فصلنامه
نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران
2 گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Introduction: Concerns about fossil energy costs, environmental deterioration, and energy security has created strong motivation for the research and development of routes to provide sustainable and renewable fuels. In recent years, the use of biomass to produce highly valued chemicals has attracted widespread attention. Lignocellulosic biomass, as a promising renewable resource for biofuel production, has distinct advantages in terms of economic and environmental benefits. The conversion of renewable raw materials to hydrocarbon fuels is an attractive alternative to fossil fuels from economic and environmental perspectives. The production process of lignocellulosic biomass mainly consists of biomass accumulation, biomass decomposition, simple sugars, and conversion of sugars to biofuel. One of the crucial steps for the economic success of lignocellulosic biofuels depends on the inhibition of competitive metabolism in microorganisms to achieve high productivity. To date, there has been a growing focus on the use of S. cerevisiae and E. coli as cell lines. These two cellular factories have well known advantages. They are genetically transmissible and several tools are available for genetic manipulation. In order to produce xylonate, the engineered xylose is first converted by a dehydrogenase into the intermediate xylonolactone, which is then slowly converted to xylonate in a nonenzymatic reaction.
Aim: The organic compound D-1,2,4-Butanetriol (BT) is a valuable chemical with wide-ranging applications in various fields such as pharmaceuticals, paper, polymer materials, and military applications. However, the chemical synthesis routes for BT have many drawbacks. By genetically modifying microorganisms, the metabolic pathway for producing many substances, including BT, can be engineered. When D-xylose is supplied to the bacterium, it is first converted into an intermediate compound called xylonolactone. This compound slowly converts into xylonate through a non-enzymatic reaction. To produce xylonate, the engineered bacteria receive xylose, which is initially converted by a dehydrogenase reaction catalysed by the xylose dehydrogenase enzyme into an intermediate compound, xylonolactone. Xylonolactone is slowly converted to xylonate in a nonenzymatic reaction. Xylonate is a five-carbon organic acid. Over the past few years, xylonate has increasingly been considered as an important chemical due to its potential as an important chemical component. Xylonate has many applications in the food, chemical, and pharmaceutical industries. Specifically, xylonate can act as a precursor for the synthesis of D-1,2,4-Butanetriol and as a concrete water reducing agent. E. coli was chosen as the target strain for genetic and metabolic engineering due to its fast growth in inexpensive culture media, the presence of two enzymes for BT synthesis, and product formation in less than 24 hours of fermentation. This study aimed to clone and express xylose dehydrogenase from Caulobacter vibrioides in E.coli.
Materials and Methods: At first, to access the bacterial gene sequence, the genome of the target bacterium was extracted. Then, to create a strain expressing the enzymes xylose dehydrogenase and xylonolactonase, the genes for these proteins were amplified from Caulobacter vibrioides CB1 and transferred into E. coli. For this purpose, the target genes were amplified using specifically designed primers via the Polymerase Chain Reaction (PCR) method and initially cloned into a pTZ57cloning vector and then subcloned into pET 26b expression vector. At the final step, the expression of the enzyme was assessed by SDS-PAGE, and the other confirmation was the reduction of NAD+ to NADH, which was used as an activity indicator of the enzyme, as investigated by a change in NADH absorbance at 340 nm.
Results: Confirmatory tests were performed to ensure the presence of the gene in the vectors (using restriction enzymes and colony PCR for gene amplification). The expression and activity of the enzyme were analyzed. The recombinant protein's presence was confirmed by SDS-PAGE for the xylose dehydrogenase gene, with a molecular weight of 52.2 kDa. The estimated expression level of the recombinant protein was approximately 25%.
Conclusion: The objective of this research was solely to establish the metabolic pathway for xylonate production in E. coli by surface expression of enzymes in this pathway (xylose dehydrogenase). The results obtained in this study confirm that half of the pathway is active at the cell surface, but further experiments are required to determine the precise production levels and complete the pathway.
کلیدواژهها English
- مقدمه
زایلوز دومین قند فراوان در طبیعت و یکی از اجزای اصلی همی سلولز در زیست توده لیگنوسلولزی است. استفاده از زایلوز مشتق شده از زیست توده بهعنوان یک منبع تجدید پذیر غیرخوراکیِ فراوان و ارزان برای تولید مواد شیمیایی مبتنی بر زیست، مزایای زیادی نسبت به مسیرهای سنتی پتروشیمی دارد، زیرا از منابع تجدیدپذیر ساخته شده است، دارای شرایط تغییر شکل ملایم است و آلودگی زیست محیطی را کاهش میدهد. تعدادی از گونههای میکروبی نوع وحشی یا سویههای مهندسی شده متابولیک برای تخمیر زایلوز بهمنظور تولید اتانول(1)، زایلیتول(2)، سوکسینات(3)، لاکتات(4)، بوتان تریول و سایر محصولات مهم جدا شده یا ساخته شدهاند (5).
زایلونات یک اسید آلی پنج کربنه است. در چند سال گذشته، زایلونات بهدلیل پتانسیل آن بهعنوان یک ماده شیمیایی مهم مورد توجه فزایندهای قرار گرفته است. زایلونات کاربردهای گستردهای مشابه بسیاری از اسیدهای قندی دیگر مانند گلوکونات دارد و میتواند در صنایع غذایی، شیمیایی و دارویی استفاده شود (6, 7). بهطور خاص، زایلونات میتواند بهعنوان یک پیش ماده برای سنتز 1،2،4-بوتانتریول (8) و کاهش دهنده آب بتن (9) عمل کند. زایلونات ممکن است از هیدرولیز همیسلولز غیرغذایی تولید شود که جایگزین ارزان قیمتی برای گلوکونات است. در گزارشی از وزارت انرژی ایالات متحده، زایلونات در میان 30 ماده شیمیایی با ارزش افزوده برتر تولید شده از زیست توده است (10).
اگرچه بسیاری از گونههای باکتریایی نوع وحشی میتوانند زایلونات را با بازده بالا تولید کنند، این تولیدکنندگان طبیعی همیشه به محیطهای گران قیمت مواد مغذی نیاز دارند و چندین روز طول میکشد تا به حداکثر تیتر برسند. در این میان جداسازی و خالص سازی زایلونات از آبگوشت تخمیر نیز کار دشواری است (5). همچنین اگرچه اکسیداسیون شیمیایی زایلوز برای تولید زایلونات را میتوان با استفاده از پلاتین یا طلا بهعنوان کاتالیزور بهدست آورد (11) اما گزینش پذیری ضعیف باعث میشود این مسیرهای مصنوعی از نظر اقتصادی برای مقاصد صنعتی امکان پذیر نباشد (6).
از مواد مهم که توسط روشهای مهندسی متابولیک و مهندسی پروتئین توسط میکروارگانیسمها تولید میشوند، انواع الکلها هستند. یکی از این الکلها بوتان تریول (BT) میباشد. 1,2,4-Butantriol (BT)یک پلی ال چهار کربنه با سه گروه هیدروکسیل آب دوست است. بهعنوان یک ماده شیمیایی کارآمد، BT کاربردهای همه جانبهای در زمینههای مختلف دارد. بهعنوان مثال، BT را میتوان برای ساخت فومهای پلی یورتان استفاده کرد. این فومها دارای ویژگیهای خمشی-فشردگی مشابه لاستیک طبیعی هستند (12). BT همچنین درساخت جوهرهای با کیفیت بالا نقش بهسزایی دارد. BT فعال نوری همچنین یک بلوک ساختمانی بالقوه برای سنتز داروهای مختلف مانند Crestor و Zetia3 است. در نهایت، BT پیش ساز مستقیم برای ساخت بوتانتریول تری نیترات است، یک نرم کننده پرانرژی عالی برای جایگزینی نیتروگلیسیرین که فراریت کمتری دارد، از نظر حرارتی پایدارتر است و خواص بهتری در دمای پایین ارائه میدهد (13).
تا به امروز، تمرکز فزایندهای بر استفاده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه و باکتری اشریشیا کلی بهعنوان کارخانههای سلولی وجود دارد. این دو کارخانه سلولی دارای مزایایی هستند که بهخوبی مشخص میشوند. آنها از نظر ژنتیکی قابل حمل هستند و ابزارهای متعددی برای دستکاری ژنتیکی در آنها در دسترس هستند. همچنین آنها برای سنتز طیف متنوعی از سوختها و مواد شیمیایی، عمدتا شامل الکلها، ترپنها و محصولات مبتنی بر اسیدهای چرب از زایلوز اصلاح شدهاند (14).
برای تولید زایلونات، باکتری مهندسی شده زایلوز را دریافت کرده و ابتدا توسط یک واکنش دهیدروژنازی توسط آنزیم زایلوز دهیدروژناز، آن را تبدیل به مادهی حد واسط زایلونولاکتون مینماید. زایلونولاکتون به آهستگی و طی یک واکنش غیرآنزیمی به زایلونات تبدیل میشود. زایلونولاکتوناز در این مرحله نقش کاتالیزوری را ایفا کرده و طی انجام یک واکنش شیمیایی دو طرفه به انجام فرایند سرعت بسیار بیشتری میبخشد. زایلونولاکتوناز عضو مهمی از خانوادهی پروتئینی SMP30 میباشد که طبق گزارشهای پیشین پروتئینهای این خانواده در حضور یونهای فلزی دو ظرفیتی مانند Fe، از خود فعالیت موثر نشان میدهند (15, 16). از یک منظر دیگر برای تولید زیستی بوتان تریول، به یک مسیر متابولیسمی متشکل از آنزیمهای مختلف نیاز داریم. آنزیم اول این مسیر یعنی زایلوزدهیدروژناز از آنزیمهای کلیدی این مسیر بوده و در حضور آن مرحلهی اول یعنی تولید زایلونیک اسید بهعنوان یک ترکیب واسط حیاتی برای ادامهی مسیر تولید حاصل میشود.
2- مواد و روشها
پلاسمید و سویههای باکتری: سویه اشریشیا کلی بهدلیل رشد سریع در محیط کشت ارزان، دارا بودن دو آنزیم مسیر سنتز BTO و تولید محصول در کمتر از ۲۴ ساعت تخمیر بهعنوان سویه هدف مهندسی ژنتیک و متابولیسم انتخاب شد. همچنین اطلاعات ژنوم، توالی و متابولیسم این سویه شناخته شده میباشد. سویه DH5α جهت ترانسفرم (کلون سازی) و سویه BL21 بهعنوان سلول هدف مهندسی ژنتیک وتولید محصول در نظر گرفته شد. بهمنظور تکثیر ژن زایلوز دهیدروژناز از ژنوم باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس ابتدا باکتری در محیط 830R2A کشت داده و در OD:600 مراحل استخراج آن انجام شد.
بهترین آنزیم زایلوزدهیدروژناز گزارش شده برای مسیر تولید BTO که فعالیت کینتیکی بالایی نسبت به سایر سویههای شناخته شده دارد در کلوباکتر کرسنتوس بیان میشود. لیکن بهدلیل شباهت بسیار بالای این باکتری به کلوباکتر ویبریوئیدس از باکتری اخیر استفاده شد بهطوریکه ژن xylB,C آن ۹۶ درصد شباهت به xylB,C سویه کلوباکتر کرسنتوس دارد.
وکتور pTZ57 R از مجموعه T وکتورها میباشد که برای کلون قطعات ژنی بهکار گرفته شد بهعلاوه وکتور pET 26 از دسته وکتورهای بیانی میباشد که توسط lacI promoter بیان ژن مورد نظر را کنترل میکند. استفاده از این وکتور برای تنظیم و کنترل بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت.
بهمنظور ساخت سویهی بیان کننده آنزیم زایلوز دهیدروژناز ژن این پروتئین از باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس CB1 تکثیر و به باکتری اشریشیا کلی انتقال یافت. برای این منظور ژن مورد نظر با استفاده از پرایمرهای طراحی شده بهروش واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR) تکثیر و ابتدا در وکتور کلونینگ و سپس در وکتور بیانی کلون شد.
تکثیر قطعه ژنی xylB: در این پژوهش بهمنظور تکثیر قطعه ژنی xylB بهروش PCR، با استفاده از نرم افزار Snap Gene 5.2 و همچنین دانلود فایل توالی ژنومی باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس از سایت NCBI به شماره دستیابی CP023314.2 و با توجه به جایگاه برش آنزیمها در وکتور مورد نظر pET26، پرایمرهایی با جایگاه برشNCO1 و Pst1 طراحی شد. پرایمر xylB-NcoI.F با جایگاه برش NcoI و به اندازه 37 جفت باز و پرایمر xylC.R(stop-)، با اندازه 40جفت باز با جایگاه برش Pst1 انتخاب شد (جدول1). بهدلیل استفاده از جایگاه برش NcoI و اضافه شدن یک نوکلوئید G برای جلوگیری از تغییر ترتیب کدونها، آمینواسید دوم این پروتئین از سرین به گلایسین که شباهت ساختاری به یکدیگر دارند تغییر یافت.
ابتدا باید ژنوم باکتری مورد نظر استخراج میشد. بدین منظور باکتری کشت داده شده را در دور rpm ۷۰۰۰، بهمدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ(Eppendorf)کرده و پس از دور ریختن محیط رویی اقدام به استخراج ژنوم باکتری با استفاده ازکیت استخراج DNA (شرکت GTP[1]،ایران)، بهترتیب مراحل زیر انجام شد.
· اضافه کردن یک میلیلیتر بافر استخراج به رسوب باکتری
· انتقال محلول ایجاد شده به میکروتیوپ ۵/۱
· اضافه کردن یک میکرولیتر پروتئینازk
· اضافه کردن ۶۰ میکرولیتر SDS ۲۰ درصد
· اضافه کردن ۱۵ میکرولیتر Triton x100
· قراردادن میکروتیوپ بهمدت یک ساعت در بن ماری ۶۵ درجه سانتیگراد
· سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد (rpm ۱۲۰۰۰ ، min ۵)
· انتقال محلول رویی به ستون و ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ ) rpm ۱۲۰۰۰)
· اضافه کردن ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو wash buffer)) به ستون و ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ (۲بار)
· انجام یک دور سانتریفیوژ خالی جهت خروج مواد و الکل اضافی در فیلتر
· انتقال ستون به میکروتیوپ ۵/۱
· اضافه کردن ۵۰ میکرولیتر Elution buffer به ستون و بعد از گذشت ۵ دقیقه، ستون سانتریفیوژ شد.
· اضافه کردن یک میکرولیتر RNase به ژنوم استخراج شده
· محلول به مدت ۱۰ دقیقه در دمای محیط قرار گرفت و سپس در دمای ۲۰- دزجه سانتیگراد نگهداری شد.
سپس ساختار و مشخصات پرایمرها توسط نرم افزار OligoAnalyzer مورد بررسی قرار گرفت. برای تکثیر ژن زایلوز دهیدروژناز از ژنوم باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس ابتدا باکتری در محیط 830R2A کشت داده و پس از اینکه دانسیته نوری (JENWAY6310) در طول موج 600 نانومتر به 2 رسید استخراج ژنوم، صورت گرفت. سپس با استفاده از پرایمرهای طراحی شده و روش PCR تکثیر ژن و زایلونولاکتوناز به طول 1800 جفت باز از ژنوم استخراج شده باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس صورت گرفت. در خصوص شرایط واکنش زنجیرهای پلیمراز، ابتدا بهمدت 5 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد واسرشت سازی اولیه انجام گرفت. سپس 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد واسرشت سازی، 30 ثانیه در 53 درجه سانتیگراد اتصال، 2 دقیقه در 72درجه سانتیگراد گسترش برای 10 چرخه انجام شد و بلافاصله 5 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد واسرشت سازی، 30 ثانیه در 63 درجه سانتیگراد اتصال و 2 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد گسترش برای 20 چرخه انجام گرفت و در نهایت 5 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد گسترش نهایی انجام گرفت. پس از انجام واکنش محصولات PCR روی ژل آگارز(Sigma، آمریکا) برده شد.
جدول 1: پرایمر های استفاده شده در این پژوهش
|
نام پرایمر |
توالی پرایمر |
درصد GC |
دمای TM (basic) |
|
xylB-NcoI.F:
|
5'ACAGGAGAATTAACCATGGCCTCAGCCATCTATCCC 3' |
51.4% |
66.5 |
|
xylC.R(stop-):
|
5' CCATATGGTACCAGCTGCAGGTGTAGACAAGGCGGACCTC 3' |
57.5% |
69.1 |
|
T7پروموتور |
5'TAATACGACTCACTATAGGG3'
|
40.0% |
56 |
|
T7ترمیناتور |
5' GCTAGTTATTGCTCAGCGG3'
|
52.6% |
47.3 |
کلونینگ ژن xylB,C در وکتور pET26: پس از تکثیر ژن با آنزیم Taq پلیمراز، بهعلت اضافه شدن نوکلئوتید A توسط این آنزیم در هردو انتهای ژن، این قطعه بهکمک آنزیم T4 لیگاز بهT وکتور خطی pTZ57R اتصال یافت. میزان معین و مناسب از نمونه مورد نظر (بهعنوان مثال: ۵ میکرولیتر از مخلوط ligation) به ۵۰ میکرولیتر سلول مستعد که روی یخ قرار دارد اضافه شده و بهمدت ۲۰ دقیقه بر روی یخ در یخچال نگهداری شد. سپس بهمدت ۹۰ ثانیه میکروتیوپ را در بنماری (Grant Instrument) با دمای 42 درجه سانتیگراد حرارت داده و دوباره روی یخ قرار گرفت. پس از گذشت ۲ دقیقه به سلولها یک میلیلیتر محیط LB براث(Sigma، آمریکا) اضافه و یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه (Stuart) شد تا باکتریها رشد کنند. در آخر۶۰ میکرولیتر از محیط مایع برروی پلیت آگار حاوی آنتیبیوتیک و مواد مناسب کشت داده شد تا باکتریهای نوترکیب و حاوی وکتور رشد کنند.
با انجام مراحل ترانسفرم در سویه DH5α، از بین کلونیهای سفید و آبی؛ کلونیهای سفید مورد بررسی قرار گفتند. بدین منظور کلونیها بهروش کلونی PCR ارزیابی شدند و از کلونیهایی که مثبت بودند استخراج پلاسمید صورت گرفت. سپس این پلاسمید ها بهوسیلهی آنزیم Pst1 برش داده شد. این آنزیم دارای یک جایگاه برش بر روی T وکتور و یک جایگاه برش Pst1 نیز بر روی پرایمر(Stop-) xylC-R میباشد. بنابراین ابتدا و انتهای قطعه توالی یکسانی داشته و قطعه میتواند در دو جهت قرارگیرد. برای تشخیص صحت قرارگیری قطعه در جهت مناسب (هم جهت با ژن lacZ) از روش هضم آنزیمی میتوان استفاده کرد. بخش MCS (Multiple Cloning Site) این T وکتور و ابتدای قطعه موردنظر ما جایگاه برش آنزیم pst1(Fermentas) وجود دارد. زمانیکه قطعه خلاف جهت متصل شده باشد این دو جایگاه با فاصله ۲۶ نوکلئوتید در کنارهم قرار میگیرند و با برش توسط این آنزیم وکتور بر روی ژل بهصورت تک باند و خطی دیده میشود. اگر قطعه در جهت lacZ قرار گرفته باشد فاصله دو جایگاه به اندازه قطعه یعنی ۱۷۴۰ نوکلئوتید خواهد بود. بنابراین بر روی ژل دو باند مشاهده خواهد شد که شامل بدنهی وکتور و قطعهی کامل Xyl BC(Stop-) میباشد. برش دیگر این وکتور با آنزیم BamhI(Fermentas) و EcorI (Fermentas) حضور قطعه (با هر جهتی) در وکتور را تایید شد.
پس از تائید اولیهی قطعه، وکتور pTZ57R.xylBC(Stop-) با آنزیم HindIII و Nco1 برش خورده و قطعه ژن xylB,C از روی ژل آگارز استخراج شد. سپس در وکتور بیانی pET26 کلون شد و پس از انجام مرحله ترانسفرم در باکتری DH5، کلونیهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی کانامیسین کشت داده و مراحل تایید آن با PCR انجام شد. پلاسمید از باکتریهایی که کلونینگ موفق داشتند استخراج و به باکتری بیانی Bl21-Rosetta منتقل شد.
بیان پروتئین: در این روش با مقایسه نمونه باکتریهای کشت داده شده در محیط LB بهدو صورت القا شده و القا نشده، میتوان به بیان آنزیم مورد نظر پیبرد. برای این منظور باکتری نوترکیب بههمراه نمونه شاهد (سویه وحشی بدون وکتور) کشت داده و در تراکم سلولی 7/0 : OD600 مورد القاء با IPTG1mM (Sigma، آمریکا) قرار گرفت. برای بررسی میزان بیان و یا عدم بیان پروتئین در ساعتهای مختلف، نمونه برداشته و به میکروتیوپ 5/1 منتقل و سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد رسوب باکتری برای ژل SDS-PAGE مورد استفاده قرار گرفت. رسوب باکتریها بر اساس میزان جذب با بافر نمونه مخلوط و ۱۰ دقیقه درآب جوشانده شد. پس از جوشیدن، ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه دردر چاهکهای ژل SDS (Merck، آلمان) ریخته شد. سپس ژل به جریان برق با قدرت ۱۲۰ ولت متصل شد. با خارج شدن بافر نمونه از ژل و مشاهده اولین باند نشانگرپروتئین در پایین ژل میتوان جریان برق را قطع و ژل را جدا نمود.
بهمنظور تهیه ۱۰ میلیلیتر بافر نمونه، ۵ میلیلیتر بافر ژل بالا، 5/2 میلیلیتر گلیسرول(Merck، آلمان) 100 درصد، 5/0 گرم پودر SDS و ۱ میلیلیتر ۲- مرکاپتواتانول(Sigma، آمریکا) بهکمک آب دیونیزه به حجم رسانده شد. میزانی از پودر بروموفنول بلو حل شد تا رنگ محلول به آبی تیره تغییر کند.
نسبت بافر نمونه :۵۰ میکرولیتر بافر نمونه به ازای رسوب یک میلیلیتر باکتری با تراکم سلولی یک در OD600 مورد استفاده قرار گرفت.
در این پژوهش، پس از کشت و القای سویه نوترکیب در حجم ۱۰ میلیلیتر به رسوب باکتری ۱۰ میلیلیتر بافر NPl با ۸ :pH اضافه و بهخوبی مخلوط شد. سپس مخلوط با توجه به بیان سطحی آنزیم سوسپانسیون باکتری بدون اینکه سونیکه شود برای بررسی فعالیت آنزیم بیان شده مورد مطالعه قرار گرفت. تهیه بافر NPI-10 سدیم کلرید(Merck، آلمان) ۳۰۰ میلیمولار، مونو سدیم فسفات ۵۰ میلیمولار و ایمیدازول۱۰میلیمولار را شامل میشود. برای تهیه 50 میلیلیتر از این بافر 39/0 گرم (Merck، آلمان)NaH2PO4، 87/0 گرم سدیم کلرید را در ۴۰ میلیلیتر آب مقطر حل کرده و پس از تنظیم pH با آب به حجم رسانده و اتوکلاو شد.
پس از کشت و القا، بهمنظور بیان پروتئین موردنظر، باکتریها رسوب داده میشوند. به اندازه حجم کشت اولیه، بافر به رسوب باکتری اضافه و بهخوبی مخلوط شد (نوع بافر براساس پروتئین مورد بررسی انتخاب میشود). سپس این مخلوط درون بشری که بر روی یخ قرار دارد ریخته و سونیکه شد. سپس مخلوط را در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کرده تا پروتئین و سایر اجزا سلول جدا شوند. در این پروژه، پس از کشت و القای سویه نوترکیب در حجم ۱۰ میلیلیتر به رسوب باکتری ۱۰ میلیلیتر بافر NPl (این بافر حاوی سدیم کلرید ۳۰۰ میلیمولار، مونو سدیم فسفات ۵۰ میلیمولار و ایمیدازول ۱۰میلیمولار میباشد. برای تهیه 50 میلیلیتر از این بافر 39/0 گرم NaH2PO4، 87/0 گرم سدیم کلرید را در 40 میلیلیتر آب مقطر حل کرده و پس از تنظیم pH با آب به حجم رسانده و اتوکلاو میشود) با 8 :pH اضافه و بهخوبی مخلوط شد (توصیه میشود بافر سرد استفاده شود و تمام مراحلی بعدی باید بر روی یخ انجام شود). سپس مخلوط در بشر استریل ۲۵ میلیلیتری ریخته و طبق برنامه (۱۹۰ولت، ۶ ثانیه روشن، ۴ ثانیه خاموش: ۸ دقیقه) سونیکه و سپس۲۰ دقیقه درrpm ۱۲۰۰۰ و دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاوی تمام پروتئینهای سلول میباشد.
۳,۵-دی نیترو سالسیلیک اسید طی واکنش با قند به ۳ آمینو ۵ نیترو سالسیلیک اسید تبدیل میشود. این روش برای تشخیص اکثر قندها استفاده میشود. در این روش نمونهی رقیق شده (۱:۱۰) به نسبت ۱:۱ با معرف تازه ساز مخلوط شده و بهمدت ۱۰ دقیقه جوشانده شد. پس از سرد شدن، جذب نمونه در طول موج ۵۷۵ نانومتر خوانده شد.
برای بررسی بیان پروتئین هدف پس از کشت ۱۰ میلیلیتر از سویه نوترکیب، نمونهها با تراکم سلولی 1: OD600 تهیه شدند. به نمونهها 10 میکرولیتر IPTG(Sigma، آمریکا) اضافه و پس از گذشت 4 و 17 ساعت از زمان القا، میزان تراکم همه نمونهها درOD600 خوانش و بهمیزان ۱ میلیلیتر از آنها رسوب داده شد.
3- نتایج
کلونینگ ژن xylB,C در وکتور pET26
پس از تکثیر ژن، این قطعه به کمک آنزیم T4 لیگاز به T وکتور خطی pTZ57R اتصال یافت. در بررسی نتیجه، قطعهای بهطول 1800 جفت باز از ژن زایلوز دهیدروژناز تکثیر شد (شکل1). با انجام مراحل ترانسفرم در سویه DH5α کلونیهای سفید-آبی بر روی پلیت حاوی آمپیسیلین،IPTG، X-gal مشاهده شد که کلونیهای سفید حاکی از وکتور نوترکیب میباشد.
1 2
|
1800 |
شکل 1: 1-قطعه ی تکثیر شده، 2- نشانگر 1کیلوبازی
برای اطمینان از حضور ژنهای xylB,C در کلونیهای سفید با روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند که در این بین تکثیر ژن چند کلونی مثبت بود (شکل 2).
1 2 3 4 5 6
شکل 2: تایید حضور ژنهای xylB,C در کلونیهای سفید با کمک کلنی PCR : 1تا5-PCR مثبت کلنی ها، 6- نشانگر 1 کیلوبازی.
گام بعدی برای تایید حضور قطعه در وکتور استفاده از آنزیمهای محدود کننده میباشد. با برش بهوسیلهی این آنزیمها دو قطعه روی ژل ظاهر میشوند که یکی از آنها بدنه وکتور و دیگری Xyl BCمیباشد (شکل 3).
پس از تائید قطعه، وکتور pTZ57R.xylBC با آنزیم HindIII و Nco1 برش خورده و قطعه ژن xylB,C از روی ژل آگارز استخراج شد. سپس در وکتور بیانی pET26-yiaT در پایین دست ژن عرض غشایی yiaT کلون شد (شکل 4 و شکل 6) و پس از انجام مرحله ترانسفرم در باکتری DH5، کلونیهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی کانامیسین کشت داده شد (شکل 4). تصاویر شماتیک این کلونینگ نیز در شکلهای 5 و6 نمایش داده شده اند.
1
شکل 3: هضم آنزیمی کلنی ها برای اطمینان از حضور ژنهای xylB,C در کلونیهای سفید 2 –7 کلنی های برش خورده با آنزیم های HindIII و Nco1 و جدا شده قطعه ی xylB,C 1)نشانگر 1 کیلوبازی.
شکل 4: پلیت کانامایسین که باکتری های نوترکیب حاصل لایگیشن pET 26 Yia T و XylBC، بر روی آن رشد کردهاند.
شکل 5: تصویر شماتیک وکتور pET26b-yiaT و جایگاه آنزیمی کلون کردن قطعهی xylBC.
شکل 6: تصویر شماتیک وکتور pET26-yiaT-XylBC حاصل از کلون کردن ژنهای xylBC در وکتور pET26b-yiaT.
سپس وکتور pET26-yiaT-XylBC از باکتری DH5 استخراج شده و در باکتری E.coli-Rosetta و E.coli-Bl21 ترانسفورم شد و بهوسیلهی PCR به وسیلهی پرایمرهای عمومی T7پروموتور و ترمیناتور، تایید حضور وکتور و قطعه انجام گرفت (شکل 7).
1 2 3 4 10 5 6 7 8 9
شکل 7: تست PCR کلنیهای ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب pET26-yiaT-XylBC کد کننده ی ژنyiaT-xylB
1تا(5 باکتری E.coli-Rosetta ترانسفورم شده با پلاسمید pET26-yiaT-XylBC ، 6تا9) باکتریE.coli-Bl21 ترانسفورم شده با پلاسمید pET26-yiaT-XylBC 10) نشانگر یک کیلوبازی.
بیان پروتئین هدف
بیان پروتئین زایلوز دهیدروژناز بههمراه قطعه ی YiaT مجموعا با وزن مولکولی 2/52 کیلو دالتون در عصاره سلولی سویههای بیانی E. coli Rosetta، E. coli BL21 و سویهی غیربیانیE.coli DH5 به عنوان کنترل منفی مورد بررسی قرار گرفت.
همانطورکه مشاهده میشود xylB بههمراه قطعه ی YiaT مجموعا با وزن مولکولی 2/52 کیلو دالتون( (XDH KDa =6/26; YiaT=25/6 KDa) در سویههای E. coli Rosetta، E. coli BL21 چهار ساعت و 16 ساعت پس از القا بهطور مشهودی بیان نشان میدهد (شکل 8).
شکل 8: بیان XylC و XylB بههمراه. YiaT شماره 1و2و3: القا و بیان طی 4 ساعت، شماره 4و5 و6: القا و بیان طی 17 ساعت(اورنایت)
1،4) DH5 E. coli ، 2،5) , E. coli Rosetta 3،6) E. coli BL21.
XylB بههمراهYiaT در عرض 4 ساعت و در باکتریE.coli-Rosetta و E.coli-Bl21 بیان مشهودی دارند.
واحد آنزیمی یعنی مقدار آنزیمی که در یک دقیقه، یک ماکرومول سوبسترا را به فرآورده تبدیل میکند. با استفاده از نمودار استاندارد، غلظت NADH تولید شده در هر نمونه بر اساس میزان جذب خوانش شده آن بهدست میآید و سپس با در نظر گرفتن وزن مولکولی NADH میزان ماکرومول آن حساب میشود که برابر واحد آنزیمی میباشد. در نهایت با احتساب میزان رقیق سازی مقدار واحد آنزیم مشخص میشود. (MW NAD+ : 663/43 g/mol)
4- بحث
از سال 2003 تاکنون گروههای مختلف در جهان برای تولید زایلونات که کاربرد فراوانی در صنایع دارد، سویههای میکروبی و قارچی را طراحی کردند. تولید زیستی این محصول نیازمند آنزیم زایلوز دهیدروژناز که در میکروارگانیسمهای گوناگون با فعالیت کاتالیتیکی مشابه یافت میشود. تا به امروز XDHو زایلونولاکتوناز سویه C.crecentus در مطالعات مولکولی مورد بررسی و بهره برداری قرار گرفته است و بهعنوان کارامدترین نوع این آنزیمها شناخته شده است و اکثر گروهها از توالی ژنی این سویه برای ساخت مسیر متابولیسمی خود استفاده کردند. مقایسهی ترادف نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی این ژنها در سویهی کلوباکتر ویبریوئیدس NA1000 از طریق NCBI مورد بررسی قرار گرفت نشان دهندهی شباهتی قریب به 98 درصد میباشد. بدین ترتیب در این پژوهش از ژنهای سویهی اخیر استفاده شد.
ساخت مسیر تولید زایلونات در سویههای مختلف ای.کلی بهدلیل وجود انتقال دهنده زایلوز و سرعت بالا رشد و تخمیر، مورد هدف بسیاری از گروهها قرار گرفته است. در این میان آقای فراست XDH سویه P.fragi را در سویه αDH5 و آقای والدهوزا (17) XDH سویه C.crecentus را در سویه W3110 بیان کردند. آقای کائو (5) این مسیر را در سویه BL21 مهندسی کردند. آقای کائو بیان میکند این سویه برخلاف خانواده K12 E.coli بهدلیل دارا نبودن ژن yagF/yjhG قادر به مصرف زایلونات بهعنوان منبع کربن نمیباشد و همچنین ژن جهش یافته rne پروتئین RNase E کوتاه شدهای را کد میکند که توانایی تخریب mRNA را ندارد. بنابراین منجر به ماندگاری mRNA و بیان پروتئین میشود. در اکثر این گروهها بجز آقای والدهوزا از وکتورهای با پروموتر T7 استفاده شده است.
از سوی دیگر تبدیل زیستی اجزای زیست توده توسط تثبیتشده بهعنوان یک روش موثر و امیدبخش برای تولید پایدار ترکیبات شیمیایی ارزشمند در شرایط واکنش ملایم ارائه شدهاست (18 و 19). استفاده از گلوکز دهیدروژناز و زایلوز دهیدروژناز (XDH) به این دلیل مورد توجه است که این آنزیمهای وابسته به NAD+ بهترتیب تبدیل گلوکز به گلوکونیک اسید و زایلوز به زایلونیک اسید با کاربردهای صنعتی را کاتالیز میکنند (20 و 21).
در این پروژه با مقایسه کار گروههای مختلف طراحی این مسیر با استفاده از xylB,C سویه کلوباکتر ویبریوئیدس CB1که توالی آن کاملا مشابه NA1000 میباشد در سویه ای.کلی انجام شد. بر خلاف دیگر پروژهها که xylB,C را با واسطهی وکتور بیانی pET و بهصورت بیان درون سلولی انجام داده بودند در این پژوهش بیان همراه با YiaT بهعنوان یک پروتئین عرض غشایی صورت گرفت. بدین صورت که از pET وکتور دارای YiaT استفاده شد تا زایلوزدهیدروژناز تولید شده به سطح سلول رفته و در آنجا فعالیت خود را نشان دهد.
بیان خارج سلولی بهصورت سطحی مشابه بیان موفقیت آمیز لیپاز فعال در سطح سلول توسط Mee-Jung و همکاران (22)، الگوبرداری شد. . الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات - پلی آکریل آمید، لکهگذاری وسترن، میکروسکوپ ایمونوفلورسانس و اندازهگیری فعالیت آنزیم کل سلولی بیان پروتئینهای ادغامی را بر روی سطح اشریشیا کلی تایید کرد (22).
بر همین اساس و با توجه به اینکه در پژوهش حاضر نیز پروتئین بیان شده فعالیت آنزیمی قابل اندازهگیری دارد از سلول کامل برای این منظور استفاده شد و فعالیت تشکیل کامل مشهود قابل اندازهگیری بود و با توجه به وزن مولکولی پروتئین بیان شده در ژل SDS-PAGE که کاملا تایید میکرد که این دو پروتئین بهصورت ادغامی ظاهر شده اند همه موید این بود که بیان صورت گرفته مشابه تیمهای تحقیقاتی دیگر سطحی بوده و میتواند بهخوبی سوبسترا را به زایلونیک اسید تبدیل کند.
همانطور که بیان شد با توجه به بیان سطح سلولی لیپاز فعال که بدون نیاز به شکستن سلول فعالیت آنزیم قابل محاسبه بود، سویهی تولید کنندهی زایلوزدهیدروژناز نیز پس از القای بیان و اطمینان از تولید پروتئین فیوز شده با YiaT با وزن مولکولی متناظر با آن (2/52 کیلودالتون) که در نتایج SDS-PAGE مشاهده شد، فعالیت آنزیمی باکتری هضم نشده بررسی شد.
بررسی فعالیت آنزیم براساس خوانش جذب NADH در 340nm انجام و مقادیر و روش کار طبق مقاله آقای کائو محاسبه شد (6). در این آزمایش با اضافه شدن سوبسترا به سوسپانسیون سلولی بههمراه افزودن NAD+ جذب درطول موج 340 نانومتر به سرعت و میزان بالایی نمایان شد که بیانگر تولید NADH بهعنوان محصول جانبی تبدیل زایلوز به زایلونات میباشد.
طبق دادههای طول موجی، هر سه نمونه که شامل دو نمونه Ros و یک نمونه BL21 بودند در 340نانومتر در یک دقیقه جذب داشتند (بهترتیب 8/0، 019/0 و 85/0) که بهوضوح نشان دهندهی فعالیت آنزیم در سطح سلول میباشد.
پژوهشهای انجام شده جهت بیان درون سلولی زایلوزدهیدوژناز نشان میدهند که در ساعت اول بهدلیل حضور آنزیم با میزان بیان بالا و فعال نبودن مسیر کاتابولیسم، زایلوز به سرعت به زایلونات تبدیل میشود. اما با گذشت زمان و فعال شدن مسیرهای فرعی مصرف زایلوز افزایش و تولید زایلونات در رقابت با دیگر آنزیمها کاهش مییابد. بهنظر میرسد با افزایش بیان دو آنزیم مسیر رقابتی مصرف زایلوز یعنی XylA و XylB این قند پس از تبدیل به زایلولوز توسط زایلوز ایزومراز و زالولوکیناز، وارد چرخه پنتوز فسفات و گلیکولیز شده و تولید و تجمع استات، گلایکول آلدهید، گلایکولات و زایلونات باعث کاهش pH محیط، رشد باکتری و فعالیت آنزیم میشود.
اما طبق نتایج بهدست آمده از این پژوهش، با انتقال زایلوز دهیدروژناز به سطح سلول، دیگر مشکل ورود زایلوز به مسیرهای فرعی و کاهش pH محیط که باعث کاهش بازدهی میشود را نخواهیم داشت. مشاهدات پژوهش حاضر نیز موید عدم کاهش در میزان فعالیت آنزیم بیان شده در سطح باکتری در بازه ی زمانی مشابه میباشد.
5- نتیجهگیری
ترکیب 1,2,4-Butantriol (BT)یک پلی ال چهار کربنه با سه گروه هیدروکسیل آب دوست است. بهعنوان یک ماده شیمیایی کارآمد، BT کاربردهای همه جانبهای در زمینههای مختلف دارد.
از لحاظ سنتزی تا به امروز 2 روش سنتزی شامل یک روش بر پایه تولید شیمیایی و دیگری، روش بر پایه تولید زیسـتی برای الکل BTO در مقالات و اختراعات بین المللی ارائه شـده است
اما در اقتصادیترین و معمولترین روش تولید شیمیایی ترکیب BTO، ترکیب دی و ال مالیک اسید استری شده، توسط ترکیب سدیم بورهیدرات (NaHBH4) احیا و ترکیب BTO تولید میشود.
واکنش احیای اسید مالیک در مجاورت NaBH4 جهت تولید الکل BTO بهدلایل مختلف از راندمان کمی برخوردار است از سوی دیگر بهدلیل چالش های پیش روی سنتز شیمیایی الکل BTO، چندی است که محققین حوزه زیستی به فکر تولید این ماده از طریق فرایند زیستی افتادهاند.
-
