نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: از آنجایی که القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی یکی از روش های مناسب برای درمان سرطان بوده و یافتن ترکیبات ضدسرطان جدید به ویژه ترکیبات القاء کننده آپوپتوزیس اولویت تحقیقاتی محسوب میگردد، لذا در این مطالعه متابولیتهای محلول در اتر باکتری بومی ایران به نام Streptomyces sp. ABRIINW 111 جدا سازی و اثرات ضدسرطانی متابولیتها با استفاده از رده سلولی K562 لوسمی میلوییدی مزمن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها: سلولهای K562 با غلظتهای مختلف متابولیتهای محلول در اتر و برای مدت زمان 12 تا 72 ساعت تیمار شد. از آزمون دفع رنگ تریپان بلو و آزمون قطعه قطعه شدن DNA به ترتیب برای بررسی مهار رشد و وقوع آپوپتوزیس استفاده شد.
نتایج: متابولیتهای محلول در اتر باعث مهار رشد وابسته به غلظت و زمان در سلولهای K562 گردید، بطوری که میزان IC50 24 و 48 ساعت به ترتیب برابر 1000 و 400 نانوگرم بر میلیلیتر بود. به علاوه، این متابولیتها باعث کاهش معنیدار (05/0P <) در زیستایی سلولهای K562 شد. نتایج حاصل از مشاهدات میکروسکوپ نوری و آزمون قطعه قطعه شدن DNA حاکی از القای آپوپتوزیس در سلولهای K562 بود.
نتیجه گیری: به طور کلی، با توجه به نقایص به وجود آمده در فرآیند آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی و نیز وجود مقاومت دارویی در این سلولها، شناسایی ترکیبات جدید القا کننده آپوپتوزیس همانند متابولیتهای محلول در اتر میتواند برای مطالعات بیشتر در زمینه درمان سرطان کمک کننده باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Growth Inhibition and Induction of Apoptosis by Ether Soluble Metabolites of Streptomyces sp. ABRIINW 111 in Human Myeloid Leukemia K562 Cell Line
چکیده [English]
Aim: Since induction of apoptosis is an important strategy in cancer treatment, many attempts are in program to find new apoptotic inducer agents. Hence, ether soluble metabolites from Iranian native bacteria, Streptomyces sp. ABRIINW 111, were isolated and anti-cancer activity of these metabolites was studied using human chronic myeloid leukemia K562 cells.
Materials and methods: K562 cells were treated by various concentrations of these metabolites for 12- 72 h. Trypan blue exclusion test and DNA fragmentation assay were used to study growth inhibition and apoptosis occurrence, respectively.
Results: Ether soluble metabolites induced growth inhibition in K562 cells in a concentration- and time- dependent manner. IC50 values after 24 and 48 h treatment were 1000 and 400 ng/ml, respectively. Moreover, these metabolites caused significant decrease in K562 cells viability (P < 0.05). Light microscopy and DNA fragmentation assay results showed apoptosis induction in treated cell.
Conclusion: According to apoptosis deficient and drug resistance in cancer cells, identification of new apoptosis inducers such as ether soluble metabolites could be helpful in more investigations in cancer treatment.
کلیدواژه‌ها [English]
- Apoptosis
- Chronic myeloid leukemia
- Natural products
- Streptomyces
مقاله پژوهشی مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی)
جلد 2، شماره3، پاییز 1390، 234-225
مهار رشد و القای آپوپتوزیس توسط متابولیت های محلول در اتر باکتری Streptomyces sp. ABRIINW 111 در سلولهای K562 لوسمی میلوییدی انسان
سیّد محمّد امین موسوی1*، فریده قنبروند1، علیرضا دهناد2
1- گروه زیست شناسی جانوری، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
2- پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی شمال و شمال غرب، تبریز، ایران
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: moosav_m@ tabrizu.ac.ir
تاریخ دریافت: 2/8/1390 تاریخ پذیرش: 27/10/1390
چکیده
هدف: از آنجایی که القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی یکی از روش های مناسب برای درمان سرطان بوده و یافتن ترکیبات ضدسرطان جدید به ویژه ترکیبات القاء کننده آپوپتوزیس اولویت تحقیقاتی محسوب میگردد، لذا در این مطالعه متابولیتهای محلول در اتر باکتری بومی ایران به نام Streptomyces sp. ABRIINW 111 جدا سازی و اثرات ضدسرطانی متابولیتها با استفاده از رده سلولی K562 لوسمی میلوییدی مزمن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها: سلولهای K562 با غلظتهای مختلف متابولیتهای محلول در اتر و برای مدت زمان 12 تا 72 ساعت تیمار شد. از آزمون دفع رنگ تریپان بلو و آزمون قطعه قطعه شدن DNA به ترتیب برای بررسی مهار رشد و وقوع آپوپتوزیس استفاده شد.
نتایج: متابولیتهای محلول در اتر باعث مهار رشد وابسته به غلظت و زمان در سلولهای K562 گردید، بطوری که میزان IC50 24 و 48 ساعت به ترتیب برابر 1000 و 400 نانوگرم بر میلیلیتر بود. به علاوه، این متابولیتها باعث کاهش معنیدار (05/0P <) در زیستایی سلولهای K562 شد. نتایج حاصل از مشاهدات میکروسکوپ نوری و آزمون قطعه قطعه شدن DNA حاکی از القای آپوپتوزیس در سلولهای K562 بود.
نتیجه گیری: به طور کلی، با توجه به نقایص به وجود آمده در فرآیند آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی و نیز وجود مقاومت دارویی در این سلولها، شناسایی ترکیبات جدید القا کننده آپوپتوزیس همانند متابولیتهای محلول در اتر میتواند برای مطالعات بیشتر در زمینه درمان سرطان کمک کننده باشد.
واژگان کلیدی: آپوپتوزیس، استرپتومایسس، فرآوردههای طبیعی، لوسمی میلوییدی مزمن
مقدمه
آپوپتوزیس ((Apoptosis یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی که با ویژگیهایی همانند چروکیده شدن سلول، تشکیل اجسام آپوپتوتیک و قطعه قطعه شدن DNA کروموزومی شناخته میشود نقش مهمی در رشد جنینی و حفظ هومئوستازی بدن دارد (1). نقص در فرآیند آپوپتوزیس علت بسیاری از بیماریها از جمله سرطان است (2). بنابراین به نظر میرسد القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی روشی مناسب برای درمان سرطان باشد (3). در سالهای اخیر تلاشهای فراوانی برای یافتن ترکیبات جدید، به ویژه از فرآوردههای طبیعی که خاصیت ضد سرطانی خود را از طریق القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی مختلف اعمال میکنند صورت گرفته است (4). برخی از این مواد همانند تاکسول (Taxol)، اتوپوزاید (Etoposide) و سیس پلاتین (Cisplatin) از گیاهان بدست میآیند و دارای کاربردهای بالینی میباشند (5). علاوه براین، ترکیبات ضد سرطان مختلفی نیز وجود دارند که توسط باکتریهای جنس اکتینومیست Actinomycete)) تولید میشوند (6). اکتینومیستها باکتریهای گرم مثبت و ساپروفیتی هستند که به طور گستردهای در خاک و محیط های آبی پراکندهاند (7). اعضای جنس اکتینومیست به ویژه استرپتومایسسها تولید کننده بیش از نیمی از متابولیتهای ثانویه فعال بیولوژیک میباشند (8). این باکتریها ظاهری شبیه به قارچ دارند و میزان G+C در DNA ژنومی آنها 78- 69 درصد میباشد (9). تاکنون ترکیبات متعددی از باکتریهای جنس استرپتومایسس جدا سازی شده است که باعث مهار رشد و القای آپوپتوزیس در ردههای مختلف سلولهای سرطانی از جمله Hep3B (سرطان کبد انسانی)، HeLa (سرطان گردن رحم) و NB4 (لوسمی پرومیلوسیتیک حاد) شده است (12-10). به منظور یافتن ترکیبات ضدسرطان جدید، در مطالعه حاضر، متابولیتهای محلول در اتر باکتری بومی ایران به نام Streptomyces sp. ABRIINW 111 (ایزوله 111) جداسازی شد و پس از بررسی و مشاهده خاصیت آنتی باکتریال قوی آن، خاصیت ضدسرطانی این متابولیتها با استفاده از رده سلولی K562 لوسمی میلوییدی مزمن انسانی مورد بررسی قرار گرفت. لوسمی میلوییدی مزمنChronic myeloid leukemia-) CML) بیماری کلونال سلولهای بنیادی چند توان است که حاصل جابجایی دو طرفه کروموزومی بین کروموزم های 9 و 22 میباشد (13). این جابجایی کروموزومی باعث به وجود آمدن ژن هیبرید BCR-ABL میشود که پروتئین p210 Bcr-Abl را کد میکند و فعالیت تیروزین کینازی این پروتئین باعث تکثیر بیرویه این سلولها و نقص در فرآیند آپوپتوزیس میگردد (14). با وجود توسعه داروهای موثری همانند ایماتینیب مسیلات (STI571 یا Gleevec) که باعث القای آپوپتوزیس در سلولهای BCR-ABL مثبت میشود، مقاومت داروئی یکی از مشکلات اساسی در درمان این بیماران بوده و هنوز درمان قطعی برای این بیماری گزارش نشده است (15و16). از این رو، سلولهای K562 به عنوان مدل فاز حاد بیماری CML انتخاب (17و18) و اثرات ضدسرطانی متابولیتهای محلول در اتر باکتری استرپتومایسس ایزوله 111 در این سلولها مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
جداسازی و کشت اکتینومیست ها: نمونه های خاک از مناطق مختلف استان همدان جمع آوری و به منظور جداسازی اکتینومیست ها، رقت های مختلف تهیه شده از نمونه های خاک به مدت 7 روز در محیط کشت ترکیبی استارچ- کازئین آگار (SCA )(International Streptomyces project medium)(مرک، آلمان) در انکوباتور با دمای 29 درجه سانتی گراد نگهداری شد. پس از گذشت هفت روز، کلنی های اکتینومیست که دارای ویژگی هایی مانند رنگ سفید و ظاهری خشک و گچی بر روی محیط کشت بوده و بویی شبیه به خاک داشتند انتخاب و به پلیت جدید حاوی محیط کشت SCA منتقل و به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد کشت داده شد. تک کلنی های مورد نظر به محیط کشتyeast extract- malt extract agar (ISP2)( Internationalproject medium) (مرک، آلمان) که به طور اختصاصی برای کشت استرپتومایسس ها بکار می رود انتقال یافته و به مدت 3 تا 4 روز در انکوباتور شیکردارکشت داده شد. از کلنی های جداسازی شده استوک تهیه شده و در دمای 70- درجه سانتی گراد نگهداری شد (19).
بررسی خاصیت آنتی باکتریال: نمونه های خالص جدا شده از خاک به منظور بررسی خاصیت آنتی باکتریال آنها در محیط کشت SCA کشت داده شد و میکروارگانیسم هایE. Coli ATCC 1399، K. pneumonie ATCC 1290،S. flexneri ATCC 1234، B. cereus ATCC 1431، Y.enterocolitica ATCC 35669 وS. eureus ATCC 29213 (ATCC، آمریکا) به پلیت ها اضافه شد. پلیت هایی که در آن تنها باکتری های جدا شده از خاک رشد می کرد از نظر خاصیت آنتی باکتریال مثبت تلقی شد. پس از جداسازی متابولیت های آنتی باکتریال، این متابولیت ها به دیسک های خالی انتقال یافته و فعالیت آنتی باکتریال آنها با اندازه گیری هاله عدم رشد در غربال ثانویه مورد ارزیابی قرار گرفت (19).
جداسازی متابولیت ها: به منظور جداسازی متابولیت های آنتی باکتریال، مقداری از باکتری های خالص جدا شده از خاک به محیط کشت مولر هینتون براث (Muller Hinton Broth) اضافه شده و در انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتی گراد و دور حرکت rpm 125 قرار گرفت و 36 ساعت بعد میزان کدورت محیط کشت در طول موج 600 نانومتر اندازه گیری شد. در مرحله بعد، 1 میلی لیتر از سوسپانسیون حاصل به ظرف جدید حاوی محیط مولر هینتون براث انتقال یافته و همانند مرحله اول در انکوباتور شیکردار قرار گرفت. پس از 36 ساعت، تمامی محیط کشت در دور rpm 4000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. رسوب (بیومس) حاصل دور ریخته شده و مایع رویی از کاغذ صافی شماره 1 عبور داده شد. فرآیند استخراج با استفاده از حلال آلی اتر انجام گرفت. این حلال به نسبت 1:1 به مایع حاصل اضافه شد و به مدت 1 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتی گراد و دور حرکت rpm 175 قرار گرفته و به شدت هم زده شد. مخلوط حاصل به دکانتور انتقال یافته و فاز مایع از فاز حلال جدا گردید. فاز حلال که حاوی ترکیبات آنتی باکتریال است در دمای 34 درجه سانتی گراد و در فشار پایین تغلیظ شد (19).
کروماتوگرافی HPLC: جهت بررسی کمی فراکشن های موجود در متابولیت های استخراج شده از روش HPLC (Highperformance liquid chromatography)HPLC Knauer (Analytical)، ستونC18 (4 ×250 میلی متر)، دتکتور UV و طول موج 215 نانومتر استفاده شد. به این صورت که پس از خشک شدن کامل حلال، متابولیت در استونیتریل HPLC grade حل شد. از حلال‌های متانول، آب و استونیتریل به نسبت (45:50:5) به عنوان فاز شستشو استفاده شد و Flow rate دستگاه در 1 میلی متر در دقیقه تنظیم گردید. نمونه تزریقی 1 میکرولیتر در نظر گرفته شد و نمونه مذکور به مدت 10 دقیقه در دستگاه مورد بررسی قرار گرفته و پیک‌های مربوطه توسط نرم افزار دستگاه رسم گردید (19).
آماده سازی و تهیه غلظت های مختلف متابولیت: حلال اتر در دمای اتاق تبخیر و پودر خشک بدست آمده در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. به منظور تهیه غلظت های مختلف، پودر حاصل در حلال دی متیل سولفوکساید (DMSO) (سیناژن، تهران) حل شده و غلظت های مختلف از آن (10 تا 5000 نانوگرم بر میلی لیتر) تهیه گردید.
کشت سلول: رده سلولی K562 از انستیتو پاستور ایران تهیه و در محیط کشت RPMI 1640(بیوسرا، انگلستان) که با سرم جنین گاوی Fetal bovine serum)) (بیوسرا، انگلستان) 10 درصد و آنتی بیوتیک های استرپتومایسین (100 میکروگرم بر میلی لیتر) و پنی سیلین (100 واحد بر میلی لیتر) (سیناژن، تهران) غنی شده بود،کشت داده شد. سلول ها در مدت کشت سلولی در شرایط دمای 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 95 درصد و CO2 پنج درصد نگهداری شد.
بررسی رشد و زیستایی سلولی: به منظور بررسی اثر متابولیت های محلول دراتر ایزوله 111 بر رشد و زیستایی سلول های K562، تعداد104× 2 سلول در فاز رشد لگاریتمی در ظروف 96 چاهکی (SPL life science، کره جنوبی) کشت داده شد. سپس سلول ها با غلظت های مختلف متابولیت ها برای فواصل زمانی 12، 24، 48 و 72 ساعت تیمار شد. اثرات متابولیت ها بر رشد و زیستایی سلول های K562 با استفاده از آزمون دفع رنگ تریپان بلو (سیگما، آمریکا) و لام هموسایتومتر بررسی شد. به این صورت که با گذشت هر بازه زمانی تعداد سلول های موجود در هر چاهک شمارش گردید. این آزمایش سه بار به طور مستقل تکرارشد.
مطالعه ریخت شناسی سلول های تیمار شده با متابولیتها:تغییرات ریخت شناسی سلول های تیمار شده با متابولیت های محلول در اتر و سلول های تیمار نشده (کنترل) با استفاده از میکروسکوپ نوری معکوس (المپیوس، ژاپن) مورد ارزیابی قرار گرفت.
آزمون قطعه قطعه شدن DNA:به منظور بررسی قطعه قطعه شدن DNA و تشخیص آپوپتوزیس از الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد. برای این منظور تعداد 105 × 5 سلول با غلظت 3 میکروگرم بر میلی لیتر متابولیت ها و برای مدت زمان 48 ساعت تیمار شد. پس از سانتریفیوژ و شستشوی سلول ها با بافر فسفات، 20 میکرولیتر بافر لیز کننده (20 mM EDTA 100mM Tris, pH 8.0, 0.8% [W/V] SDS) (مرک، آلمان) اضافه شد. سپس 10 میکرولیتر از RNase A/T1 (فرمنتاس، آلمان) اضافه شده و به مدت حداقل 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. در نهایت مقدار 10 میکرولیتر پروتئیناز K (فرمنتاس، آلمان) اضافه شده و به مدت یک شب در دمای 50 درجه سانتی گراد نگهداری شد. پس از افزودن 5 میکرولیتر بافر لودینگ x6 (30 درصد گلیسرول، 25/0 درصد بروموفنول بلو) نمونه های DNA در ژل آگارز 5/1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید و با ولتاژ 35 ولت به مدت 2 ساعت بارگذاری شد (20).
تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار Microsoft Excel 2003، SPSS 14.0 و آزمون Student t -test انجام شد و داده های با ارزش 05/0 > P معنی دار تلقی شد.
نتایج
مهار رشد سلول های K562 توسط متابولیت های محلول در اتر:
متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 (شکل 1 فراکشن های موجود در متابولیت های جداسازی شده توسط حلال اتر را نشان می دهد) باعث مهار رشد وابسته به غلظت و زمان در سلول های K562 شد. همانطور که در شکل 2- الف و جدول1 نشان داده شده است، 24 ساعت پس از تیمار سلول ها با غلظت های 10 تا 5000 نانوگرم بر میلی لیتر متابولیت ها، درصد رشد سلول ها به میزان 2/15 تا 7/85 درصد کاهش یافت. این متابولیت ها باعث مهار رشد وابسته به زمان نیز در سلول های K562 تیمار شده شد. به عنوان مثال، تیمار سلول ها با غلظت 1000 نانوگرم بر میلی لیتر و برای مدت زمان 12، 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب باعث کاهش 40، 50، 3/62 و 7/70 درصدی در رشد سلول های تیمار شده گردید. میزان IC50 24 و 48 ساعت پس از تیمار با این متابولیت ها به ترتیب برابر 1000 و 400 نانوگرم بر میلی لیتر می باشد.
کاهش زیستایی سلول های K562 توسط متابولیت های محلول در اتر:
نتایج حاصل از تیمار سلول های K562 با متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 نشان داد که این متابولیت ها باعث کاهش وابسته به غلظت و زمان در زیستایی این سلول ها می گردد. همانطور که در شکل 2- ب و جدول2 نشان داده شده است در فاصله زمانی 12 تا 24 ساعت پس از تیمار با متابولیت های محلول در اتر و در غلظت های بالاتر از 1000 نانوگرم بر میلی لیتر کاهش معنی داری در زیستایی این سلول ها مشاهده شد (05/0 > P). این در حالی است که در بازه های زمانی بالاتر (48و 72 ساعت) کاهش معنی دار در زیستایی سلول های تیمار شده از غلظت 200 نانوگرم بر میلی لیتر آغاز گردید. به عنوان مثال، تیمار سلول های K562 با غلظت 2000 نانوگرم بر میلی لیتر متابولیت ها و برای مدت زمان 12، 24، 48 و 72 ساعت باعث کاهش زیستایی سلول ها به ترتیب به میزان 5/20، 7/21، 5/25 و 7/40 درصد گردید.
شکل 1: کروماتوگرام(HPLC) مربوط به متابولیتهای محلول در اتر باکتری Streptomyces sp. ABRIINW 111.
شکل 2:اثرات متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 بر رشد و زیستایی سلول های K562. سلول های K562 با غلظت های مختلف متابولیت ها و زمان های متفاوت تیمار شد و اثرات آن بر رشد (الف) و زیستایی (ب) سلول ها با استفاده از آزمون دفع رنگ تریپان بلو و شمارش سلولی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به صورت میانگین± خطای استاندارد (SD) نمایش داده شده است.
جدول 1: آنالیز آماری درصد رشد سلول های K562 تیمار شده با متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 با استفاده از نرم افزار SPSS 14.0 و آزمون Student t- test. مقادیر بصورت میانگین± خطای استاندارد (SD) نمایش شده است.
|
غلظت (ng/ml) |
درصد رشد نسبت به کنترل |
|||
|
12 ساعت |
24 ساعت |
48 ساعت |
72 ساعت |
|
|
کنترل |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
10 |
76/3 ± 23/90 096/0= P |
89/1 ± 8/84 012/0 = P |
41/4 ± 7/82 011/0 = P |
7/3 ±6/77 001/0 = P |
|
100 |
54/2 ± 9/78 006/0 = P |
72/1 ± 9/74 014/0 = P |
1 ± 9/62 001/0 = P |
09/3 ± 4/56 005/0 = P |
|
200 |
41/3 ± 1/72 05/0 = P |
029/2 ± 7/68 008/0 = P |
16/1± 7/55 002/0 = P |
83/3 ± 1/52 006/0 = P |
|
500 |
43/2 ± 5/63 007/0 = P |
07/2 ± 7/56 002/0 = P |
27/3 ± 2/46 001/0 = P |
2/4 ± 1/40 001/0 = P |
|
1000 |
68/2 ± 8/59 014/0 = P |
39/1 ± 9/49 009/0 = P |
3/2 ± 6/37 002/0 = P |
35/2 ± 2/29 003/0 = P |
|
2000 |
72/0 ± 7/31 001/0 = P |
2 ± 8/29 002/0 = P |
76/0 ± 19 002/0 = P |
54/6 ± 7/10 003/0 = P |
|
5000 |
97/0 ± 4/30 004/0 = P |
27/0 ± 3/14 001/0 = P |
95/1 ± 3/10 001/0 = P |
17/0 ± 23/0 001/0 = P |
جدول2: آنالیز آماری درصد زیستایی سلول های K562 تیمار شده با متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 با استفاده از نرم افزار SPSS 14.0 و آزمون Student t- test. مقادیر بصورت میانگین± خطای استاندارد (SD) نمایش شده است.
|
غلظت (ng/ml) |
درصد زیستایی نسبت به کنترل |
|||
|
12 ساعت |
24 ساعت |
48 ساعت |
72 ساعت |
|
|
کنترل |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
10 |
76/3 ± 5/98 *49/0 = P |
89/1 ± 3/97 *19/0 = P |
4/4 ± 9/98 *19/0= P |
7/3 ±2/98 *11/0 = P |
|
100 |
54/2 ± 3/98 *31/0 = P |
72/1 ± 1/96 *14/0 = P |
1 ± 6/96 *17/0 = P |
3 ± 1/96 *13/0= P |
|
200 |
41/3 ± 6/97 *22/0 = P |
2 ± 9/94 *095/0 = P |
1/1 ± 2/94 041/0 = P |
8/3 ± 3/93 004/0 = P |
|
500 |
43/2 ± 95 *19/0 = P |
2 ± 8/91 *1/0 = P |
2/3 ± 3/92 024/0 =P |
2/4 ± 5/88 002/0 = P |
|
1000 |
68/2 ± 1/94 *053/0 = P |
39/1 ± 6/88 023/0 = P |
3/2 ± 3/88 034/0 = P |
3/2 ± 2/80 004/0 = P |
|
2000 |
72/0 ± 5/79 013/0 = P |
2 ± 3/78 003/0 = P |
76/0 ± 5/74 047/0 = P |
5/6 ± 3/59 022/0 = P |
|
5000 |
97/0 ± 9/80 016/0 = P |
27/0 ± 2/58 003/0 = P |
9/1 ± 1/56 003/0 = P |
17/0 ± 2/2 028/0 = P |
شکل3: تغییرات ریخت شناسی سلول های K562 تیمار شده با متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111. سلول ها با غلظت های 10- 5000 نانوگرم بر میلی لیتر متابولیت ها و به مدت 48 ساعت تیمار شد (A: سلول های کنترل، B: غلظت 10نانوگرم بر میلی لیتر، C: غلظت 200 نانوگرم بر میلی لیتر، D: غلظت 1000 نانوگرم بر میلی لیتر و E: غلظت 5000 نانوگرم بر میلی لیتر را نشان می دهد) و تغییرات ریخت شناسی سلول ها با استفاده از میکروسکوپ نوری (بزرگنمایی x40) مورد بررسی قرار گرفت. همان طور که مشاهده می شود با افزایش غلظت سلول های K562 از حالت کروی خارج شده و یکپارچگی غشای خود را از دست می دهند.
تغییرات در شکل ظاهری سلول های K562 توسط متابولیت های محلول در اتر:
بررسی ریخت شناسی سلول های K562 تیمار شده و کنترل توسط میکروسکوپ نوری نشان داد که این متابولیت ها باعث ایجاد تغییرات ریخت شناسی مرتبط با آپوپتوزیس در سلول های K562 شد. همان طور که در شکل 3 نشان داده شده است، سلول های K562 تیمار شده یکپارچگی غشای خود را از دست داده و چروکیده شدند. این تغییرات ظاهری با تشکیل اجسام آپوپتوتیک همراه بود. تغییرات در ظاهر سلول های K562 به صورت وابسته به غلظت و زمان افزایش یافت.
القای آپوپتوزیس در سلول های K562 توسط متابولیت های محلول در اتر:
به منظور اثبات وقوع آپوپتوزیس در سلولهای K562 از آزمون قطعه قطعه شدن DNA استفاده شد. نتایج حاصل از این آزمون نشان داد که تیمار سلولهای K562 با غلظت 3 میکروگرم بر میلی لیتر متابولیت ها (3000 نانوگرم بر میلیلیتر) و برای مدت 48 ساعت باعث قطعه قطعه شدن و تغییر در الگوی DNA ژنومی گردید. همان طور که در شکل 4 نشان داده شده است DNA ژنومی سلولهای تیمار شده به صورت لکه (Smear) ضعیفی بر روی ژل الکتروفورز دیده میشود که این حالت در سلولهای کنترل مشاهده نشد. در برخی از سلولها از جمله رده سلولی K562 الگوی کلاسیک نردبانی در ژل الکتروفورز دیده نشده و DNA آنها در اثر وقوع آپوپتوزیس به صورت لکه (Smear) مشاهده میگردد که این امر به دلیل نقص در عملکرد آنزیم CAD (Caspase- activated deoxyribonuclease) میباشد (20و 21).
شکل 4:اثرات متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 بر قطعه قطعه شدن DNA در سلول های K562. سلول های K562 با غلظت 3000 نانوگرم (3 میکروگرم بر میلی لیتر) و به مدت 48 ساعت تیمار گردید و اثرات آن بر قطعه قطعه شدن DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت.
بحث
یافتههای اخیر نشان میدهد که بسیاری از ترکیبات شیمی درمانی از طریق القای آپوپتوزیس منجر به مرگ سلولهای سرطانی میگردند. از آنجایی که القای آپوپتوزیس روش مناسبی برای حذف سلولهای سرطانی است و اغلب سلولهای سرطانی دارای نقص در مکانیسمهای آپوپتوزی خود میباشند بنابراین یافتن ترکیباتی که بتواند باعث القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی گردد یکی از اولویتهای تحقیقاتی محسوب میگردد (8). لذا اهمیت مطالعه حاضر در بررسی اثرات مهار رشدی و توان القای آپوپتوزیس متابولیتهای محلول در اتر ایزوله 111در سلولهای K562 لوسمی میلوییدی مزمن انسانی میباشد.
تاکنون اثرات مهار رشدی متابولیتهای حاصل از گونههای مختلف باکتری استرپتومایسس در ردههای مختلف سلولهای سرطانی مورد بررسی قرار گرفته است. به عنوان مثال، متابولیت استرپتوکوردین (Streptokordin) که از باکتری استرپتومایسس گونه KORDI-3238 بدست آمده باعث مهار رشد در چندین رده سلول انسانی از جمله MDA-MB-231(سرطان سینه)، HCT-15 (سرطان کولون)، PC-3 (سرطان پروستات) و K562 ( لوسمی میلوییدی مزمن) شده است (22). میزان IC50 48 ساعت پس از تیمار سلول های فوق با این ترکیب به ترتیب برابر 5/7، 8/7، 2/3 و 6/8 میکروگرم بر میلی لیتر می باشد. ترکیب دیگری به نام YM- 216319 که از استرپتومایسس nobilis و به عنوان یک متابولیت ثانویه جداسازی شده است و در واقع یک پپتید حلقوی است باعث مهار رشد سلولهای Hela S3 (سرطان رحم) می شود که IC50 72 ساعت آن برابر 14 نانومولار است (23). نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که 48 ساعت پس از تیمار با متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 میزان IC50برابر 400 نانوگرم بر میلی لیتر می باشد که در مقایسه با سلول های K562 تیمار شده با استرپتوکوردین در غلظت های نانوگرم بر میلی لیتر باعث مهار رشد این سلول ها می گردد.
در مطالعه حاضر مشاهدات میکروسکوپ نوری و نتایج حاصل از آزمون قطعه قطعه شدن DNA نشان دهنده وقوع آپوپتوزیس در سلول های K562 تیمار شده با متابولیت های محلول در اتر می باشد. اخیراً متابولیت های مختلف القا کننده آپوپتوزیس از گونههای مختلف باکتری های استرپتومایسس بدست آمده است که در این میان میتوان به متابولیت های PCC(Pure cytotoxic compound) و F3-2-5 اشاره کرد که از باکتریهای Streptomyces sp. بدست می آیند و باعث القای آپوپتوزیس به ترتیب در رده های سلولی سرطان خون (HL-60، K562، U937 و THP-1) (8) و سلول های HeLa (سرطان گردن رحم انسان) می گردند (11). PCC در غلظت 30 نانوگرم بر میلی لیتر و در مدت زمان 48 ساعت و از طریق فعال سازی کاسپاز 3 و کاهش بیان پروتئین ضد آپوپتوزی Bcl-2 باعث القای آپوپتوزیس در رده های سلولی سرطان خون می گردد (8). در سلول های HeLa که با غلظت 80 میکرومولار متابولیت F3-2-5 و در بازه زمانی بالاتر از 24 تیمار شده بود تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و وقوع آپوپتوز در سلول های تیمار شده مشاهده گردید (11). در مطالعه حاضر نیز اثرات آپوپتوزی متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 در سلول های K562 در غلظت 3 میکروگرم بر میلی لیتر در مدت زمان 48 ساعت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج حاصل حاکی از قطعه قطعه شدن DNA ژنومی و ایجاد تغییرات ریخت شناسی مرتبط با آپوپتوزیس از جمله جمع شدگی سلول ها و ایجاد اجسام آپوپتوتیک در این سلول ها بود. با توجه به این اثرات، مطالعات بیشتر در جهت شناسایی مکانیسم های احتمالی القای آپوپتوزیس توسط متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 در این رده سلولی ضروری به نظر می رسد. با توجه به اینکه سلول های K562 در واقع سلول هایی مقاوم به داروی ایماتینیب مسیلات (مهار کننده تیروزین کیناز Bcr- Abl که برای درمان بیماری CML بکار می رود) می باشند (24) بنابراین تلاش برای یافتن ترکیباتی با قدرت القای آپوپتوزیس به ویژه از فرآورده های طبیعی ضروری به نظر می رسد و شناسایی متابولیت های محلول در اتر ایزوله 111 به عنوان ترکیبات القا کننده آپوپتوزیس در این رده سلولی می تواند حائز اهمیت باشد.
نتیجه گیری
به طور کلی، با توجه به نقایص به وجود آمده در فرآیند آپوپتوزیس در سلول های سرطانی و نیز وجود مقاومت داروئی در این سلول ها، شناسایی ترکیبات جدید القاء کننده آپوپتوزیس همانند متابولیت های محلول در اتر باکتری Streptomyces sp. ABRIINW 111 می تواند برای مطالعات بیشتر در زمینه درمان سرطان کمک کننده باشد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله مراتب تشکر و قدردانی صمیمانه خود را از امور پژوهشی دانشگاه تبریز و پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی شمال و شمال غرب کشورکه هزینه ی قسمتی از طرح را تقبل فرموده اند، ابراز می دارند.
)