سلول و بافت
فصلنامه

اثرات سمیت سلولی و آپوپتوزیسی نانوذرات سلنیوم بر روی رده سلولی سرطان کولون (HT29)

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

سیده سارا حسنی 1
سید عطا اله سادات شاندیز 2
بهاره پاکپور 2

1 کارشناس ارشد، گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 استادیار، گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

https://doi.org/10.61186/JCT.15.3.190
چکیده
هدف: امروزه نانوذرات اهمیت کاربردی بالایی را در تشخیص و درمان سرطان پیدا کرده‫اند. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات سایتوتوکسیک و ضد سرطانی نانوذرات سلنیوم بر روی رده سلولی سرطان کولون و آنالیز بیان ژن  CAD  Caspase-activated Dnaseمی‫باشد. مواد و روش‫ها: در این مطالعه، ابتدا اثرات سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم در مدت زمان 24 ساعت بر روی رده سلولی سرطان کولون HT-29 و نرمال HEK293 توسط روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. به‫دنبال آن، پس از تیمار سلول‫ها با غلظت 50 درصد کشندگی،RNA  سلول استخراج شده و به cDNA تبدیل شد. میزان بیان ژن CAD با استفاده از روش Real Time PCR مطالعه شد. در نهایت، مطالعه آپوپتوزیس و نکروزیس با کمک روش فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: نتایج نشان داد که نانوذره سلنیوم در غلظت‫های µg/mL25/31 تا µg/mL500 بیشترین مهار تکثیر سلولی را داشته که از لحاظ آماری معنی‫دار بوده است (p<0.001). میزان IC50 برای نانوذرات سلنیوم در مدت زمان 24 ساعت µg/mL 75 محاسبه شد. بیان ژن CAD نسبت به ژن مرجع در رده سلولی HT29 تیمار شده با نانوذرات سلنیوم طی 24ساعت به‫میزان 125/0±04/4  برابر افزایش یافت. همچنین داده‫های فلوسایتومتری بیانگر افزایش به‫میزان 71/34 درصدی مرگ آپوپتوزیسی در رده سلولی سرطانی کولون بود. نتیجه گیری: با توجه به داده‫های افزایش بیان ژنی درگیردر آپوپتوزیس (CAD) و فعال نمودن آپوپتوزیس می توان از نانوذرات سلنیوم به‫عنوان کاندیدای دارویی در درمان سرطان کولون استفاده نمود، که نیاز به مطالعات بیشتری در خصوص اهمیت دارویی نانوذرات دارد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

نانوذرات سلنیوم
سرطان کولون
آپوپتوزیس
سمیت
dor -

عنوان مقاله English

Cytotoxicity and Apoptotic Effects of Selenium Nanoparticles Toward HT29 Colon Cancer Cells

نویسندگان English

S Hasani 1
SA Sadat Shandiz 2
B Pakpour 2
1 Department of Biology, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Department of Biology, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده English

Aims: Nanoparticles due to their wide applications in medicine,industry,and biotechnology, have attracted many scientists’ attentions. Recently, nanoparticles especially selenium nanoparticles are widely used to diagnosis and cancer treatment. The aim of this study was to evaluate the cytotoxic and anticancer effects of selenium nanoparticles on colon cancer cell line and analysis of CAD (Caspase Activated DNase) gene expression.
Material and methods: In this study, colon cancer HT29 and normal HEK293 cell lines were purchased from the Pasteur Institute Cell Bank of Tehran and treated with selenium nanoparticles overnight. The cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Gibco, Scotland) medium with 10% FBS serum and 1% streptomycin antibiotic (Gibco, Scotland). The cells were then stored at 37 ° C. In this study, cytotoxic effect of Selenium NPs was evaluated on HT29 and HEK293 cells using MTT (3-(4, 5-Dimethyltetrazollium Bromide) assay. Subsequently, they were treated with selenium nanoparticles in different concentrations (0, 7.81, 15.62, 31.25, 62.5, 125, 250 and 500 mg/mL) for 24 hours. To solubilize the viable cells formazan crystals production, we added 100 μl/well of dimethyl sulfoxide (DMSO) to them. After treatment of HT29 cells with IC50 concentration, the total RNA was extracted and cDNA synthesized. Moreover, CAD gene expression was evaluated using Real Time PCR method. The data was evaluated by ABI StepOne utilizing the Applied Biosystems qRT-PCR (ABI 7300 system, Applied Biosystems). The quantification of the mode of Selenium NPs -induced cell death in the HT29 cells were ascertained using flow cytometry followed by staining with fluorescein isothiocyanate (FITC)‐Annexin V and propidium iodide (PI) staining. Finally, the study of apoptosis and necrosis of Selenium NPs was evaluated using flow cytometry method. Data analysis was statistically determined by using One-way analysis of variance (ANOVA) with SPSS/22 software followed by a Tukey test.
Results: The result showed that the treatment of Selenium NPs at 31.25 to 500 µg/mL concentration had maximum cytotoxic effect, revealed statistically significant (P˂0.001). The IC50 value for Selenium NPs were measured at 75 µg/mL after 24 hours. In order to determine the effect of Selenium NPs on cancerous cells, alterations in the mRNA expression levels of CAD gene in HT29 cells were done by qRT-PCR technique followed by the exposure to nanoparticle. The CAD gene expression comparing to reference gene was up-regulated 4.04±0.125 fold. To determine the mechanism of cell death in the cancer cells, annexin V/PI flow cytometry was carried out. In the treatment of HT29 cells by IC50 of selenium NPs, 10.43%, and, 24.28% of early and late stages’ apoptosis were observed, respectively
Conclusion: Our results suggest that selenium NPs can display some promising cytotoxic properties through inducing apoptosis pathway. Based on the results, up-regulated gene expression involved in apoptosis (CAD) and activating apoptosis, it can be concluded that the selenium NPs can be used as drug candidate in colon cancer treatment, but more studies are needed regarding the medicinal importance of nanoparticles.

کلیدواژه‌ها English

Selenium nanoparticles
Colon cancer
Apoptosis
Anticancer
Toxicity

مقدمه

سرطان حاصل رشد و تکثیر غیرقابل کنترل سلول‫ها و دومین علت مرگ در جهان است (1). سرطان کولورکتال چهارمین علت مرگ ناشی از سرطان در جهان و شایع‫ترین بیماری بدخیم دستگاه گوارش است (2). هم‫چنین سومین نوع شایع تومور بدخیم در سراسر جهان است و  بعد از سرطان ریه و پروستات، سومین سرطان شایع مردان و دومین سرطان شایع در زنان (بعد از سرطان پستان) می‫باشد (3). از عوامل اصلی ابتلا به این بیماری می‫توان به پیری، سابقه خانوادگی و سبک زندگی (سیگار کشیدن، مصرف زیاد الکل،رژیم غذایی ناسالم و اضافه وزن که قابل پیشگیری هستند) اشاره کرد (4). پیشگیری و تشخیص به‫موقع سرطان‫ها جهت درمان بسیار حائز اهمیت است. روش های کولونوسکوپی، سیگموئیدوسکوپی، اندوسکوپی و آزمایش خون از جمله روش‫های غربالگری این بیماری هستند (5). امروزه از روش‫های مختلفی همچون جراحی، شیمی درمانی، پرتودرمانی و ایمونوتراپی جهت درمان سرطان استفاده می شود (1). گفتنی است یکی از عوارض جانبی غیرقابل اجتناب اکثر داروهای شیمی درمانی این است که علاوه بر ازبین بردن سلول‫های سرطانی به سلول‫های طبیعی نیز آسیب می‫رسانند (6). بنابراین، یکی از اهداف اصلی درمان سرطان، دست یابی به روش‫های نوین درمان با عوارض جانبی کمتر و بدون آسیب رساندن به سلول‫های سالم است (1). پیشرفت‫های اخیر حاکی از آن است که نانوذرات تاثیر چشم‫گیری بر تشخیص و درمان بیماری سرطان جهت حذف سلول‫های سرطانی بدون آسیب جدی به سلول‫های طبیعی دارند (7). یکی از این نانوذرات، نانوذرات سلنیوم است که به‫عنوان یک ترکیب امیدوار کننده در پیشگیری و درمان سرطان گزارش شده است. طی مطالعات اخیر خواص ضد سرطانی آن نشان داده شده است که بیشترین اثر را در برابر سرطان‫های کولورکتال، ریه و پروستات دارد (10).  نانوذرات سلنیوم، به‫علت اندازه و نسبت سطح به حجم پایین، دارای ویژگی‫های فیزیکی و شیمیایی متمایز نسبت به سایر فرم‫های سلنیوم هستند (8). گزارش شده است که سلنیوم با محافظت در برابر آسیب اکسیداتیو که به‫عنوان یکی از عوامل اصلی در شروع سرطان شناخته شده است، اثرات ضد سرطانی خود را نشان می‫دهد (9). سلنیوم  نقش ضد سرطانی خود را نه تنها به‫واسطه ی خاصیت آنتی اکسیدانتی بلکه توسط مکانیسم‫های مختلف دیگری، که در هر دو سطح مولکولی و ژنتیکی شناسایی شده اند، ایفا می‫کند، از جمله  این مکانیسم‫ها عبارت است از: تحریک ترمیم DNA، القای توقف چرخه سلولی، آپوپتوزیس، مهار موضعی تهاجم و مهاجرت، توقف رگ زایی و تعدیل تکثیر سلولی (10).

توانایی سلول‫های سرطانی در جلوگیری از مرگ برنامه ریزی شده سلول (آپوپتوزیس) دلیل گسترش سرطان می‫باشد. به‫همین دلیل یکی از اهدافی که در درمان سرطان دنبال می شود، القای آپوپتوزیس در سلول‫های سرطانی است. القای آپوپتوزیس توسط دو مسیر اصلی داخلی و خارجی آپوپتوتیک انجام می‫شود. یکی از اصلی ترین اندامک‫ها در مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی آپوپتوزیس، میتوکندری است که به‫واسطه‫ی رهایی سیتوکروم C و فعال کننده‫های کاسپاز3 باعث القای آپوپتوزیس می‫شود. مسیر خارجی توسط گیرنده‫های مرگ آغاز می‫شود که در نهایت با فعال شدن کاسپازهای 6،7،8 و 3 در این فرایند شرکت می‫کند (11). از نشانه‫های اصلی آپوپتوزیس قطعه قطعه شدن DNA است که توسط آنزیم CAD (Caspase Activated DNase) رخ می‫دهد. این آنزیم به‫صورت طبیعی غیرفعال است که کاسپاز3، مهارکننده ی CAD را تجزیه و در نتیجه CAD فعال رها می‫شود تا با خاصیت DNase خود، DNA را قطعه قطعه کند (12). مطالعات اخیر نشان داده که ترکیبات سلنیوم  قادر به القای آپوپتوزیس در سلول سرطانی از طریق مکانیسم‫های متفاوتی بر اساس نوع سلول هستند. مکانیسم‫های عمل سلنیوم بر چرخه سلولی و آپوپتوزیس بسیار پیچیده بوده و هنوز به‫طور کامل شناخته نشده اند، که می‫تواند شامل پیام رسانی پروتئین کینازها، فعال شدن کاسپازها، فسفوریلاسیون پروتئین p53 و گونه‫های اکسیژن فعال (ROS) باشد (13). در این مطالعه به آنالیز تیمار رده سلولی سرطان کولون (HT-29) و رده سلولی نرمال HEK293 با غلظت‫های مختلف نانوذرات سلنیوم پرداخته شد و هدف از انجام این مطالعه بررسی تاثیر نانوذرات سلنیوم بر مرگ سلولی آپوپتوزیس و بررسی تغییرات بیان ژنی CAD می باشد.

 

2- مواد و روش‫ها

مشخصات نانوذرات سلنیوم: نانوذرات سلنیوم تجاری به‫صورت محلول کلوئیدی از شرکت پیشگامان نانومواد ایرانیان، با اندازه 10 تا 45 نانومتر، غلظت ppm 1000 و خلوص 95/99 درصد خریداری شد.

کشت رده سلولی سرطانی  و نرمال: رده‫ی سلولی سرطانی کولون HT29  و رده سلولی نرمال HEK293 از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شد. سلول‫های مورد مطالعه در محیط DMEM(H.G) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی خریداری شده از شرکت Gibco ساخت کشور برزیل و در انکوباتوری با دمای 37 درجه سانتی‫گراد حاوی پنج درصد گاز CO2 و رطوبت 90 درصد، کشت داده شدند.

بررسی میزان سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم با استفاده از تست MTT:  به‫منظور بررسی سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم، تست رنگ سنجی MTT انجام گرفت (14). برای انجام این تست، در روز اول شمارش سلولی انجام گرفت و سوسپانسیون سلولی طوری رقیق  شد که در هر خانه 100 میکرولیتر محیط کشت ده درصد FBS که حاوی 10000 سلول قرار گرفت. سپس با توجه به زمان دوبرابر شدن سلول‫ها پلیت‫ها در انکوباتور به‫مدت 24 ساعت انکوبه شدند. غلظت‫های 500 ،250 ،125 ،62.5 ،31.25 ،15.62 ،7.81  میکروگرم/میلی لیتر از نانوذرات سلنیوم تهیه شد و در 490 میکرولیتر محیط کشت و 10میکرولیتر DMSO به حجم 1000میکرولیتر رسیده و حل شد. سپس محیط کشت تخلیه شد و 100 میکرولیتر از غلظت‫های ساخته شده اضافه شد. همچنین یک گروه کنترل اختصاصی برای غلظت 500 میکروگرم/میلی لیتر و یک گروه کنترل دیگر برای مابقی غلظت‫ها به‫صورت  8 بار تکرار درنظر گرفته شد (گروه کنترل فاقد تیمار با نانوذرات می‫باشد). سپس پلیت به‫مدت 24ساعت در انکوباتور قرار گرفت. پس از گذشت 24ساعت (روز سوم) به‫هر چاهک 100میکرولیتر رنگ MTT با غلظت 05/0 میلی گرم/100میکرولیتر (5 میلی‫گرم رنگ MTT در 10میلی لیتر PBS حل شد) در شرایط  تاریکی اضافه شد. در هر گروه غلظتی دو ردیف آخر گروه بلانک درنظر گرفته شد (گروه بلانک فاقد رنگ MTT و فقط حاوی  PBSاست). پس از مدت سه ساعت تیمار در انکوباتور، جهت حل نمودن کریستال‫های فورمازان تولید شده به‫هر خانه 100 میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه شد و پلیت  به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت تا فورمازان به‫خوبی حل شود. در مرحله‫ی بعد جذب توسط دستگاه قرائت گر Elisa Reader در طول موج های 630 و570 نانومتر اندازه گیری شد.

درصد زنده مانی  = تیمار میانگین جذب هر گروه  /   میانگین جذب گروه کنترل   ×  100

بررسی بیان ژن CAD توسط روش Real Time PCR: به‫منظور اندازه گیری بیان ژنCAD ، استخراج RNA از رده سلولی HT29 تیمارشده با غلظت IC50 نانوذرات سلنیوم انجام شد و سنتز cDNA صورت گرفت. سنتزcDNA  با استفاده از کیت شرکت بایوفکت (BioFACT, Korea) انجام شد که در آن مخلوط واکنش حاوی λ 9 RNA استخراج شده به همراه λ 10 Master mix و λ 1 پرایمر اولیگوdT  بود. برنامه دمایی- زمانی به‫صورت 50 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 30 دقیقه و سپس در دمای 95 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 5 دقیقه انجام گرفت. جهت انجام Real time PCR از دستگاه  AB Applied Biosystem ساخت کشور آمریکا و کیت  شرکت ترنس ساخت کشور کره استفاده شد، که در آن مخلوط واکنش حاوی λ 10  Master Mixو λ 2 پرایمر به‫همراه λ 1 cDNA و7λ آب به مخلوط حاصل اضافه شد تا حجم نهایی به 20λ برسد. برنامه دمایی_زمانی به‫صورت 95 درجه سانتی‫گراد به‫مدت10دقیقه ، 95 درجه سانتی‫گراد به‫مدت15ثانیه و سپس در دمای 60 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 1دقیقه انجام گرفت. در این واکنش ژن CAD به عنوان ژن هدف و ژن(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) GAPDH به‫عنوان ژن مرجع درنظرگرفته شدند. توالی پرایمرهای به‫کار گرفته شده در این واکنش در جدول1 مشخص شده است.

جدول 2:  پرایمر های مورد استفاده در تحقیق

 

Gene                                           Primer                                                                    PCR Product 

 

CAD          F   5'-TGGCAGAGATCGGAGAGCAT-3'                                       

                                                                                                                                               232bp

                  R   5'-TCCTTCCATCCCTTCAGAGACTT-3'                                                      

GAPDH    F   5'-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'                                            

                                                                                                                                                75bp

                 R   5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3'          

 

بررسی آپوپتوزیس و نکروزیس نانوذرات سلنیوم با کمک روش فلوسایتومتری: به‫منظور ارزیابی میزان آپوپتوزیس و نکروزیس از خاصیت رنگی ایزوتیوسیانات-انکسین5 و پروپیوم آیوداید با استفاده از دستور کار کیت Apoptosis Annexin V/Propidium iodide(PI) detection kit, Roch, Germany)) انجام گرفت. سلول‫های سرطانی کولون با غلظت IC50 نانوذرات سلنیوم تیمارشده و سلول های تیمار نشده به‫عنوان کنترل مطالعه شدند. درصد آپوپتوزیس/نکروزیس سلول‫ها با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت.

3- آنالیز آماری

محاسبه  P valueاین پژوهش با استفاده از نرم افزار SPSS 16 انجام شد و p<0.05 معنی‫دار درنظر گرفته شد. نتایج با استفاده از آنالیز واریانس یک‫طرفه (one way ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. آنالیز نتایج Real Time PCR هم با استفاده از فرمول ∆∆CT انجام پذیرفت.

4- نتایج

نتایج آزمایش سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم دربرابر رده های سلولی با روش MTT assay

اثرات سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم در شرایط in vitro برروی رده سلولی سرطانی HT-29 در غلظت‫های مختلف به‫صورت 8 بار تکرار برای هر غلظت توسط تست MTT طی مدت 24 ساعت بررسی شد. نتایج نشان داد که نانوذرات سلنیوم در غلظت‫های  25/31 تا 500 میکروگرم/میلی‫لیتر بیش‫ترین مهار تکثیر سلولی را داشته اند که از لحاظ آماری معنی‫دار بوده است (001. 0>p) (شکل1). میزان IC50  برای نانوذرات سلنیوم در مدت زمان 24 ساعت 75 میکروگرم/میلی لیتر محاسبه شد. تیمار رده سلولی HT29 با نانوذرات سلنیوم نشان داد که این نانوذرات اثر سمیت وابسته به دوز دارد.

اثرات سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم در شرایط in vitro برروی رده سلولی نرمال HEK293 در غلظت‫های مختلف طی مدت 24 ساعت بررسی شد (شکل 2). نتایج نشان می‫دهد که نانوذرات سلنیوم در غلظت µg/ml 500 بیشترین مهار تکثیر سلولی را داشته اند که از لحاظ آماری معنی‫دار بوده است (001. 0>p). میزان IC50 برای نانوذرات سلنیوم در مدت زمان 24 ساعت µg/ml 3/36محاسبه شد.

 

 

شکل1: درصد بقای سلول‫های HT29 در برابر غلظت‫های مختلف نانوذره سلنیوم پس از 24ساعت انکوباسیون.نتایج به‫صورت درصد بقا در مقاسه با نمونه‫های کنترل گزارش شده است. ستاره‫ها (*) تفاوت معنی‫داری با گروه  کنترل نشان می‫دهند (p<0.05:*، p<0.01:** ،  p<0.001:*** ).

 

شکل2: درصد بقای سلول‫های HEK293 در برابر غلظت‫های مختلف نانوذرات سلنیوم پس از 24ساعت انکوباسیون. نتایج به‫صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‫های کنترل گزارش شده است. ستاره‫ها ( *) تفاوت معناداری با گروه  کنترل نشان می‫دهند (p<0.05:*، p<0.01:** ،  p<0.001:***).

 

نتایج ارزیابی نانوذره سلنیوم بر بیان ژن CAD درسلول های HT29

این تست به‫منظور اندازه‫گیری تغییر بیان ژنCAD در رده سلولی HT29 تیمارشده با غلظت IC50 نانوذرات سلنیوم انجام شد. مطابق شکل3، (RQ)Relative quantification در گروه دریافت کننده دوزIC50  نانوذره سلنیوم نسبت به گروه کنترل ژن  GAPDH به‫میزان 125/0 ± 04/4 برابر افزایش معناداری داشته است (001/0<p).

شکل3: اثر نانوذرات سلنیوم بر بیان ژن CAD در سلول HT29در مقایسه با ژن کنترل GAPDH. *بیانگر افزایش معناداری نسبت به گروه کنترل (***001/0 p<).

 

نتایج بررسی آپوپتوزیس و نکروزیس

بررسی میزان درصد آپوپتوزیس و نکروزیس القا شده در سلول‫های سرطان کولون تیمار شده با نانوذرات سلنیوم با کمک دستگاه فلوسایتومتری ارزیابی شد. داده‫های حاصل از بررسی فلوسایتومتری نشان داد که نانوذرات سلنیوم بر روی آپوپتوزیس و نکروزیس موثر می‫باشد. مطابق شکل 4 مربع سمت چپ پایین Q4 سلول‫های زنده، مربع سمت چپ بالا Q1 نکروز، مربع سمت راست پایین Q3 آپوپتوزیس اولیه ، مربع سمت راست بالا Q2 نشان دهنده آپوپتوزیس تاخیری می‫باشند. درصد سلول‫ها در مناطق Q1 ، Q2 ، Q3 و Q4 به‫ترتیب برابر 45/0 ، 12/0، 64/96 ، 80/2 درصد و بود که بعد تیمار با نانوذرات به‫ترتیب 35 /12، 28/24، 94/52 و  43/10 درصد تغییر یافتند.

 

 

 شکل4: نتایج آنالیز فلوسایتومتری تاثیر نانوذرات سلنیوم بر روی رده سلولی سرطان کولون (HT29). نمونه کنترل تیمار نشده (سمت راست)، نمونه تحت تیمار با نانوذرات (سمت چپ). ستاره‫ها(*) تفاوت معناداری با گروه کنترل نشان می‫دهند (p<0.05:* ، p<0.01:** ،  p<0.001:*** ).

 

5- بحث

 مسئله اصلی در درمان سرطان، مصرف غلظتی از ماده درمانی است که در حین از بین بردن سلول‫های سرطانی به سلول‫های طبیعی آسیب نرساند. پیشرفت‫های اخیر حاکی از آن است که درمان‫های سرطانی توسط مهندسی  نانو به‫عنوان یک درمان قانع کننده برای حذف سلول‫های سرطانی بدون آسیب جدی به سلول‫های طبیعی شناخته شده است (7). اگرچه تحقیقات در حوزه نانوذرات و فناوری نانو در سال‫های اخیر گسترش زیادی داشته است اما اطلاعات محدودی در مورد سمیت احتمالی نانوذرات و تاثیرات آن‫ها بر بدن انسان وجود دارد (15). نانوذرات سلنیوم یک نانوذره شبه فلزی است که به‫دلیل خواص آنتی اکسیدانتی، ضدمیکروبی و تقویت کنندگی سیستم ایمنی توجه بسیاری را به خود جلب کرده است (16). سلنیوم یکی از املاح معدنی ضروری و کمیاب برای بدن می‫باشد و جزء مهم گلوتاتیون پراکسیداز شناخته شده است. مطالعه اخیر نشان می‫دهد سلنیوم به‫عنوان یک عنصر کمیاب قادر است در تعدیل ناهنجاری‫های سطح و سیالیت غشا زیستی در مراحل ابتدایی ایجاد سرطان بزرگ مفید واقع می‫شود. یکی از مکانیسم‫های درمانی، القای آپوپتوزیس در سلول‫های توموری می‫باشد. آپوپتوزیس به‫عنوان یکی از مکانیسم‫های مقابله با سلول‫های سرطانی به‫شمار می‫رود که در مقابل ویژگی اصلی سرطان، یعنی تکثیر غیرقابل کنترل قرار دارد. سلول‫های سرطانی به‫منظور رشد و پیشرفت خود، از مکانیسم‫های مختلفی از جمله افزایش پروتئین‫های ضد آپوپتوزیسی و کاهش پروتئین‫های پیش آپوپتوزیسی، آپوپتوزیس را مهار می‫کنند. به‫همین جهت آپوپتوزیس در مطالعات ضد سرطان مورد توجه بسیاری از محققان قرارگرفته است (17).

در این مطالعه به آنالیز تیمار رده سلولی سرطان کولون(HT-29) با غلظت‫های مختلف نانوذرات سلنیوم پرداخته شد و هدف از انجام این مطالعه بررسی تاثیر نانوذرات سلنیوم بر مرگ سلولی و بقای این سلول‫ها از طریق بررسی تغییرات بیان ژن CAD می‫باشد. تاکنون مطالعات مختلفی اثرات ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم را دربرابر رده‫های سلولی متفاوت نشان داده است. در مطالعه ای که Liao, G و همکاران (18) با کمک روش‫های MTT،qRT-PCR و فلوسایتومتری، اثرات ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم سنتز شده با میانگین اندازه‫ی88.89 نانومترعلیه هشت رده سلولی سرطانی از جملهLNCaP،Colon-26،HepG2،Hela،A549،MCF7،A498،WM-115، نشان داده شد که نانوذرات سلنیوم بیشترین اثر ضدسرطانی را در برابر سلول های سرطانی پروستات داشت. در مطالعه حاضر اثر ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم فقط بر روی رده سلولی سرطان کولون (HT-29) بررسی شد. همچنین در مغایرت با مطالعه حاضر در این مطالعه نشان دادند که اثر سمیت نانوذرات سلنیوم بر روی سلول‫های نرمال پروستات نسبت به رده سرطانی آن، بسیار کمتر است که این تفاوت در نتیجه ی مطالعه بر روی رده‫ی سلولی سرطانی متفاوت به‫وجود آمده است. در مقاله منتشر شده از آقاعلینژاد و همکاران (19) بیان شد که مصرف نانوذرات سلنیوم به‫همراه تمرین تناوبی می­‫تواند تاثیر سینرژیک در مقابله با رشد تومور پستان موش‫های ماده داشته باشد و نتیجه گرفتند که این تاثیرات احتمالا تا حدودی ناشی از تغییرات در بیان ژن­‫های Bcl-2 و LC3 در بافت تومور باشد. ‫ با مطالعه آقاعلینژاد، در مطالعه حاضر نانوذرات سلنیوم تجاری از طریق القای آپوپتوزیس و افزایش بیان ژن CAD با رده  سلولی سرطانی کولون ارزیابی شد. Ramamurthy CH و همکاران (20) نیز با سنتز نانوذرات سلنیوم و بررسی اثر سمیت آن با استفاده از روش MTT بر روی رده‫ی سلول‫های سرطانی پستان دریافتند که نانوذرات سلنیوم قادر به مهار رشد سلول‫های سرطانی پستان رده‫ی MCF-7 به‫صورت وابسته به دوز است.

نتایج مطالعه حاضرنیز نشان داد که اثر کشندگی نانوذرات سلنیوم بر روی سلول‫ها، بستگی به غلظت (وابسته به دوز) آن دارد. در مطالعه‫ی دیگری توسط YC Chen و همکاران (21) نشان داده شد که مصرف مکمل سلنیوم به‫عنوان یک عامل ضد متاستاز می‫تواند به‫دلیل مهار مهاجرت سلول‫های سرطانی، تهاجم و رگ زایی، متاستاز سرطان پستان را به تاخیر اندازد. در مطالعه‫ای توسط Geoffrion LD و همکاران (22) نشان داده شد که می‫توان از نانوذرات سلنیوم به‫دلیل خواص ضدباکتریایی و ضدسرطانی در غلظت‫های بسیارکم بهره برد که هم‫سو با نتایج به‫دست آمده از مطالعه حاضر می‫باشد. در مطالعه انجام شده توسطWadhwani SA  و همکاران، (23) خاصیت ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم در سرطان پستان پیشنهاد شد که در مطالعه حاضر خاصیت ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم در سرطان کولون پیشنهاد و بررسی شد. Othman MS و همکاران (24) با سنتز نانوذرات سلنیوم به این نتایج دست یافتند که نانوذرات سلنیوم از طریق تاثیر بر میزان بیان BCL2و کاسپاز3، آپوپتوزیس را درسلول‫های توموری فعال می‫کند و در مطالعه حاضر میزان بیان ژن CAD بررسی شد. Spyridopoulou K و همکاران (8) در مطالعه‫ای از طریق نتایج فلوسایتومتری استنباط کردند که نانوذرات سلنیوم تولید شده از باکتری Lacticaseibacillus L.casei می‫تواند از طریق القای تولید ROS، باعث القای آپوپتوزیس در سلول‫های سرطانی کولون شوند (8). Huang G و همکاران (6) با استفاده از روش فلوسایتومتری بعد از 48،24 و72 ساعت و با دوزهای متفاوت نشان داده اند که کمپلکس پلی ساکارید-پروتئین پوشش داده شده با نانوذرات سلنیوم (PTR-SeNPs) می‫توانند به‫صورت وابسته به دوز اتوفاژی را در رده سلول سرطانی کولون (HCT116) تحریک کنند که در نهایت منجر به آپوپتوزیس در این سلول‫ها می‫شود، در نتیجه نقش ضد سرطان بازی می‫کنند (6).

همسو با مطالعات پیشین در مطالعه حاضر القای آپوپتوزیس توسط نانوذرات سلنیوم نشان داده شد، به‫طوری‫که بیان ژن CAD در سطح mRNA مورد بررسی قرار گرفت و نسبت به ژن مرجع در رده سلولی HT29 به‫میزان  0.125±4.04  برابر افزایش یافت و همچنین افزایش 71/34 درصدی مرگ آپوپتوزیسی در رده سلولی سرطانی کولون از طریق نتایج فلوسایتومتری نشان داده شد. در مطالعاتی که تاکنون انجام شده به خاصیت ضدسرطانی نانوذرات سلنیوم به‫صورت وابسته به دوز اتفاق نظر داشتند. نتایج ب‫دست آمده در مطالعه حاضر نیز نشان می‫دهد نانوذرات سلنیوم در غلظت‫های 25/31 تا 500 میکروگرم/میلی لیتر، بیشترین اثر کشندگی را در برابر سلول‫های سرطانی دارد که وابسته به دوز بودن سمیت نانوذرات سلنیوم را تایید می‫کند. تاکنون مطالعه مشابه ای بر روی سمیت نانوذرات سلنیوم و تاثیر آن بر بیان ژن CAD و بررسی میزان آپوپتوزیس القا شده در رده سلولی HT-29 انجام نشده است. نانوذرات با توجه به پارامترهای سایز، شکل، بار و میزان سختی میتوانند توسط مکانیسم‫های مختلفی از جمله فاگوسیتوز، اندوسیتوز و مکانیسم‌های جایگزین که هنوز به‫طور کامل مشخص نشده‌اند، وارد سلول شوند (25). با این‫حال، مطالعات حیوانی جهت سنجش ایمنی و تاثیر ترکیبات سلنیوم در افزایش اثربخشی و کاهش سمیت درمان‫های ضد سرطانی رایج مورد نیاز است.

6- نتیجه گیری

در این مطالعه، اثرات نانوذرات سلنیوم برروی تکثیررده های سلولی سرطانی کولون HT29 و سلول نرمال HEK293 با انجام آنالیز سمیت سلولی MTT در طی 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اثر کشندگی نانوذرات سلنیوم بر روی سلول‫ها، بستگی به غلظت آن دارد. با توجه به نتایج به‫دست آمده از PCR  qRT و افزایش فعالیت ژن درگیر در آپوپتوزیس (CAD) و همچنین نتایج حاصل از فلوسایتومتری در سلول‫های سرطانی استنباط می‫شود که سمیت به میزان بیشتری از طریق القای آپوپتوزیس به‫جای نکروز رخ داده است. براساس نتایج این پژوهش و مطالعات پیشین نتیجه گرفت که نانوذرات سلنیوم اثرات ضد سرطانی قابل قبولی بر رده سلولی سرطان کولون دارد، بنابراین این نانوذرات می‫تواند در آینده نقش به‫سزایی در درمان این نوع سرطان بازی کنند.

7- تشکر و قدردانی:

این مقاله حاصل پایان نامه نویسنده اول است. بدین وسیله از دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران مرکزی  و تمامی افرادی که در انجام این پروژه همکاری داشته اند، قدردانی می‫شود..

-

  1. Kim C, Kim B. Anti-cancer natural products and their bioactive compounds inducing ER stress-mediated apoptosis: A review. Nutrients. 2018 Aug 4;10(8):1021.

    1. Keshtvarz AK, Peeri M. The Effect of Aerobic Exercise and Aqueous Extract of Portulaca Oleracea on Gene Expression of Factors Involved in Apoptosis in Rats With Colon Cancer. Journal of Jiroft University of Medical Sciences. 2022 May 10;9(1):905-14. ( In Persian)
    2. 3. Abrudan R, Abrudan L, Pop O, Zaha DC. A Rare Case of an Occult Primary Tumor With a Profile of Colon Cancer and Synchronous Metastasis in the Lung, Liver, Bone, and Cerebellum: A Case Report and Literature Review. Cureus. 2023 Oct 27;15(10).

    4.Siegel RL, Miller KD, Goding Sauer A, Fedewa SA, Butterly LF, Anderson JC, Cercek A, Smith RA, Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2020. CA: a cancer journal for clinicians. 2020 May;70(3):145-64.

    1. Kanth P, Inadomi JM. Screening and prevention of colorectal cancer. Bmj. 2021 Sep 15;374.
    2. Huang G, Liu Z, He L, Luk KH, Cheung ST, Wong KH, Chen T. Autophagy is an important action mode for functionalized selenium nanoparticles to exhibit anti-colorectal cancer activity. Biomaterials science. 2018;6(9):2508-17.

    7.Misra R, Acharya S, Sahoo SK. Cancer nanotechnology: application of nanotechnology in cancer therapy. Drug discovery today. 2010 Oct 1;15(19-20):842-50.

    8.Spyridopoulou K, Tryfonopoulou E, Aindelis G, Ypsilantis P, Sarafidis C, Kalogirou O, Chlichlia K. Biogenic selenium nanoparticles produced by Lactobacillus casei ATCC 393 inhibit colon cancer cell growth in vitro and in vivo. Nanoscale Advances. 2021;3(9):2516-28.

    9.Tan HW, Mo HY, Lau AT, Xu YM. Selenium species: current status and potentials in cancer prevention and therapy. International journal of molecular sciences. 2018 Dec 25;20(1):75.

    10.Kuršvietienė L, Mongirdienė A, Bernatonienė J, Šulinskienė J, Stanevičienė I. Selenium anticancer properties and impact on cellular redox status. Antioxidants. 2020 Jan 17;9(1):80.

    1. Pfeffer CM, Singh AT. Apoptosis: a target for anticancer therapy. International journal of molecular sciences. 2018 Feb 2;19(2):448.

    12.Takikita S, Takano T, Narita T, Takikita M, Ohno M, Shimada M. Neuronal apoptosis mediated by IL-1β expression in viral encephalitis caused by a neuroadapted strain of the mumps virus (Kilham Strain) in hamsters. Experimental neurology. 2001 Nov 1;172(1):47-59.

    13.Sanmartín C, Plano D, Sharma AK, Palop JA. Selenium compounds, apoptosis and other types of cell death: an overview for cancer therapy. International journal of molecular sciences. 2012 Aug 2;13(8):9649-72.

    1. 14. Abdallah LA, Omar G, Khdeer SA, Heeh H, Khateeb D, Salameh N. Screening of anticancer potential of leaf aqueous extract fromPulicaria incisa growing wild in Palestine. Indian Journal of Natural Products and Resources (IJNPR)[Formerly Natural Product Radiance (NPR)]. 2023 Oct 25;14(3):402-8.
    2. Bharali DJ, Khalil M, Gurbuz M, Simone TM, Mousa SA. Nanoparticles and cancer therapy: a concise review with emphasis on dendrimers. International journal of nanomedicine. 2009 Apr 1:1-7.

    16.Shakibaie M, Jafari M, Ameri A, Rahimi HR, Forootanfar H. Biosynthesis and physicochemical characterization, and cytotoxic evaluation of selenium nanoparticles produced by streptomyces lavendulae FSHJ9 against MCF-7 cell line. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences. 2018 Nov 10;17(7):625-38. (In Persian)

    1. Kheiltash F, Parivar K, Roodbari NH, Sadeghi B, Badiei A. Effects of 8-hydroxyquinoline-coated graphene oxide on cell death and apoptosis in MCF-7 and MCF-10 breast cell lines. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2020 Jul;23(7):871.

    18.Liao G, Tang J, Wang D, Zuo H, Zhang Q, Liu Y, Xiong H. Selenium nanoparticles (SeNPs) have potent antitumor activity against prostate cancer cells through the upregulation of miR-16. World Journal of Surgical Oncology. 2020 Dec;18:1-1.

    1. Agha-Alinejad H, Hashemi Jokar E. Effect of Six Weeks of Interval Exercise Training along with Selenium Nanoparticle Ingestion on Bcl-2 and LC3 Genes expression in the Tumor Tissue of Breast Tumor–Bearing Mice. Iranian Journal of Breast Diseases. 2019 Aug 10;12(2):26-37.( In Persian)

    20.Ramamurthy CH, Sampath KS, Arunkumar P, Kumar MS, Sujatha V, Premkumar K, Thirunavukkarasu C. Green synthesis and characterization of selenium nanoparticles and its augmented cytotoxicity with doxorubicin on cancer cells. Bioprocess and biosystems engineering. 2013 Aug;36:1131-9.

    1. Chen YC, Prabhu KS, Das A, Mastro AM. Dietary selenium supplementation modifies breast tumor growth and metastasis. International journal of cancer. 2013 Nov;133(9):2054-64.
    2. Geoffrion LD, Hesabizadeh T, Medina-Cruz D, Kusper M, Taylor P, Vernet-Crua A, Chen J, Ajo A, Webster TJ, Guisbiers G. Naked selenium nanoparticles for antibacterial and anticancer treatments. ACS omega. 2020 Feb 5;5(6):2660-9.
    3. Wadhwani SA, Gorain M, Banerjee P, Shedbalkar UU, Singh R, Kundu GC, Chopade BA. Green synthesis of selenium nanoparticles using Acinetobacter sp. SW30: Optimization, characterization and its anticancer activity in breast cancer cells. International journal of nanomedicine. 2017 Sep 13:6841-55.

    24.Othman MS, Obeidat ST, Al-Bagawi AH, Fareid MA, Fehaid A, Moneim AE. Green-synthetized selenium nanoparticles using berberine as a promising anticancer agent. Journal of Integrative Medicine. 2022 Jan 1;20(1):65-72.

    1. Francia V, Montizaan D, Salvati A. Interactions at the cell membrane and pathways of internalization of nano-sized materials for nanomedicine. Beilstein journal of nanotechnology. 2020 Feb 14;11(1):338-53.
سلول و بافت
دوره 15، شماره 3
پاییز 1403
صفحه 190-202

XML
اصل مقاله 1.13 M
فایل‌های تکمیلی/اضافی
article 1.pdf

  • تاریخ دریافت 29 مهر 1403

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما