر.
عصاره آبی: از آنجا که با افزایش دوز عصاره از 5000 میکروگرم بر میلیلیتر به بالا قابلیت حیات سلولها افزایش قابل ملاحظه و معنیداری پیدا کرد. بنابراین سمیترین دوز عصاره آبی معادل 4000 میکروگرم بر میلیلیتر در نظر گرفته شد.
جدول 2:مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی سلولهای سرطانی پس از تیمار با دوزهای مختلف تاکسول، عصارۀ آبی و عصارۀ الکلی در زمان 24 ساعت که به روش MTT اندازه گیری شده است. مقادیر به صورت ± SDmeans بوده و تفاوت میانگین ها در سطح 05/0 p< معنی دار در نظر گرفته شده است. میانگین های با کد حروف متفاوت در هر ستون دارای تفاوت معنادار می باشند (ANOVA, one way, Duncan test).
|
عصاره الکلی |
عصاره آبی |
تاکسول |
ماده دوز |
|
00/0±a100 55/1±b20/67 37/3±c83/59 05/2±d39/53 85/0±e16/48 87/3±f01/36 |
00/0±a100 54/1±a16/93 99/0±b23/86 68/3±b14/84 89/1±b92/77 76/2±c67/87 |
00/0±a100 83/2±b74/86 60/1±c93/76 49/4±d44/65 64/1±e06/50 03/1±f84/44 |
0 1 2 3 4 5 |
بحث
نتایج بدست آمده از بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافتهای توموری که به روش هماتوکسیلین- ائوزین رنگ آمیزی شده بودند مؤید این مطلب بود که پاتولوژی تومورهای ایجاد شده در موشهای صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان دارد. پیش از این نیز Russo (5) گزارش کرده بود که اکثر تومورهای پستانی القا شده توسط DMBA از نوع ادنوکارسینوما بوده و مشخصات تومورهای پستان انسانی را از نظر رشد وابسته به هورمون و هیستولوژی تقلید میکند و بنابراین مدل حیوانی مناسبی جهت تحقیق در مورد کارسینوژنز تومورهای پستان انسانی میباشند. با توجه به این یافتهها و با نظر به اینکه ژنوم انسان و رت تا حد زیادی به یکدیگر مشابه است بنابراین از دیدگاه ژنتیکی نیز میبایست تشابهات زیادی بین تومورهای پستانی ایجاد شده در رت و تومورهای انسانی وجود داشته باشد. بررسی توانایی زیستی سلولهای سرطانی با استفاده از دو آزمون رنگ آمیزی با تریپان بلو و MTT نشان داد که عصاره الکلی و تاکسول موجب کاهش چشمگیر توانایی زیستی سلولهای سرطانی شدند. گرچه عصارهی آبی نیز توانست سلولهای سرطانی را تا حدودی از بین ببرد، اما اثرات سایتوتوکسیک آن نسبت به تاکسول و عصاره الکلی بسیار ناچیز بود. نتایج به دست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تأیید نمودند.
سایر مطالعاتی که پیش از این در رابطه با اثرات سایتوتوکسیک تاکسول و عصارهی الکلی رزماری صورت گرفته است نیز توانایی این ترکیبات در کاهش توانایی زیستی سلولهای سرطانی را نشان دادهاند. تحقیقات متعددی که در مورد اثرات سایتوتوکسیک تاکسول چه به صورت in vivo و چه in vitro صورت گرفته است سمیت تاکسول برای سلولهای سرطانی را نشان دادهاند. مشخص شده است که تاکسول با ایجاد وقفه در چرخه سلولی موجب مرگ سلولها میشود. بررسیهای صورت گرفته بر ردههای سلولی MCF-7،HeLa ، A549، U373، HT-29، OVG-1، PC-Sh و PC-Zd (6) NUGC-3، SC-M1 (7) SKOV3، U937(8) همگی سایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول را نشان دادهاند.
مطالعاتی که تا کنون در رابطه با اثرات ضد تکثیری (Anti proliferative) و سایتوتوکسیک عصاره الکلی رزماری بر روی ردههای سلولی سرطانی انسانی از جملهHL60 ، K562،MCF7 و MDA-MB-468 (9) M14 و A375 ، NCI-H82، DU-145، K-562، Hep-3B، MCF7، MDA-MB-231 وPC-3 صورت گرفته نشان میدهد و IC50 عصاره وابسته به نوع سلول بوده و در ردههای سلولی مختلف متفاوت است (10). تاکنون ترکیبات بسیار زیادی از رزماری استخراج شدهاند که بسیاری از آنها دارای خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی، ضد توموری و غیره میباشند. عصاره الکلی رزماری حاوی 5/0 تا 1 درصد کارنوسیک اسید، 8/3 تا 6/4 درصد کارنوسول،2 تا 4 درصد رزمارینیک اسید، 5/16 تا 2/19 درصد اورسولیک اسید و کمتر از 5/0 درصد رزمانول است که از این میان تنها رزمارینیک اسید در آب محلول بوده و سایر ترکیبات در حلالهای آلی محلول میباشند. بسیاری از ویژگیهای فارماکولوژیکی رزماری را به این ترکیبات منتسب میدانند و تا امروز نقش آنتی اکسیدانتی و ضد سرطانی برخی از آنها به خوبی به اثبات رسیده است. مطالعات گستردهای که روی ترکیبات مؤثر رزماری صورت گرفته مکانیسم عمل آنها را تا حدودی مشخص نموده است، با این حال هنوز تا درک کامل مکانیسم عمل این ترکیبات راه زیادی باقی است (11). نتایج بررسی انجام گرفته روی سرطان پستان القا شده توسط DMBA در موش های نژاد FVB/N مشخص نموده است که DMBA بیان برخی از ژنهای دخیل در روند کارسینوژنز از جمله ژن c-myc و cyclin D1 را افزایش داده و مسیر NF‐κB را در این تومورها فعال میکند. همچنین DMBA موجب القاء التهاب مزمن و تولید بیش از اندازه ROS و ایجاد آسیب اکسیداتیو در DNA شده و اثرات مخرب خود را بدین صورت اعمال میکند (12).
استفاده از عصاره متانلی رزماری روی پوست موش از اتصال کووالان بنزوپیرن به DNA اپیدرمال جلوگیری نموده و آغاز تومور توسط آن را مهار میکند. همچنین مشخص شده است که اورسولیک اسید از اتصال بنزوپیرن و DMBA به DNA سلولهای اپیدرم و اتصال TPA به غشاء این سلولها ممانعت به عمل میآورد. اورسولیک اسید موجود در رزماری مسیر NF‐κB را در سلولهای سرطانی مهار میکند و احتمالاً این کار را از طریق سرکوب مهارکننده فسفریلاسیون P65 و NF‐κB انجام میدهد و بدین ترتیب موجب تنظیم کاهشی انکوژنهایی مانند COX-2، MMP-9، Cyclin D1، C-Jun و C-Fos میشود. کارنوسول موجود در برگهای رزماری نیز مانند اورسولیک اسید عمل کرده و فعالیت NF‐κB را مهار میکند (13).
COX-2 آنزیمی است که بیان آن در شرایط بدخیم و پیش بدخیم سرطانهایی مانند پستان، کولون، کبد، پانکراس، ریه، معده، سر و گردن، پوست و حلق افزایش مییابد. تحقیقات نشان داده اند که بیان بیش از حد COX-2 میتواند با جلوگیری از اپپتوزیس، توموریژنز را افزایش دهد (14). فلاونوئیدهای موجود در رزماری، زیره، گشنیز و آویشن PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) را فعال کرده و به موجب آن بیان COX-2 را مهار مینمایند. رزمارینیک اسید نیز موجب کاهش COX-2 شده و سلولهای سرطان کولون را از بین میبرد. علاوه بر این رزمانول نیز قادر به مهار کردن بیان COX-2 بوده و نقش ضد التهابی نشان میدهد (15).
کارنوسیک اسید موجود در برگ های رزماری نیز با جارو کردن رادیکالهای آزاد اکسیژن- مانند رادیکال هیدروکسیل و رادیکالهای لیپید پراکسی- غشاهای بیولوژیک را از گزند آنها حفظ نموده و از پراکسیداسیون لیپیدی جلوگیری میکند (16). گزارش شده است که کارنوسیک اسید قادر است تحت شرایط استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدی را بین 88 تا 100 درصد کاهش دهد. اورسولیک اسید نیز به روشی مشابه با کارنوسیک اسید قادر به کنترل استرس اکسیداتیو میباشد (20). رزمانول هم از مسیر میتوکندریایی و هم از مسیر رسپتور مرگ، موجب القاء مرگ سلولی در سلولهایCOLO 205 میشود و ممکن است دارای کاربرد بالینی در درمان و پبشگیری از سرطان باشد (17).
گزارشات متعددی منتشر شده اند که نشان میدهند در بسیاری از سلولهای سرطانی بیان ژنهایی مانند bcl-2، bcl-Xl، IAP (پروتئین مهار کننده اپوپتوزیس)، survivin، Cyclin D1 و فاکتور مرتبط با رسپتور TNF1 (TRAF1) افزایش مییابد و این افزایش بیان موجب ترقی و افزایش حیات و تکثیر سلولهای سرطانی شده و آنها را نسبت به اپوپتوزیس مقاوم و غیرحساس میکند. اما ترکیبات رزماری از قبیل اورسولیک اسید قادرند از طرق مختلفی همچون مهار رونویسی DNA، تنظیم افزایشی بیان ژنهای خانواده MMP، القاء بیان ژن سرکوبگر تومور P53، فعال سازی JNK1 و JNK2، فعال کردن کاسپازهای 3، 8 و 9 و همچنین کاهش بیان پروتئینهای خانواده bcl-2 موجب القاء مرگ سلولی در ردههای سلولی مختلفی از قبیل K652، HL-60، A549، H460، PC-3، M4Beu، MCF-7 و HepG2 شوند (11). سایر تحقیقات نشان داده اندکه کارنوسول نیز قادر است با کاهش دادن سطوح Bcl-2 به میزان 34 تا 53 درصد موجب القاء مرگ سلولی در سلولهای لوکمی حاد انسانی شود (18).
از آنجا که اکثر ترکیبات اصلی رزماری (به غیر از رزمارینیک اسید) در آب محلول نبوده و در حلالهای غیرقطبی و آلی حل میشوند (19)، بنابراین نتایج به دست آمده از اثرات عصاره آبی فاقد عوامل غیرقطبی در رزماری دور از انتظار نبود، با این حال این عصاره توانست به میزان ناچیزی سلولهای سرطانی را از بین برد که شاید بتوان این اثر را ناشی از حضور رزمارینیک اسید دانست، علاوه بر این در گروه تیمار مشاهده شد که با افزایش دوز عصاره آبی از 4000 میکروگرم بر میلیلیتر به 5000 میکروگرم بر میلیلیتر توانایی زیستی سلولها افزایش پیدا کرد. شاید بتوان این نتیجه را ناشی از اثر عوامل محرک رشد نا شناخته موجود در عصاره آبی دانست که در غلظتهای بالا اثر سایتوتوکسیک ترکیبات موجود در این عصاره را خنثی میکنند اما به هرحال با نظر به اینکه ترکیبات موجود در عصاره مورد آنالیز و تجزیه کمی و کیفی قرار نگرفتهاند و با توجه به عدم وجود تحقیقات مشابه در این زمینه، نمیتوان در این مورد اظهار نظر قطعی نمود.
نتیجه گیری
تاکسول و عصاره الکلی رزماری موجب القا مرگ در سلولهای سرطانی القا شده توسط DMBA شدند ولی عصاره آبی رزماری که فاقد عوامل غیرقطبی است اثرات سایتوتوکسیک چندانی از خود نشان نداد علاوه بر این تشابه نتایج حاصله با نتایج صورت گرفته بر روی ردههای سلولی انسانی مؤید این مطلب است که مدل القایی سرطان پستان رت که در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفته است یک مدل مناسب و قابل اطمینان برای انجام آزمایشات سایتوتوکسیک میباشد که قادر به تقلید رفتار تومورهای پستانی انسانی بوده و میتوان در بسیاری از پژوهشهایی از این قبیل از آن بهره جست.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه اراک جهت تامین هزینههای مالی این پژوهش و همچنین آقای فراهانی که در کارهای آزمایشگاهی ما را یاری رساندند تشکر و قدردانی میگردد.
1. Ahmadi M, Asadi F, Jalali-fard B, Sadoghi F.[Management of health nformation]. Tehran:Nopardaz ublications; 2005.
- Fruebauf JP, Bosanquet AG. In vitro determination of drug response: a discussion of clinical applications. principle and practice of oncology. 1993; 7: 25-32.
- Tian B, Wang Z, Zhao Y, Wang D, et al. Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model, Cancer Letter. 2008; article in press.
- Craig wJ. Health promoting properties of common herbs. American journal of clinical nutrition. 1999; 70(3): 491-499.
- Russo J, Russo IH. Atlas and Histologic Classification of Tumors of the Rat Mammary Gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 2000; 5(2): 187-200.
- Liebmann JE, Cook JA, Lipschultz C, Teague D, et al. Cytotoxic studies of Paxlitaxel (Taxol) in human tumor cell lines. British Journal of Cancer. 1993; 68(6): 1104-1109.
- Chang YF, Li LL, Wu C, Liu T, et al. Paclitaxel induced apoptosis in human gastric carcinoma cell lines. Cancer. 1996; 77(1): 8-14.
- Ofir R, Seidman R, Rabinski T, Kurp M, et al. Taxol-induced apoptosis in human SKOV3 ovarian and MCF7 breast carcinoma cells is caspase-3 and caspase-9 independent. Cell Death and Differentiation. 2002; 9(6): 636-642.
- Cheung S, Tai J. Anti-proliferative and antioxidant properties of rosemary Rosmarinus officinalis. Oncology reports. 2006; 17: 1525-1531.
10. Yesil-Celiktas O, Sevimli C, Bedir E, Vardar-Sukan F. Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carnosic Acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines. Plant Foods Human Nutrition. 2010; 65: 158-163.
11. Yasutaka Ikeda A, Hajime Ohigashi M. Ursolic acid: An anti- and pro-inflammatory triterpenoid. Mol. Nutr. Food Res. 2008; 52(1): 26-42.
12. Currier N, Solomon SE, Demicco EG, Chang D, et al. Oncogenic Signaling Pathways Activated in DMBA-Induced Mouse Mammary Tumors. Toxicologic Pathology. 2005; 33(6): 726-737.
13. Lo AH, Liang YC, Lin-Shiau SY, Ho CT, et al. Carnosol, an antioxidant in rosemary, suppresses inducible nitric oxide synthase through down-regulating nuclear factor-kappaB in mouse macrophages. Carcinogenesis. 2002; 23(6): 983-991.
14. Aggarwal BB, Ichikawa H, Garodia P, Weerasinghe P, et al. From traditional Ayurvedic medicine to modern medicine: identification of therapeutic targets for suppression of inflammation and cancer. Oncologic, Endocrine & Metabolic. 2006; 10(1): 87-118.
15. Liang YC, Tsai SH, Tsai DC, Lin-Shiau SY. Suppression of inducible cyclooxygenase and nitric oxide synthase through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by flavonoids in mouse macrophages. FEBS Letters. 2001; 496(1): 12–8.
16. Serafini M, Bellocco R, Wolk A, Ekstrom AM. Total antioxidant potential of fruit and vegetables and risk of gastric cancer. Gastroenterology. 2002; 123(4): 985–91.
17. Cheng A, Lee m, Tsai ML, Lai CS, et al. Rosmanol potently induces apoptosis through both the mitochondrial apoptotic pathway and death receptor pathway in human colon adenocarcinoma COLO 205 cells. Food and Chemical Toxicology. 2010; article in press.
18. Dorrie J, Sapala K, Zunino SJ. Carnosol-induced apoptosis and downregulation of Bcl-2 in B-lineage leukemia cells. Cancer Letters. 2001; 170: 33-39.
Huang MT, Ho CT, Wang ZY, Ho CT, et al. Inhibition of skin tumorigenesis by rosemary and its constituents carnosol and ursolic acid. Cancer Researches. 1994; 54: 701-708.
)