فصلنامه
نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی ارشد بیوشیمی، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی. ، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
2 گروه بیوتکنولوژی ، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
3 استادیار گروه خانواده درمانی، پژوهشکده زنان، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
4 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی. ، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Introduction: Plant-derived exosome-like nanoparticles (PDENs) are nano-sized vesicles released by plant cells. They contain a lipid bilayer membrane and carry bioactive molecules such as proteins, lipids, nucleic acids, and secondary metabolites. Due to their low toxicity and natural drug delivery potential, they have gained attention for therapeutic applications. Plant extracts are also rich in phenolic compounds and flavonoids with known antioxidant and antimicrobial effects. The rising problem of antibiotic resistance in pathogens like Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Streptococcus pyogenes has created an urgent need for new natural agents.
Aim: This study aimed to isolate and characterize exosomes from ginger, lavender, onion, and lemon, and to compare their antioxidant and antibacterial activities with those of aqueous extracts from the same plants.
Materials and methods: Fresh ginger, lavender, onion, and lemon were used for the preparation of plant extracts and exosome isolation. For aqueous extraction, 2 g of ginger and lavender samples were homogenized with 20 mL of distilled water and incubated in a water bath at 70°C for 90 minutes. The mixtures were centrifuged at 3000 × g for 10 minutes, and the supernatants were filtered and stored at 4°C until analysis. Exosomes were isolated using the Exosun Exosome Isolation Kit (EXOSUN Company). Plant materials were homogenized, filtered, and subjected to differential centrifugation. The resulting supernatants were processed according to the manufacturer's instructions using buffers A and B. Due to the acidic nature of lemon juice, modification of the protocol was required by increasing the concentration of buffer A to facilitate exosome precipitation. Protein concentration of isolated exosomes was determined using the Bradford assay with bovine serum albumin (BSA) as the standard. Exosome morphology was characterized by transmission electron microscopy (TEM). The antioxidant activity of extracts and exosomes was evaluated using the Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay. Samples were analyzed in 96-well microplates, and absorbance was measured at 570 nm. Antibacterial activity was assessed against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Streptococcus pyogenes using the disk diffusion method. Sterile blank disks were impregnated with plant extracts or exosome preparations at concentrations of 25, 50, and 100 mg/mL and placed on Mueller-Hinton agar plates inoculated with bacterial suspensions adjusted to a 0.5 McFarland standard. Gentamicin and vancomycin served as positive controls. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values were determined using the broth microdilution method in 96-well microplates. All experiments were performed in triplicate. Statistical analyses were conducted using SPSS version 27, applying one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test, with p <0.05 considered statistically significant.
Results: TEM confirmed successful isolation of exosome-like vesicles from all plants. Bradford assay indicated protein-containing nanoparticles. FRAP analysis showed that lavender had the highest antioxidant capacity. Plant extracts generally showed greater antioxidant activity than their corresponding exosomes. Antibacterial testing revealed that exosomes from all four plants had no detectable antibacterial effect. Similarly, aqueous extracts of ginger, lavender, and onion showed no inhibition. However, lemon extract exhibited significant antibacterial activity against all three bacteria. MIC values of lemon extract were 3.12 mg/mL for S. aureus, 6.25 mg/mL for S. pyogenes, and 50 mg/mL for E. coli. Inhibition zones for S. aureus reached 22 mm at 100 mg/mL. Gram-positive bacteria were more susceptible than Gram-negative E. coli.
Discussion:The spread of antibiotic-resistant pathogens has increased the need for new treatments. In this study, exosomes isolated from ginger, lavender, onion, and lemon showed no antibacterial activity, while among aqueous extracts, only lemon extract displayed good antibacterial properties. The lack of activity in aqueous lavender extract compared to alcoholic extracts in previous reports may be due to solvent differences affecting phenolic compound extraction. Aqueous ginger extract also showed no effect, which contrasts with some alcoholic extracts. However, lavender exosomes demonstrated the highest antioxidant capacity among all samples, highlighting their potential for antioxidant applications.
Conclusion: Although plant-derived exosomes from these four species did not show antibacterial effects under the tested conditions, lemon aqueous extract exhibited promising antimicrobial activity, especially against Gram-positive bacteria. Lavender exosomes showed the strongest antioxidant potential. These findings suggest that lemon extract could serve as a natural antibacterial agent, while lavender-derived exosomes and extracts may be valuable sources of natural antioxidants. Further in vivo studies are needed to explore their efficacy and safety.
کلیدواژهها English
- مقدمه
اگزوزومها ذراتی با اندازه تقریبی ۳۰ تا ۱۰۰ نانومتر هستند که از انواع سلولهای مختلف به محیط خارج سلولی ترشح میشوند. این وزیکولها ماهیت غشای لیپیدی داشته و میتوانند با غشای سلول ادغام شوند. همچنین این وزیکولها غنی از لیپیدهای CD81 (Cluster of Differentiation 81)، CD9 (Cluster of Differentiation 9 و اسفنگومیلین هستند و در ارتباطات سلولی، تنظیم عملکرد ایمنی، مهاجرت توموری و تعدیل واکنشهای دارویی نقش دارند، اما عصاره گیاهی به تمام موادی گفته میشود که طی فرایند استخراج از فضای سلولی گیاه جدا شده و بهخارج از بافت انتقال مییابد، که عصارهها حاوی مجموعهای از متابولیتهای اولیه و متابولیتهای ثانویه هستند (۱).
گیاهان بهدلیل فواید بیشمارشان، توجه زیادی را در تحقیقات زیستپزشکی به خود جلب کردهاند. وزیکولهای مشتقشده از گیاهان، وزیکولهای کوچک در مقیاس نانو هستند که توسط سلولهای گیاهی ترشح میشوند (1). آنها همچنین نویدبخش درمان بیماریها هستند و ساختارهای وزیکولی آنها، آنها را به حاملهای مناسبی برای دارورسانی تبدیل میکند و تولید در مقیاس بزرگ را امکانپذیر کرد. کشف وزیکولهای اگزوزوم مانند در گیاهان، به سال ها پیش از مشاهده آنها در سلولهای پستانداران باز میگردد ادغام این ساختارها با غشای سلولی، منجر به آزادسازی وزیکولهای اگزوزوم مانند به فضای خارج سلولی میشود (2).
برای مقاصد و کاربردهای مختلف، روشهای جداسازی متفاوتی برای اگزوزوم انتخاب میشوند که در میان آنها روشهای اولترا سانتریفیوژ، روشهای جداسازی مبتنی بر اندازه، رسوب پلیمری، تکنیکهای جذب ایمنی بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند (3).
شیوع پاتوژنهای عفونی جدی، از جمله اشریشیاکلی (E.coli) و استرپتوکوک پیوژنز (S. pyogenes) ، باعث افزایش شدید بیماری و مرگومیر در سراسر جهان میشود. همچنین افزایش نگرانکنندهای در میزان مقاومت آنتیبیوتیکی دیده میشود. اشریشیاکلی بخشی از فلور باکتریایی طبیعی موجود در دستگاه گوارش است بااینحال، برخی از سویههای E.coli قادر به تولید سمومی هستند که ممکن است منجر به عفونتهای جدی شوند. سویههای باکتری E.coli در بیماریهای اسهالی نقش دارند (4).
مطالعههای انجام شده توسط مصدق پور و همکاران (5) درصد عفونتهای بیمارستانی در ایران را بین ۳۲/۰ و ۱/۹ گزارش کردند. شیوع عفونت بیمارستانی در بیمارستانهای ایران بر اساس مدل تصادفی 01/0 درصد بهدست آمد. شایعترین نوع عفونت مربوط به دستگاه ادراری و شایعترین نوع میکروارگانیسم اشریشیا کولی بود. میزان شیوع E.coli (عفونت های گوارشی ) در ایران بر اساس سایتWHO ، 30 درصد است (6).
استرپتوکوک پیوژنز که بهعنوان (استرپتوکوک گروه A) شناخته میشود، مسئول طیف وسیعی از تظاهرات بالینی از بیماریهای کمخطرتر از جمله گلودرد، فارنژیت، التهاب لوزه، تب مخملک، زردزخم و سلولیت تا بیماریهای جدیتر مانند سپسیس، مننژیت، ذاتالریه و فاشئیت نکروزان است (7).
بسیاری از مطالعات، فعالیتهای درمانی لیموترش (لیمون) از جمله فعالیتهای ضد التهابی، ضد باکتریایی، ضد سرطانی و ضد انگلی را بهدلیل وجود محتوای بالای فنلی عمدتا فلاونوئیدها (بهعنوان مثال، دیوزمین، هسپریدین، لیموسیترین) و اسیدهای فنولیک (بهعنوان مثال، فرولیک، سیناپیک، اسیدهای p-هیدروکسی بنزوئیک) گزارش کردهاند (8). علاوه بر این، پوست لیموترش بهدلیل داشتن انواع مختلف مواد مغذی و فیتوشیمیایی از جمله β- و γ-سیتوسترول، انواع مختلف روغنهای فرار و گلیکوزیدها، در درمان بیماریهای مختلف مانند اسکوربوت، مشکلات تنفسی، سوء هاضمه، عفونت چشم و بیماریهای پوستی استفاده میشود (9).
زنجبیل گیاهی است که از ریزوم آن بهعنوان ادویه و دارو استفاده فراوانی شده است. حدود 400 ترکیب فعال زیستی در زنجبیل کشف شده است که فواید سلامتی بالقوهای مانند اثرات ضد التهابی، ضد توموری، ضد چاقی و ضد دیابت و غیره را نشان داده است (10). گزارش شده است که زنجبیل بهدلیل وجود جینجرول و پارادول، شوگاول و زینجرون دارای پتانسیل ضدباکتریایی است که میتواند از رشد باکتریها و قارچها جلوگیری کند. فعالیت بالقوه در برابر بسیاری از باکتریهای گرم منفی مانند Helicobacte pylori ، Pseudomonas و باکتریهای گرم مثبت مانند aureus Staphylococcus، Bacillus subtili ، Staphylococcus epidermidis نشان میدهد (11). دلیل انتخاب لیمو در این پژوهش به دلیل وجود محتوای بالای فنلی عمدتا فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک است که خاصیت ضد باکتریایی دارند. دلیل انتخاب زنجبیل ترکیبات غیرفرار مانند جینجرولها، شوگائولها، پارادولها و زینگرون که اثرات آنتی اکسیدانتی دارند.
پیاز (Allium cepa) از قدیمیترین گیاهان کشتشده است و برای اهداف متعددی مورد استفاده قرار میگیرد. علاوه بر اثرات تغذیهای، فعالیتهای آنتی اکسیدانتی و ضدباکتریایی پیاز نیز مطرح شده و همچنان بهطور گسترده مورد بررسی قرار میگیرد (12).
هـدف از این پژوهش در مرحلـه اول عصارهگیری و استخراج اگزوزوم از زنجبیل و اسطوخودوس و پیاز و لیموترش بود. سـپس تستهای شناسایی اگزوزوم انجام شد. از طرفی محتوی آنتی اکسیدانتی FRAP نیز در اگزوزوم و عصارهها بررسیشــد. همچنین اثر عصارهها و اگزوزومها بر باکتریهای Escherichia coli و Staphylococcus aureu و Sterptococcousus جهت سنجش خاصیت ضد باکتریایی عصارهها و اگزوزومها بررسـی شد.
در این پژوهش برای اولینبار بین عصارهها و اگزوزومهای چهار گیاه مقایسه انجام شد همچنین تاکنون روی تأثیر اسطوخودوس و زنجبیل بر روی Escherichia coli Sterptococcous, کار نشده است.
2- مواد و روشها
تمام آزمایشهای انجام شده توسط کمیتة اخلاق دانشگاه الزهرا تأیید شد. شماره کد اخلاقIR.ALZAHRA.REC.1403.053))
تهیة عصاره: مقدار 2 گرم از اسطوخودوس و زنجبیل را با20 میلیلیتر آب آسیاب شد و درون دستگاه بنماری در دمای70 درجه سانتیگراد بهمدت 90 دقیقه قرار داده شد. پس از آن نمونه درون دستگاه سانتریفوژ بهمدت10دقیقه در 3000g دور قرار داده شد و در آخر مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ از صافی گذرانده شد. عصاره در دمای 4 درجه سانتیگراد تا زمان تجزیه و تحلیل نگهداری شد (13).
روش تخلیص اگزوزومهای زنجبیل، اسطوخودوس، لیموترش و پیاز: با استفاده از کیت اندازهگیری اگزوسان از شرکت EXOSUN اگزوزومها استخراج شد. در ابتدا زنجبیل و اسطوخودوس تازه را آسیاب کرده و آب لیموترش و پیاز گرفته شد و از صافی عبور داده شد. محلول عبوری از صافی را با سرعت 3000 g بهمدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب را دور ریخته و محلول رویی با شدت 7000g بهمدت نیم ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. بافر B کیت اگزوسان به نسبت ۱ به 8 به محلول رویی مرحله قبل افزوده و کاملا مخلوط شد. مخلوط حاصل با شدت g 7۰۰۰ بهمدت دو ساعت سانتریفیوژ شد. بافر A کیت اگزوسان را به نسبت ۱ به ۸ به محلول رویی مرحله قبل اضافه شد (14) ولی در لیمو ترش بهدلیل اسیدیته با نسبت 1به 8 بافر A اگزوزوم استخراج نشد بافر A به نسبت 1به 1 اضافه شد که غلظت پلیمر بالا برود و اگزوزوم ها رسوب کنند.
تست برادفورد: برای تعیین غلظت پروتئینهای اگزوزومها پس از جداسازی و تخلیص، از تکنیک برادفورد استفاده شد. ابتدا غلظتهای (mg/ml ۲۵/۳۱، mg/ml ۵/۶۲، mg/ml ۱۲۵، mg/ml ۲۵۰، mg/ml ۵۰۰ و mg/ml ۱۰۰۰ از محلول استاندارد پروتئین BSA در حجمهای μL ۵۰۰ در شش ویال متفاوت آماده گشت. ویال هفتم نیز از ۵۰۰ میکرولیتر بافر PBS بهعنوان بلانک پر شد. در هر خانه از پلیت الایزا ابتدا۱۸۰ میکرولیتر از معرف A (1) کیت برادفورد ریخته و سپس ۲۰ میکرولیتر از غلظتهای استاندارد BSA، PBS، محلول اگزوزوم حل شده در بافر C و همچنین بافر C بهتنهایی اضافه شد و چندمرتبه پیپتینگ اجرا شد. انکوباسیون پلیت الایزا بهمدت ۵ دقیقه و در دمای اتاق بود و درنهایت توسط دستگاه خوانش الیزا در طولموج 570 نانومتر خوانش انجام شد (15).
شناسایی اگزوزوم
استفاده از میکروسکوپ TEM: در آنالیز TEM ( Transmission electron microscopy)، اگزوزومها بهطور خلاصه در پارافرمالدهید 2 درصد تیمار شدند، روی شبکههای TEM با پوشش کربن Formvar قرار داده شدند و بهمدت 20 دقیقه انکوبه شدند. سپس اگزوزومها با گلوتارآلدهید انکوبه، شسته، در هوا خشک و با اورانیل استات رنگآمیزی شدند (16).
سنجش ظرفیت تام اکسیدانتی بهروش FRAP: با استفاده از کیت اندازهگیری ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی (TAC) از شرکت نوند سلامت میزان آنتی اکسیدانت عصارهها و اگزوزوم اسطوخودوس و زنجبیل اندازهگیری شد. برای تهیة معرف FRAP 50 میلیلیتر از بافر استات 300 مولار را با 5 میلیلیتر FeCl3 40 میلیمولار 5 میلیلیتر محلول TPTZ 10 میلیمولار ترکیب وپس استانداردها تهیه میشود.
در چاهکهای پلیت 96 خانه ای μL 5 از عصاره ها و اگزوزومها با غلظت 100 ریخته شد و در ادامه به همهی خانههای حاوی نمونه یا استاندارد 250میکرو لیتر از محلول کار اماده شده را اضافه کرده تغییر رنگ بنفش نشان دهندی خاصیت آنتی اکسیدانتی است بعد جذب آنها پس از 5 دقیقه در طولموج 570 نانومتر خوانده شد (17).
تست ضد باکتریایی بهروش انتشار دیسک: برای انجام این تست در پلیتهای 10 سانتیمتر پلیت با محیط کشت مولر هینتون آگار پر گردید. سپس باکتریهای مورد مطالعه با غلظت نیم مک فارلند بر روی پلیتها بهصورت چمنی کشت داده شدند. سپس روی هر دیسک بلانک μL50 از اگزوزوم و عصارهها در غلظتهای mg/ml100,50, 25 ریخته شد و پس از جذب در دیسک بلانک، بر روی پلیت قرار گرفت. بر روی هر پلیت یک دیسک آنتیبیوتیک بهعنوان کنترل مثبت قرار داده شد. از آنتیبیوتیکهای جنتامایسین و ونکومایسین بهعنوان کنترل مثبت استفاده شد (18).
بررسی تعیین کمترین غلظت بازدارنده و کمترین غلظت کشنده: برای بررسی Minimum Inhibitory Concentration (MIC)و Minimum Bactericidal Concentration (MBC) از روش microdilution broth در پلیت 96 خانه استفاده شد. در تمامی چاهکهای ردیف اول 100 میکرولیتر محیط کشت مولر هینتون براث ریخته شد. در چاهک اول از ردیف اول 100 میکرولیتر از عصارهها با غلظت 100mg/ml ریخته شد و پیپتاژ بهخوبی صورت گرفت. سپس 100 میکرولیتر از چاهک اول برداشته شد و به چاهک دوم اضافه شد و پیپتاژ انجام شد. این روند تا چاهک ششم صورت گرفت و از چاهک ششم 100 میکرولیتر خارج شد. در مرحله بعد 100 میکرولیتر از سوسپاسیون میکروبی تهیه شده به هر یک از چاهکها بجز چاهک (کنترل منفی) اضافه شد و پلیت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت قرار گرفت. این روش برای اگزوزومهای گیاه نیز تکرار شد.
پس از گذشت 24 ساعت پلیت از انکوباتور خارج شد و چاهکی که با کمترین غلظت از تیمار هیچگونه رشد بصری از باکتری در آن دیده نشد بهعنوان MIC در نظر گرفته شد. برای تعیین MBC، ازهمهی رقت ها در پلیتهای دیگری کشت چمنی داده شدند (18).
3- آنالیز آماری
تمام آزمایشهای انجام شده در این پژوهش در سه تکرار طراحی شدهاند. با نرمافزار SPSS نسخه 27، آزمون واریانس یکطرفه و تست تکمیلی توکی با شرط آماری p<0.05 انجام شدو رسم نمودار با اکسل انجام شد.
4- نتایج
شکل 1 اگزوزوم زنجبیل و اسطوخودوس را نشان میدهد که با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گرفته شده است تصاویر نشان میدهد اگزوزومها کروی شکل هستند.
شکل 1: تصاویر میکروسکوپ الکترونی. الف) اگزوزوم اسطوخودوس را نشان میدهد که با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گرفته شده است تصویر نشان میدهد اگزوزومها کرویشکل هستند. فاصلة بین اگزوزومها زیاد است وزیکولهای ریز هم در تصویر دیده میشوند؛ ولی وضوح خوبی ندارد. ب) تصویر اگزوزوم زنجبیل را نشان میدهد اگزوزومها کرویشکل هستند و بهصورت متراکم در کنار یکدیگر قرار گرفتهاند.
تست برادفورد
تست برادفورد برای تعیین غلظت اگزوزوم انجام میشود. پس از رﺳـﻢ ﻧﻤﻮدار اﺳـﺘﺎﻧﺪارد پروﺗﺌﯿﻦ BSA نمودار 1 و بهدست آوردن معادلهی خط آن جذبﻧﻮری ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﺠﻬﻮل یعنی اگزوزوم درمعادله قرار گرفت وﻏﻠﻈﺖ پروﺗﺌﯿﻦﻫﺎ یا اگزوزوم ﺗﻌﯿﯿﻦﺷﺪ.
نمودار 1 :ﻧﻤﻮدار اﺳـﺘﺎﻧﺪارد پروﺗﺌﯿﻦ BSA.. غلظت اگزوزوم زنجبیل mg/ml 5/193 و اگزوزوم اسطوخودوس 109 mg/ml اگزوزوم لیمو mg/ml 200 و اگزوزوم پیاز mg/ml 150 بهدست آمد.
نتایج تستهای آنتیاکسیدانتی
در پژوهش حاضر اگزوزومها استخراج شد و فعالیت آنتی اکسیدانتی آنها و عصارههای آنها بررسی شد که نتایج آن در نمودار 2 و3 قابل مشاهده است. عصارهی اسطوخودوس خاصیت آنتی اکسیدانتی بالاتری از سایر عصارهها داشت . نمودار 2 نشان میدهد خاصیت آنتیاکسیدانتی عصارهی پیاز و زنجبیل و لیمو مشابه بود) حروف مشترکC (خاصیت آنتیاکسیدانتی اسطوخودوس به شکل معناداری از همه عصارهها بیشتر بود. نمودار 3 نشان میدهد بین ظرفیت تام آنتیاکسیدانتی پیاز با اسطوخودوس و لیمو تفاوت معناداری وجود دارد.
نمودار 2: مقایسهی ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی بین عصاره اسطوخودوس، لیمو، پیاز و عصاره زنجبیل n=3.حروف متفاوت، اختلاف معناداری در سطح (05/0 ) را نشان می دهد. بین عصاره لیمو ,عصاره پیازوعصاره زنجبیل تفاوت معناداری در میزان خاصیت آنتی اکسیدانتی وجود ندارد ) حروف مشترکC (خاصیت آنتیاکسیدانتی عصارهی اسطوخودوس0.03± 1.82و در لیمو0.01± 0.88 و در زنجبیل 07. ±87 است. ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی اسطوخودوس بهطور معناداری بیشتر از سایر عصارهها است. این مقادیر میانگین است.
|
|
|
|
|
|
نمودار 3: مقایسهی ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی بین اگزوزوم اسطوخودوس، لیمو, زنجبیل وپیازn=3. حروف متفاوت نشاندهندة اختلاف معنادار در سطح (05/0 ) بین ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی پیاز با اسطوخودوس ولیمو تفاوت معناداری وجود دارد (حروف متفاوت a,b ) اما بین پیاز و زنجبیل تفاوت معناداری وجود ندارد (حرف مشترک a ) این مقادیر میانگین است.
همانطور که در نمودار 2 و3 دیده می شود ظرفیت تام آنتی اکسیدانتی عصاره اسطوخودوس و اگزوزوم اسطوخودوس و لیمو نسبت به سایر موارد بررسی شده بیشتر میباشد.
نتایج تستهای ضد باکتری
در پژوهش حاضر اگزوزومها استخراج شد و فعالیت ضد باکتریایی این عصارهها و اگزوزومها را در برابر گونههای گرم مثبت و گرم منفی، از جمله Staphylococcus aureus و Escherichia coli بهروش تعیین حداقل غلظت مهارکننده رشد (MIC) و انتشار دیسک بررسی شد. اگزوزومها خاصیت ضد باکتریایی نداشتند. همچنین عصارههای زنجبیل، اسطوخودوس و پیاز خاصیت ضد باکتریایی نداشتند و فقط در عصارة لیمو خاصیت ضد باکتریایی مشاهده شد.
MIC لیمو در استافیلوکوکوس اورئوس mg/ml 3.12 و در اشرشیاکلی mg/ml50 و در استرپتوکوکوس پیوژنز 6.25mg/ml بهدست آمد.
تاثیر عصارة لیمو بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بررسی شد. قطر هاله اندازهگیری شد و نشان داد که در غلظت mg/ml 100 قطر هاله mm 22 در غلظت mg/ml 50 mm ,20 در غلظت mg/ml 25 قطر هاله mm 17 بود بهعنوان کنترل مثبت از ونکومایسین استفاده شد.
تاثیر عصارة لیمو بر باکتری استرپتوکوکوس پایوژنز بررسی شد. قطر هاله اندازهگیری شد و نشان داد که در عصارة لیمو در غلظت mg/ml 100 قطر هاله mm22 در غلظت mg/ml 50 قطر mm 15 در غلظت mg/ml 25 قطر هاله mm15 بود بهعنوان کنترل مثبت از جنتامایسین استفاده شد.
تاثیر عصاره لیمو بر باکتری اشرشیاکلی بررسی شد. قطر هاله اندازهگیری و نشان داده شد که در عصارة لیمو در غلظت mg/ml 100 قطر هاله mm15 در غلظت mg/ml50 قطر هاله mm8 در غلظت mg/ml 25 قطر هاله mm 1 بود بهعنوان کنترل مثبت از جنتامایسین استفاده شد. قطر هاله اندازهگیریشده mm20 بود؛ بنابراین نتایج نشان دادند که کمترین هاله در اشرشیاکلی و بیشترین آن در استافیلوکوکوس اورئوس ایجاد شد.
در باکتری Sterptococcous بین غلظت 100 و 50 تفاوت معناداری در قطر هاله وجود دارد )حروف متفاوت a,b ( اما بین غلظتهای 50 و 25 تفاوت معناداری در قطر هاله وجود ندارد (حروف یکسانb ).
همانگونه که در جدول 1 دیده میشود عصاره لیموترش بیشترین اثر را بر باکتری اشرشیاکلی دارد. همچنین نشاندهنده خاصیت ضد باکتریایی زیاد عصاره لیمو است.
جدول 1: قطر هاله ی عدم رشد برحسب میلی متر
|
غلظت عصاره لیمو (mg/ml) |
100 |
50 |
25 |
|
S. aureus |
20 ±0.4 |
17±.47 |
|
|
E.Coli |
8±.08 |
1±.4 |
|
|
S. pyogenes |
±1.0817 |
15±.23 |
15±.81 |
شکل 2: تاثیر عصارهی لیمو بر باکتریهای (الف) استافیلوکوکوس اورئوس (ب) استرپتوکوکوس پیوژنز (ج) اشرشیا کلی
نمودار 4: مقایسهی قطر هاله ی عدم رشد باکتریهای Sterptococcous ، Escherichia coli و Staphylococcus aureus در حضور غلظتهای مختلف عصارهی لیمو ترشn=3. حروف متفاوت در هریک از غلظتها نشان دهندة اختلاف معنادار در سطح (05/0) است. در باکتری Sterptococcous بین غلظت 100 و 50 تفاوت معناداری وجود دارد (حروف متفاوت a,b ). در اکولای بین غلظت های 100و50و25اختلاف معنا داری وجود دارد (حروف متفاوت C,d,f(بنایراین نتایج نشان دادند که در بالاترین غلظت کمترین قطرهاله در اکولای 15±1.08 و بیشترین ان در استافیلو کوکوس اورِئوس22± 0.23 ایجاد شد.
در این پژوهش ، فعالیت ضد باکتریایی عصارهها و اگزوزومها به روش تعیین حداقل غلظت مهارکننده رشد (MIC) بررسی شد که نتایج آن در جدول 2 قابل مشاهده است. جدول 2 نشان دهندهی میزان MIC وMBC عصاره لیمو ترش است.
جدول 2: نتایجMIC و MBC عصاره لیمو ترش
5- بحث
شیوع پاتوژنهای عفونی جدی، از جمله اشریشیاکلی و استرپتوکوک پیوژنز، باعث افزایش شدید بیماری و مرگومیر در سراسر جهان میشود. همچنین افزایش نگرانکنندهای در میزان مقاومت آنتیبیوتیکی نگرانکننده است بنابراین، مسائل قبلی دانشمندان را بر آن داشته است که به رویکرد جدیدی از درمان رویآورند. گیاهان، در طول تاریخ، با بهدستآوردن مواد زیستی، تاثیر مفیدی بر سلامت انسان با کمترین سمیت نشان دادهاند. این مواد طبیعی پتانسیل قابلتوجهی در تولید داروهای جدید دارند.
در این پژوهش اگزوزوم زنجبیل با کیت اگزوسان استخراج شد و با تکنیک TEM شناسایی شد. TEM بر اساس همان مفاهیم اساسی میکروسکوپ نوری کار میکند، با این تفاوت که بهجای نور از الکترونها استفاده میکند. با قراردادن یک لایه کوچک از نمونه با پرتو الکترونی، لنزهای الکترومغناطیسی میتوانند نحوه پراکندگی الکترونها را تشخیص دهند و یک الگوی پراش ایجاد کنند که میتواند بهعنوان یک تصویر بزرگنمایی شده ثبت شود. قطر وزیکول، از جمله اگزوزومها، را میتوان با استفاده از تصاویر TEM اندازهگیری کرد. در TEM، EVها در اشکال مختلف مورفولوژی، از کروی تا فنجانی شکل، کشف شدهاند. اگزوزومها، برخلاف سلولهای دارای اسکلت سلولی، فاقد ساختار پشتیبانی داخلی هستند. بههمین دلیل، هنگامی که یک نمونه اگزوزوم برای بررسی TEM دهیدراته میشود، وزیکول ممکن است شکل فنجانی به خود بگیرد و مورفولوژی اصلی خود را از دست بدهد. مکانیابی دقیق مولکولهای پروتئینی خاص موجود در لومن EVها یکی از مهمترین جنبههای درک فرایندهای زیستی آنهاست. نمونههای زیستی میتوانند توسط پرتو الکترونی مورد استفاده آسیب ببینند. مولکولهای پروتئینی موجود در EVها را میتوان با استفاده از رنگهای فلورسنت خاص برچسبگذاری و مشاهده کرد. با اینحال، سیگنال فلورسنت بیش از حد از پروتئینهای برچسبگذاری شده، استفاده از TEM را در تصویربرداری از EVهای برچسبگذاری شده محدود میکند. برای مشاهده EVهای متصل به پروبهای آنتیبادی برچسبگذاری شده، به یک روش جایگزین، TEM ایمونوگلد، نیاز است در پژوهشی Jingyao Mu و همکاران (19) برای اولینبار نانوذرات اگزوزوم مانند زنجبیل (GELN) را جدا و خالص کردند.
در این پژوهش خاصیت ضد باکتریایی اگزوزومهای استخراج شده و عصارهها با روشهای انتشار دیسک، MIC سنجیده شد. اگزوزومها خاصیت ضد باکتریایی نداشتند در عصارة زنجبیل، اسطوخودوس، پیاز خاصیت ضد باکتریایی مشاهده نشد، اما عصاره لیمو خاصیت ضد باکتریایی خوبی داشت پژوهشی که توسط شرفی و همکاران (20) انجام گرفت بیانگر خاصیت ضد باکتریایی اسانس لیمو در مقابل باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی میباشد که مطابق با پژوهش حاضر است.
در پژوهشی دیگر که Teng و همکاران (21) انجام دادند مشخص شد که اگزوزوم زنجبیل افزایشی در لاکتوباسیلاسه ایجاد میکنند و تاثیری بر رشد E. coli ندارند. در پژوهش حاضر هم اگزوزوم زنجبیل بر اکولای تاثیر نداشت که مطابق پژوهش Tengبود.
حناچی و همکاران (13) اسطوخودوس را با دو روش لیو فیلیزه و خیساندن عصارهگیری کردند. عصاره متانولی اسطوخودوس بر باکتری Escherichia coli با قطر هاله mm ۱۹ بیشترین اثر را نسبت به حلالهای آبی و اتانولی داشته است. همچنین عصاره متانولی اسطوخودوس با قطر هاله mm ۱۵ بهترین اثر را بر باکتری Staphylococcus aureus داشته است. اما در این پژوهش عصارهی آبی اسطوخودوس تاثیری بر باکتری نداشت که بهعلت متفاوت بودن نوع حلالها است. حلالهای غیر قطبی باعث استخراج بیشتر ترکیبات فنولی میشوند و عصارههای الکلی خاصیت ضدباکتریایی و آنتی اکسیدانتی بیشتری خواهند داشت.
Li و همکاران (22) در پژوهشی که انجام دادند ، وزیکولهای خارج سلولی مشتق شده از مرکبات (CEVs) از نارنگی قرمز (Citrus reticulata Blanco cv. ‘Dahongpao’) استخراج شدند و مشخص شد که آنها حاوی سطوح بالایی از لیپیدها، پروتئینها و کربوهیدراتها هستند. سطوح بالای فنولهای کل و فلاونوئیدهای کل نشان میدهد که CEVs خواص آنتیاکسیدانتی شیمیایی خوبی دارند.
در این پژوهش خاصیت آنتیاکسیدانی اگزوزومهای استخراج شده بررسی شد که نتایج نشان دادند اگزوزوم اسطوخودوس خاصیت آنتی اکسیدانتی بالاتری از سایر اگزوزومها دارد همچنین عصارة اسطوخودوس نیز خاصیت آنتی اکسیدانتی بالاتری از سایر عصاره داشت.
6- نتیجهگیری
بر اساس نتایج حاضر عصارههای زنجبیل، اسطوخودوس و پیاز دارای اثر ضد باکتریایی نبودند، اما عصارة لیمو دارای اثر ضدباکتریایی بر روی باکتریهای S. pyogenes ، Escherichia coli و Staphylococcus aureus است همچنین اگزوزومهای گیاهی خاصیت ضد باکتریایی نداشتند. نتایج روش انتشار دیسک نشان میدهد که با افزایش غلظت عصاره لیمو میزان قطر هالة عدم رشد افزایش مییابد در تحقیق حاضر بیشترین میزان قطر هالة عدم رشد در Staphylococcus aureus کمترین میزان قطر هالة عدم رشد به Escherichia coli مربوط است. عصاره لیمو بر باکتریهای گرم مثبت مانند Staphylococcus aureus علیرغم حضور دیواره سلولی اثر بیشتری نسبت به باکتریهای گرم منفی مانند Escherichia coli دارد. در سایر پژوهشها بیشتر از روش متانولی و اتانولی برای عصارهگیری استفاده شده اما در این پژوهش از روش آبی برای عصارهگیری استفاده شد.
همچنین خاصیت آنتیاکسیدانتی اگزوزوم و عصارهها را بهروش FRAP اندازهگیری کردیم اگزوزوم و عصارة اسطوخودوس بالاترین خاصیت آنتی اکسیدانتی را داشتند. میزان خاصیت آنتی اکسیدانتی عصاره اسطوخودوس از اگزوزوم بالاتر بود این نتیجه بهدست آمد که خاصیت آنتی اکسیدانتی عصارهها از اگزوزومها بیشتر است. محدودیت این مطالعه به شرایط In vitro برمیگردد مطالعات آینده میتواند اثرات In vivo و سمیت رو بررسی کنند.
7- تشکر و قدردانی
از اساتید و کارشناسان آزمایشگاه بهدلیل یاری و همکاری بیچشمداشت ایشان سپاسگزار هستیم.
