فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولید مثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: بسیاری از بیماری‌های ویرانگر انسانی در اثر ایجاد جهش در ژنوم و بروز اختلال عمل‫کرد در سلول، تغییرات ژنتیکی حاصل از بیماری‌های عفونی و یا تغییرات سلولی رخ می‌دهند. از زمان شناسایی ژن به‫عنوان واحد اصلی وراثت، توانایی ایجاد تغییر در محل به­خصوصی از ژنوم انسان به‫منظور درمان و درک بهتر عملکرد بیماری‌­ها، هدفی مهم در علوم پزشکی و زیست‌­شناسی بوده است. نتیجه‌گیری: اصلاح ژن به‫صورت هدفمند از طریق ابزار­هایی مانند ZFN، TALEN و CRISPR/Cas یک تکنیک قدرتمند جهت ارزیابی عملکرد ژن و همچنین دستکاری دقیق رفتار و بازده‌ی سلول بوده و امروزه با توسعه­ و پیشرفت چشمگیر ابزارهای ویرایش ژنوم، تعداد بسیاری کارآزمایی بالینی مبتنی بر این روش با هدف درمان انواع بیماری‌­ها در حال انجام است. هدف: در این مقاله به‫طور خلاصه پیشینه­، مراحل پیشرفت ابزارهای ویرایش ژنوم و همچنین کاربردهای این روش نوظهور را در پزشکی بازگو کرده و چالش‌های پیش روی آن را بیان می‌­کنیم.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Genome Editing Technologies and Application in Medicine: Discoveries, Challenges, and Prospects

نویسندگان [English]

  • R Lohrasbi
  • A Amiri-Yekta

Department of Genetics, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

چکیده [English]

Aim: A multitude of devastating human diseases arise from genetic mutations that lead to cellular dysfunction, as well as from infectious diseases and cell transformation. These diseases have significantly impacted individuals and communities worldwide and led to challenges in medical and biological sciences to address their causes and improve treatment approaches. Since identifying genes as the main heredity unit, generating targeted alterations in specific gene loci for treatment and perception of disease function has been a crucial concern. The discovery of nuclease enzymes revolutionized this field and transformed the concept of genome editing from a dream to a tangible reality.
Currently, targeted gene editing and modification through techniques such as zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), and clustered regulatory interspaced short palindromic repeat Cas-associated nuclease (CRISPR/Cas) offers robust methods to assess gene function, also precisely and efficiently manipulate cells behavior.
ZFN and the TALEN were the earliest gene editing approaches that developed, which rely on the FokI enzyme and engineered protein that binds to a specific sequence in the genome and induces double-strand breakage, stimulating the cell's repair mechanisms. Although these techniques led to many significant discoveries and developments in gene editing, they had limitations such as complexity and high prices.
The emergence of CRISPR/Cas technology propelled gene editing to a new stage of efficiency and accessibility. This technique utilizes RNA to guide the Cas enzyme to the target gene sequence and, like the ZFN and TALEN, creates a double-strand breakage, which triggers DNA repair mechanisms. CRISPR/Cas is a versatile, simple, and cost-effective revolutionary gene-manipulating tool that enabled researchers to explore the potential of gene editing in a wide application range.
Base and Prime editors are the latest systems in the genome manipulation area, which, based on the CRISPR/Cas technique, represent the impressive development and improvement in gene editing capabilities. Despite the others, these two technologies induce the single-strand breakage and modify at the nucleotide level in target sequences.
The ability to edit genes indicates new possibilities for treating genetic diseases and even preventing them before they appear. Nowadays, a growing number of clinical trials utilizing genome editing for therapeutic purposes are underway, thanks to the substantial advancements in these tools. These remarkable improvements hold promise in treating various diseases and improving patient’s outcomes.
However, despite the outstanding progress made in gene editing technology, there are still several challenges and obstacles, such as ethical considerations, off-target effects, and safety concerns, which still need more investigation and studies. Consequently, ongoing researches are focused on developing the accuracy and efficacy of these editing tools.
Conclusion: The advancement of gene editing technology has opened up a new way in medical and biological sciences to modify and manipulate the genome, also exploring the various diseases caused.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genome editing
  • Gene therapy
  • Clinical trial
  • Clinical application
  • CRISPR/Cas
  • مقدمه

جهش ژنتیکی یکی از عوامل موثر در ایجاد تکامل و سبب دستیابی انسان­ به توانایی­هایی جهت برتری­ نسبت به سایر گونه­ها است. با این وجود تمامی جهش­های ژنتیکی سودمند نبوده و بسیاری از آن­ها باعث ایجاد شرایط تهدید­کننده­ی زندگی انسان می­شوند. در حال حاضر 6000 تا 8000 بیماری ژنتیکی نادر، شناخته شده است (1). به‫کارگیری ابزار­های مولکولی و دانش بیوتکنولوژی به‫منظور درک گسترده و درمان دقیق اختلالات ناشی از جهش­های ژنتیکی، ضروری می­باشد. به‫طور کلی ویرایش ژنوم (Genome editing) در مهندسی ژنتیک، تکنیکی است که با استفاده از روش­های ترمیم در محل مشخصی (Site-specific) از توالی DNA، تغییرات خاصی از جمله حذف، تصحیح و یا جایگزینی را ایجاد می­کند (2, 3). به‫کارگیری این شیوه در درمان بیماری­های حاصل از جهش و همچنین ایجاد مدل­های حیوانی، همواره هدفی مهم در زیست­شناسی مولکولی بوده است (4). از این‫رو کشف آنزیم­های محدود کننده (Restriction enzymes) در سال 1970 میلادی که به‫طور معمول سبب مقاومت باکتری­ها در مقابل فاژ­ها می­گردند، نقطه­ی عطفی در ظهور فناوری­های DNA نوترکیب و درنهایت سبب تحولی عظیم در اواخر دهه 1980 میلادی و پیدایش تکنولوژی ویرایش ژنوم شد (5-7).

به‫طور کلی ابزارهای ویرایش ژنوم محققین را قادر می­سازد تا از حیوانات مدل به‫منظور درک علت بیماری­های مختلف و شفاف­سازی­ مکانسیم­ مولکولی آن­ها جهت به‫کارگیری استراتژی­های درمانی بهتر استفاده کنند. علاوه بر آن به‫کارگیری این روش به‫منظور درمان دقیق و هدفمند انواع بیماری­ها، در پزشکی نوین امیدبخش بوده و آینده­ی روشنی را جهت معالجه­ی اختلالات غیرقابل درمان نوید می­دهد.

در این مقاله برآنیم که  از ابتدای پیدایش ابزار­های ویرایش ژن تا پیشرفت­ها و کاربرد­های امروز­ه­ی آن در بالین را به‫صورت اجمالی مرور کرده و همچنین چشم انداز و چالش­های پیش­روی این روش نوین را مورد بررسی قرار دهیم.

- اولین قدم­های پیدایش تکنیک ویرایش ژنوم

توانایی درمان یک بیماری ارثی و یا سرطان­ها در سطح ژنتیک، موضوعی است که همواره ذهن دانشمندان علم زیست شناسی را به خود مشغول کرده است. کشف راه­های انتقال قطعات ژنتیکی از یک باکتری به باکتری دیگر به‫روش­ تقسیم و یا ترانسفورماسیون و همچنین انتقال DNA از فاژ به باکتری توسط مکانیسم ترانسداکشن، سبب تغییر نگرش دانشمندان به این گونه از موجودات به‫منظور به‫کارگیری آن­ها به‫عنوان ابزار انتقال شد (8, 9). ایده­ی درمان نقص ژنتیکی با انتقال DNA عملکردی به سلول، از نتایج حاصل از تحقیقات انجام شده در اوایل دهه­ی 1960 میلادی که توانایی دریافت DNA خارجی به صورت دائمی و پایدار در سلول­های جانوری و ایجاد عملکردی جدید در آن­ها را در پی داشت، منشا گرفت (10). در همین زمان مطالعات انجام شده بر روی ویروس­ها قابلیت آن­ها در انتقال ژن و ایجاد بیان پایدار در سلول هدف را مشخص نمود. پس از مطرح نمودن نظریه­ی به‫کارگیری ویروس به‫منظور تغییر در سلول­های سوماتیک (Somatic cells) و ژن درمانی، در نهایت در سال 1968 میلادی از ویروس موزائیک تنباکو (Tobacco mosaic virus) به‫عنوان ناقل، جهت انتقال قطعه­ی پلی آدنیلات (Polyadenylate) به یک RNA ویروس استفاده شد (11-13). این نتایج سبب ترغیب دانشمندان به انجام آزمایش‌ها و تحقیقات بیشتر در این حوزه و درنهایت شروع انجام تکنیک­های ویرایش ژن به صورت مستقیم بر روی انسان شد.

نخستین بیماران تحت درمان با تکنیک ویرایش ژنوم: به‫کارگیری تکنیک ویرایش ژنوم در بالین و ژن درمانی، سبب ایجاد امید در هزاران فرد مبتلا به بیماری­های ژنتیکی شده است. در ابتدا جهت انتقال ترانس­ژن (Transgene) به سلول هدف به‫منظور درمان سرطان­ها و بیماری­های تک­ژنی، ناقل‌های ویروسی مورد استفاده قرار می‌گرفت (14, 15). اولین کارآزمایی بالینی و پیشرو در ویرایش ژنوم جهت انتقال ژن خارجی به انسان در سال 1988 میلادی انجام شد. این مطالعه با هدف انتقال مارکر انتخابی مقاومت به نئومایسین ((NeoR) Neomycin resistance) به وسیله­ی حامل رتروویروس (Retrovirus) به لکوسیت‫های نفوذکننده به تومور ((TILs) Tumor infiltration leukocytes) استخراج شده از بیمار مبتلا به ملانوم (Melanoma) در شرایط ex vivo انجام شد. سپس کاست ژنی حاصل با هدف نشانه گذاری و ردیابی TIL­ها و همچنین مشخص شدن اثربخشی آن­ها در برابر تومور به بیمار منتقل شد­ (16). بلافاصله پس از آن در سال 1990 میلادی اولین کارآزمایی بالینی با هدف درمان بیماری تک ژنی نقص ایمنی مختلط شدید آدنوزین دآمیناز ((ADA-SCID) Adenosine deaminase-severe combined immunodeficiency) به‫منظور انتقال ژن آدنوزین دآمیناز به لنفوسیت T فرد بیمار با استفاده از رتروویروس انجام شد. در این مطالعه در حالی‫که یکی از بیماران بهبودی نسبی را نشان داد، اما این روند در فرد دیگر نمایان نشد (17, 18). اگرچه مشاهدات و نتایج اولیه در تکنیک ویرایش ژنوم تا حدودی مطلوب بود، با این وجود شکست­های بزرگی نیز به دنبال داشت.

اولین تراژدی ژن درمانی: در سال 1999 میلادی، بدترین سناریوی درمان با روش ژن درمانی و ویرایش ژنوم زمانی به واقعیت پیوست که جسی گلسینگر (Jesse Gelsinger) 18 ساله که از کمبود نسبی آنزیم اورنیتین کاربامیلاز ((OTC) Ornithine transcarbamylase) که در کبد برای حذف نیتروژن بیش از حد اسید­های آمینه و پروتئین­ها مورد نیاز است رنج می­برد، در یک کارآزمایی بالینی شرکت نمود. ناقل آدنوویروس تزریق شده به گلسینگر بلافاصله واکنش ایمنی بسیار بالایی در او ایجاد و متاسفانه چهار روز پس از آن، به دلیل نارسایی در چند عضو بدن، درگذشت (19, 20). مدت کوتاهی پس از این اتفاق، ژن درمانی انجام شده بر روی بیماران دارای نقص ایمنی مختلط شدید ((SCID) Severe combined immunodeficiency) سبب ابتلای پنج نفر به لوسمی (Leukemia) و فوت یکی از آن­ها شد (21, 22). تحقیقات بیشتر نشان داد که درج ناقل در جایگاه پروتوانکوژن (Protooncogene) LMO2 سبب ایجاد لوسمی در این افراد شده است (23). هر دوی این اتفاقات غم­انگیز موجب ایجاد نگرانی در خصوص ایمنی انجام ژن درمانی بر روی انسان و توقف مطالعات این حوزه در بالین تا زمان دستیابی به صلاحیت لازم شد (24). در همین راستا تحقیقات بر روی بهینه­سازی ناقل­ها و همچنین استفاده از ابزار­هایی که به صورت هدفمند، تغییری را در سلول مورد نظر ایجاد می­کنند، با هدف ارتقای ایمنی در ژن درمانی شدت گرفت.

  • توسعه­ی ابزار­های هدفمند ویرایش ژنوم

دستورزی DNA توسط دانشمندان برای اولین بار در لوله­های آزمایش صورت گرفت. از اوسط دهه­ی 1980 میلادی مطالعات دستکاری ژن‌های سلول­های یوکاریوتی مخمر و سپس پستانداران آغاز شد. نتایج حاصل از این پژوهش­ها نشان داد که ژنوم سلول­های پستانداران از طریق فرایند نوترکیبی هومولوگ ((HR) Homologues recombination)، توانایی ادغام با یک کپی DNA خارجی را دارا می­باشند (25-28). با این وجود، بازده­ی پایین این روش و همچنین خطر بالای درج تصادفی ژن خارجی در نواحی ناخواسته، از چالش­ها و محدودیت­های این روش بودند (29).

به‫منظور رفع این مشکلات و جایگزین کردن روش­هایی جهت غلبه بر محدودیت­ها، پژوهشگران بر روی توسعه­ی استراتژی‫های متفاوت به‫منظور دستیابی به تکنیک شکست در دو رشته ((DSB) Double-strand break) به‫صورت هدفمند متمرکز شدند (30). در همین راستا، ابتدا مگانوکلئازها و یا Homing endonuclease که اندونوکلئاز­هایی (Endonuclease) با توانایی شناسایی 14 تا 40 جفت باز می­باشند، مورد بررسی قرار گرفتند. با به‫کارگیری این آنزیم­ها، علی‫رغم افزایش بازده­ی درج، همچنان یافتن آنزیمی که در محل مورد نظر شکست ایجاد کند به سختی امکان پذیر بود. علاوه بر آن، برش ایجاد شده توسط این آنزیم­ها در ژنوم سلول با استفاده از روش اتصال انتهای غیرهولوگ ((NHEJ) Non-homologues end joining) صورت می­گیرد که همین امر نه تنها سبب می­شود که توالی مورد انتظار در ژنوم ادغام نگردد، بلکه می­تواند درج قطعات DNA به صورت تصادفی در محل شکست و حتی حذف (Deletion) را  به‫دنبال داشته باشد (31, 32).

پس از آن مطالعات در حوزه­ی توسعه­ی تکنیک­های ویرایش ژن با استفاده از اندونوکلئاز­ها بر روی ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA با دقت بالاتر متمرکز شد. در نهایت کشف پروتئین­های انگشت روی ((ZFP)  Zinc finger protein) یوکاریوتی، عصر جدیدی را در صنعت ویرایش ژنوم آغاز نمود. این مولکول­ها با کمک یون روی ((Zn) Zinc) توالی­های سه جفت بازی خاصی را بر روی ژنوم شناسایی کرده، به، آن متصل می­گردند و برخلاف مگانوکلئازها توانایی تجمع در محل شناسایی شده جهت افزایش اختصاصیت برش را دارا می­باشند. همین امر سبب ترکیب این پروتئین با آنزیم­ اندونوکلئاز FokI و در نهایت خلق نوکلئاز انگشت روی ((ZFN) Zinc finger nuclease) شد (33, 34). این تکنیک به‫طور قابل توجهی موجب افزایش بازده­ی نوترکیبی هومولوگ به‫صورت هدفمند، در موجودات مدل و همچنین انسان شد (35, 36). با این وجود، ایجاد جهش­های خارج از هدف (Off-target) یکی از نگرانی­های به‫کارگیری این روش جهت ویرایش ژن و درمان بیماری­ها بود (37, 38). در حالی که ZNF به‫عنوان ابزار مهندسی ژن معرفی و شروع دوره­ی جدیدی در درمان و زیست فناوری را رغم زد، اما کشف افکتور شبه فعال کننده­ی رونویسی ((TALE) Transcription activator-like effector) از باکتری زانتوموناس در سال 2009 میلادی که توانایی شناسایی یک نوکلئوتید خاص را دارا بود، توجه زیادی را به خود جلب کرد (39, 40). این کشف در عرض چند ماه، امکان ایجاد نوکلئاز­های شبه فعال کننده­ی رونویسی ((TALEN) Transcription activator-like effector nuclease) که قادر به ایجاد تغییر در هر ژنی بودند را فراهم نمود. برخلاف برتری سیستم TALEN نسبت به ZFN در افزایش نرخ اختصاصیت برش و همچنین کاهش سمیت، اندازه­ی بزرگ این پروتئین­ها انتقال آن­ها به سلول مورد نظر را با چالش روبرو کرد (41, 42).

ظهور تکنولوژی CRISPR: اگرچه کشف مگانوکلئازها و به‫دنبال آن سیستم­های ZFN و TALEN بازده­ی ویرایش ژنوم را افزایش داد، اما همچنان هدف قراردادن مکان­های مختلف در ژنوم، نیازمند به‫کارگیری روش­های کارآمدتری بود. دشواری مراحل کلونینگ و مهندسی پروتئین­ در تکنیک­های ZFN و TALEN تا حدودی مانع پذیرش این ابزارها توسط جامعه­ی علمی شد (43). از این رو سهولت به‫کارگیری و همچنین قدرت بالای تکنولوژی CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat) در ویرایش ژنوم که یک پروتئین اندونوکئاز بوده و توانایی هدف قراردادن توالی خاصی از DNA توسط یک RNA راهنمای کوتاه و برش آن ­را دارا می­باشد، انقلاب عظیمی در زمینه­ی ابزار­های ویرایش ژنوم ایجاد کرد (44). در سال 1987 میلادی برای اولین بار تکرار­های کوتاه پالیندرومی با فاصله­ی منظم خوشه­ای (CRISPR) در باکتری Escherichia coli کشف شد، اما باتوجه به دشوار بودن مطالعه­ی آن­ها، منشا و اهمیت این توالی نقطه­ای مبهم در علم زیست شناسی باقی­ماند (45). در سال 1995 میلادی، فرانچسکو موجیکا (Francisco Mojica) با کشف ساختارهای مشابه توالی­های CRISPR در ژنوم آرکی Haloferax mediterranei سبب پیشرفت قابل توجهی در درک عملکرد بیولوژیکی توالی CRISPR شد (46). در حقیقت حضور این عناصر در دو رده­ی تکاملی متفاوت این فرضیه را مطرح نمود که این توالی­ها شامل قطعات DNA خارجی بوده و در واقع بخشی از سیستم ایمنی باکتری­ها و آرکی­ها می­باشند (47). در نهایت در سال 2012 میلادی امانوئل شارپنتیر (Emmanuelle Charpentier) و جنیفر دودنا (Jennifer Doudna) با طراحی RNA راهنما ((gRNA) Guide RNA) برای هدف قراردادن یک منطقه­ی خاص در توالی ژنوم توسط سیستم CRISPR و همچنین آنزیم وابسته­ی آن ((Cas9) CRISPR-associated 9)، درخشان­ترین ابزار تکنولوژی دستکاری ژن را که به‫عنوان نسل سوم ابزار­های ویرایش ژنوم شناخته می­شود، معرفی نمودند (48).

سیستم CRISPR/Cas کاملا متفاوت از نسل قبلی ابزارهای ویرایش ژن یعنی ZFN و TALEN که بر پایه­ی جفت شدن قلمرو پروتئینی و نوکلئوتید­ها هستند، می­باشد و با استفاده از این تکنیک می‌توان ادغام DNA مورد نظر در موقعیت از پیش تعیین شده در ژنوم سلول هدف را تضمین نمود (49). gRNA و پروتئین Cas دو جز ضروری در سیستم CRISPR هستند. پروتئین Cas که به آن قیچی ژنتیکی نیز گفته می­شود، یک اندونوکلئاز بوده که شامل دو بخش شناسایی ((REC) Recognition) و نوکلئاز ((NUC) Nuclease) است و DNA هدف را به‫منظور شکست در دو رشته، برش می­دهد (50). جز REC از دو قلمرو REC1 و REC2 که مسئول اتصال به gRNA هستند، تشکیل شده و بخش NUC دارای ناحیه­­های اندونوکلئازی HNH و RuvC و همچنین قلمرو تعامل با PAM (Protospacer adjust motif) که یک توالی کوتاه حفاظت شده DNA بوده و در شروع اتصال به توالی هدف نقش دارد، می­باشد (51). gRNA از دو بخش crRNA (CRISPR RNA) که 18 تا 20 جفت باز بوده و به صورت اختصاصی به توالی DNA هدف متصل می­گردد و tracrRNA (Trans-activating CRISPR RNA) که با ایجاد لوپ سبب تشکیل داربست اتصال Cas9 می­شود، تشکیل شده است. در حوزه­ی ویرایش ژنوم می­توان با ادغام crRNA و tracrRNA به‫منظور هدف قرار دادن هرگونه توالی ژن، یک RNA راهنمای واحد ((sgRNA) Single guide RNA) طراحی نمود (50).

مکانیسم عملکرد سیستم CRISPR/Cas9 به سه مرحله­ی شناسایی، برش و ترمیم تقسیم­بندی می­شود (52). sgRNA طراحی­شده، پروتئین Cas را به سمت توالی هدف هدایت کرده، سپس این نوکلئاز سبب ایجاد شکست دو رشته­ی DNA در 3 نوکلئوتید بالاتر از توالی PAM می­گردد و در نهایت DBS توسط مکانیسم­های ترمیم سلول میزبان، بازسازی می­شوند (53).

اتصال انتهای غیر همولوگ (NHEJ) و نوترکیبی همولوگ ((HDR) Homology-direct repair) دو مکانیسم ترمیم در برش‫های ایجاد شده توسط سیستم CRISPR/Cas و همچنین ZFN و TALEN هستند (54). فرایند بازسازی NHEJ در تمامی مراحل چرخه­ی سلولی فعال بوده و طی واکنش آنزیمی  با اتصال انتهای قطعات DNA غیرهمولوگ به یکدیگر، شکست ایجاد شده را ترمیم می­کند. این مکانیسم در بیشتر سلول­ها فعال و روش غالب در ترمیم سلولی می­باشد، با این وجود مستعد خطا بوده و ممکن است سبب ایجاد درج و یا حذف­های کوچک در محل برش که منجر به ایجاد جهش­های تغییر چهارچوب (Frame shift) و یا کدون توقف زودرس شوند، گردد (55). بازسازی محل برش در دو رشته­ی DNA توسط مکانیسم HDR بسیار دقیق بوده و نیاز به یک DNA الگوی خارجی (Exogenous DNA) دارای همولوژی با توالی هدف، جهت درج در محل شکست توالی و یا جایگزینی با قطعه­ی موجود در محل برش دارد (شکل 1). این نوع از روش ترمیم بیشتر در اواخر مراحل S و G2 چرخه­ی سلولی فعال است (54, 55).

 

 

شکل 1: ابزارهای ویرایش ژنوم و مراحل ترمیم شکست دو رشته­ای DNA با به‫کارگیری استراتژی­های HDR و NHEJ. آنزیم­های مگانوکلئاز توالی­های 14 تا 40 جفت باز را به صورت اختصاصی شناسایی نموده و به تنهایی توانایی برش در DNA هدف را دارا می­باشد. این در حالی است که سیستم­های ZFN و TALEN به صورت جفت عمل کرده و برش توسط قلمرو FokI تنها زمانی اتفاق می­افتد که دو مولکول ZFN و یا TALEN به توالی هدف متصل شوند. ساختار CRISPR/Cas به تنهایی و با راهنمایی gRNA به توالی موردنظر متصل شده و DNA را برش می­دهد. تمامی این ابزارها سبب ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA می­شوند. ترمیم برش ایجاد شده در صورت وجود توالی الگو با استفاده از روش HDR و درج قطعه در این محل انجام می­گیرد. در غیر این صورت، بازسازی محل شکست در مسیر اتصال انتهای غیرهمولوگ قرار گرفته و می­تواند حذف و یا درج در جایگاه مورد نظر و همچنین غیرفعال سازی ژن را در پی داشته باشد.

  • راه­های انتقال ابزار­های ویرایش ژنوم به سلول

از دیدگاه بیوتکنولوژی یکی از اصلی­ترین چالش­ها در فناوری­های مولکولی، انتقال موثر و آسان اجزای ویرایش ژن به سلول هدف در شرایط in vivo و یا ex vivo می­باشد. موانع متعددی از جمله موارد فیزیکی ( غشای سلولی، غشای هسته)، هضم توسط پروتئاز و یا نوکلئازهای سلول هدف و همچنین شناسایی حامل از طریق سیستم ایمنی میزبان در شرایط in vivo، وجود دارند. اگرچه انتقال پلاسمید حاوی ژن مورد نظر به میزبان به تنهایی، ساده­تر و دارای بازده­ی بیشتری می­باشد اما مطالعات نشان می­دهد که استفاده از سیستم حامل مناسب، پایداری مولکول DNA خارجی را در سلول هدف افزایش می­دهد (56). به‫طور کلی روش­های انتقال ابزار­های ویرایش ژن به سلول، در سه دسته­ی بیولوژیکی، شیمیایی و فیزیکی قرار می­گیرند. در مجموع هر روش دارای مزایا و معایب مختص به خود می­باشد و موفقیت در به‫کارگیری تکنیک ویرایش ژن به صورت بالینی تا حد زیادی به توسعه­ی بیشتر روش­های انتقال مناسب نیازمند است. در جدول 1 تمامی راه­های انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم به سلول هدف با یکدیگر مقایسه شده­اند.

انتقال بیولوژیکی (ویروسی): در این روش از موارد زیستی طبیعی مانند حامل­های ویروسی، ذرات شبه ویروس ((VLP) Virus-like particle) و پپتیدهای نفوذ کننده به سلول ((CPPs) Cell-penetrating peptides) جهت انتقال ابزارهای ویرایش ژن به میزبان استفاده می­شود. بطور کلی حامل­های ویروسی به دلیل توانایی آن­ها در آلوده کردن انواع بافت­ها و سلول­های انسانی و بهره­مندی از ساختاری که سبب محافظت در مقابل تخریب توسط آنزیم­های میزبان می­گردد، بیشترین بازده در انتقال قطعات ژنتیکی به سلول هدف را دارا می­باشند (57). به‫منظور حفظ امنیت استفاده از ویروس­ها در بدن انسان، ژن­های ویروسی بسته به نوع ناقل حذف می­شوند (58). در حال حاضر آدنوویروس ((AdV) Adenovirus)، ویروس همراه آدنو ((AAV) Adeno-associated virus) و لنتی ­ویروس ((LV) Lentivirus) پرکاربردترین حامل­های ویروسی می­باشند (59) (شکل A-2).

 

جدول 1: روش­های انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم به سلول هدف.

ردیف

دسته­بندی اصلی

حامل

مزایا

محدودیت­ها

1

انتقال بیولوژیکی (ویروسی)

ویروس همراه آدنو

ایجاد پاسخ ایمنی پایین

ظرفیت پایین در حمل

آدنوویورس

انتقال با بازده­ی بالا

امکان ایجاد واکنش التهابی

لنتی­ویروس

انتقال ژن به صورت پایدار

مستعد بازآرایی ژن

2

انتقال شیمیایی (غیرویروسی)

نانوذرات لیپیدی

قابل اصلاح و تغییر

طراحی دشوار

نانوذرات طلا

دستکاری ساده

سمیت

وزیکول­های خارج سلولی

سازگاری بالا، ایمنی­زایی کم

بازده­ی حمل پایین

3

انتقال فیزیکی

میکرواینجکشن

انتقال حتمی ژن به سلول

نیاز به مهارت بالا

الکتروپوریشن

انتقال به جمعیت سلولی

انجام تنها در شرایط آزمایشگاهی

تغییر شکل غشا

توانایی انتقال به انواع سلول­ها

هزینه­بر

انتقال هیدرودینامیک

مقرون به صرفه

امکان آسیب به بافت

 

انتقال شیمیایی (غیرویروسی): به‫منظور جلوگیری از خطر پاسخ ایمنی فرد بیمار علیه اجزا پروتئینی حامل ویروسی، به‫کارگیری روش­های شیمیایی جهت تحویل ابزار­های ویرایش ژنوم به سلول هدف، یک رویکرد امیدوارکننده می­باشد. در این تکنیک از مواد سنتز شده­ی مصنوعی مانند پلیمر­ها، لیپیدها و یا فلزات برای تسهیل ورود قطعات ژنتیکی به سلول میزبان استفاده می­شود. در این نوع از روش انتقال می­توان به وزیکول­های خارج سلولی ((EV) Extracellular vesicles)، نانوذرات طلا ((AuNPs) Gold-nanoparticle) و نانوذرات لیپیدی ((LNPs) Lipid nanoparticles) اشاره نمود (59). در میان تمامی روش‫های غیرویروسی جهت انتقال ابزارهای ویرایش ژن به سلول هدف در شرایط in vivo، LNPها از محبوبیت بیشتری نسبت به سایر تکنیک­ها برخوردارند (60, 61). در شکل A-2 این نوع از حامل­ها به صورت شماتیک نمایش داده شده­اند.

 

 

شکل 2:  روش­ها و مسیرهای انتقال ابزار ویرایش ژنوم به سلول هدف. A) روش­های انتقال بیولوژیکی (ویروسی)، شیمیایی (غیر ویروسی) و فیزیکی به صورت شماتیک نمایش داده شده­اند. حامل­های بیولوژیکی شامل آدنوویروس (AdV)، ویروس همراه آدنو (AAV) و لنتی­ویروس (LV) می­باشند. انتقال غیرویروسی با به‫کارگیری نانوذرات لیپیدی (LNP)، نانوذرات طلا (AuNP) و وزیکول­های خارج سلولی (EV) صورت می­گیرد. در روش فیزیکی، انتقال به‫صورت میکرواینجکشن و الکتروپوریشن نمایش داده شده است. B) شرایط in vivo و ex vivo دو مسیر انتقال ابزار­های تصحیح ژن به سلول مورد نظر می­باشند. در مسیر ex vivo سلول مورد نظر از فرد بیمار دریافت شده و پس از انتقال عناصر ویرایش ژن و سپس تکثیر آن­ها به بدن فرد منتقل می­گردند. طی شرایط in vivo، ابزارهای تصحیح ژنوم به‫طور مستقیم به سلول هدف منتقل می­گردند.

 

انتقال فیزیکی: تکنیک­های فیزیکی به‫منظور انتقال ژن­ها به سلول مورد نظر بر انرژی الکتریسیته و یا مکانیکی متکی هستند. این دسته از حامل­ها شامل الکتروپوریشن، میکرواینجکشن، تغییر شکل غشا (Membrane deformation) و انتقال هیدرودینامیک ((HD) Hydrodynamic delivery) که در سال 1999 میلادی جهت انتقال DNA برهنه (Naked DNA) از طریق روش in vivo توسعه یافت، می­باشد (59, 62, 63). الکتروپوریشن تکنیکی فیزیکی، ساده و ارزان بوده که عمدتا در شرایط آزمایشگاهی جهت انتقال عناصر CRISPR/Cas به سلول هدف مورد استفاده قرار گرفته و به‫کارگیری آن در شرایط in vivo جهت انتخاب پارامترهای مناسب، به‫منظور جلوگیری از آسیب رساندن به بدن انسان یک چالش بزرگ بوده و به‫صورت محدود گزارش شده است (64-66). در این نوع از انتقال صرف نظر از نوع سلول و ترکیب بافر مورد استفاده در حین الکتروپوریشن، غلظت‌های متفاوت DNA نیز می‌تواند مستقیما بر نتیجه‌ی این تکنیک تاثیر گذاشته و همچنان به تحقیقات بیشتری در این حوزه نیاز است (66). به‫کارگیری روش میکرواینجکشن در انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم دشوار بوده و به مهارت بالایی جهت تزریق نیاز دارد (67, 68). در شکل A-2 به این دو روش اشاره شده است. علاوه بر این تکنیک تغییر شکل غشا نیز در حال حاضر یک روش آزمایشگاهی بوده که در طی آن به‫صورت مکانیکی به‫طور موقت در غشا منافذی ایجاد شده و سبب انتشار غیرفعال ماکرومولکو‫ها به سلول هدف می­شود. این فناوری راندمان بالایی داشته و می­توان از آن برای انتقال سیستم CRISPR/Cas به انواع سلول­های تومور استفاده نمود (69, 70).

  • ویرایش ژنوم و درمان بیماری­های انسانی

امروزه به‫کارگیری بالینی ابزار­های ویرایش ژنوم جهت تصحیح اشتباهات ژنتیکی که سبب بروز فنوتیپ­های خاصی می­گردند، به یک خواست طبیعی تبدیل شده است. در چند دهه­ی گذشته، ویرایش توالی DNA با استفاده از ابزار­های مولکولی منجر به افزایش تعداد مطالعات تجربی در این حوزه شده است. بخش چالش برانگیز و غیرقابل پیش­بینی این نوع از پژوهش، دستکاری ژنتیکی ژنوم انسان بوده که به‫منظور درک بهتر و تعیین توانایی­های فناوری ویرایش ژنوم در درمان بیماری­ها و همچنین تکنولوژی دارو­های مبتنی بر ویرایش ژنوم، نیازمند پیشرفت راهکار­های موجود و انجام کارآزمایی­هایی بر روی انسان می­باشد.

در مجموع سیستم­های ویرایش ژن به‫منظور درمان بیماری­ها به دو گروه in vivo و ex vivo تقسیم­بندی می­شوند (شکل B-2). در درمان به صورت in vivo سیستم ویرایش ژنوم به‫طور مستقیم به سلول و یا اندام مورد نظر بیمار انتقال پیدا کرده تا جهش و یا علت بیماری در بدن فرد تصحیح گردد. در حال حاضر کاربرد اصلی این روش عمدتا در درمان اختلالات تک ژنی (Monogenic) می­باشد (71). در شرایط ex vivo سلول هدف، از بیمار جدا شده و پس از ویرایش ژن در شرایط آزمایشگاهی، دوباره به فرد منتقل می­گردد. این روش از فناوری ویرایش ژنوم در درمان بیماری­های ارثی (Hereditary disease) مانند کم­خونی داسی شکل (Sickle cell anemia) و بتاتالاسمی (-thalassemiaβ)، ایمونوتراپی سرطان­ها (Cancer) و همچنین مهار عفونت­های ویروسی از اهمیت بالایی در بالین برخوردار است (72-75). در جدول 2 به‫صورت گزیده کارآزمایی­های بالینی که در آن از تکنولوژی ویرایش ژنوم استفاده می‫شود، ذکر شده‫­اند.

قابل ذکر است که تمام درمان­های مبتنی بر ویرایش ژنومی که امروزه در حال توسعه هستند با هدف درمان بیماران از طریق اصلاح سلول­های سوماتیک انجام می­گیرند و این درمان­ها به گونه­ای طراحی شده­اند که تنها بر روی فرد دریافت­کننده­ی دارو تاثیر می­گذارند. با این وجود، این تکنیک پتانسیل اصلاح جهش­های ژنتیکی ایجاد­کننده­ی بیماری­ها را در سلول­های جنسی نیز دارا بوده و می­تواند سبب تغییرات ژنتیکی و انتقال آن به نسل بعد شود (76).

درمان بیماری­های عفونی: ویرایش ژنوم به‫طور بالقوه می­تواند با حذف توالی قطعات DNA ویروسی درج شده در ژنوم میزبان و یا اصلاح گیرنده­هایی که برای آلوده شدن سلول ضروری می­باشند در درمان بسیاری از بیماری­های ویروسی مورد استفاده قرار گیرد. این فناوری به روش­های in vivo و ex vivo جهت درمان بیماری ویروس نقص ایمنی انسانی ((HIV) Human immunodeficiency virus) به کار گرفته شده است (77, 78). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داده که استراتژی غیرفعال کردن ژن CCR5 در سلول­هایی که گیرنده­ی کموکاین 5 (Chemokine receptor 5) را کد می­کنند، از ادغام ویروس HIV در ژنوم میزبان جلوگیری کرده و سبب از بین رفتن آن می­شود (78, 79).

بیان پایدار انکوژن­های E6 و E7 ویروس پاپیلومای انسانی ((HPV) Human papilloma virus) نقش مستقیمی در سرطان دهانه­ی رحم دارد (80). ایجاد جهش هدفمند در این ژن­های پرخطر HPV توسط ابزارهای ویرایش ژنوم می­تواند به‫عنوان یک نوع از درمان مطرح شود (81). 

ویروس هپاتیت B ((HBV) Hepatitis B virus ) مهم­ترین پاتوژن­ بیماری­های کبدی است. به‫منظور بررسی تکنیک ویرایش ژنوم در درمان این بیماری، یک gRNA که جایگاه ژنومی HBV را مورد هدف قرار می­دهد، طراحی و به وسیله­ی لنتی­ویروس به سلول آلوده شده به این ویروس منتقل شد. در نهایت مهار بیان و تکثیر ژن­های HBV در سلول هدف تایید شد (82, 83).

به‫طور کلی فناوری ویرایش ژنوم علاوه بر اینکه امکان درک عمیق­تری از مکانیسم بیماری­های عفونی ویروسی را فراهم نموده، در درمان این گونه از بیماری­ها پتانسیل بالایی نشان داده است.

درمان تومورهای بدخیم: تکنیک ویرایش ژنوم به‫طور گسترده جهت درمان تومورهای بدخیم نیز در حال توسعه و بررسی می­باشد. نمونه­ای از آزمایش موفق در درمان تومورهای بدخیم، به‫کارگیری سلول­های CAR-T بهینه­شده که قادر به شناسایی و مبارزه­ی موثر با سلول­های سرطانی هستند، می­باشد. تغییرات در ژن­های کد کننده­ی گیرنده­ی سلول T و همچنین حذف HLA-1 می­تواند سبب ایجاد سلول­های CAR-T عمومی برای درمان انواع مختلف تومورها شود (84).

درمان بیماری­های ارثی اتوزوم غالب: ایجاد تغییراتی در ژن­های بیماری­زا و کسب و یا از دست دادن عمل‫کرد (Gain or loss of function) می­تواند در درمان بیماری­های ارثی مثمر ثمر واقع گردد. در بیماری­های اتوزوم غالب (Autosomal dominant) مانند آکوندروپلازی (Achondroplasia)، هنگامی‫که واریانت پاتوژن منجر به دستیابی عملکرد بیماری­زا می­شود، ایجاد شکست در دو رشته­ی آلل جهش­یافته برای تغییر چهارچوب پروتئین مخرب که سبب درج و یا حذف به صورت NHEJ می­شود، کارساز خواهد بود و بر فنوتیپ فرد تاثیر نخواهد گذاشت. این نوع از بیماری­ها را می­توان از طریق نوترکیبی همولوگ جهت درج ژن صحیح نیز درمان نمود (85).

درمان بیماری­های ارثی که در اثر تکرارهای کوتاه پشت سر هم ((STR) Short tandem repeat) ایجاد می­شوند، ایجاد برش در دو طرف آلل­های بیماری­زا و حذف ژن، موثر واقع می­شود. علاوه بر آن در بیماری­هایی مانند هانتینگتون (Huntington) که سنتز پروتئین مخرب توسط ژن جهش­یافته انجام می­شود، به‫کارگیری استراتژی NHEJ می­تواند کارساز باشد (86).

درمان بیماری­های اتوزوم و وابسته به X مغلوب: با توجه به اینکه در بیماری­های مغلوب، عملکرد پروتئین از بین رفته و هر دو آلل دارای اثرات بیماری­زا هستند، با وضعیت پیچیده­تری برای درمان این نوع از اختلالات مواجه هستیم. به همین منظور به‫کارگیری روش اتصال انتهای غیرهمولوگ موثر نبوده و جهت درمان این نوع از بیماری­ها، همراه بودن یک قطعه­ی DNA با سیستم اندونوکلئاز به‫منظور نوترکیبی هومولوگ ضروری می­باشد (87). علاوه بر این در برخی از بیماری­ها مانند دیستروفی عضلانی دوشن ((DMD) Duchene muscular dystrophy) تخریب و یا حذف اگزون می­تواند تا حد قابل قبولی عمل‫کرد پروتئین هدف را بازیابی کند (88).

تحقیقات انجام شده در سال­های اخیر پتانسیل ویرایش ژنوم در پیشگیری و درمان بیماری­های پیچیده مانند آلزایمر را نیز نشان می­دهد (89). علاوه بر آن مطالعات بر روی حیوانات مدل نتایج امیدوار کننده­ای را برای به‫کارگیری ابزارهای ویرایش ژنوم در درمان بیماری­های مختلف انسانی مانند نقص ایمنی مختلط شدید (SCID)، بیماری­های چشمی، سیستیک فیبروزیس (Cystic fibrosis) و بسیاری دیگر از اختلالات ژنتیکی در بر داشته است (90-92).

 

جدول 2: گزیده­ای از کارآزمایی­های بالینی در دست انجام با استفاده از تکنیک ویرایش ژنوم (93).

ردیف

نام بیماری

ژن هدف

فاز

ابزار ویرایش

نوع ویرایش

روش انتقال

سال شروع

کد کارآزمایی

بیماری­های باکتریایی

1

عفونت اشریشیا کولای

فاش نشده

I

CRISPR/Cas

خاموش‌سازی (Knock-out) ژن

In vivo با استفاده از باکتریوفاژ

2022

NCT05277350

2

عفونت­های دستگاه ادراری ((UTI)  Urinary tract infections)

ژنوم E. coli

I

CRISPR/Cas3

-

In vivo با استفاده از باکتریوفاژ

2019

NCT04191148

 

بیماری­های خونی

3

بتا تالاسمی ((BT)  Beta-thalassemia)

BCL11A

II/III

CRISPR/Cas9

غیرفعال­سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2018

NCT03655678

HBB

I

CRISPR/Cas9

تصحیح ژن

Ex vivo

2020

NCT03728322

HBB

I/II

CRISPR/Cas9

-

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2021

NCT04205435

پروموتر ژن HBG1/2

I/II

CRISPR/Cas12a

تقویت ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2022

NCT05444894

4

هموفیلی B

NFIX

I

ZFN

درج ژن

In vivo با استفاده از AAV

2018

2017-004805-42

5

HIV

CCR5

I

ZFN

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2015

NCT02388594

فاش نشده

I

CRISPR/Cas9

غیرفعال­سازی ژن

In vivo با استفاده از AAV

2023

NCT05143307

CCR5

I/II

ZFN

خاموش‌سازی ژن

In vivo با استفاده از AdV

2010

NCT01252641

CCR5

I/II

ZFN

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo با استفاده از AdV

2019

NCT03666871

6

کم­خونی داسی­شکل ((SCD)  Sickle cell disease)

پروموتر ژن گاما گلوبین

I/II

Base editing

تقویت ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2022

NCT05456880

BCL11A

II/III

CRISPR/Cas9

غیرفعال­سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2018

NCT03745287

BCL11A

III

CRISPR/Cas9

غیرفعال­سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2022

NCT05329649

بیماری­های چشمی

7

التهاب مقوم در برابر ویروس هرپس سیمپلکس ( Herpes simplex virus refractory keratitis)

UL8/UL29

به اتمام رسیده

CRISPR/Cas9

غیرفعال­سازی ژن

In vivo

2020

NCT04560790

8

نابینایی مادرزادی لبر ( Leber)

CEP290

I/II

CRISPR/Cas9

تصحیح ژن

In vivo با استفاده از AAV

2019

NCT03872479

اختلالات متابولیکی

9

موکوپلی­ساکاریدوز نوع II ((MPSII)  Mucopolysaccharidosis II)

IDS

I/II

ZFN

درج ژن

In vivo با استفاده از AAV

2018

2018-000192-33

10

موکوپلی­ساکاریدوز نوع I ((MPSI)  Mucopolysaccharidosis I)

IDUA

I/II

ZFN

درج ژن

In vivo با استفاده از AAV

2017

NCT02702115

11

دیابت نوع I

-

I

CRISPR/Cas9

شکست و درج ژن

Ex vivo

2022

NCT05210530

-

I/II

CRISPR/Cas9

شکست و درج ژن

Ex vivo

2023

 

NCT05565248

 

سرطان­ها

12

لوسمی میلوئید حاد ((AML) Acute Myeloid leukemia)

CD123، IL3RA و TCR

I

TALEN

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشنو LV

2019

2018-001018-14

CD33

I/II

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo اما حامل فاش نشده

2021

NCT04849910

CD33

I/II

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo اما حامل فاش نشده

2022

NCT05309733

13

کارسینوما هپاتوسلولار پیشرفته ((HCC) Advanced hepatocellular carcinoma)

PDCD1

I

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2019

NCT04417764

14

لوسمی سلول B

anti-CD19/CD20 CAR و یا anti-CD19/CD22 CAR

I/II

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی و درج هدفمند ( knock-in) ژن

Ex vivo با استفاده از روش ویروسی

2018

NCT03398967

15

کارسینوم سلول­های کلیوی ((RCC)  Renal cell carcinoma)

TRAC، anti-CD70 CAR و CD52

I

TALEN

خاموش‌سازی و درج هدفمند ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن و LV

2021

NCT04696731

16

سرطان پروستات

PD-1

I/II

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo

2018

NCT03525652

PD-1

I

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo با استفاده از روش الکتروپوریشن

2021

NCT04768608

17

سرطان مثانه­ی مهاجم مرحله­ی IV ((IBC)  Invasive bladder cancer)

PDCD1

I

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo

2016

NCT02863913

18

سرطان مجاری صفراوی ((BTC)  Biliary tract cancer)

TGFβR

I

CRISPR/Cas9

خاموش‌سازی ژن

Ex vivo

2022

NCT04976218

  • ویرایش ژنوم سلول­های جنسی

ویرایش ژنوم سلول­های جنسی انسان می­تواند سبب تغییرات ژنتیکی با قابلیت به ارث رسیدن از طریق تخمک و یا اسپرم شود (94). در حال حاضر این نوع از تصحیح ژنتیکی در حیوانات، گیاهان و همچنین جنین انسانی با اهداف تحقیقاتی مورد استفاده قرار می­گیرد (76).

در مجموع ویرایش ژنوم سلول­های جنسی انسان با موانع زیادی در تئوری و همچنین در مراحل عملی و آزمایشگاهی مواجه بوده و علاوه بر آن موارد اخلاقی نیز تا به امروز مانع انجام آن شده است. علی‫رغم پتانسیل این روش درمانی در جلوگیری از اختلالات وخیم و خطرناک ارثی، نگرانی­ها در خصوص ایمنی به‫کارگیری آن و همچنین غیرممکن بودن انجام این نوع از درمان به صورت رضایتمندانه و با آگاهی برای فرد دریافت کننده این دارو، انجام آن را با مشکلات مهمی روبرو نموده است. به‫طور جدی­تر، در صورت بروز جهش­های ژنتیکی ناخواسته در سلول جنسی و ایجاد بیماری­های جدید، درمان را با مشکلات پیچیده­تر همراه خواهد نمود (95, 96). به همین منظور هرگونه ویرایش ژنوم در سلول­های جنسی در بالین ممنوع و غیرقانونی بوده و هرگونه تحقیقات در این حوزه می­بایست طبق قوانین ملی هر کشور و تحت مقررات دقیق انجام گیرد (97).

  • نسل آینده­ی ابزار­های ویرایش ژنوم

تقریبا یک دهه از زمانی که Cas9 به‫عنوان ابزار کارآمد برای ویرایش ژنوم معرفی شد، می­گذرد (98). تا به امروز انواع مختلفی از ابزار­های تصحیح ژن گسترش یافته­اند که برخی از آن­ها بدون تکیه بر مسیر­های ترمیم و برش در دو رشته­ی DNA عمل می­کنند. از این رو می­توانند به‫عنوان سیستم­های قدرتمندی جهت درمان بیماری­های ژنتیکی پیچیده معرفی گردند. با این حال، برای انتقال این ابزارها به سلول هدف نیاز به حامل­های بزرگتری می­باشد. به‫همین منظور به‫کارگیری این تکنیک­ها در بالین نیازمند بهینه­سازی و توسعه است (59). ویرایشگرهای Base، Prime ( شکل 3) و اپی­ژنوم (Epigenome) نسل جدیدی از ابزار­های اصلاح ژن هستند که در حال حاضر در مراحل اولیه آزمایش قراردارند.

ویرایشگر Base: ویرایشگر Base ((BE) Base editor) یک ابزار جدید در حوزه­ی اصلاح ژن و مبتنی بر CRISPR/Cas9 بوده که قادر به تغییر دقیق توالی DNA در یک مکان خاص، بدون القای DSB که موجب برتری آن نسبت به سیستم CRISPR/Cas9 شده است، می­باشد. همین امر سبب شده تا خطرات حذف، وارونگی (Inversion) و یا جایجایی (Translocation) در قطعات DNA به حداقل رسیده و تصحیح ژن هدف بدون ایجاد اختلالی انجام گیرد (99-103). نکته­ی شگفت انگیز در خصوص این تکنیک، توانایی آن در اصلاح حدود 60 درصد از جهش­های نقطه­ای (Point mutation) بیماری­زا می­باشد (104). به‫طور کلی BE یک ابزار درمانی جدید بوده که قادر به تصحیح دقیق و ایمن جهش­های ژنتیکی، ژن­های بیماری­زا و یا مناطق تنظیم کننده است. این استراتژی می­تواند بدون ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA، به‫طور همزمان چندین ناحیه از ژنوم را بدون حذف و یا جابجایی­ مورد هدف قرار دهد (105).

ویرایشگر Prime: ویرایشگر Prime ((PE) Prime editor) جدیدترین ابزار اصلاح ژن که به‫عنوان فناوری جستجو و جایگزینی (Search and replace) نیز توصیف می­شود، دارای سیستمی مشابه CRISPR/Cas اما بدون ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA بوده که دامنه­ی توانایی این تکنیک را جهت درمان بیماری­های تک ژنی ارتقا داده است. این مولکول شامل یک gRNA طولانی­تر از حد معمول به نام pegRNA (Prime editing gRNA) و یک پروتئین تشکیل شده از Cas9 H840A nickase و RT (Reverse transcriptase) نوترکیب می­باشد (106). PE قادر به درج، حذف و جابجایی­های هدفمند بدون نیاز به قطعه­ی الگو و ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA است (107).

 

شکل 3: فناوری‌های BE و PE. ویرایشگر Prime و Base نسل جدیدی از ابزارهای ویرایش ژنوم هستند که برخلاف CRISPR/Cas سبب ایجاد برش در یک رشته‌ی DNA می‌شوند. همین امر موجب افزایش دقت و ایمنی این تکنیک‌ها جهت به‫کارگیری آن‌ها در درمان انواع بیماری‌ها گشته است.

ویرایشگر اپی­ژنوم: در کنار ویرایش مستقیم توالی ژنتیکی، اصلاح علامت­های اپی­ژنتیک در محلی خاص با تغییر متیلاسیون DNA و یا ویرایش هیستون و حلقه­های کروماتینی که سبب تغییر بیان ژن مورد نظر می­گردند، از اهمیت بالایی برخوردار است (108, 109). این نوع ویرایشگر با ترکیب کردن dCas9 (Dead Cas9) و اصلاح­کننده­های اپی­ژنتیک (Epigenetic modifiers) و یا تنظیم کننده­های رونویسی مانند فعال­کننده­ها و سرکوب­گرها به دست می­آید (110-112). اطمینان حاصل کردن از انتقال تغییرات اپی­ژنتیکی از سلول مادر به دختر یک امر ضروری در به‫کارگیری این روش بوده و نیاز به تحقیقات بیشتر دارد (113, 114).

-چالش­های پیش روی تکنیک ویرایش ژنوم

هدف نهایی هر دارویی، درمان بیماری با ایمنی، بازده و پایداری بالا می­باشد. پیشرفت در فناوری­های ویرایش ژن، پایه و اساس نسل بعدی درمان­ طیف گسترده­ای از بیماری­های ژنتیکی و غیرژنتیکی است. علی‫رغم مزایای فراوان این تکنیک، برخی چالش­ها مانند دقت، اثربخشی، ایمنی و روش­های انتقال این ابزار درمانی نیاز به بهبود و توسعه دارند. رفع این مشکلات نیازمند دانش عمیق ماهیت مولکولی بیماری­ها و همچنین طراحی دقیق ابزارهای ویرایش ژنوم در مطالعات پیش از بالین است.

توسعه­ی روش­های انتقال: بسیاری از بیماری­های ژنتیکی نیازمند درمان در بدن فرد می­باشند و روش درمانی ex vivo برای آن­ها امکان پذیر نمی­باشد. انتقال ابزار CRISPR که مولکولی بزرگ و چند جزئی است، در شرایط in vivo یک چالش بزرگ بوده و پتانسیل درمانی آن را محدود نموده است. در روش درمانی in vivo، عناصر دارو باید پس از عبور محیط­های مختلف همچنان پایداری خود را حفظ نموده و به سلول هدف وارد شوند. انتقال اجزای ویرایش ژنوم با استفاده از لنتی­ویروس­ها به بدن فرد بیمار امکان پذیر است، اما با توجه به پتانسیل ایجاد جهش و همچنین بازده­ی پایین آن، به صورت محدود مورد استفاده قرار می­گیرد (115). به‫طور عمده وکتور­های AAV که در مناطق ایمن ژنوم درج می­شوند، جهت انتقال اجزای ویرایش ژن به سلول هدف به کار می­روند (116). با این وجود این ویروس­ها تنها توانایی انتقال عناصر کوچک را دارا بوده و محدودیت ظرفیت آن­ها در حمل ابزارهای ویرایش ژنوم یک عامل بازدارنده در به‫کارگیری آن­ها می­باشد. یکی از دلایل عمده­ی ظهور روش­های انتقال غیر ویروسی، جلوگیری از ایجاد پاسخ­های ایمنی در بدن فرد دریافت کننده­ی دارو است. VLPها ابزارهای انتقال مناسبی جهت حمل اجزای CRISPR می­باشند، اما مطالعه بر روی آن­ها در مراحل ابتدایی بوده و همچنان نیاز به انجام آزمایش‌های بیشتری جهت استفاده در بالین دارند (117-119).

در مجموع، رویکردهای مختلف مانند تغییر کپسید AAVها، توسعه­ی VLPها و همچنین مهندسی مولکول­های اجزای CRISPR مواردی هستند که باید در بهبود کارایی و ایمنی ناقل­ها مورد بررسی قرارگیرند تا پتانسیل کامل این روش درمانی نمایان شده و به‫کارگیری آن در پزشکی به حداقل سمیت و بازده­ی بالا دست پیدا کند (115).

افزایش اختصاصیت جایگاه برش: از آنجایی که فناوری CRISPR مبتنی بر اتصال توالی­های مکمل بوده، خطر اتصال غیراختصاصی sgRNA (Small guide RNA) در مکان­هایی غیر از ژن هدف وجود دارد. مطالعات مختلف نشان از اثرات مخرب جهش­های خارج از هدف Cas9 بر بیماران مانند ایجاد جهش در انکوژن­ها، جابجایی کروموزومی، حذف و درج­هایی که سبب پیچیده­تر شدن بیماری­ها شده­اند، می­دهند (120-122). شناسایی و به حداقل رساندن این اثرات مخرب به‫منظور افزایش ارزش و امنیت به‫کارگیری این فناوری در پزشکی ضروری می­باشد (120). به‫کارگیری آنزیم­های بهینه­ شده­ی SpCas9-HF1 و eSpCas9 به‫طور چشم‫گیری جهش­های خارج از هدف را کاهش داده است، اما همچنان اثرات این تغییرات در درون بدن حل نشده باقی­مانده و به توسعه و مطالعات بیشتری نیازمند است (123).

مسائل اخلاقی: بزرگترین نگرانی مربوط به پیشرفت­های قابل توجه در حوزه­ی فناوری ویرایش ژنوم، پیامدهای آن بر روی جنین انسان می­باشد. به‫طوری که حتی در سال 2015 میلادی پیشنهاد متوقف ساختن این دسته از آزمایش­ها پیشنهاد شد. استدلال‫­های علمی در خصوص مزایای چنین تحقیقاتی با عدم پیش­بینی پیامدها همراه بوده و فقدان قانون و مقررات دقیقی به‫منظور قرار دادن این تکنولوژی در چهارچوب ضوابط مشخص، سبب ایجاد ترس ظهور سلاح­های زیستی با ترکیب انسان و جهش­های ژنتیکی موثر شده است (124). میزان مجاز استفاده از تکنیک CRISPR و ویرایش ژنوم در مراحل پژوهش و پیش از بالین، حد قابل قبول به‫کارگیری این تکنیک در پزشکی، گستره­ی استفاده از این فناوری در موارد غیر از بالین و میزان دسترسی افراد به این تکنولوژی چهار عنوانی است که تمامی نگرانی­ها و مشکلات اخلاقی به‫کارگیری این روش درمانی را در خود جای می­دهد (125). بنابراین امروزه نیاز مبرم به هماهنگی، نظارت و ایجاد دستورالعمل­های مرتبط با ویرایش ژنوم در پزشکی مولکولی و همچنین صنایع غیربالینی مانند محصولات کشاورزی و غذایی وجود دارد (126). 

2- نتیجه‌گیری

تا به امروز ویرایش ژنوم یکی از پیچیده­ترین تکنیک­های درمانی توسعه یافته بوده که می­تواند شرایط پایدار و مناسبی را برای بیماری­های ویرانگر و گاهی غیرقابل درمان انسانی فراهم کند (127). با این‫حال، همچنان درمان بسیاری از بیماری­ها برآورده نشده و همین امر دانشمندان را به سمت توسعه­ی ابزارهای جدید جهت تصحیح ژن و به‫کارگیری استراتژی­های درمانی نوین سوق می­دهد. استفاده از تکنیک­ CRISPR برای هدف قرار دادن دقیق محرک­های برخی از بیماری­ها، مستلزم درک بهتر مناطق غیرکد کنند­ه­ی DNA، حالت­های اپی­ژنتیک و همچنین تاثیرات آن­ها بر بروز بیماری می­باشد (115). اگرچه مسائل مربوط به اثربخشی و ایمنی این روش همچنان یک نگرانی و چالش بزرگ به حساب می­آید، اما نمی­توان منکر توانایی آن در درمان بسیاری از بیماری­ها شد. تحقیقات همچنان در زمینه­ی ویرایش ژنوم ادامه داشته و انتظار می­رود در این حوزه پیشرفت­های چشمگیری حاصل گردد. با توجه به این‫که فناوری ویرایش ژنوم با سرعت در حال تکامل است، دور از ذهن نیست که در آینده­ای نه چندان دور این تکنیک به یکی از روش­های رایج ژن درمانی تبدیل گردد.

-

  1. Dawkins HJ, Draghia‐Akli R, Lasko P, Lau LP, Jonker AH, Cutillo CM, et al. Progress in rare diseases research 2010–2016: an IRDiRC perspective. Clinical and translational science. 2018;11(1):11.
  2. Khalil AM. The genome editing revolution. Journal of genetic engineering and biotechnology. 2020;18(1):1-16.
  3. Humbert O, Davis L, Maizels N. Targeted gene therapies: tools, applications, optimization. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 2012;47(3):264-81.
  4. Petraitytė G, Preikšaitienė E, Mikštienė V. Genome editing in medicine: tools and challenges. Acta medica Lituanica. 2021;28(2):266-80.
  5. Smith HO, Welcox K. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: I. Purification and general properties. Journal of molecular biology. 1970;51(2):379-91.
  6. Kelly Jr TJ, Smith HO. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: II. Base sequence of the recognition site. Journal of molecular biology. 1970;51(2):393-409.
  7. Danna K, Nathans D. Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1971;68(12):2913-7.
  8. Tatum E, Lederberg J. Gene recombination in the bacterium Escherichia coli. Journal of bacteriology. 1947;53(6):673-84.
  9. Zinder ND, Lederberg J. Genetic exchange in Salmonella. Journal of bacteriology. 1952;64(5):679-99.
  10. Szybalska EH, Szybalski W. Genetics of human cell lines, IV. DNA-mediated heritable transformation of a biochemical trait. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1962;48(12):2026-34.
  11. Sambrook J, Westphal H, Srinivasan P, Dulbecco R. The integrated state of viral DNA in SV40-transformed cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1968;60(4):1288-95.
  12. Tatum EL. Molecular biology, nucleic acids, and the future of medicine. Perspectives in biology and medicine. 1966;10(1):19-32.
  13. Rogers S, Pfuderer P. Use of viruses as carriers of added genetic information. Nature. 1968;219(5155):749-51.
  14. Amer MH. Gene therapy for cancer: present status and future perspective. Molecular and cellular therapies. 2014;2(1):1-19.
  15. Prakash V, Moore M, Yáñez-Muñoz RJ. Current progress in therapeutic gene editing for monogenic diseases. Molecular Therapy. 2016;24(3):465-74.
  16. Rosenberg SA, Aebersold P, Cornetta K, Kasid A, Morgan RA, Moen R, et al. Gene transfer into humans—immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. New England journal of medicine. 1990;323(9):570-8.
  17. Blaese R, Culver K, Miller A, Carter C, Fleisher T, Clerici M, et al. B Rosenberg SA, Klein H, Berger M, Mullen CA, Ramsey WJ, Muul L, Morgan RA, Anderson WF. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA-SCID: initial trial results after 4 years. Science. 1995;270:475-80.
  18. Bordignon C, Notarangelo LD, Nobili N, Ferrari G, Casorati G, Panina P, et al. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA− immunodeficient patients. Science. 1995;270(5235):470-5.
  19. Stolberg SG. The biotech death of Jesse Gelsinger. NY Times Mag. 1999;28:136-40.
  20. FS RSCNL, GP WNBAG, ML WJB. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 2003;80:148-58.
  21. Herzog RW. Gene therapy for SCID-X1: round 2. Molecular Therapy. 2010;18(11):1891.
  22. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, Basile GvdS, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science. 2000;288(5466):669-72.
  23. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack M, Wulffraat N, Leboulch Pa, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. science. 2003;302(5644):415-9.
  24. Hammer MJ, Eckardt P, Barton-Burke M, editors. Informed consent: a clinical trials perspective. Oncology nursing forum; 2016: NIH Public Access.
  25. Rothstein RJ. [12] One-step gene disruption in yeast. Methods in enzymology. 101: Elsevier; 1983. p. 202-11.
  26. Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination. Nature. 1985;317(6034):230-4.
  27. Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell. 1986;44(3):419-28.
  28. Capecchi MR. Altering the genome by homologous recombination. Science. 1989;244(4910):1288-92.
  29. Lin F, Sperle K, Sternberg N. Recombination in mouse L cells between DNA introduced into cells and homologous chromosomal sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1985;82(5):1391-5.
  30. Rouet P, Smih F, Jasin M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and cellular biology. 1994;14(12):8096-106.
  31. Jeggo P. 5 DNA Breakage and Repair. Advances in genetics. 1998;38:185-218.
  32. Cohen-Tannoudji M, Robine S, Choulika A, Pinto D, El Marjou F, Babinet C, et al. I-Sce I-induced gene replacement at a natural locus in embryonic stem cells. Molecular and cellular biology. 1998;18(3):1444-8.
  33. Klug A, Rhodes D, editors. Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology; 1987: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  34. Kim Y-G, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1996;93(3):1156-60.
  35. Bibikova M, Carroll D, Segal DJ, Trautman JK, Smith J, Kim Y-G, et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Molecular and cellular biology. 2001;21(1):289-97.
  36. Porteus MH, Baltimore D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 2003;300(5620):763-.
  37. Gabriel R, Lombardo A, Arens A, Miller JC, Genovese P, Kaeppel C, et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature biotechnology. 2011;29(9):816-23.
  38. Pattanayak V, Ramirez CL, Joung JK, Liu DR. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nature methods. 2011;8(9):765-70.
  39. Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 2009;326(5959):1509-12.
  40. Moscou MJ, Bogdanove AJ. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 2009;326(5959):1501-.
  41. Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, et al. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucleic acids research. 2013;41(5):e63-e.
  42. Mussolino C, Alzubi J, Fine EJ, Morbitzer R, Cradick TJ, Lahaye T, et al. TALENs facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity. Nucleic acids research. 2014;42(10):6762-73.
  43. Kherraf Z-E, Conne B, Amiri-Yekta A, Kent MC, Coutton C, Escoffier J, et al. Creation of knock out and knock in mice by CRISPR/Cas9 to validate candidate genes for human male infertility, interest, difficulties and feasibility. Molecular and cellular endocrinology. 2018;468:70-80.
  44. Adli M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Commun. 2018; 9: 1911. PUBMED.
  45. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology. 1987;169(12):5429-33.
  46. Mojica FJ, Juez G, Rodriguez‐Valera F. Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular microbiology. 1993;9(3):613-21.
  47. Mojica FJ, Díez-Villaseñor Cs, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution. 2005;60:174-82.
  48. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. science. 2012;337(6096):816-21.
  49. Bahrami S, Amiri-Yekta A, Daneshipour A, Jazayeri SH, Mozdziak PE, Sanati MH, et al. Designing a transgenic chicken: applying new approaches toward a promising bioreactor. Cell Journal (Yakhteh). 2020;22(2):133.
  50. Mei Y, Wang Y, Chen H, Sun ZS, Ju X-D. Recent progress in CRISPR/Cas9 technology. Journal of Genetics and Genomics. 2016;43(2):63-75.
  51. Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, et al. Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2016;165(4):949-62.
  52. Ming S, Tian-Rui X, Ce-Shi C. The big bang of genome editing technology: development and application of the CRISPR/Cas9 system in disease animal models. Zoological Research. 2016;37(4):191.
  53. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2016;1863(9):2333-44.
  54. Liu M, Rehman S, Tang X, Gu K, Fan Q, Chen D, et al. Methodologies for improving HDR efficiency. Frontiers in genetics. 2019;9:691.
  55. Yang H, Ren S, Yu S, Pan H, Li T, Ge S, et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9 induced-double strand breaks. International journal of molecular sciences. 2020;21(18):6461.
  56. Mali S. Delivery systems for gene therapy. Indian journal of human genetics. 2013;19(1):3.
  57. Ludwig IS, Lekkerkerker AN, Depla E, Bosman F, Musters RJ, Depraetere S, et al. Hepatitis C virus targets DC-SIGN and L-SIGN to escape lysosomal degradation. Journal of virology. 2004;78(15):8322-32.
  58. Gao J, Mese K, Bunz O, Ehrhardt A. State‐of‐the‐art human adenovirus vectorology for therapeutic approaches. FEBS letters. 2019;593(24):3609-22.
  59. Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: trends and challenges. Journal of Controlled Release. 2022 Feb 1;342:345-61.
  60. Yanez Arteta M, Kjellman T, Bartesaghi S, Wallin S, Wu X, Kvist AJ, et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2018;115(15):E3351-E60.
  61. Miller JB, Zhang S, Kos P, Xiong H, Zhou K, Perelman SS, et al. Non‐viral CRISPR/Cas gene editing in vitro and in vivo enabled by synthetic nanoparticle co‐delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angewandte Chemie. 2017;129(4):1079-83.
  62. Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene therapy. 1999;6(7):1258-66.
  63. Zhang G, Budker V, Wolff JA. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human gene therapy. 1999;10(10):1735-7.
  64. Potter H, Heller R. Transfection by Electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. 2018;121(1):9.3.1-9.3.13.
  65. Suzuki K, Tsunekawa Y, Hernandez-Benitez R, Wu J, Zhu J, Kim EJ, et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 2016;540(7631):144-9.
  66. Amiri-Yekta A, Dalman A, Sanati MH, Fatemi N, Vazirinasab H, Zomorodipour A, et al. Optimization of the electroporation conditions for transfection of human factor IX into the goat fetal fibroblasts. Cell Journal (Yakhteh). 2013;14(4):270.
  67. Abe T, Inoue K-i, Furuta Y, Kiyonari H. Pronuclear microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 2020;31(7):107653.
  68. Alghadban S, Bouchareb A, Hinch R, Hernandez-Pliego P, Biggs D, Preece C, et al. Electroporation and genetic supply of Cas9 increase the generation efficiency of CRISPR/Cas9 knock-in alleles in C57BL/6J mouse zygotes. Scientific Reports. 2020;10(1):1-12.
  69. Han X, Liu Z, Jo MC, Zhang K, Li Y, Zeng Z, et al. CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation. Science advances. 2015;1(7):e1500454.
  70. Sharei A, Zoldan J, Adamo A, Sim WY, Cho N, Jackson E, et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013;110(6):2082-7.
  71. Dasgupta I, Flotte TR, Keeler AM. CRISPR/Cas-dependent and nuclease-free in vivo therapeutic gene editing. Human Gene Therapy. 2021;32(5-6):275-93.
  72. Depil S, Duchateau P, Grupp S, Mufti G, Poirot L. ‘Off-the-shelf’allogeneic CAR T cells: development and challenges. Nature reviews Drug discovery. 2020;19(3):185-99.
  73. Dever DP, Bak RO, Reinisch A, Camarena J, Washington G, Nicolas CE, et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 2016;539(7629):384-9.
  74. Papizan JB, Porter SN, Sharma A, Pruett-Miller SM. Therapeutic gene editing strategies using CRISPR-Cas9 for the β-hemoglobinopathies. Journal of Biomedical Research. 2021;35(2):115.
  75. Chen Y-C. CRISPR based genome editing and removal of human viruses. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 2021;179:93-116.
  76. Doudna JA. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 2020;578(7794):229-36.
  77. Hu W, Kaminski R, Yang F, Zhang Y, Cosentino L, Li F, et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111(31):11461-6.
  78. Deng Q, Chen Z, Shi L, Lin H. Developmental progress of CRISPR/Cas9 and its therapeutic applications for HIV‐1 infection. Reviews in Medical Virology. 2018;28(5):e1998.
  79. Schmidt SC, Anedda B, Burchartz A, Eichsteller A, Kolb S, Nigg C, et al. Physical activity and screen time of children and adolescents before and during the COVID-19 lockdown in Germany: a natural experiment. Scientific reports. 2020;10(1):1-12.
  80. Moody CA, Laimins LA. Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation. Nature Reviews Cancer. 2010;10(8):550-60.
  81. Ding W, Hu Z, Zhu D, Jiang X, Yu L, Wang X, et al. Zinc Finger Nucleases Targeting the Human Papillomavirus E7 Oncogene Induce E7 Disruption and a Transformed Phenotype in HPV16/18-Positive Cervical Cancer CellsZFN Induces E7 Disruption in HPV-Positive Cells. Clinical cancer research. 2014;20(24):6495-503.
  82. Cradick TJ, Keck K, Bradshaw S, Jamieson AC, McCaffrey AP. Zinc-finger nucleases as a novel therapeutic strategy for targeting hepatitis B virus DNAs. Molecular Therapy. 2010;18(5):947-54.
  83. Ramanan V, Shlomai A, Cox DB, Schwartz RE, Michailidis E, Bhatta A, et al. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Scientific reports. 2015;5(1):10833.
  84. Liu X, Zhang Y, Cheng C, Cheng AW, Zhang X, Li N, et al. CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells. Cell research. 2017;27(1):154-7.
  85. Miao K, Zhang X, Su SM, Zeng J, Huang Z, Chan UI, et al. Optimizing CRISPR/Cas9 technology for precise correction of the Fgfr3-G374R mutation in achondroplasia in mice. Journal of Biological Chemistry. 2019;294(4):1142-51.
  86. Ekman FK, Ojala DS, Adil MM, Lopez PA, Schaffer DV, Gaj T. CRISPR-Cas9-mediated genome editing increases lifespan and improves motor deficits in a Huntington’s disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2019;17:829-39.
  87. Tang X-D, Gao F, Liu M-J, Fan Q-L, Chen D-K, Ma W-T. Methods for enhancing clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9-mediated homology-directed repair efficiency. Frontiers in genetics. 2019;10:551.
  88. Li HL, Fujimoto N, Sasakawa N, Shirai S, Ohkame T, Sakuma T, et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem cell reports. 2015;4(1):143-54.
  89. Rohn TT, Kim N, Isho NF, Mack JM. The potential of CRISPR/Cas9 gene editing as a treatment strategy for Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer's disease & Parkinsonism. 2018;8(3).
  90. Pavel-Dinu M, Wiebking V, Dejene BT, Srifa W, Mantri S, Nicolas CE, et al. Gene correction for SCID-X1 in long-term hematopoietic stem cells. Nature communications. 2019;10(1):1634.
  91. Cabral T, DiCarlo JE, Justus S, Sengillo JD, Xu Y, Tsang SH. CRISPR applications in ophthalmologic genome surgery. Current opinion in ophthalmology. 2017;28(3):252.
  92. Maule G, Arosio D, Cereseto A. Gene therapy for cystic fibrosis: progress and challenges of genome editing. International journal of molecular sciences. 2020;21(11):3903.
  93. CRISPR CLINICAL TRIALS (https://crisprmedicinenews.com/clinical-trials/).
  94. Ormond KE, Mortlock DP, Scholes DT, Bombard Y, Brody LC, Faucett WA, et al. Human germline genome editing. The American Journal of Human Genetics. 2017;101(2):167-76.
  95. Lander ES, Baylis F, Zhang F, Charpentier E, Berg P, Bourgain C, et al. Adopt a moratorium on heritable genome editing. Nature. 2019;567(7747):165-8.
  96. Zhang D, Lie RK. Ethical issues in human germline gene editing: a perspective from China. Monash Bioethics Review. 2018;36:23-35.
  97. Huang C, Li Q, Li J. Site-specific genome editing in treatment of inherited diseases: possibility, progress, and perspectives. Medical Review. 2022 Oct 26;2(5):471-500.
  98. Jinek M. A Programmable Dual-Siswanto, FM, BH Kartiko/Media Sains 1 (2)(2017) 56 J. Media Sains–September 2017 RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 2012;337(6096):816-21.
  99. Cromer MK, Vaidyanathan S, Ryan DE, Curry B, Lucas AB, Camarena J, et al. Global transcriptional response to CRISPR/Cas9-AAV6-based genome editing in CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Molecular Therapy. 2018;26(10):2431-42.
  100. Kosicki M, Tomberg K, Bradley A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature biotechnology. 2018;36(8):765-71.
  101. Cullot G, Boutin J, Toutain J, Prat F, Pennamen P, Rooryck C, et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Nature communications. 2019;10(1):1136.
  102. Blattner G, Cavazza A, Thrasher AJ, Turchiano G. Gene editing and genotoxicity: targeting the off-targets. Frontiers in Genome Editing. 2020;2:613252.
  103. Leibowitz ML, Papathanasiou S, Doerfler PA, Blaine LJ, Sun L, Yao Y, et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR–Cas9 genome editing. Nature genetics. 2021;53(6):895-905.
  104. Rees HA, Liu DR. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature reviews genetics. 2018;19(12):770-88.
  105. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 2020;367(6481):eaba7365.
  106. Matsoukas IG. Prime editing: genome editing for rare genetic diseases without double-strand breaks or donor DNA. Frontiers in Genetics. 2020:528.
  107. Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-57.
  108. Weinberg DN, Papillon-Cavanagh S, Chen H, Yue Y, Chen X, Rajagopalan KN, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape. Nature. 2019;573(7773):281-6.
  109. Kearns NA, Pham H, Tabak B, Genga RM, Silverstein NJ, Garber M, et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9–histone demethylase fusion. Nature methods. 2015;12(5):401-3.
  110. Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 2014;159(3):647-61.
  111. Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013;154(2):442-51.
  112. Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, Tuttle M, PR Iyer E, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods. 2015;12(4):326-8.
  113. D’Urso A, Brickner JH. Mechanisms of epigenetic memory. Trends in genetics. 2014;30(6):230-6.
  114. Sarkies P, editor Molecular mechanisms of epigenetic inheritance: possible evolutionary implications. Seminars in Cell & Developmental Biology; 2020: Elsevier.
  115. Chavez M, Chen X, Finn PB, Qi LS. Advances in CRISPR therapeutics. Nature Reviews Nephrology. 2023;19(1):9-22.
  116. Samulski RJ, Muzyczka N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annual review of virology. 2014;1:427-51.
  117. Hamilton JR, Tsuchida CA, Nguyen DN, Shy BR, McGarrigle ER, Espinoza CRS, et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell reports. 2021;35(9):109207.
  118. Ling S, Yang S, Hu X, Yin D, Dai Y, Qian X, et al. Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice. Nature Biomedical Engineering. 2021;5(2):144-56.
  119. Banskota S, Raguram A, Suh S, Du SW, Davis JR, Choi EH, et al. Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins. Cell. 2022;185(2):250-65. e16.
  120. Frock RL, Hu J, Meyers RM, Ho Y-J, Kii E, Alt FW. Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nature biotechnology. 2015;33(2):179-86.
  121. Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  122. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, Deshmukh H, Ranjan P, Sarode N, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic acids research. 2014;42(11):7473-85.
  123. Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 2016;351(6268):84-8.
  124. Rothschild J. Ethical considerations of gene editing and genetic selection. Journal of General and Family Medicine. 2020;21(3):37-47.
  125. Brokowski C, Adli M. CRISPR ethics: moral considerations for applications of a powerful tool. Journal of molecular biology. 2019;431(1):88-101.
  126. Khan SH. Genome-editing technologies: concept, pros, and cons of various genome-editing techniques and bioethical concerns for clinical application. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2019;16:326-34.
  127. Dunbar CE, High KA, Joung JK, Kohn DB, Ozawa K, Sadelain M. Gene therapy comes of age. Science. 2018;359(6372):eaan4672.