نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: ارقام بسیار متنوعی از انگور در ایران کشت میشوند که در بین آن ها، ارقام بی دانه جز بهترین ارقام خشکباری انگور هستند. هدف از این پژوهش، پی بردن به پتانسیل نشانگر ملکولی RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) برای تعیین دوری و یا نزدیکی ارقام و یا احتمالاً یکی بودن برخی از آن ها صورت گرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه، 21 رقم انگور بی دانه و 11 آغازگر RAPD مورد استفاده قرار گرفتند.
نتایج: از بین ارقام استفاده شده، 8 آغازگر تکثیر DNA را بخوبی انجام و در بین ژنوتیپها چند شکلی بالایی نشان دادند. مجموعاٌ 117 باند (آلل) چند شکل به دست آمد که بیشترین تعداد باند دهی مربوط به آغازگر H و کمترین تعداد مربوط به آغازگر B بود. درصد باندهای چند شکل در بین آغازگرها از 4/71 برای آغازگر B تا 100 درصد برای آغازگر C متغیر و متوسط بانددهی برای هر آغازگر 8/12 باند بود. در تجزیه آماری، باندهای در محدوده 3000-200 جفت باز که دارای تکرار پذیری بالایی بودند انتخاب و در محاسبه وارد شدند. تجزیه کلاستر با استفاده از ضریب تشابه جاکارد مبتنی بر روش UPGMA (Unweighted pair-group method of arithmetic average) انجام و ارقام در 3 گروه طبقه بندی شدند. دامنه ضریب تشابه از 21/0 تا 716/0 با میانگین ضریب تشابه 46/0 تعیین گردید.
نتیجه گیری: بیشترین تشابه بین ارقام عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر و کمترین تشابه بین ارقام خلیلی بی دانه و عسگری نیشابور تشخیص داده شد. احتمالاً دو رقم عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر دارای مبدا یکسانی هستند که در طی زمان به مکانهای مختلفی برده شدهاند.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigation on Genetic Variation in Seedless Grapevine Cultivars, Using RAPD Molecular Marker
چکیده [English]
Aim: A large variety of grapevine cultivars are cultivated in Iran, amongst which seedless cultivars are regarded as the best one to make dried-fruit. The aim of this research was to discover the potential of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) molecular marker to identify similarity/dissimilarity or probable homogeneity between grape cultivars.
Materials and methods: In this study, 21 seedless grape cultivars and 11 RAPD primers were used.
Results: out of 11, eight primers could amplify DNA fragments very well and showed reasonable polymorphism between cultivars. Totally 117 polymorphic bands were produced at which primer H produced the highest and primer B produced the lowest number of bands. The percentage of polymorphism ranged from 71.4 % for primer B to 100 % for primer C and the average number of bands per primer was 12.8. For statistical analysis, only the reproducible bands which their length was between 200-3000 bp were considered. Cluster analysis was carried out using Jaccard’s similarity coefficient based on UPGMA (Unweighted pair-group method of arithmetic average) method and the cultivars were classified in three main groups. The range of similarity coefficient with the average of 0.462 was determined between 0.208 to 0.716.
Conclusion: Asgari Ghermez and Asgari Meshkin shahr cultivars showed the highest similarity and Khalili Beedaneh and Asgari Neishabour showed the lowest similarity. Therefore it could be assumed that Asgari Ghermez and Asgari Meshkinshahr cultivars posses the same origin but have been moved to different places in the course of time.
کلیدواژه‌ها [English]
- genetic variation
- Grape
- Polymorphism
- RAPD technique
مقاله پژوهشی مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی)
جلد 2، شماره 2، تابستان 1390، 106-99
بررسی تنوع ژنتیکی در ارقام بی دانه انگور توسط نشانگر ملکولی RAPD
بهروز جداری کوهی، قاسمعلی گروسی، رامین حسینی*
- دانشگاه بین المللی امام خمینی قزوین، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: r.hosseini@ikiu.ac.ir
تاریخ دریافت: 8/6/1390 تاریخ پذیرش: 8/8/1390
چکیده
هدف: ارقام بسیار متنوعی از انگور در ایران کشت میشوند که در بین آن ها، ارقام بی دانه جز بهترین ارقام خشکباری انگور هستند. هدف از این پژوهش، پی بردن به پتانسیل نشانگر ملکولی RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) برای تعیین دوری و یا نزدیکی ارقام و یا احتمالاً یکی بودن برخی از آن ها صورت گرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه، 21 رقم انگور بی دانه و 11 آغازگر RAPD مورد استفاده قرار گرفتند.
نتایج: از بین ارقام استفاده شده، 8 آغازگر تکثیر DNA را بخوبی انجام و در بین ژنوتیپها چند شکلی بالایی نشان دادند. مجموعاٌ 117 باند (آلل) چند شکل به دست آمد که بیشترین تعداد باند دهی مربوط به آغازگر H و کمترین تعداد مربوط به آغازگر B بود. درصد باندهای چند شکل در بین آغازگرها از 4/71 برای آغازگر B تا 100 درصد برای آغازگر C متغیر و متوسط بانددهی برای هر آغازگر 8/12 باند بود. در تجزیه آماری، باندهای در محدوده 3000-200 جفت باز که دارای تکرار پذیری بالایی بودند انتخاب و در محاسبه وارد شدند. تجزیه کلاستر با استفاده از ضریب تشابه جاکارد مبتنی بر روش UPGMA (Unweighted pair-group method of arithmetic average) انجام و ارقام در 3 گروه طبقه بندی شدند. دامنه ضریب تشابه از 21/0 تا 716/0 با میانگین ضریب تشابه 46/0 تعیین گردید.
نتیجه گیری: بیشترین تشابه بین ارقام عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر و کمترین تشابه بین ارقام خلیلی بی دانه و عسگری نیشابور تشخیص داده شد. احتمالاً دو رقم عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر دارای مبدا یکسانی هستند که در طی زمان به مکانهای مختلفی برده شدهاند.
واژگان کلیدی: انگور، تنوع ژنتیکی، چند شکلی، تکنیک RAPD
مقدمه
انگور از تیره Amplidaceae است که آن را Vitaceae نیز مینامند. گونههایی که در موکاری استفاده میشوند و ارزش تجاری دارند از جنس Vitis هستند. این جنس دارای دو زیر جنس به نامهای V. muscadine و V. euvitis است (1). زیر جنس Muscadine دارای 40=n2 کروموزوم و زیرجنس Euvitis دارای 38=n2 کروموزوم میباشد. گونههای زیرجنس V. euvitis دارای صفات زراعی ویژه و جالب توجه بوده و در موکاری استفاده می شوند بطوری که تا کنون 35 گونه از این زیرجنس شناخته شده است (2).
منابع ژنتیک گیاهی علاوه بر این که به عنوان عامل زیربنایی برای توسعه کشاورزی محسوب می شوند، به عنوان منبعی از سازگاری ژنتیکی و همچون سپری در برابر تغییرات عوامل محیطی عمل می نمایند (2). فرسایش ژنتیکی در اثر گسترش ارقام اصلاح شده، امنیت غذایی در جهان را با تهدید مواجه می کند. نیاز به حفظ و بکارگیری منابع ژنتیکی به عنوان محافظی در برابر مشکلات غیر قابل پیش بینی در آینده بر همگان آشکار است و چشم نگرانی از تضعیف تنوع منابع ژنتیکی به همراه تقاضای روزافزون به این منابع، آن ها را در مرکز توجه جهانی قرار داده است. تنوع مبنای گزینش فنوتیپی و ژنوتیپی و اساس اصلاح کمی وکیفی محصولات کشاورزی است. آگاهی از تنوع ژنتیکی و مدیریت منابع ژنتیکی ضمن حفاظت ذخایر ژنتیکی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامه اصلاحی ممکن می سازد (3). حذف تنوع ژنتیکی در توده های بومی و تولید ارقام یکنواخت، آینده را به خطر می اندازد. بنابراین شناسایی تنوع ژنتیکی و حفظ و نگهداری ذخایر توارثی، ضروری و یکی از اولین قدمها در یک برنامه به نژادی موفق است (4).
امروزه جهت تعیین تنوع ژنتیکی بین جمعیت های حفاظت شده علاوه بر شیوه های سنتی (مبتنی بر خصوصیات و نشانگرهای مرفولوژیک و فیلوژنیک) از ابزارها و نشانگرهای نوین مولکولی از جمله نشانگرهایDNAاستفاده می شود. لذا میزان چند شکلی بدست آمده از این نشانگرهای ژنتیکی، یکی از پارامترهای قابل ارزیابی برای مطالعه جمعیت ها و درک تفاوت های ژنتیکی بین آنها محسوب می شود (5).
نشانگرهایDNAمبتنی بر چند شکلی طبیعی درDNAهستند که اساس بهره برداری برای اهداف کاربردی را تشکیل می دهند. یک نشانگر باید چند شکل باشد تا آن را نشانگر نامید، بدین معنی که باید فرم های مختلفی از آن وجود داشته باشد. به عنوان مثال کروموزوم حامل ژن جهش یافته از کروموزوم حامل ژن معمولی، از طریق نشانگری که حمل می کند قابل تشخیص باشد (6). نشانگرهایDNAدر مدت یک دهه از آغاز پیدایش، تکاملی شگرف و تحسین برانگیز داشته اند. انواع مختلف نشانگرهایDNAبا تفاوت های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیاز بندی و تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیدند. بدون تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهایDNAداشته است.
با وجود گستردگی نشانگرهای مختلف DNA و ابداع روش ها و تکنیکهای جدیدتر، هنوز نشانگر ملکولی RAPD استفاده خود را جهت بررسیهای تنوع ژنتیکی حفظ نموده است. Collins و Symons (7) در سال 1993، برای اولین بار نشانگر ملکولی RAPD را در ارقام مختلف انگور استفاده نمودند. Ningsai و همکاران (8) با استفاده از آغازگرهای 24-17 نوکلئوتیدی RAPD انگشت نگاری ژنتیکی از انگور انجام دادند و نقشه ژنتیکی از این گیاه را رسم نمودند. از نشانگر ملکولی RAPD همچنین برای تعیین ارقام مقاوم به سفیدک پوری استفاده شده است (9). از دیگر بررسی ها می توان به برخی مطالعات که اخیراً در مورد انگور انجام شده اشاره کرد. Aras و همکاران (10) 14 رقم، Karatas و Agaglu (11، 12) به ترتیب 46 و 49 رقم انگور از ارقام انگور ترکیه، همچنین Bodea و همکاران (13) 26 رقم انگور رومانی و Gaffari و همکاران (14) ارقام انگور تونس را با استفاده از نشانگر ملکولی RAPD مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه شناسایی تنوع مولکولی و تعیین فواصل ژنتیکی 21 رقم مهم انگور بیدانه با روش RAPD مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
تعداد 21 رقم انگور بصورت نمونه برگی از کلکسیون ژرم پلاسم انگور تاکستان جمع آوری شد (جدول 1). نمونه های برگی سالم و جوان انتخاب و بعد از وزن کردن در ازت مایع تثبیت و سریعاً به داخل فریزر 70- درجه سانتیگراد برای استفاده های بعدی منتقل گردیدند.
جدول1. نام ارقام انگور مورد مطالعه قرار گرفته
|
شماره رقم |
نام رقم |
شماره رقم |
نام رقم |
شماره رقم |
نام رقم |
|
1 |
کشمشی قرمز1 |
8 |
کشمشی تبریز |
15 |
عسگری مشکین شهر |
|
2 |
عسگری قوچان |
9 |
کشمشی مشکین شهر |
16 |
عسگری قرمز |
|
3 |
عسگری نر قوچان |
10 |
کشمشی سفید |
17 |
بی دانه جرتوده |
|
4 |
کشمشی قرمز2 |
11 |
عسگری تبریز |
18 |
عسگری نیشابور |
|
5 |
خلیلی بی دانه |
12 |
کشمشی جرتوده |
19 |
بی دانه قوچان |
|
6 |
سرخک قرمز |
13 |
سرخک قوچان |
20 |
بی دانه قرمز قزوین |
|
7 |
کشمشی قرمز |
14 |
عسگری بیرجند |
21 |
بی دانه سفید قزوین |
استخراج DNA:استخراج DNA ژنومی مطابق با روش CTAB، Lodhi و همکاران (15) با اعمال کمی تغییرات در روش و بافر استخراج (w/v 2%CTAB ، Sodium EDTA20 میلی مولار، Tris-HCl 100 میلی مولار (8=pH) و NaCl 4/1 مولار) انجام شد. مقدار5/0 گرم بافت برگی در ازت مایع به صورت پودر درآمد. پودر حاصله به لوله 15 میلی لیتری فالکون منتقل و به ازای هر 1/0 گرم بافت، 5 میلی لیتر بافر استخراج و 50 میلی گرم PVP (polyvinylpyrrolidone) به عصاره سلولی اضافه گردید. لوله در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه نگه داری و هر 10 دقیقه به آرامی سر و ته گردید. هم حجم محتوای لوله، کلروفرم: ایزوامیل الکل (24:1) اضافه و در 6000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ (Beckman, 64R, USA) شد. سپس فاز رویی به لوله جدید منتقل و مجدداً با شرایط قبل، سانتریفیوژ گردید. مایع رویی به لوله جدید منتقل و مقدار 2/0 حجم NaCl 5 مولار و 2 حجم اتانول 95 درصد (v/v) سرد اضافه شد. بعد از ظاهر شدن کلاف های DNA، تیوب به مدت 10 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. رسوب تشکیل شده با اتانول 70 درصد (v/v) شستشو و مجدداً به مدت 10 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. مایع رویی دور ریخته شد و رسوب DNA خشک و در 300 میکرولیتر آب مقطر تزریقی حل گردید. برای از بین بردن RNA مقدار 3 میکرولیتر RNaseA (Sibenzyme, Russia) به هر 300 میکرولیتر محلول DNA اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمابه گذاری شد. جذب نوری نمونه های DNA به کمک دستگاهspectrophotometre (Labomed, UVD-3200, USA) در دو طول موج 260 و 280 نانومتر اندازه گیری شد. نسبت 280/260 در محدوده 7/1 تا 9/1 قرار داشت که نشان دهنده کیفیت مناسب نمونه ها بود. نمونه های DNA در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
جدول 2. مشخصات آغازگرهای استفاده شده.
|
آغازگرها |
توالی آغازگر ('5 به '3) |
درصد GC |
دمای اتصال Cº |
|
B |
CGGAGAGCGA |
70 |
40 |
|
C |
CCGGCATAGA |
60 |
36 |
|
D |
TGGGCTCGCT |
70 |
40 |
|
E |
ACTTGTGCGG |
60 |
40 |
|
F |
CCCACTGACG |
70 |
40 |
|
G |
CTGAGGAGTC |
60 |
36 |
|
H |
GGTCAACCCT |
60 |
36 |
|
J |
CCTCACCTGT |
60 |
36 |
انجام PCR:در این پژوهش 11 آغازگر ده نوکلئوتیدی تصادفی (شرکت سیناژن، ایران) استفاده شدند، که بر مبنای پیش آزمایش ها 8 آغازگر که دارای چند شکلی مطلوب تری بودند برای آزمایش های اصلی PCR انتخاب شدند (جدول 2). در هر واکنش PCR، مقدار میلی مولار 2MgCl2 ، 2/0 میلی مولار dNTP، 1 واحدTaq DNA polymerase ، 30 DNA نانوگرم و 1 میلیمولار آغازگر، در حجم نهایی 20 میکرولیتر استفاده شدند.
PCR طی 35 سیکل (Primus, MWG-Biotech, Germany) انجام شد. قبل از شروع واکنش برای واسرشته سازی DNA دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه اعمال گردید و سپس توالی هایDNA هدف طی 35 چرخه (واسرشته سازی در 94 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه، اتصال در 36 درجه سانتیگراد (یا 40 درجه سانتیگراد) به مدت یک دقیقه، و گسترش در 72 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه)، تکثیر شدند. آزمایش ها سه بار تکرار شدند.
تجزیه و تحلیل نتایج:تفکیک فرآورده های حاصل از تکثیر روی ژل آگارز 5/1 درصد (w/v) الکتروفورز گردید و سپس با محلول اتیدیوم بروماید (غلظت 1 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزی شدند. باندهای تکرار پذیر بر اساس حضور با عدد (1) یا عدم حضور با عدد (0) امتیاز دهی شدند و ماتریس شباهت دادهها بر اساس ضریب جاکارد تشکیل شد. دندروگرام شباهت نیز به روش UPGMAو به کمک نرم افزار SPSS ویرایش 13 ترسیم شد.
نتایج
بطور کلی در این مطالعه از 11 آغازگر ده نوکلئوتیدی اختیاری استفاده شد که حاوی 70-60 درصد GC بودند و توالی هیچکدام از آغازگرها دارای انتهای خود مکملی نبودند. از این تعداد، 8 آغازگر باندهای واضح و مشخص تولید کردند (شکل 1). تعداد کل باندهای چند شکل تولید شده 117 عدد بود که بیشترین بانددهی در آغازگر H با 17 باند و کمترین تعداد بانددهی در آغازگر B با 7 باند مشاهده گردید. دامنه اندازه باندهای تکثیر شده در محدوده بین 200 الی 3000 جفت بازی متغیر بود.
بر اساس ضریب تشابه جاکارد، دندروگرام توسط روش UPGMA و به کمک نرم افزار SPSS ترسیم شد و ارقام مورد مطالعه به 3 گروه و دو گروه بیرونی (out group) طبقه بندی شدند (شکل2).
شکل1: نمونه الگوی باندهای حاصل از الکتروفورز محصول PCR توسط آغازگر .G ستون L نشان دهنده نشانگر اندازه ملکولی و شماره‌های بالای تصویر نشان دهنده شماره ارقام مطابق جدول 1 می باشد.
شکل2: دندروگرام فاصله ژنتیکی 21 رقم بر مبنای ضریب تشابه جاکارد و گروه بندی آن ها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزار SPSS. اعداد نشان دهنده شماره ارقام مطابق جدول 1 می باشد.
گروه اول شامل رقم کشمشی قرمز 1 و کشمشی قرمز 2 بود. گروه دوم شامل ارقام عسگری قوچان، عسگری نر قوچان، خلیلی بی دانه، کشمشی سفید، بی دانه قرمز قزوین، بی دانه سفید قزوین، عسگری تبریز، عسگری مشکین شهر و عسگری قرمز بود. گروه بیرونی اول شامل رقم بی دانه قوچان بود. گروه سوم شامل ارقام سرخک قرمز کشمشی قرمز، کشمشی جرتوده، کشمشی تبریز، کشمشی مشکین شهر، سرخک قوچان، عسگری بیرجند و عسگری نیشابور بود. گروه بیرونی دوم شامل رقم بی دانه جرتوده بود. بر اساس میزان ضریب تشابه، بیشترین شباهت بین دو رقم عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر با ضریب تشابه 6/71 درصد و پس از آنها بین ارقام کشمشی تبریز و کشمشی مشکین شهر با ضریب تشابه 9/67 درصد بود. بیشترین فاصله ژنتیکی بین دو رقم خلیلی بی دانه و عسگری نیشابور با ضریب تشابه 8/20 درصد و بعد از آن دو رقم سرخک قرمز و بی دانه قوچان با ضریب تشابه 4/27 درصد دارای کمترین تشابه ژنتیکی بود.
بحث
به دلیل هزینه پایین، سادگی و نیاز به مقدار کم DNA، RAPD هنوز به عنوان یکی از نشانگرهای ملکولی برای تشخیص تنوع ژنتیکی و نزدیکی و یا دوری گونهها و ارقام در گیاهان بسیاری از جمله انگور مورد استفاده قرار می گیرد (10، 11، 12، 13، 14، 16، 17، 18). در کشور ترکیه بیش از 1200 رقم انگور وجود دارند که اسامی بسیاری از آن ها یکسان یا مشابهاند. ارقام انگور موجود در ایران نیز 1052 عدد گزارش شده است
(http://www.iana.ir/detailed_news.aspx?news_id=14162).
نتیجه گیری
در دو مطالعه که توسط Karatas و Agaglu (8، 9) با استفاده از نشانگر ملکولی RAPD انجام شد، مشاهده گردید که بسیاری از ارقام که نام های یکسانی داشتند و در مناطق مختلف کشت میشدند، از نظر ملکولی بین ارقامی قرار گرفتند که کمترین شباهت را با هم داشتند. آن ها استفاده از نشانگر ملکولی RAPD را برای شناسایی چنین تفاوت ها یا شباهت هایی بسیار مفید دانستند. عکس این مورد نیز ممکن است اتفاق بیفتد یعنی ارقامی از نقطه ای به نقطه دیگر کشور برده شده باشند و با اسامی دیگری در آن محل کشت شوند.
با توجه به نتایج بدست آمده می توان اظهار نمود که ممکن است این دو رقم عسگری قرمز و عسگری مشکین شهر یکسان و به دلیل مهاجرت به مناطق مختلف به دو نام متفاوت ثبت شده باشند. همچنین این موضوع در مورد دو رقم کشمشی تبریز و کشمشی مشکین شهر نیز صدق می کند. مشابه این نتیجه را با استفاده از نشانگر ملکولی SSR، Ramazani (19) روی 44 رقم انگور به دست آورد. بین 44 رقم انگور بیشترین شباهت را دو رقم عسگری نیشابور و عسگری مشهد با ضریب تشابه 96 درصد داشتند. با توجه به نزدیکی دو منطقه جمع آوری دو نمونه (مشهد و نیشابور)، وی نتیجه گیری کرد که به احتمال زیاد این دو رقم باید مبداء یکسانی داشته باشند.
ممکن است ارقام یکسانی در طی زمان و بر اثر مهاجرت به نقاط مختلف منتقل و نام های متفاوتی یافته باشند؛ در حالی که ممکن است از نظر مولکولی و یا مورفولوژیکی شباهت زیادی به هم نشان می دهند. استفاده از نشانگرهای ملکولی در بسیاری موارد به حل مشکلات به نژادگران کمک نموده است. در این مطالعه 21 رقم انگور بی دانه جهت بررسی شباهت و یا تفاوت با کمک نشانگر ملکولی RAPD مورد بررسی قرار گرفتند. برای دقیق تر انجام شدن کار پیشنهاد می گردد که از تعداد آغازگرهای بیشتری استفاده گردد و همچنین برای حصول اطمینان کامل از یکی بودن ارقامی با نام های مختلف، از نشانگر ملکولی دیگری مانند SSR، AFLP و نشانگر های مورفولوژیک نیز بهره گرفته شود و اطلاعات به دست آمده در کنار هم تفسیر شوند.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با کمک مالی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) انجام شد که به این وسیله تقدیر می گردد.
)