نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف این تحقیق همسانه سازی ژن گاما توکوفرول متیل ترانسفراز (γ-tmt) از گیاه گوجه فرنگی رقم Memory 1، جهت تعیین توالی و خصوصیات ملکولی آن و نیز انتقال این ژن به یک گیاه روغنی مثل کلزا در پژوهشهای آتی برای بالا بردن خاصیت تغذیه ای آن بود. مواد و روش ها: از بافت میوه گوجه فرنگی، RNAی کل استخراج و ساخت cDNAصورت گرفت. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن مذکور تکثیر و همراه با ناقلpBluescript (SK-) به کمک آنزیم برشی XbaI هضم و واکنش اتصال با آنزیم T4 انجام شد. باکتریE. coli مستعد با ناقل نوترکیب تراریخت و شناسایی کلونیهای نوترکیب بر اساس آزمون سفید–آبی انجام شد. نتایج: با استفاده از PCR و آغازگرهای اختصاصی، cDNA به طول 1089 bp به دست آمد. همردیف سازی توالی نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای ژن هدف با توالی های γ-tmt دیگر ثبت شده از خانواده Solanaceae به میزان 98 درصد شباهت داشت. در توالی اسید آمینه ای پروتئین استنتاج شده چند تغییر مشاهده شد. با استفاده از نرم افزار PSIpred، ساختارهای دوم و سوم این پروتئین پیش بینی و با استفاده از نرم افزار ClustalW درخت فیلوژنتیکی پروتئین حاصل از این ژن ساخته شد. نتیجه گیری: cDNAی ژن γ-tmt همسانه سازی شده با توالی ثبت شده از گوجه فرنگی رقم Cerasiforme 98 درصد شباهت داشت. با انتقال این ژن به گیاهان دانه روغنی مانند کلزا می توان میزان آلفا توکوفرول را افزایش داد. این کار هم به اهمیت این گیاه از نظر تغذیهای می افزاید و هم می تواند مقاومت آن را نسبت به تنش های محیطی بالا ببرد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Molecular Characterisation of Gamma Tocopherol Methyl Transferase (γ-tmt) From Tomato CV Memory 1
چکیده [English]
Aim: The aim of this research was the cloning and sequencing of gamma tocopherol methyl transferase gene (γ-tmt) from Memory 1 cv and transferring it into an oilseed plant such as canola, in the future studies for improving its nutritional value. Material and Methods: Total RNA was extracted from tomato fruit and cDNA constructed. By using specific primers the γ-tmt gene was amplified by PCR reaction and a 1089 bp fragment was produced. The amplified fragment and the pBluescript (SK-) vector were digested by XbaI. The ligation reaction was carried out by T4 ligase. E. coli competent cells were transformed by the resulting vector and recombinant colonies were identified using the white-blue screening assay. Results: The nucleotide sequence of the gene was determined and aligned with the available sequences recorded in the NCBI data bank. This sequence showed 98% similarity with the other recorded γ-tmts from Solanaceae family. Some changes in nucleotide sequence and the deduced amino acids were observed. The secondary and tertiary structures of the protein were predicted, using PSIpred software. A phylogenetic tree was also constructed for the protein product of the gene, using ClustalW. Conclusion: The cloned cDNA of γ-tmt showed 98 % similarity with the recorded sequence from tomato cv Cerasiforme. Upon transfer of this gene into an oil seed plant such as canola, one can increase both its nutritional value and resistance to environmental stresses.
کلیدواژه‌ها [English]
- Gamma tocopherol methyltransferase
- secondary structure
- Vitamin E
مقدمه
ویتامین E یکی از ویتامینهای محلول در چربی و ضروری برای انسان است که بیشتر به دلیل خاصیت آنتی اکسیدانتیاش در بدن شناخته شده است. از میان هشت شکل طبیعی این ویتامین، آلفا توکوفرول دارای بالاترین فعالیت و به دلیل جذب انتخابی آن توسط پروتئین جگری ناقل آلفا توکوفرول بیشتر در دسترس است (1و2). در بدن انسان این ویتامین دارای دو عملکرد است بدین معنا که هم به عنوان یک ویتامین عمل مینماید و هم نقش یک آنتی اکسیدانت مهم را ایفا میکند (3). زمانی نقش بسیار مهم آلفا توکوفرول به عنوان یک آنتی اکسیدانت بیشتر آشکار میشود که رابطه ی بسیاری از بیماریها با خاصیت مذکور روشن می شود. از آنجا که معمولا نشانههای بیماری پس از سال ها تجمع رادیکال های آزاد در بدن ظاهر میشوند لذا بیماریهای ایجاد شده توسط این رادیکال اکثرا دارای دورهی نهفتگی بلند مدت میباشند. برخی از اثرات این ویتامین بر این بیماری ها عبارتند از: کاهش احتمال بیماریهای قلبی- عروقی، موثر در درمان انواع سرطان، کند شدن پدیده پیری سلولها و بافتها، حفظ سلامت سلولهای قرمز خون و مقابله با کم خونی، تسریع در بهبود زخم ها، کمک به درمان اختلالات تولیدمثلی، بهبود عملکرد سیستم ایمنی، کند شدن پیشرفت بیماریهایی که با پدیدهی پیری همراه اند (مانند آب مروارید و آرتریتیس) (4، 5و6).
ویتامین E تنها در موجودات فتوسنتز کننده و برخی از سیانوباکتری ها تولید می شود، بنابراین منبع تامین آن در انسان مصرف گیاهان است (7). بیشترین غلظت توکوفرول را می توان در دانه های روغنی گیاهانی همچون کانولا، نخل، گلرنگ، سویا و آفتابگردان یافت که غلظت توکوفرول طبیعی در دانه ی آن ها بطور میانگین 10 تا 20 برابر بیشتر از بافت هایی غیر از دانه است. این درحالی است که بیشترین ایزوفرم موجود در آنها گاما توکوفرول یعنی همان پیش ماده ی بیوسنتزی آلفا توکوفرول می باشد (8). توانایی آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز در جابجایی گروه متیل در سال 1980 شناسایی و محل آن در غشای داخلی کلروپلاست اسفناج تعیین (9و10) و پس از آن در سال 1985 توسط دارلینگ و کامارا از کروموپلاست فلفل استخراج گردید (11).
ژن توکوفرول متیل ترانسفراز از باکتری سینکوسیستیس از طریق یافتن همولوژی با دیگر ژن های شناسایی شده در مسیر بیوسنتز ویتامین E شناسایی شد. این ژن در اربیدوپسیس از طریق جستجوی همولوژی با ژن γ-tmtباکتری سینکوسیستیس در سال 1998 شناسایی شد. همچنین این نکته روشن گردید که گونه های مختلف گیاهان روغنی دارای مقدار زیادی توکوفرول در دانههای خود هستند. اما در اکثر گیاهان دانه روغنی همچون دانههای سویا و کلزا، میزان گاما توکوفرول (پیش مادهی آلفا- توکوفرول)، نسبت به آلفا-توکوفرول بسیار بیشتر است (8). بنابراین تبدیل متابولیکی گاما توکوفرول به آلفا توکوفرول از طریق فناوری گیاهان تراریخت جهت افزایش کارآیی جذب آن توسط انسان و جانوران مد نظر بوده است. این کار برای اولین بار با ابر بیان ژن γ-tmt در گیاه مدل اربیدوپسیس صورت گرفت (8). بدین وسیله به نقش کلیدی آنزیم γ -TMT در تعیین نوع توکوفرول موجود در دانه پی برده شد . محققین طی این آزمایش ژن کد کننده ی آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز را از گیاه thaliana Arabidopsis همسانه سازی و سپس cDNA آن را تعیین توالی کردند. در این مطالعه محققین با ابر بیان ژن مذکور، ترکیب دانههای A. thaliana را از 97 درصد گاما توکوفرول به 95 درصد آلفا توکوفرول تبدیل کردند (8).
فعالیتهای زیستی بسیاری از جمله از بین بردن ملکولهای اکسیژن یگانه که در طی واکنش های فتوسیستم II ایجاد میشوند (12)، کنترل غیر آنزیمی اکسایش لیپید ها در گیاهان (13) و افزایش سازگاری گیاهان به دماهای پایین (14)، به توکوفرولها نسبت داده شده است. در جهت افزایش میزان آلفا توکوفرول در گیاهان مختلف پژوهشهایی انجام شده که اجمالا به برخی از آنها اشاره می گردد.
در سال 2005، محتوی آلفا توکوفرول برگ گیاه کاهوبا ابر بیان ژن γ -tmtگیاه اربیدوپسیس تا سه برابر افزایش یافت. در این آزمایش نقشγ -TMTدر کنترل میزان تولید آلفا توکوفرول در برگ کاهو و همبستگی میان mRNA تراریخت و میزان فعالیت ژن به اثبات رسید )15(. در سال 2006 با بیان ژن γ -tmtگیاه اربیدوپسیس در گیاه دانه روغنیBrassica junceaمیزان آلفا توکوفرول دانه های این گیاه شش برابر گردید )16(. در سال 2007 (17) و سپس در سال 2011 (18) با همسانه سازی و سپس ابر بیان ژن γ -tmt Perilla frutescensدر خودگیاه بیشتر گاما توکوفرول موجود در دانه به آلفاتوکوفرول تبدیل گردید. در سال 2007 نیز محققان با ابر بیان ژن گاما توکوفرول متیل ترانسفراز گیاهPerilla frutescensدر گیاهسویا مقدار آلفا توکوفرول دانه را چندین برابر افزایش دادند (19). با توجه به اینکه آلفا توکوفرول در میان تمامی ایزوفرم های دیگر این ویتامین دارای بالاترین فعالیت بیولوژیکی، و آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز آخرین آنزیم در مسیر بیوسنتز آلفا توکوفرول است در نتیجه افزایش تولید ویتامینE ، هدف مهندسی گیاهان تراریخت، ترجیحا ابر بیان آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز می باشد. این پژوهش با هدف استخراج و همسانه سازی ژن گاما متیل ترنسفراز از گیاه گوجه فرنگی رقم Memory 1 انجام شد تا بتوان در قدم بعدی این ژن را جهت بالا بردن ارزش تغذیه ای، به یک گیاه دانه روغنی مانند کلزا منتقل نمود. توالی این ژن در گیاه گوجه فرنگی در ارقام دیگری قبلا به ثبت رسیده است؛ اما در رقم Memory 1تا پیش از این مطالعه، شناسایی نشده و به ثبت نرسیده بود.
مواد و روش‌ها
استخراج RNA: تمامی وسایل پلاستیکی و شیشه ای و همچنین محلول های مورد نیاز به استثنای محلول های حاوی Tris با استفاده از محلول DEPC (دی اتیل پیروکربنات) یک دهم درصد ضد عفونی و عاری از آنزیم های RNase شدند. سپس وسایل و محلول ها به مدت 12 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری (incubation) و به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند تا DEPC از طریق شکسته شدن به دی اکسیدکربن، آب و اتانول کاملا از بین برود. بافر استخراج شامل
[Tris-HCl 300mM, EDTA 25mM, NaCl 2M, CTAB 2% (w/v), PVP 2% (w/v), ß-Mercaptoethanol 2%, DEPC-treated water 0.1%]
به میزان 27 میلیلیتر برای هر 5/2 گرم از نمونه ی پودر شده تهیه گردید. همهی مواد بجز بتا- مرکاپتواتانول درون فالکون 50 میلی لیتری ریخته و در حمام آب گرم در دمای 80 درجه ی سانتی گراد به مدت 30 الی 45 دقیقه قرار داده شدند. استخراج RNA بر اساس روش تغییر یافته رید وهمکاران (20) صورت گرفت.
واکنش نسخه برداری معکوس تهیه cDNA: جهت سنتز cDNA واکنش نسخه برداری معکوس به روش زیر انجام گرفت. مخلوط زیر در یک میکروتیوب استریل روی یخ تهیه گردید.
Template (total RNA or mRNA): 50 ng
Primer (Oligo (dT)18): 1 pmol
Deionized and nuclease-free water to final volume: 7-12 µl
مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در 70 درجه سانتیگراد و سپس روی یخ قرار داده شد و مواد زیر به آن اضافه شد:
5 X reaction buffer: 4 µl
dNTP Mix 10 mM: 2 µl
مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد و سپس مقدار 1 میکرولیتر از آنزیم نسخه برداری معکوس (reverse transcriptase، سیناژن، ایران) به ترکیب فوق اضافه و مخلوط فوق به مدت 60 دقیقه دردمای 42 درجه سانتیگراد قرار داده شد. واکنش فوق با قرار دادن مخلوط واکنش در 70 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه متوقف گردید.
تکثیر cDNAژن tmt با استفاده از PCR: آغازگر های اختصاصی با توجه به توالی ژن tmt گیاه گوجه فرنگی با شماره دستیابی DQ456876 طراحی و برای تکثیر cDNAی ژن tmt به طول bp1089 سنتز شدند (جایگاه برش آنزیمی XbaIدر دو انتهای ¢ 5 دو آغازگر اختصاصی tmtF و tmtR طراحی شد).
5' TATCTAGAATGGGCAGCCAATGCTATT 3'
5' GCTCTAGATTATTCAGGTTTTCGACATGTG 3'
واکنش PCR پس از بهینه سازی دمای اتصال جهت تکثیر اختصاصی و تک باند شدن محصول PCR در دمای 60 درجه سانتیگراد با استفاده از PCR Master Mix (سیناژن، ایران) صورت گرفت. سپس واکنش برای 30 دور، شامل دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و در نهایت، دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه انجام گردید. بعد از اتمام 30 دور واکنش، تیوب ها به مدت ده دقیقه در 72 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. محصول PCR روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید.
cDNAی مورد نظر پس از خالص سازی از ژل به کمک DNA Extraction Kit (شرکت فرمنتاس) و برش توسط آنزیم XbaI با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase به ناقل از پیش برش یافته اتصال یافت. پس از مستعد سازی سلولهای E. coli، باکتری های مستعد با استفاده از ناقل های نوترکیب تراریخت شدند. آزمایش های تاییدی جهت اطمینان از نوترکیبی کلنی ها به ترتیب زیر صورت گرفت: آزمون کلنیهای سفید- آبی، Toothpick minipreparation، استخراج فاژمید و هضم آنزیمی توسط آنزیم XbaI (21).
پس از انجام آزمایشهای تاییدی جهت اطمینان از حضور cDNAی ژنtmt در فاژمید نوترکیب و مطالعه توالی ژن همسانه سازی شده از توالی یابی استفاده شد. به این منظور ناقل نوترکیب از باکتریE. coli تراریخت شده استخراج و به همراه آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت جهت توالی یابی در دو جهت به شرکت Millgen فرانسه ارسال شد.
مقایسه توالی پروتئینی استنتاج شده از ژن tmt با دیگر پروتئین های مشابه: پس از تعیین توالی نوکلئوتیدیcDNA ژن γ-tmt همسانه سازی شده، توالی اسید آمینهای آن با استفاده از سایت http://expasy.org/translate مشخص و سپس درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزار آنلاین ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw) رسم گردید. جهت این کار توالی پروتیینهای مشابه با شماره‌های دستیابی
(ZP-08985217) Fisherella sp.,
(AE68180) Perilla frutescens,
(ADZ24710) Solanum penellii,
(BAK57287) Glycine max,
(NP_176677) Arabidopsis thaliana,
(BAJ86294) Hordeum vulgare,
(ZP_07111019) Oscillatoria sp.,
(YP_003722211) Nostoc azolae,
(EGB05977) Aureococcus anaphagefferens,
(NP_091105914) Zea mays,
(EAZ24304) Synechococcus sp.,
(ADV36922) Solanum tuberosum,
(CBN74411) Ectocarpus siliculosus,
(ZP_00518612) Crocosphaera watsonii,
(ADC91915) Lactuca sativa,
(ADP00411) Catharanthus roseus,
(ZP_05030254) Microcoleus chthonoplastes,
(YP_001657502) Microcystis aeroginosa,
(XP_003083842) Ostrecoccus tauri,
(XP_002951641) Volvox carteri,
(XP_001421685) Ostrococcus lucimarinus, (XP_00288296) Arabidipsis lyrata,
(XP_002319777) Populus tricocaroa,
(XP_001694470) Clamydomonas reinhardtii,
(XP_002292406) Thalacsiosira pseudomona, (XP_002180606) Phaeodactylum tricornutum, (AA013806) Brassica oleracea,
(ABB52800) Helianthus annuus,
(ACD03285) Brassica napus,
(XP_002503087) Micromonas sp.,
(XP_002454429) Sorghum bicolor,
(AC057634) Linum sitatissimum,
(XP_002269749) Vitis vinifera,
(BAH10645) Hevea brasiliensis,
(ACj84366) Medicago truncaula,
(CAI77219) Triticum aestivum,
(ABI23433) Brassica juncea.
مورد استفاده قرار گرفتند.
خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین ژن همسانه سازی شده در سایت ProtParam http://web.expasy.org/protparam)) بررسی گردید. ساختار دوم و سوم پروتئین نیز توسط نرم افزار آنلاین سایت PSIpred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred) پیش بینی و رسم گردید. بررسی موقعیت زیر سلولی پروتئین مذکور با استفاده از نرم افزارهای TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) و Psort (http://www.psort.org) و وجود پپتید پیام (signal peptide) توسط نرم افزار iPsort (http://ipsort.hgc.jp) انجام شد.
نتایج
در این تحقیق cDNAی ژن γ-tmtاز گیاه گوجه فرنگی رقم Memory1 به طول bp 1089 جهت بررسی توالی و استفاده برای انتقال به یک گیاه دانه روغنی مانند کلزا، در پژوهش های آتی، تکثیر گردید. بدین منظور از مرحلهی قرمز این گیاه، RNA استخراج و واکنش RT-PCR انجام گردید. پس از الکتروفورز محصول PCR روی ژل اگارز یک درصد، یک باند بطول حدود Kb 1/1 مشاهده گردید (شکل A1).
باند مذکور از ژل آگارز استخراج و خالص سازی گردید. با توجه به صحت طول قطعه، واکنش اتصال قطعهی مذبور و ناقل pBluescript صورت گرفت. باکتریهای مستعد شدهE. coli توسط فاژمیدهای نوترکیب تراریخته شدند. کلنی های تراریخت شدهی نوترکیب ابتدا از طریق آزمون کلنیهای سفید- آبی غربال گردیدند (شکلB 1). سپس جهت بررسی بیشتر، آزمون Tooth pick minipreparation نیز روی کلنیهای سفید صورت گرفت و کلنیهای نوترکیب از روی اختلاف اندازه شان انتخاب گردیدند (شکل A2). پس از انتخاب کلنیهای نوترکیب، ناقل آنها استخراج گردید. با استفاده از آنزیم XbaI آزمایش هضم آنزیمی صورت گرفت که به ترتیب قطعات مورد انتظار با طول bp1089 و bp 2961 حاصل و بدین ترتیب همسانهسازی ژن گاما- توکوفرول متیل ترانسفراز تایید گردید (شکل B2).
شکل 1: A-تکثیر cDNAی tmt-γ در دمای اتصال 60 درجه سانتی گراد توسط PCR. ردیف1 نشانگر اندازه ملکولی kb 1 (سینا ژن، ایران) . B-تشخیص کلنیهای نو ترکیب توسطآزمون کلنیهای سفید- آبی. کلنیهای آبی فاقد پلازمید نوترکیب و کلنیهای سفید حاوی پلازمید نو ترکیباند.
شکل2: A) آزمون .toothpick minipreparation فاژمید هایی که بالاتر قرارگرفته اند (نشان داده شده با پیکان، ردیف های 5، 6، 9، 10، 11، 12)، نوترکیب هستند. B) فاژمید نوترکیب هضم شده توسط آنزیم XbaI: مطابق انتظار ژن مورد نظر، به ترتیب از پایین به بالا، با طول bp 1089 و فاژمید با طول bp 2961 حاصل شد. M نشانگر اندازه ملکولی kb 1 (سینا ژن، ایران).
بررسی ویژگی توالی اسیدهای آمینه و خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین استنتاج شده از ژن هدف با استفاده از ابزار ProtParam نشان داد که ژن هدف، پروتئینی با طول 362 اسید آمینه و وزن مولکولی 5/39800 دالتون و pH ایزوالکتریک 28/8 را کد میکند. فرمول شیمیایی این پروتئینC1764H2785N483O529S18 و در مجموع دارای 5579 اتم است. بیشترین و کمترین اسید آمینه را در توالی این پروتئین به ترتیب سرین (42 عدد) با 2/11 درصد و هیستیدین (7 عدد) با 9/1 درصد به خود اختصاص میدهند. این آنزیم دارای 41 اسید آمینه بازی، 38 اسید آمینه اسیدی، 127 اسید آمینه آبگریز و 99 اسید آمینه قطبی است. با استفاده از نرم افزار آنلاین iPsort مشخص گردید که پروتئین مذکور دارای پپتید پیام با توالی MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFSL برای انتقال به کلروپلاست است و نرم افزارهای آنلاین TargetP و Psort احتمال کلروپلاستی بودن این پروتئین را به ترتیب 97 و 100 درصد پیش بینی کردند. همردیف سازی توالی نوکلئوتیدی (شکل 3) و اسید آمینهای توالی (شکل 4) به دست آمده با دیگر توالیهای ثبت شده از گیاه گوجه فرنگی در بانک NCBI انجام شد. تفاوتهایی در نوکلئوتیدهای شماره 84، 273، 561 و 642 مشاهده شد. این تغییرات باعث جایگزینی دو اسید آمینه گردید (بحث را مشاهده کنید).
JN620365 -----------------ATGGGCAGCCAATGCTATTCCGCTTATTCTATCCAATCATTGA 43
GU358684 ------------TAGTAATGGGCAGCCAATGCTATTCCGCTTATTCTATCCAATCATTGA 48
GU563800 ------------TAGTAATGGGCAGCCAATGCTATTCCGCTTATTCTATCCAATCATTGA 48
DQ456876 ATATATATAGTATAGTAATGGGCAGCCAATGCTATTCCGCTTATTCTATCCAATCATTGA 60
ABE41794 -----------------ATGGGCAGCCAATGCTATTCCGCTTATTCTATCCAATCATTGA 43
*******************************************
JN620365 ACCCCACGTGTCCATCATCTTCTTCCTCCTCTGTTATCTTCTCTCTTCTTAAACCCCAGA 103
GU358684 ACCCCACGTGTCCATCATCTTCTTCCTCCTCTGTTATCTTCACTCTTCTTAAACCCCAGA 108
GU563800 ACCCCACGTGTCCATCATCTTCTTCCTCCTCTGTTATCTTCACTCTTCTTAAACCCCAGA 108
DQ456876 ACCCCACGTGTCCATCATCTTCTTCCTCCTCTGTTATCTTCACTCTTCTTAAACCCCAGA 120
ABE41794 ACCCCACGTGTCCATCATCTTCTTCCTCCTCTGTTATCTTCACTCTTCTTAAACCCCAGA 103
*****************************************:******************
JN620365 TTCACAGAAGAAGAATCATTACTTGTTGTAATAGTAGTAGAAGAAGAAGAAGAATGGCTA 163
GU358684 TTCACAGAAGAAGAATCATTACTTGTTGTAATAGTAGTAGAAGAAGAAGAAGAATGGCTA 168
GU563800 TTCACAGAAGAAGAATCATTACTTGTTGTAATAGTAGTAGAAGAAGAAGAAGAATGGCTA 168
DQ456876 TTCACAGAAGAAGAATCATTACTTGTTGTAATAGTAGTAGAAGAAGAAGAAGAATGGCTA 180
ABE41794 TTCACAGAAGAAGAATCATTACTTGTTGTAATAGTAGTAGAAGAAGAAGAAGAATGGCTA 163
************************************************************
JN620365 GTGTTGCTGCGATGAATGCTGTGTCTTCGTCATCTGTAGAAGTTGGAATACAGAATCAAC 223
GU358684 GTGTTGCTGCGATGAATGCTGTGTCTTCGTCATCTGTAGAAGTTGGAATACAGAATCAAC 228
GU563800 GTGTTGCTGCGATGAATGCTGTGTCTTCGTCATCTGTAGAAGTTGGAATACAGAATCAAC 228
DQ456876 GTGTTGCTGCGATGAATGCTGTGTCTTCGTCATCTGTAGAAGTTGGAATACAGAATCAAC 240
ABE41794 GTGTTGCTGCGATGAATGCTGTGTCTTCGTCATCTGTAGAAGTTGGAATACAGAATCAAC 223
************************************************************
JN620365 AGGAGCTGAAAAAAGGAATTGCAGATTTATATGATGAGTCTTCTGGGATTCGGGAAGATA 283
GU358684 AGGAGCTGAAAAAAGGAATTGCAGATTTATATGATGAGTCTTCTGGGATTCGGGAAGATA 288
GU563800 AGGAGCTGAAAAAAGGAATTGCAGATTTATATGATGAGTCTTCTGGGATTCGGGAAGATA 288
DQ456876 AGGAGCTGAAAAAAGGAATTGCAGATTTATATGATGAGTCTTCTGGGATTTGGGAAGATA 300
ABE41794 AGGAGCTGAAAAAAGGAATTGCAGATTTATATGATGAGTCTTCTGGGATTTGGGAAGATA 283
************************************************** *********
JN620365 TTTGGGGTGACCATATGCATCATGGATATTATGAACCTAAATCCTCTGTGGAACTTTCAG 343
GU358684 TTTGGGGTGACCATATGCATCATGGATATTATGAACCTAAATCCTCTGTGGAACTTTCAG 348
GU563800 TTTGGGGTGACCATATGCATCATGGATATTATGAACCTAAATCCTCTGTGGAACTTTCAG 348
DQ456876 TTTGGGGTGACCATATGCATCATGGATATTATGAACCTAAATCCTCTGTGGAACTTTCAG 360
ABE41794 TTTGGGGTGACCATATGCATCATGGATATTATGAACCTAAATCCTCTGTGGAACTTTCAG 343
************************************************************
JN620365 ATCATCGTGCTGCTCAGATCCGTATGATTGAACAGGCTCTAAGTTTTGCTGCTATTTCTG 403
GU358684 ATCATCGTGCTGCTCAGATCCGTATGATTGAACAGGCTCTAAGTTTTGCTGCTATTTCTG 408
GU563800 ATCATCGTGCTGCTCAGATCCGTATGATTGAACAGGCTCTAAGTTTTGCTGCTATTTCTG 408
DQ456876 ATCATCGTGCTGCTCAGATCCGTATGATTGAACAGGCTCTAAGTTTTGCTGCTATTTCTG 420
ABE41794 ATCATCGTGCTGCTCAGATCCGTATGATTGAACAGGCTCTAAGTTTTGCTGCTATTTCTG 403
************************************************************
JN620365 AAGATCCAGCGAAGAAACCAACGTCCATAGTTGATGTTGGATGTGGCATCGGTGGCAGTT 463
GU358684 AAGATCCAGCGAAGAAACCAACGTCCATAGTTGATGTTGGATGTGGCATCGGTGGCAGTT 468
GU563800 AAGATCCAGCGAAGAAACCAACGTCCATAGTTGATGTTGGATGTGGCATCGGTGGCAGTT 468
DQ456876 AAGATCCAGCGAAGAAACCAACGTCCATAGTTGATGTTGGATGTGGCATCGGTGGCAGTT 480
ABE41794 AAGATCCAGCGAAGAAACCAACGTCCATAGTTGATGTTGGATGTGGCATCGGTGGCAGTT 463
************************************************************
JN620365 CTAGGTACCTTGCAAAGAAATATGGCGCTACAGCTAAAGGTATCACTTTGAGTCCTGTAC 523
GU358684 CTAGGTACCTTGCAAAGAAATATGGCGCTACAGCTAAAGGTATCACTTTGAGTCCTGTAC 528
GU563800 CTAGGTACCTTGCAAAGAAATATGGCGCTACAGCTAAAGGTATCACTTTGAGTCCTGTAC 528
DQ456876 CTAGGTACCTTGCAAAGAAATATGGCGCTACAGCTAAAGGTATCACTTTGAGTCCTGTAC 540
ABE41794 CTAGGTACCTTGCAAAGAAATATGGCGCTACAGCTAAAGGTATCACTTTGAGTCCTGTAC 523
************************************************************
JN620365 AAGCAGAGAGGGCTCAAGCTCTTGCTGATGCTCAGGGGTTAGGTGATAAGGTTTCATTTC 583
GU358684 AAGCAGAGAGGGCTCAAGCTCTTGCTGATGCTCAGGGATTAGGTGATAAGGTTTCATTTC 588
GU563800 AAGCAGAGAGGGCTCAAGCTCTTGCTGATGCTCAGGGATTAGGTGATAAGGTTTCATTTC 588
DQ456876 AAGCAGAGAGGGCTCAAGCTCTTGCTGATGCTCAGGGATTAGGTGATAAGGTTTCATTTC 600
ABE41794 AAGCAGAGAGGGCTCAAGCTCTTGCTGATGCTCAGGGATTAGGTGATAAGGTTTCATTTC 583
*************************************.**********************
JN620365 AAGTAGCAGACGCCTTGAATCAGCCTTTTCCAGATGGGCAATTCGACTTGGTTTGGTCGA 643
GU358684 AAGTAGCAGACGCCTTGAATCAGCCTTTTCCAGATGGGCAATTCGACTTGGTTTGGTCCA 648
GU563800 AAGTAGCAGACGCCTTGAATCAGCCTTTTCCAGATGGGCAATTCGACTTGGTTTGGTCCA 648
DQ456876 AAGTAGCAGACGCCTTGAATCAGCCTTTTCCAGATGGGCAATTCGACTTGGTTTGGTCCA 660
ABE41794 AAGTAGCAGACGCCTTGAATCAGCCTTTTCCAGATGGGCAATTCGACTTGGTTTGGTCCA 643
********************************************************** *
JN620365 TGGAGAGTGGAGAACACATGCCGAACAAAGAAAAGTTTGTTGGCGAATTAGCTCGAGTGG 703
GU358684 TGGAGAGTGGAGAACACATGCCGAACAAAGAAAAGTTTGTTGGCGAATTAGCTCGAGTGG 708
GU563800 TGGAGAGTGGAGAACACATGCCGAACAAAGAAAAGTTTGTTGGCGAATTAGCTCGAGTGG 708
DQ456876 TGGAGAGTGGAGAACACATGCCGAACAAAGAAAAGTTTGTTGGCGAATTAGCTCGAGTGG 720
ABE41794 TGGAGAGTGGAGAACACATGCCGAACAAAGAAAAGTTTGTTGGCGAATTAGCTCGAGTGG 703
************************************************************
JN620365 CAGCACCAGGAGGCACAATCATCCTTGTCACATGGTGCCACAGGGACCTTTCCCCTTCGG 763
GU358684 CAGCACCAGGAGGCACAATCATCCTTGTCACATGGTGCCACAGGGACCTTTCCCCTTCGG 768
GU563800 CAGCACCAGGAGGCACAATCATCCTTGTCACATGGTGCCACAGGGACCTTTCCCCTTCGG 768
DQ456876 CAGCACCAGGAGGCACAATCATCCTTGTCACATGGTGCCACAGGGACCTTTCCCCTTCGG 780
ABE41794 CAGCACCAGGAGGCACAATCATCCTTGTCACATGGTGCCACAGGGACCTTTCCCCTTCGG 763
************************************************************
JN620365 AGGAATCTCTGACTCCAGAGGAGAAAGAGCTGTTAAATAAGATATGCAAAGCCTTCTATC 823
GU358684 AGGAATCTCTGACTCCAGAGGAGAAAGAGCTGTTAAATAAGATATGCAAAGCCTTCTATC 828
GU563800 AGGAATCTCTGACTCCAGAGGAGAAAGAGCTGTTAAATAAGATATGCAAAGCCTTCTATC 828
DQ456876 AGGAATCTCTGACTCCAGAGGAGAAAGAGCTGTTAAATAAGATATGCAAAGCCTTCTATC 840
ABE41794 AGGAATCTCTGACTCCAGAGGAGAAAGAGCTGTTAAATAAGATATGCAAAGCCTTCTATC 823
************************************************************
JN620365 TTCCGGCTTGGTGTTCCACTGCTGATTATGTGAAGTTACTTCAATCCAATTCTCTTCAGG 883
GU358684 TTCCGGCTTGGTGTTCCACTGCTGATTATGTGAAGTTACTTCAATCCAATTCTCTTCAGG 888
GU563800 TTCCGGCTTGGTGTTCCACTGCTGATTATGTGAAGTTACTTCAATCCAATTCTCTTCAGG 888
DQ456876 TTCCGGCTTGGTGTTCCACTGCTGATTATGTGAAGTTACTTCAATCCAATTCTCTTCAGG 900
ABE41794 TTCCGGCTTGGTGTTCCACTGCTGATTATGTGAAGTTACTTCAATCCAATTCTCTTCAGG 883
************************************************************
JN620365 ATATCAAGGCAGAAGACTGGTCTGAGAATGTTGCTCCATTTTGGCCAGCAGTCATAAAGT 943
GU358684 ATATCAAGGCAGAAGACTGGTCTGAGAATGTTGCTCCATTTTGGCCAGCAGTCATAAAGT 948
GU563800 ATATCAAGGCAGAAGACTGGTCTGAGAATGTTGCTCCATTTTGGCCAGCAGTCATAAAGT 948
DQ456876 ATATCAAGGCAGAAGACTGGTCTGAGAATGTTGCTCCATTTTGGCCAGCAGTCATAAAGT 960
ABE41794 ATATCAAGGCAGAAGACTGGTCTGAGAATGTTGCTCCATTTTGGCCAGCAGTCATAAAGT 943
************************************************************
JN620365 CAGCACTGACATGGAAGGGCTTCACATCAGTACTACGCAGTGGATGGAAGACAATCAAAG 1003
GU358684 CAGCACTGACATGGAAGGGCTTCACATCAGTACTACGCAGTGGATGGAAGACAATCAAAG 1008
GU563800 CAGCACTGACATGGAAGGGCTTCACATCAGTACTACGCAGTGGATGGAAGACAATCAAAG 1008
DQ456876 CAGCACTGACATGGAAGGGCTTCACATCAGTACTACGCAGTGGATGGAAGACAATCAAAG 1020
ABE41794 CAGCACTGACATGGAAGGGCTTCACATCAGTACTACGCAGTGGATGGAAGACAATCAAAG 1003
************************************************************
JN620365 CTGCACTGGCAATGCCACTGATGATTGAAGGATACAAGAAAGGTCTCATCAAATTTGCCA 1063
GU358684 CTGCACTGGCAATGCCACTGATGATTGAAGGATACAAGAAAGGTCTCATCAAATTTGCCA 1068
GU563800 CTGCACTGGCAATGCCACTGATGATTGAAGGATACAAGAAAGGTCTCATCAAATTTGCCA 1068
DQ456876 CTGCACTGGCAATGCCACTGATGATTGAAGGATACAAGAAAGGTCTCATCAAATTTGCCA 1080
ABE41794 CTGCACTGGCAATGCCACTGATGATTGAAGGATACAAGAAAGGTCTCATCAAATTTGCCA 1063
************************************************************
JN620365 TCATCACATGTCGAAAACCTGAATAA---------------------------------- 1089
GU358684 TCATCACATGTCGAAAACCTGAATAATTATTGCTTAGCTACTGCGCG------------- 1115
GU563800 TCATCACATGTCGAAAACCTGAATAATTATTGCTTAGCTACTG----------------- 1111
DQ456876 TCATCACATGTCGAAAACCTGAATAATTATTGCTTAGCTACTGATGAATAATACAACATC 1140
ABE41794 TCATCACATGTCGAAAACCTGAATAA---------------------------------- 1089
**************************
شکل 3: همردیف سازی توالی نوکلئوتیدی cDNAی ژن گاما توکوفرول متیل ترنسفراز بین رقم Memory 1 ( با شماره دستیابی (JN620365 و دیگر اکسشن های ثبت شده از گوجه فرنگی در بانک NCBI.
GU563800 MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFTLLKPQIHRRRIITCCNSSRRRRRMASVAAMN 60
GU358684 MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFTLLKPQIHRRRIITCCNSSRRRRRMASVAAMN 60
DQ456870 MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFTLLKPQIHRRRIITCCNSSRRRRRMASVAAMN 60
ABE41794 MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFTLLKPQIHRRRIITCCNSSRRRRRMASVAAMN 60
JN620365 MGSQCYSAYSIQSLNPTCPSSSSSSVIFSLLKPQIHRRRIITCCNSSRRRRRMASVAAMN 60
****************************:*******************************
GU563800 AVSSSSVEVGIQNQQELKKGIADLYDESSGIREDIWGDHMHHGYYEPKSSVELSDHRAAQ 120
GU358684 AVSSSSVEVGIQNQQELKKGIADLYDESSGIREDIWGDHMHHGYYEPKSSVELSDHRAAQ 120
DQ456870 AVSSSSVEVGIQNQQELKKGIADLYDESSGIWEDIWGDHMHHGYYEPKSSVELSDHRAAQ 120
ABE41794 AVSSSSVEVGIQNQQELKKGIADLYDESSGIWEDIWGDHMHHGYYEPKSSVELSDHRAAQ 120
JN620365 AVSSSSVEVGIQNQQELKKGIADLYDESSGIREDIWGDHMHHGYYEPKSSVELSDHRAAQ 120
******************************* ****************************
GU563800 IRMIEQALSFAAISEDPAKKPTSIVDVGCGIGGSSRYLAKKYGATAKGITLSPVQAERAQ 180
GU358684 IRMIEQALSFAAISEDPAKKPTSIVDVGCGIGGSSRYLAKKYGATAKGITLSPVQAERAQ 180
DQ456870 IRMIEQALSFAAISEDPAKKPTSIVDVGCGIGGSSRYLAKKYGATAKGITLSPVQAERAQ 180
ABE41794 IRMIEQALSFAAISEDPAKKPTSIVDVGCGIGGSSRYLAKKYGATAKGITLSPVQAERAQ 180
JN620365 IRMIEQALSFAAISEDPAKKPTSIVDVGCGIGGSSRYLAKKYGATAKGITLSPVQAERAQ 180
************************************************************
GU563800 ALADAQGLGDKVSFQVADALNQPFPDGQFDLVWSMESGEHMPNKEKFVGELARVAAPGGT 240
GU358684 ALADAQGLGDKVSFQVADALNQPFPDGQFDLVWSMESGEHMPNKEKFVGELARVAAPGGT 240
DQ456870 ALADAQGLGDKVSFQVADALNQPFPDGQFDLVWSMESGEHMPNKEKFVGELARVAAPGGT 240
ABE41794 ALADAQGLGDKVSFQVADALNQPFPDGQFDLVWSMESGEHMPNKEKFVGELARVAAPGGT 240
JN620365 ALADAQGLGDKVSFQVADALNQPFPDGQFDLVWSMESGEHMPNKEKFVGELARVAAPGGT 240
************************************************************
GU563800 IILVTWCHRDLSPSEESLTPEEKELLNKICKAFYLPAWCSTADYVKLLQSNSLQDIKAED 300
GU358684 IILVTWCHRDLSPSEESLTPEEKELLNKICKAFYLPAWCSTADYVKLLQSNSLQDIKAED 300
DQ456870 IILVTWCHRDLSPSEESLTPEEKELLNKICKAFYLPAWCSTADYVKLLQSNSLQDIKAED 300
ABE41794 IILVTWCHRDLSPSEESLTPEEKELLNKICKAFYLPAWCSTADYVKLLQSNSLQDIKAED 300
JN620365 IILVTWCHRDLSPSEESLTPEEKELLNKICKAFYLPAWCSTADYVKLLQSNSLQDIKAED 300
************************************************************
GU563800 WSENVAPFWPAVIKSALTWKGFTSVLRSGWKTIKAALAMPLMIEGYKKGLIKFAIITCRK 360
GU358684 WSENVAPFWPAVIKSALTWKGFTSVLRSGWKTIKAALAMPLMIEGYKKGLIKFAIITCRK 360
DQ456870 WSENVAPFWPAVIKSALTWKGFTSVLRSGWKTIKAALAMPLMIEGYKKGLIKFAIITCRK 360
ABE41794 WSENVAPFWPAVIKSALTWKGFTSVLRSGWKTIKAALAMPLMIEGYKKGLIKFAIITCRK 360
JN620365 WSENVAPFWPAVIKSALTWKGFTSVLRSGWKTIKAALAMPLMIEGYKKGLIKFAIITCRK 360
************************************************************
GU563800 PE 362
GU358684 PE 362
DQ456870 PE 362
ABE41794 PE 362
JN620365 PE 362
**
شکل 4: همردیف سازی توالی اسید آمینه ای منتج شده از cDNAی ژن گاما توکوفرول متیل ترنسفراز بین رقم Memory 1 ( با شماره دستیابی (JN620365 و دیگر اکسشن های ثبت شده از گوجه فرنگی در بانک .NCBI
بررسی درخت فیلوژنتیکی ژن گاما توکوفرول متیل ترانسفراز با استفاده از نرم افزار Clustalw صورت گرفت. به همین منظور از ژن های گاما توکوفرول متیل ترانسفراز دیگر گیاهان ثبت شده در NCBI استفاده شد (شکل 5). بررسی های انجام شده با استفاده از نرم افزار Clustalw نشان داد که پروتئین منتج از ژن همسانه سازی شده با پروتئین های ثبت شده مشابه در بانک ژنNCBI ، 32 تا 5/99 درصد تشابه دارد. ژن توالی یابی شده با داشتن 5/99 و 6/98 درصد، بیشترین تشابه را به ترتیب با توالیهای Solanum penellii وSolanum tuberosum با شماره ی دستیابی ADZ24710 و ADV36922 و کمترین تشابه را با Synechococcus با 32 درصد، نشان داد. ساختار دوم پروتئین در اثر فعل و انفعالات پیوند هیدروژنی باقی مانده اسیدهای آمینه در داخل یا بین زنجیره های پپتیدی ایجاد می شود. پیش بینی ساختار دوم پروتئین ژن هدف با استفاده از نرم افزار آنلاین PSIpred صورت گرفت و نتایج نشان داد که این پروتئین از 16 مارپیچ آلفا، 8 صفحه ی بتا و 23 کویل تشکیل شده است(شکل 6).
شکل 5:درخت فیلوژنتیک پروتئین گاما توکوفرول متیل ترانسفراز گیاهان موجود در NCBI. I.توالی هایی که با پروتئین منتج شده از ژن توالی یابی شده 30تا40 درصد شباهت دارند. II. توالی هایی که با پروتئین ژن توالی یابی شده 40تا50 درصد شباهت دارند، III. توالی هایی که با پروتئین ژن توالی یابی شده 50تا60 درصد شباهت دارند، IV. توالی هایی که با پروتئین ژن توالی یابی شده 70تا80 درصد شباهت دارند V توالی هایی که با پروتئین ژن توالی یابی شده 80 تا90 درصد و VI توالی هایی که با پروتئین ژن توالی یابی شده 90تا99 درصد شباهت دارند. * توالی پروتیین مورد بررسی.
شکل6: پیش بینی ساختار دوم پروتئین گاما توکوفرول متیل ترانسفراز با استفاده از نرم افزار آنلاین .PSI pred
شکل 7:ساختار سوم آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز با استفاده از نرم افزار آنلاین .PSI pred
مدل سازی تطبیقی، روشی معتبر برای پیش بینی ساختار سه بعدی پروتئین ها بر اساس توالی اسید آمینه می باشد. برای ترسیم ساختار سوم پروتئین ژن هدف توالی اسیدآمینه ای آنزیم گاما توکوفرول متیل ترانسفراز در سایت PS2 مورد بررسی قرار گرفت و آنزیم سارکوزین دی متیل گلایسین متیل ترانسفراز Galdieria sulphuraria (PDB 2O57) با 21 درصد شباهت به عنوان الگو در نظر گرفته شد (شکل 7).
بحث
در گیاهان فتوسنتز کننده، توکوفرول ها در پاسخ به بسیاری از تنش های غیر زنده افزایش نشان می دهند؛ از جمله نور شدید (22) خشکی (23) و دماهای پایین و بالا (24). بیشتر توکوفرول ها در گیاهان در پلاستید ها قرار دارند، تنها استثنا در این مورد، گیاهان دانه روغنی است که توکوفرولها در دانه این گیاهان به صورت ذرات روغن (oil bodies) که از شبکه آندوپلاسمی منشا میگیرند، ذخیره می شوند (14). این مطالعه با هدف همسانه سازی ژن گاماتوکوفرول متیل ترنسفراز از گیاه گوجه فرنگی، مطالعه و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی و ملکولی پروتئین منتج از آن و در نهایت، انتقال آن به یک گیاه دانه روغنی، در پژوهش های آینده صورت گرفت. انتقال این ژن (گاما توکوفرول متیل ترنسفراز) می تواند هم ارزش غذایی گیاه را به دلیل تولید بیشتر آلفا توکوفرول بالا ببرد و هم از نظر افزایش مقاومت گیاه در مقابل تنش ها، مفید واقع شود.
ژن همسانه سازی شده با ژن های ثبت شده گوجه فرنگی در بانک ژن 98 درصد شباهت را نشان داد. تفاوت هایی در موقعیت های 84، 273، 561 و 642 در بین توالی های نوکلئوتیدی همردیف سازی شده بین ژن ثبت شده در این پژوهش با شماره دستیابی JN620365، با ژن ثبت شده با شماره دستیابی DQ456876 که به عنوان توالی مرجع استفاده شده بود، مشاهده گردید (شکل 3). این تفاوت ها به ترتیب شامل جایگزینی یک نوکلئوتیدA به جای T، یک نوکلئوتید C به جای T، یک نوکلئوتید A به جای G و یک نوکلئوتید C به جای G می شد. این تغییرات به ترتیب باعث تبدیل کدون ACT به TCT، کدون TGG به CGG، کدون GGA به GGG و TCC به TCG شده اند (شکل 4). در دو موقعیت 84 و 273 جایگاه اول کدون و در موقعیت 561 و 642 جایگاه سوم کدون تغییر یافته اند. تغییر در جایگاه 84 موجب تبدیل اسید آمینه ی ترئونین به سرین، در جایگاه 273 اسیدآمینه ی تریپتوفان به آرژنین و در موقعیت های 561 و 642، به ترتیب، کدون گلایسین و سرین به کدون های دیگری از همین اسیدهای آمینه تبدیل شده اند (شکل های 4 و 5). در بین چهار تغییری که در کدون ها رخ داده بود، تنها دو کدون، اسیدهای آمینه متفاوتی را بوجود می آورند. تبدیل اسید آمینه ترئونین به سرین (تغییر در جایگاه 84) شاید باعث تغییر عمده ای در ساختار و عملکرد پروتئین حاصله نشود؛ زیرا هر دوی این اسید های آمینه از نظر ساختاری بسیار به هم شبیه و جزو اسید های آمینه قطبی بدون بارند. اما تبدیل اسید آمینه تریپتوفان به آرژنین (تغییر در جایگاه 273) می تواند تغییر اساسی در ساختار و در نتیجه در عملکرد پروتئین حاصله داشته باشد؛ زیرا تریپتوفان جز اسیدهای آمینه آبگریز و آرژنین جز اسیدهای آمینه بازی دارای بار مثبت است. چنین جایگزینی یک تغییر عمده در قسمتی از ساختار و خصوصیت بیوشیمی یک پروتئین محسوب میشود. این تغییر در سه اکسشن دیگر گوجه فرنگی هم به چشم میخورد (شکل 5). حال این که کدام یک از این آیزوفرم ها می تواند گاما توکوفرول را به آلفا توکو فرول تبدیل نماید و یا با کارآیی بیشتری این عمل را انجام دهد، به انتقال این آیزوفرم ها به گیاهان جهش یافتهی فاقد این ژن و بررسی میزان تولید آلفا تو کوفرول در آنها نیاز دارد. در هر صورت، پروتئین حاصله دارای 362 اسید آمینه و وزن ملکولی حدود kD 39 است که با پروتئین های مشابه از گیاه فلفل زنگوله ای با وزن ملکولیkD 33 (10) و پروتئین فلفل دلمهای با وزن ملکولی kD36 (25) مشابهت دارد.
مشاهده گردید که ژن به دست آمده در این مطالعه دارای توالی راهنمای پلاستیدی است. این یافته با حضور توکوفرول ها در کلروپلاست مطابقت دارد (14)، به این معنی که این آنزیم باید جهت تبدیل گاما توکوفرول به آلفا توکوفرول، به مکان سوبسترای خود (درون کلروپلاست)، حمل گردد. توکوفرول های آلفا، بتا، گاما و دلتا دارای فعالیت آنتی اکسیدانتی مختلفی دربرابر اکسایش لیپیدها در شرایط in vivo دارند. هر ملکول از این توکوفرولها میتواند به ترتیب علیه 220، 120، 100 و 30 ملکول PUFA (polyunsaturated fatty acid) فعالیت داشته باشد. همچنین پیشنهاد شده که توکوفرولها نقش مهمی را در محافظت از دستگاه فتو سنتزی گیاه دارند و دیده شده است که در پا سخ به تنشهای غیر زنده مانند خشکی و وجود فلزات سنگین افزایش نشان می دهند (26). تبدیل گاما توکوفرول به شکل فعالتر آن یعنی آلفا توکوفرول توسط آنزیم گاما توکوفرول متیل ترنسفراز صورت میگیرد (16) که انتقال این ژل به گیاهان هدف، از جمله گیاهان دانه روغنی میتواند در افزایش خاصیت تغذیه ای و عملکرد آن ها در شرایط سخت نقش مهمی را ایفا نماید.
نتیجهگیری
آلفا توکوفرول ماده ضد اکسنده قوی است که طی واکنش بیوشیمیایی از گاما توکوفرول ساخته می شود. با افزایش میزان این آنزیم از طریق مهندسی ژنتیک می توان محتوای ویتامین E گیاه و مقاومت آن را در برابر تنش های محیطی بالا برد. مهندسی ژنتیکی را می توان جایگزین بالقوهی منبع ویتامین E با فرض تولید مقرون به صرفهی اقتصادی نسبت به تولید شیمیایی آلفاتوکوفرول در نظر گرفت. در میان گیاهان دانه روغنی بعلت غنی بودن از گاما توکوفرول بهترین هدف تولید اقتصادی توکوفرول ها از طریق مهندسی مسیر بیوسنتزی آنها می باشد. بنابراین برای ابربیان ژن گاما توکوفرول متیل ترانسفراز در گیاهان مذکور باید ژن همسانه سازی شده در ناقل pBluescript را به یک ناقل بیانی همسانه سازی کرد و به گیاهان دانه روغنی انتقال داد.
تشکر و قدر‌دانی
هزینه این پژوهش از بودجه گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) تامین گردید که به این وسیله تشکر میگردد.
)