نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تهیه شبکه خارج سلولی (ماتریکس) سه بعدی از بافت لثه کامی و بررسی امکان کاربرد داربستهای طبیعی (Scaffolds) تهیه شده در تحقیقات کشت سلولی و مهندسی بافت میباشد.
مواد و روشها: به منظور تهیه داربستها، بافت لثه کامی انسان به صورت بیوپسی تهیه و سلول زدایی به روش فیزیکی (قرار دادن در تانک ازت و شستشو با آب مقطر) شیمیایی با درصدهای متفاوتی ازسدیم دودسیل سولفات SDS (غلظت های 1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/0 درصد) در 5 گروه انجام شد. سپس جهت تست داربست سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد محلول SDS، از سلولهای شبه جنینی بافت بلاستما برای کشت بر روی این داربست سه بعدی استفاده گردید.
نتایج: کاهش درصد SDS به پایین تر از 5/0درصد به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت شد (p <0/05). مطالعه میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت نفوذ سلولی، مهاجرت، چسبندگی و تمایز را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان میدهد که امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. از طرف دیگر نتایج مطالعات هیستولوژیک نشان میدهد که داربستهای سلولزدایی شده لثه کامی می تواند همچون لثه آزاد داربست زیستی سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلولها باشد. آزمایشات بیشتر جهت تعیین ماهیت سلولهای تمایز یافته میتواند به پیشرفت دانش ما در رابطه با بر هم کنشهای سلول- ماتریکس کمک کنند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
A Case Study of Decellularization of Human Palatal Gingiva Tissue and Preparation Three-Dimensional Model for Use in Primary Research Gingival Tissue Engineering
چکیده [English]
Aim: The main goal of this research was to prepare a three-dimensional matrix from gingival palate tissues and investigate the possible application of this scaffold in cell culture and tissue engineering.
Materials and methods: In order to fabricate the scaffolds, the biopsy samples of human palate gingival tissue were preparated surgically and divided in 5 groups then decellulization of the samples were carried out via physical method (put in nitrogen tanks and rinsing with distilled water) as well as chemical method using different concentrations of SDS (0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75% and 1%). Furthermore to evaluate the scaffold prepared with 1% SDS, embryonic like cells from blastema tissue were seeded on the three-dimensional scaffold.
Results: Concentration of SDS below 0.5% caused significant reduction (p < 0.05) of decellulization of the tissues. Microscopic studies of blastema tissue on the scaffold in different days revealed the penetration, migration, adhesion and differentiation of the cells.
Conclusion: This study showed that, it is possible to prepare a natural scaffold frome palatal gingiva tissue using SDS treatment. On the other hand, the results of histologic studies showed that the decellulized scaffolds of palatal gingival might be suitable as three-dimensional bioscaffold for movement, adhesion, differentiation and migration of cells. More investigation is needed to determine the identity of the differentiated cells which further it can help to improve our knowledge about cell-matrix interaction.
کلیدواژهها [English]
- Blastema tissue
- Decellulization
- Palate gingiva tissue
- Tissue engineering
مقاله پژوهشی مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی)
جلد 2، شماره 2، تابستان 1390، 116-107
مطالعه یک مورد سلول زدایی بافت لثه کامی انسان و آماده سازی مدلی سه بعدی (3D matrix) برایکاربرد در تحقیقات مقدماتی مهندسی بافت لثه
مجتبی چروی *1، ناصر مهدوی شهری 1، جواد بهارآرا 1 ، سیدعلی بنی هاشم راد 2، جینا خیاط زاده 1 ،
خدیجه نژاد شاهرخ آبادی1 ،سمیه نادری 1
1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، ایران
2- دانشکده دندانپزشکی و مرکز تحقیقات دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: Mojtaba_cheravi@yahoo.com
تاریخ دریافت: 26/5/1390 تاریخ پذیرش: 17/8/1390
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تهیه شبکه خارج سلولی (ماتریکس) سه بعدی از بافت لثه کامی و بررسی امکان کاربرد داربستهای طبیعی (Scaffolds) تهیه شده در تحقیقات کشت سلولی و مهندسی بافت میباشد.
مواد و روشها: به منظور تهیه داربستها، بافت لثه کامی انسان به صورت بیوپسی تهیه و سلول زدایی به روش فیزیکی (قرار دادن در تانک ازت و شستشو با آب مقطر) شیمیایی با درصدهای متفاوتی ازسدیم دودسیل سولفات SDS (غلظت های 1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/0 درصد) در 5 گروه انجام شد. سپس جهت تست داربست سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد محلول SDS، از سلولهای شبه جنینی بافت بلاستما برای کشت بر روی این داربست سه بعدی استفاده گردید.
نتایج: کاهش درصد SDS به پایین تر از 5/0درصد به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت شد (P<0/05). مطالعه میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت نفوذ سلولی، مهاجرت، چسبندگی و تمایز را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان میدهد که امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. از طرف دیگر نتایج مطالعات هیستولوژیک نشان میدهد که داربستهای سلولزدایی شده لثه کامی می تواند همچون لثه آزاد داربست زیستی سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلولها باشد. آزمایشات بیشتر جهت تعیین ماهیت سلولهای تمایز یافته میتواند به پیشرفت دانش ما در رابطه با بر هم کنشهای سلول- ماتریکس کمک کنند.
واژگان کلیدی: بافت بلاستما، سدیم دودسیل سولفات، ماتریکس خارج سلولی، مهندسی بافت
مقدمه
مهندسی بافت یکی از علوم جدید است که در سال های اخیر در درمان ضایعات بافتی و اندامی و حتی جایگزینی کامل یک اندام، بسیار مورد توجه قرار گرفته است (1). مهندسی بافت مولد یک حوزه مطالعاتی جدید است که در آن اصول مهندسی و بیولوژی را جهت اصلاح بافت زنده آسیب دیده بکار میگیرد و موجب تجدید، ترمیم وحفظ عمل بافت می شود (2). داربست، سلول و فاکتورهای رشد، سه رکن اصلی در مهندسی بافت هستند. یک داربست ایده آل باید دارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امکان پاک سازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مکانیکی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد (3). علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی را به نحوی ارتقا دهد که سلولها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند (4). مولکول های ماتریکس خارج سلولی ECM (Extracellular matrix) مانند فیبرونکتین، لامینین و رسپتورهای گلیکوپروتئینی سطح سلولی آنها در مهاجرت و تمایز سلولی نقش دارند. در واقع اجزای ماتریکس خارج سلولی زیر بنای مهندسی بافت را تشکیل میدهند. دینامیک سلول- ماتریکس نقش مهمی در تسهیل و سازماندهی بسیاری از فرایندهای سلولی بازی میکند. ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش اتصالی و داربستی برای سلولها، به آماده سازی و جداسازی فاکتورهای رشد مورد نیاز سلولها کمک میکنند. با توجه به ویژگی فوق، استفاده از داربست های طبیعی حاصل از سلولزدایی بافتهای موجودات زنده مفید بنظر میرسد (5). سلول زدایی فرآیندی است که طی آن تمامی سلولهای یک اندام یا بافت از آن جدا میشوند، به طوری که فقط شبکه خارج سلولی و چهارچوب ما بین سلولها به صورت دست نخورده باقی بماند. سلول زدایی از بافتها و ارگانها جهت استفاده از ماتریکسهای خارج سلولی برای ایجاد داربستهای زیستی به طور موفقیت آمیزی در مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی انجام شده است (6). اولین درخواستهای کلینیکی به منظور استفاده از سلول های انسانی در مهندسی بافت برای بافت پوست با استفاده فیبروبلاستها ، کراتینوسیت ها و داربست در سال 1980 آغاز شد. اندکی پس از آن تلاش به منظور بازسازی بافتهای دهانی، استخوان اسفنجی و پریودونتیکس یا اطراف دندانی انجام گرفت (7). تاثیر مهندسی بافت در دندانپزشکی ناشی از درخواستهای بی شمار آن در بافتهای مرتبط با حفره دهانی بوده، چرا که درمانهای پزشکی برای ضایعات بافتهای دهانی و دندانی سالیانه میلیونها انسان را در بر میگیرد (8). بافت دهانی به دلیل وجود سلولهای بنیادی جوانه دندانی با خصوصیاتی مشابه سلولهای بنیادی مزانشیمی قادر به تمایز به عاج دندان، سلولهای چربی و عصبی در شرایط آزمایشگاهی و بدنی، همواره مورد توجه مهندسی بافت بوده است (9). با توجه به اینکه بافت لثه خود از سه قسمت لثه چسبنده، لثه آزاد و مارژینال و لثه چسبنده تشکیل شده، حاوی مقدار زیادی الیاف کلاژن است. کلاژن به عنوان داربست طبیعی دارای سازش پذیری زیستی بالا به عنوان یکی از ویژگیهای داربست طبیعی است و امکان جایگزینی آسان سلول و فاکتور رشد را فراهم میکند (10،11). بافت بلاستما گروهی از سلول های تمایز نیافته ای هستند که در بخش هایی از بدن یک موجود زنده با شباهت بسیار زیادی به سلول های جنینی قادر به تقسیم و تمایز میباشند و در پیدایش اعضا یا فرایند ترمیم و بازسازی بافتهای آسیب دیده مشارکت مینمایند. گوش خرگوش مدل مناسبی برای مطالعات بافت بلاستما بوده و با ایجاد سوراخی در لاله گوش تمام بافت از دست رفته در آن محل دوباره بازسازی میگردد. تشکیل این بافت و بازسازی مجدد در ناحیه آسیب دیده طی فرایندهای تکثیر سلولی، سنتز اجزای ماتریکس خارج سلولی، مهاجرت و تمایز سلولی صورت میگیرد (12).
هدف از انجام این تحقیق در مرحله اول، تهیه داربستهای سه بعدی مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی بافت لثه کامی انسان بود. همچنین تاثیر غلظتهای مختلفی از سدیم دودسیل سولفات SDS)) به عنوان یک دترجنت یونی که در فرایندهای سلولزدایی استفاده میشود مورد بررسی قرار گرفت. در بخش دوم این تحقیق جهت آزمایش داربست، بر هم کنش بین داربست تهیه شده و بافت بلاستمای حاصل از گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
سلول زداییبافت لثه کامی به منظور تهیه داربست طبیعی: قطعات بافت لثه کامی انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی از نواحی از سطح کامی دندان که نیاز به اعمال جراحی لثه از قبیل: افزایش طول تاج دندان به منظور انجام ترمیم و یا از ناحیه جراحی دندان های عقل نهفته فک بالا، با اجازه و توجیه بیماران و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید (این قطعات اضافی در حالت طبیعی دور ریخته میشوند). نمونه ها متعلق به مردان و زنان 20 تا 45 ساله، فاقد بیماری های سیستمیک و غیر سیگاری بودند. نمونهها پس از انتقال به آزمایشگاه به قطعات یکسان برش داده شدند. نمونه های حاصل توسط سرم فیزیولوژی شستشو و حدود یک هفته در فریزر در دمای 4- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. جهت فریز کردن آنی، نمونه ها درون کرایوتیوب های 2 میلی لیتری قرار گرفته و بمدت 2 دقیقه وارد ازت مایع با دمای 196- درجه سانتیگراد گردیدند. سپس برای ذوب شدن سریع به مدت 5 دقیقه نمونه ها در آب مقطر با دمای 27 درجه سانتیگراد وارد شدند. این فرایند، 6 بار تکرار شد و بعد از آن نمونه ها برای شستشو به مدت یک ساعت در محلول (PBS) phosphate-buffered saline قرار داده شدند. سپس نمونه ها به 5 گروه تقسیم و 24 ساعت در شوینده ی سدیم دو دسیل سولفات ((SDS, Merck با 5 غلظت مختلف (1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/ 0درصد) قرار گرفتند و در طی این مدت به آرامی مخلوط شدند. بعد از آن به منظور خروج هسته ها، بقایای سلولی و همچنین شوینده ها از بافت، نمونه ها به مدت 2 ساعت در PBS قرار گرفته، و سپس چندین مرحله با آب مقطر شستشو داده شد. جهت فیکس کردن نمونه ها از محلول بوئن استفاده گردید (برای ساخت این محلول مقدار 75 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع با 25 میلی لیتر فرمالین 37 درصد و 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال مخلوط شد). بعد از انجام مراحل آبگیری، پارافین دهی و قالب گیری، مقاطع پارافینی از بافت های سلولزدایی شده در هر گروه تهیه و به منظور بررسی موفقیت سلولزدایی، از رنگ آمیزی های هماتوکسیلین- ائوزین و پیکروفوشین استفاده شد. برای شمارش سلول هایی که در فرایند سلول زدایی از بین نرفته و در ماتریکس حضور دارند، از هر کدام از گروه های که با درصد متفاوتی از SDS سلول زدایی شده اند به طور تصادفی 20 مقطع بافتی انتخاب و با استفاده از عدسی مدرج میکروسکوپ نوری و با درشت نمایی x40 شمارش شد. جهت تعیین اختلاف معنی دار، با استفاده از نرم افزار آماریMinitab ویرایش 16 و آنالیز ANOVAتست Tukey انجام گرفت و نمودار با استفاده از نرم افزار Excel رسم گردید. از نظر آماری مقادیر(05/0P<) معنی دار در نظر گرفته شد.
کشت بافت: جهت کشت، از نمونه های سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد SDS که به طور کامل سلول زدایی شده بودند استفاده شد. بعد از سلول زدایی، نمونه ها به مدت نیم ساعت در الکل 70 درجه و به مدت یک ساعت در PBS استریل قرار داده شدند. در آخرین مرحله نمونه ها به مدت 24 ساعت در محیط کشت، DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium Euro clone) همراه با 15 درصد سرم جنینی گاوی FBS (Fetal bovine derum, biosera) در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با CO2، 5 درصد نگهداری شدند.
تهیه بافت بلاستما: جهت تهیه بافت بلاستما از خرگوشهای نر سفید نژاد نیوزلندی 8-6 ماهه با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه تحقیقاتی سرم سازی رازی مشهد تهیه شده بودند، استفاده گردید. در تمام زمان استفاده از این حیوانات، آن ها در حیوان خانه دانشگاه نگهداری شدند و تحت یک رژیم غذایی پایه به صورت انفرادی در قفس و با درجه حرارت کنترل شده 2 ± 20 درجه سانتی گراد و روشنایی 12 ساعت در شبانه روز قرار داشتند. با رعایت نکات اخلاقی و بعد از بی حس کردن گوش خرگوش توسط لیدوکائین، با استفاده از دستگاه پانچ چند سوراخ به قطر 2 میلی متر در لاله گوش خرگوش ایجاد شد و بعد از گذشت سه روز در محل سوراخ اولیه، پانچ دیگری به قطر 4 میلی متر زده شد و حلقه ی بلاستمایی جدا گردید. بعد از جدا سازی حلقه بلاستمایی، جهت حذف آلودگی چندین بار با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده شد.
قرار دادن داربست آماده شده درون بلاستما و مطالعه بافت شناسی: بعد از آماده سازی داربست و بافت بلاستما، در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل داربست های تهیه شده در میان حلقه های بلاستمایی قرار داده شدند و در ظروف شش خانه ای کشت قرار گرفتند. در هر خانه میزان 4 میلی لیتر محیط کشتDMEM با 15 درصد FBSو 500 میکرو لیتر آنتی بیوتیک پنیسیلین/ استرپتومایسین ریخته شد. سپس نمونهها به انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با CO2، 5 درصد منتقل گردید.
به منظور بررسی مهاجرت سلولها از حلقه بلاستمایی به داربست، تا 25 روز کشت ادامه یافت. طی روزهای مختلف (5، 10، 15 ، 20، 25) نمونه های کشت یافته به منظور مطالعات بافت شناسی برداشته شده، در محلول بوئن فیکس و پاساژ بافت مطابق روش معمول انجام شد. به منظور مشاهده رفتار سلولهای مهاجر از بلاستما به درون داربست از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و پیکروفوشین استفاده شد.
نتایج
نتایج سلول زدایی
بافت لثه کامی سلول زدایی شده باSDS 1/0 درصد تا حدی شدت رنگ پذیری ماتریکس نسبت به نمونه های کنترل کاهش پیدا کرده بود (شکل1) و لایه اپی تلیوم همچون یک لایه تور مانند با حفظ اتصالات بین سلولی که فاقد هسته و مواد سیتوپلاسمی بوده کاملا به لایه بازال و بافت همبند متصل باقی مانده بود (شکل 2، A و B). در غلظت 25/0 درصد SDS، جدا شدن اپی تلیوم از بافت همبند و لایه بازال در برخی نواحی قابل مشاهده بود (شکل 2، C و D). در غلظت 5/0 درصد SDS لایه اپی تلیوم حذف ولی لایه بازال باقی مانده بود. از تغییرات واضح در بافت همبند می توان به تخریب الیاف کلاژن اشاره نمود که باعث ایجاد تخلخل در ماتریکس شده بود (شکل2، E و F). در غلظت 75/0 درصدSDS لایه بازال در اغلب نواحی حذف شده بود و تخلخل ماتریکس نیز افزایش یافته بود (شکل2، G و H). و در نهایت در غلظت 1 درصد SDS چهارچوب اپی تلیوم و لایه بازال کاملا خذف شده بود (شکل 3). با کاهش غلظت SDS احتمال حضور سلول ها در داربست افزایش می یابد (نمودار 1).
نتایج کشت بافت
رفتار سلول های بافت بلاستما در داربست سه بعدی لثه کامی در شرایطin vitro بعد از5، 10، 15، 20، 25روز بررسی شد. نتایج هیستولوژیک نشان داد که 5 روز پس از کشت هیچ سلول بلاستمایی به داربست نفوذ نکرده بود. مهاجرت سلول های بلاستما از روز 10 در ماتریکس مشاهده شد و در روزهای 15 و 20 و 25 به ترتیب سلول های بیشتری درماتریکس نفوذ کرده بود. از روز 15 به بعد تمایز سلول ها به شبه فیبروبلاست مشاهده شد (شکل 4).
نمودار 1: میانگین تعداد سلول ها در داربست های سلول زدایی شده با درصد های متفاوتی از سدیم دودسیل سولفات(SDS) میانگین ها به صورت Mean±SEM نمایش داده شدند (P= 0.001)***نسبت به غلظت 1درصد.
شکل 1: نمونههای بافت لثه کامی کنترل. A) فلش نشان دهنده اپیتلیوم کراتینیزه. (بزرگ نمایی X100). B) بافت همبند. فلشها نشان دهنده فیبروبلاستها میباشد (بزرگ نمایی X400). رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.
شکل 2: بافت سلول زدایی شده لثه کامی در غلظت های مختلف سدیم دودسیل سولفات(SDS): (A-B) غلظت 1/0 درصد، فلشها نشان دهنده لایه اپیتلیوم بوده که به بافت همبند متصل هستند. (C-D) غلظت 25/0 درصد، فلش ها نشان دهنده جدا شدن اپیتلیوم از بافت همبند میباشند. F)-E) غلظت 5/0درصد، فلش ها در شکل E تخریب الیاف کلاژن و در شکل F بقایای اپیتلیوم بر روی بافت همبند را نشان میدهند. H)-G) غلظت 75/0 درصد، فلش ها نشان دهنده تخلخل ماتریکس میباشند. A) ، C، E، G) رنگ آمیزی پیکروفوشین جهت نشان دادن رشته های کلاژنB) ، D، F، ( H رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (بزرگ نمایی X 400).
شکل3: بافت سلول زدایی شده لثه کامی با غلظت 1 درصد A) فلش نشان دهنده از بین رفتن اپی تلیوم به طور کامل است (بزرگ نمایی 100X). B) بافت همبند که به طور کامل سلول زدایی شده. فلش نشان دهنده تخلخل به وجود آمده در ماتریکس است (بزرگ نمایی X 400). رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.
شکل4: مطالعه برهمکنش بین بافت بلاستما و داربست لثه کامی در روز 25 پس از کشت. A) نمای کلی از داربست و سلولهای بلاستمایی نفوذ یافته به داخل داربست که توسط فلشها نشان داده شدهاند. (بزرگ نمایی X400). B) سلول های نفوذ یافته و تمایز آنها به سلولهای شبه فیبروبلاست (بزرگ نمایی X1000) رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.
بحث
فرایندهای ریخت زایی و اندام زایی، تحت کنترل کمپلکسی از مکانیسمهای تنظیمی هستند که تعیین کننده ویژگیهای سلولها و بافت های مختلف، به سمت سازمان یابی صحیح در بافت و یا اندام می باشد. مولکول های تنظیم کننده این مکانیسمهای تنظیمی هم مواد قابل انتشاری هستند که توسط رسپتورهای سطح سلولی ویژه شناسایی می شوند و هم اجزای ماتریکس خارج سلولیاند که اعمال متقابل سلول- سلول و سلول- ماتریکس را تنظیم میکنند و رفتار سلول و بافت مورد نظر را تعیین مینمایند (13). در این پژوهش ابتدا با عملیات سلولزدایی، داربستی مشتق شده از ECM لثه کامی به دست آمد که از دو روش فیزیکی و شیمیایی برای این کار استفاده شد. در روش فیزیکی از انجماد آهسته و سریع استفاده شد و استدلال این کار این بود که تشکیل کریستال های یخ می تواند به تخریب غشاء کمک کند. همچنین در مرحله شیمیایی سلولزدایی از SDS به عنوان ماده سلول زدا استفاده گردید.
طبق نتایج، کاهش غلظت SDS به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت لثه کامی شد که این کاهش غلظت، تغییرات هیستولوژیکی متفاوتی را به دنبال داشت. یکی از موارد مهم در سلول زدایی، راندمان حذف سلول از بافت می باشد که وابسته به نوع بافت و روشهای فیزیکی، شیمیایی و آنزیماتیک به کار گرفته شده میباشد. هر یک از این روشها در فرایند سلولزدایی روی ترکیبات بیوشیمیایی داربست تاثیر دارند (6). با توجه به نحوه عمل دترجنت های یونی از قبیل SDS در حل کردن سلول و غشای هسته و همچنین حفظ ماهیت پروتئینهای سیتوپلاسمی، این نوع دترجنت ها تاثیر کارآمدی در سلول زدایی بافت ها دارند. علاوه بر آن با توجه به تاثیر میزان غلظت این مواد در ایجاد سمیت و همچنین آسیبهایی که به کلاژن وارد می کنند، غلظت های استفاده شده از این نوع دترجنت ها نیز بسیار مهم و ضروری میباشد (14 ،15 ،16). از این رو در این تحقیق غلظت های متفاوتی از SDS را برای ایجاد یک داربست مطلوب مورد آزمایش قرار گرفت. Schaner و همکاران (17) با استفاده از SDS با غلظت 1/0 درصد، بافت دیواره رگ را به میزان 96 درصد سلول زدایی کردند و توسط میکروسکوپ الکترونی و مطالعات ایمونوهیستوشیمی، ثابت کردند که در این غلظت SDS، ماتریکس خارج سلولی و ساختار غشا ی پایه حفظ شده و بافت مقاومت کافی را برای پیوند و استفاده در مطالعات مهندسی بافت دارا می باشد. بافت همبند لثه که دارای مقادیر زیادی کلاژن نوع I و III می باشد، بخش اصلی داربست را تشکیل داده است و از آنجا که تراکم کلاژن بر روی رفتار های سلولی موثر می باشد، حفظ آن پس از فرایند سلولزدایی حائز اهمیت است. همچنین حفظ غشاء پایه و اپی تلیوم در تهیه داربست از نکات جالب توجه می باشد زیرا میتواند تاثیر مهمی بر روی رفتارهای سلولی از جمله مهاجرت و تمایز سلول ها به کراتینوسیت ها داشته باشد (18). همانطور که در قسمت نتایج اشاره شد کاهش غلظت SDS به پایین تر از 5/0 درصد تفاوتهای قابل ملاحظه ای نسبت به غلظتهای بالاتر نشان میدهد. نخستین تفاوت میزان تخلخل کمتر داربست و به هم پیوستگی بافت همبند بود. دومین تفاوت حفظ ساختار اپی تلیوم بر روی بافت همبند بود که با توجه به تخریب هسته و اجزای سلولی اپی تلیوم به شکل یک توری خالی از سلول باقی مانده بود. همچنین این نکته قابل ذکر است که در داربستهایی که با غلظت پایین تر سلول زدایی شدند احتمال حضور سلولها نیز افزایش می یابد که این خود از موانع و مشکلات در جهت تهیه داربست مطلوب می باشد. به نظر می رسد با توجه به حفظ ساختار اپی تلیوم، غشای پایه نیز حفظ شده باشد اما این امر نیازمند بررسی با مطالعات ایمنوهیستوشیمی و رنگ آمیزیهای اختصاصی می باشد تا نتایج رضایت بخشی را به همراه داشته باشد.
با این توضیح چرا داربست های زیستی که از ماتریکس خارج سلولی تشکیل شده اند برای کاربردهای پزشکی ترمیمی و جایگزینی بافت ها یا ارگان ها مناسب هستند؟ مطالعات نشان داده است که ECM شامل اجزای ساختاری مانند انواع کلاژن، گلیکوپروتئین ها، اسیدهیالورونیک، گلیکوزآمین گلیکان ها، رتیکولین و الاستین است که جهت اتصال ECM با گیرنده های سلولی مناسب هستند. ECM در واقع نمایان گر محصولات ترشح شده از سلولهای مستقر در هر بافت یا ارگان می باشد (19). Karring و همکارانش (20) در مطالعه ای که بر روی هفت میمون با پیوندهای خاصی که در ناحیه حفره دهانی انجام داده بودند با در نظر گرفتن کراتینیزه شدن اپی تلیوم غیر کراتینیزه توسط بافت همبند، مشخص گردید که بافت همبند در زیر اپی تلیوم باعث تمایز اپی تلیوم پوشاننده می گردد. اثرات متقابل بافت های Epithelio-Mesenchymal در دوران جنینی موجب تشکیل بافت ها و ارگان های مختلفی از قبیل، پر، پولک، دندان ها، اپی درمیس، کبد، غدد بزاقی و مخاط دهان میگردد. و مشخص شده است که بافت همبند در زیر اپی تلیوم باعث تمایز اپی تلیوم پوشاننده می گردد (21). در واقع تفاوت سلولی یک اپی تلیوم کراتینیزه با غیر کراتینیزه در تنوع سایتوکراتینهای موجود در لثه است که کراتینیزه شدن را به همراه خواهد داشت. با توجه به مطالب عنوان شده می توان گفت که تفاوت در بافت همبند زیرین می تواند تنوع در سایتوکراتین ها را باعث گردد (22). پس ماتریکس خارج سلولی بافت همبند که توسط فرایند سلول زدایی بدست می آید می تواند در جهت ایجاد داربست های مناسب برای تحقیقات مهندسی بافت مورد استفاده قرار بگیرد. Ott و همکارانش (23) با بکار بردن قلب های گرفته شده از موش و بکار بستن تکنیک سلول زدایی کامل از اندام بر روی آنها و نهایتا تزریق ترکیبی از سلول های زنده به این اندامها، موفق به تولید بافت فعال قلبی شده اند. Guo-feng و همکارانش (24) توسط آنزیم های تریپسین و ریبونوکلئاز، آئورت جنین خوک را سلول زدایی کردند که نتیجه آن تولید داربستی جهت مهندسی بافت رگی بود. نتایج آنها نشان داد که سلول های اندوتلیالی چسبندگی و تکثیر خود را بر روی این داربست بخوبی حفظ می کنند. Long و همکاران (25) دریچه قلب خوکی را با غلظت های مختلف تریپسین و سپس DNase تیمار کردند. این دریچه با استفاده از میکروسکوپ نوری، SEM و TEM مورد بررسی قرار گرفت که نتیجه آن تولید یک داربست فاقد سلول بود. بعد از این سلول های اندوتلیال خوکی و انسانی و همچنین میوفیبروبلاست های سگی به روی این داربست اضافه شد. آنالیز های میکروسکوپ الکترونی و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و ایمنوهیستوشیمی نشان داد که این سلولها به سطح و درون این داربست نفوذ کرده و شروع به رشد و تکثیر نموده اند.
در حالت طبیعی بعد از پانچ گوش خرگوش، رشد اپی تلیوم گوش خرگوش نژاد نیوزلندی به صورت رشد به طرف مرکز می باشد و این باعث ترمیم سوراخ ایجاد شده در گوش خرگوش در شرایط in vivo میگردد. در اینجا از این خاصیت گوش خرگوش استفاده شد و بعد از قرار دادن حلقه بلاستمایی در مجاورت داربست، برهمکنش آن در روزهای مختلف بررسی گردید (26). توسلی و همکاران (27) با کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی نشان دادند که کشت بافت بلاستما که دارای سلول های پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد می تواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایطin vitro باشد.
مطالعه در روز پنجم بعد از کشت نشان داد که هیچ سلولی به درون داربست مهاجرت نکرده است. مهاجرت سلول های بلاستمایی از روز پانزدهم بعد از کشت آغاز شد و اوج نفوذ سلول ها به درون داربست در روز بیست و پنجم مشاهده شد. در این روز تغییر شکل سلول های بافت بلاستما و کشیده شدن این سلولها را میتوان مشاهده کرد.
Yamada K و همکارانش (28) با کشت فیبروبلاست های لثه بر روی اسفنج هایی از کلاژن نوترکیب تیپ I وIII انسانی کشت دادند و این اسفنج را در محیط کشت قرار داده، تکثیر فیبروبلاست ها پس از چند روز در داربست محتوی کلاژن تیپ III نسبت به نوع I بیشتر بود و نشان دادند که این لثه تشکیل شده در محیط کشت به دلیل تکثیر خوب سلولی و آزاد شدن فاکتور رشد مشتق شده از اندوتلیال رگی در محیط کشت می تواند در درمان کلینیکی برای بیماریهای لثه استفاده شود. با توجه به این که بافت لثه کامی شامل مقادیر بالایی کلاژن نوع I و III می باشد در نتیجه می تواند عاملی برای القاء تمایز سلولهای بافت بلاستما به سمت فیبروبلاست باشد.
نتیجه گیری
نتایج ما در بخش اول این پژوهش یعنی سلول زدایی از بافت لثه کامی انسان و تشکیل یک داربست سه بعدی از ECM این بافت نشان داد که غلظتهای متفاوتی از دترجنت یونی SDS که به طور گسترده در فرایندهای سلول زدایی مورد استفاده قرار میگیرد، نتایج متفاوتی را در پی دارد. نتایج این تحقیق نشان میدهد امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. ما در قسمت پایانی این آزمایش جهت تست داربست، از سلولهای شبه جنینی بافت بلاستما لاله گوش خرگوش نر نیوزلندی برای کشت در داربست سه بعدی تهیه شده با غلظت 1 درصد که به طور کامل سلول زدایی شده بود استفاده کردیم تا تاثیرات ماتریکس خارج سلولی را بر روی این سلول های تمایز نیافته مشاهده کنیم. نتایج اولیه و بررسیهای هیستولوژیکی نشان داد که داربستهای سلول زدایی شده لثه کامی میتواند مدل سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلولها باشد.
تشکر و قدردانی
مراتب سپاس بی پایان خود را از تمامی اساتید بزرگوارم ابراز داشته و همچنین از مدیریت محترم گروه زیست شناسی و معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد مشهد که تامین کننده بخشی از هزینههای مالی پایان نامهام بودند تشکر مینمایم.