فصلنامه
نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد، بیوشیمی، علومپایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
2 هیأتعلمی، گروه زیستشناسی، دانشکده علومپایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Aim: Nowadays, one of the great challenges of mankind is to find a suitable way for the treatment of cancer. Recent developments show that nanotechnology has a significant impact on the prevention, diagnosis and treatment of cancer. In nanotechnology, there are different physical and chemical methods to produce nanoparticles but mostly chemical methods are used. The nanoparticles produced using these methods are harmful to health due to the absorption of chemical species on their surface. In order to eliminate this big problem, biological methods such as the use of fungi, bacteria and plants have replaced other methods for the synthesis of nanoparticles which is called green synthesis. It is cheaper, simpler and non-toxic than other methods. The use of plants for the synthesis of nanoparticles has become more important than other biological methods due to the elimination of the difficult step of cell culture maintenance.
Material and Methods: In this study, gold nanoparticles were formed after treating the HAuCl4 solution with the aqueous extract of Anarijeh plant with the scientific name Pimpinella affinis. In this research, different amounts of aqueous extracts of leaves and stems of Pimpinella affinis were used for the synthesis of gold nanoparticles. UV-Visible spectroscopy and DLS methods were used to evaluate nanoparticles and determine their average size and stability. Also, SEM method was used to investigate their morphology. FTIR method was used to determine the functional groups of the aqueous extract and synthesized gold nanoparticles; in addition GC/MS device was used to determine the composition of the extract. Finally, MTT analysis was used to investigate the cytotoxic effects of nanoparticles on MCF-7 cell line along with treatments of 24, 48 and 72 hours.
Results: The results of the analysis were showed that the optimal concentration of the Pimpinella affinis extract for the synthesis of gold nanoparticles is 1 mg/ml. The synthesized gold nanoparticles using the mentioned concentration of the extract have an average size of 20 nanometers with a zeta potential of -61 mV which has the best stability. They had a spherical shape with a polydispersity equal to 0.7. The results of FTIR analysis show the presence of hydroxyl, simple carbonyl groups and hydrocarbon functional groups in the compounds of the extract. Experiments showed that phenolic and carboxylic compounds play the most important role in the reduction of gold salt. Also, proteins and lipids have made gold nanoparticles stable. The essential compounds identified in the extract by GC/MS method include Phenolic and flavonoid compounds and terpenes which are confirmed by the FTIR spectrum. The treatment time of 48 hours for MCF-7 cell line is the best time for the toxicity of nanoparticles with IC50 equal to 384.2 µg/ml, which was determined by MTT analysis.
Conclusion: According to the above findings, it can be concluded that Pimpinella affinis is one of the suitable options for the synthesis of gold nanoparticles, and it can be done with more studies on nanoparticles synthesized using this plant, considered it as one of the efficient methods to achieve the goal of proper treatment for breast cancer.
کلیدواژهها English
مقدمه
سرطان یک بیماری مخرب است که مرگ و میر سالانه آن در حال افزایش است و درمان آن جزء یکی از بزرگترین چالشها برای بشر میباشد (1). از بین انواع سرطانها، سرطان پستان شایعترین سرطان در بین زنان و دومین علت اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان است (2). تا به امروز شایعترین درمانهای سرطان محدود به شیمیدرمانی، پرتودرمانی و جراحی است که علیرغم پیشرفتهای زیادی که داشتهاند، درمان سرطان هنوز دارای معایب بزرگی است. مهمترین مضراتی که در درمانهای کنونی سرطان با آن روبهرو هستیم شامل: غلظت ناکافی داروها برای وارد شدن به محل تومور، توزیع عمومی و غیر اختصاصی عوامل ضدتوموری در بدن، آسیب به بافتهای سالم، سمیت عمومی و عوارض جانبی طولانی مدت است. در مجموع، همه این عوامل کاربرد بالینی روشهای ذکرشده را محدود میسازد، بنابراین به روشهای درمانی کارآمدتر و مناسبتری برای درمان سرطان در انسان نیاز است (1, 3). مسئله کلیدی در درمان سرطان، دستیابی به غلظت مناسب عامل درمانی در محلهای تومور با هدف از بینبردن سلولهای سرطانی و در عین حال به حداقل رساندن آسیب به سلولهای طبیعی است که در این راستا نانوفناوری سرطان، انقلابی جدید برای درمان سرطان بهوجود آورده است. فناوری نانو شامل دستکاری و ایجاد مواد در مقیاس نانو برای تولید محصولات با خواص جدید است. پیشرفتهای اخیر نشان میدهد که فناوری نانو تاثیر بهسزایی در پیشگیری، تشخیص و درمان بیماری سرطان خواهد داشت (3). خروجی اصلی فناوری نانو، توسعه مواد جدید در مقیاس نانومتر از جمله نانوذرات است. نانوذرات، ذراتی با اندازههای کمتر از میکرون و معمولا بین 10 تا 100 نانومتر هستند. عملکرد نانوذرات هم به مقادیر قابل اندازهگیری آنها مانند جرم، حجم و بار الکتریکی و هم به ویژگیهای درونی آنها مانند واکنشپذیری بستگی دارد (4). از خواص عمده نانوذرات میتوان به داشتن تنوع زیاد، ویژگیهای سطحی منحصر به فرد، واکنش پذیری بسیار بالا، حلالیت بالا، سمیت کم، دسترسی زیستی و استفاده از روشهای سریعتر و ارزانتر برای تولید آنها اشاره نمود. استفاده از نانوذرات راهکاری قانع کننده برای حذف تدریجی سلولهای سرطانی بدون آسیب جدی به سلولهای طبیعی را فراهم میکند (5, 6). نانوذرات میتوانند ذرات فلزی و غیرفلزی باشند. نانوذرات فلزی دارای اشکال هندسی مختلف هستند اما معمولاً بهصورت کروی هستند و در حالت یونی، سیستمهای کلوئیدی را تشکیل میدهند (4). از بین نانوذرات مختلف، نانوذرات فلزی طلا (GNPs ) بهدلیل داشتن خواص منحصر به فرد مانند ضریب جذب قوی فتوالکتریک، سهولت در سنتز، نسبت سطح به جرم بالا، عدد اتمی بالا (Z=79 )، فعالیت بالای نانوذرات طلا و تمایل زیاد آنها به اتصال به بیومولکولها و ماکرومولکولها، بهطور خاص در بسیاری از زمینهها از جمله در درمان سرطان مورد استفاده قرار میگیرد (6, 7). برای تولید نانوذرات بهطورکلی روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی وجود دارد و به دو نوع اصلی روشهای پایین به بالا ( bottom up methods ) و روشهای بالا به پایین ( top-down methods ) دسته بندی میشوند. مشکل اصلی روش بالا به پایین، تغییر در شیمی سطح و خواص فیزیکوشیمیایی نانوذرات است و نانوذرات با کیفیت مناسب سنتز نمیشود و بهطور کلی اکثر روشهای سنتز نانوذرات، پیچیده و زمانبر میباشند. علاوهبراین، سنتز نانوذرات طلا با روشهای شیمیایی بهعلت جذب گونههای شیمیایی بر روی سطح نانوذرات ممکن است اثرات نامطلوب زیستی ایجاد کند و در نهایت برای سلامتی مضر باشد. اما سنتز نانوذرات با استفاده از میکروارگانیسمها یا گیاهان که در دستهی سنتز نانوذرات به روش پایین به بالا قرار دارند بهطور بالقوه میتوانند این مشکلات را مرتفع سازند (8). در سالهای اخیر از گیاهان، جلبکها، قارچها، باکتریها برای تولید نانوذرات فلزی استفاده شده است که به آن سنتز سبز می گویند و نسبتبه سایر روشها، ارزانتر، سادهتر و غیرسمی است (9, 10). در میان موجودات زنده مختلف که مورد مطالعه قرار میگیرد، گیاهان در سنتز نانوذرات فلزی بهدلیل مزیتی که نسبت به سایر فرآیندهای بیولوژیکی دارند از اهمیت ویژهای برخوردار هستند و آن مزیت، حذف مرحله پیچیده نگهداری کشت سلولی است. همچنین سنتز نانوذرات با استفاده از گیاهان بهدلیل سادگی، عدم بیماریزایی و سازگاری با محیط زیست اهمیت زیادی پیدا کرده است (8). علاوه بر آن وجود ترکیبات گیاهی در نانوذرات باعث جلوگیری از اثرات مخرب عوامل محیطی مانند نوسان pH، حمله آنزیمی و تخریب بیوشیمیایی احتمالی میشود. از طرفی شواهد نشان میدهد که ترکیبات ساختاری متنوعی که از گیاهان بهدست میآید قادر به پیشگیری و درمان سرطان است. فعالیت درمانی این عوامل به کلاسهای ساختاری مختلفی از جمله آلکالوئیدها، ترپنوئیدها، ترکیبات گوگردی ارگانو و پلیفنولها تعلق دارد. از رایجترین پلیفنولهای طبیعی میتوان به اسیدهای فولیک و فلاونوئیدها اشاره نمود. فلاونوئیدها حدود دو سوم ترکیبات پلیفنولی را تشکیل میدهند. طیف وسیعی از خواص ضدتوموری به این عوامل مشتق شده از گیاهان نسبت داده شده است و شامل خواص آنتیاکسیدانی، ضد تکثیر، ضد حساسیت، ضد فعالیتهای متاستاتیک و ضدالتهاب میشوند. از طرفی بیشتر داروهای شیمیدرمانی که درحالحاضر در محیطهای بالینی مورد استفاده قرار میگیرد، محصولات طبیعی یا مشتقات نیمهسنتزی این ترکیبات موجود در گیاهان است اما علیرغم فواید مهم آنها برای سلامتی، اثربخشی محصولات طبیعی بهدلیل حلالیت کم در آب، جذب کم، دسترسی کم و ماندگاری کوتاهمدت در سیستم بیولوژیکی تضعیف میشود و برای از بین بردن این ضعفها از نانو فرمولاسیون به عنوان حامل دارو برای درمان استفاده میشود. در نتیجه، ادغام گیاهدرمانی و فناورینانو در هدفهای درمان بالینی میتواند پاسخ دارویی و نتیجه بالینی بهتری را برای بیماران به ارمغان آورد (1, 11). تاکنون سنتز نانوذرات طلا با استفاده از گیاهان متعددی در خارج و داخل ایران انجام شده است ازجمله: سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاهان Magnolia Kobus، Hibiscus، Punica granatum، coriander، Pelargoniumgraveolens، Nasturtium nasturtium و میوه Sambucus ebulus که تعدادی از آنها از نظر خواص ضدسرطانی نانوذرات طلای سنتز شده مورد بررسی قرار گرفته شده است (12, 13) مانند سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره Couroupita guianensis، Curcumae Kwangsiensis و چغندر (7, 14, 15).
در این پژوهش از عصاره ساقه و برگ گیاه Pimpinella affinis با نام محلی اناریجه برای سنتز سبز نانوذرات طلا استفاده شده است. P.affinis یکی از گونههای مهم خانواده Apiaceae است. گیاهی معطر، دو ساله با ارتفاع ۲۰ تا ۱۱۰ سانتی متر با گل آذینهای سفید و میوههای بیضی شکل که در مناطق مختلف ترکمن، ایران، افغانستان، عراق، سوریه و فلسطین رشد میکند و در ایران بهصورت وحشی بیشتر در مناطق شمالی با هوای سرد پراکنده است (16). از این گیاه در طب عامیانه ایران بهعنوان مسکن، مدر، اشتها آور، آرامبخش، ضد اسپاسم، ضد میکروب، ضد قارچ، آنتی اکسیدانت و افزایش دهنده شیر مادر مورد استفاده قرار میگیرد (17). بنابراین یکیاز دلایل گزینش گیاه مذکور، بومی بودن آن است، از طرفی تا آنجاییکه میدانیم توجه بسیار کمی به کاربردهای بالینی نانوذرات سنتز شده بهوسیله این گیاه مخصوصا در درمان سرطان شده است و در این زمینه روی گیاه مذکور مطالعات چندانی صورت نگرفته است. علاوه براین اناریجه گیاهی دارویی است و در طب سنتی ایران کاربرد فراوان دارد. این گیاه دارای منابع ارزشمندی ازمتابولیتهای ثانویه مختلف است (18). متابولیتهای ثانویه بهخصوص ترکیبات فنولی موجود در آن، خاصیت آنتیاکسیدانتی فوق العادهای دارند و به همین علت این گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. بهعلت داشتن خاصیت آنتیاکسیدانتی قوی، عصارهی گیاه اناریجه با احیای نمک طلا میتواند نانوذرات کاربردی با اندازه مناسب را تولید کند و نیز بهعلت قرارگیری عوامل آنتیاکسیدانت گیاه برروی نانوذرات طلای سنتز شده، میتواند بهصورت غیر مستقیم اثر سمیتسلولی روی سلولهای سرطانی داشته باشد. در نتیجه عصاره آبی P.affinis میتواند با سنتز و تثبیت نانوذرات طلا، برای اصلاحسازی نانوداروهای ضدسرطان و در نهایت در تولید دارویی موثر برای درمان سرطان کمک کننده باشد. بنابراین بهعلت شیوع فراوان و روز افزون سرطان مخصوصا سرطان پستان بر آن شدیم تا در این پژوهش، نانوذرات طلا بر پایه عصاره آبی ساقه و برگ گیاه اناریجه را ساخته و به بررسی خصوصیات و ویژگیهای نانوذرات طلا سنتز شده بپردازیم و اثرات سمیت آنها را بر روی رده سلولی MCF-7 در سرطان پستان مورد بررسی قرار دهیم. در این پژوهش، پس از عصارهگیری از گیاه اناریجه، برای شناسایی ترکیبات درون عصاره از دستگاه GC/MSاستفاده شده است. سپس برای تعیین خصوصیات نانوذرات سنتز شده از روشهای طیف سنجی فرابنفش-مرئی (UV-Visible)، دستگاه تفرق نور پویا (DLS)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و طیف سنج فوریه مادون قرمز ( FTIR ) استفاده شده است و در نهایت از غلظت بهینهی نانوذرات طلای سنتز شده برای بررسی سمیتسلولی آنها بر روی رده سلولهای سرطانی MCF-7 در سرطان پستان در انسان بهوسیله آزمایشMTT assay با تیمارهای 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفته شد.
2- مواد و روشها
تهیه عصاره آبی گیاه اناریجه: ساقه و برگ گیاه P.affinis از منطقه رحیمآباد در شهرستان رودسر واقع در استان گیلان تهیه شدند. پساز آن، نمونههای جمع آوری شده کاملا با آب شهری شستشو داده شدند و در محیط سایه، زمان داده شد تا کاملا خشک شوند. پس از خشک شدن، گیاه توسط آسیاب خانگی بهصورت پودر تهیه شد. برای تهیه عصاره، ابتدا مقدار 5/2 گرم از پودر برگ و ساقه گیاه به ۲۵ میلیلیتر آب دیونیزه در حال جوش اضافه شد و خروجی ارلن توسط فویل پوشانیده شد. نمونه بهمدت ۳۰ دقیقه در دمای جوش باقی ماند. پس از سرد شدن نمونه، مخلوط حاصل دو بار از کاغذ صافی، بهمنظور حذفکردن ذرات جامد موجود در نمونه و تهیهی یک عصاره با درصدخلوص بالا و شفاف، عبور داده شد. عصاره حاصل در دمای 4 درجه سانتیگراد بهمدت حداکثر 4 روز و در دمای 18- درجه سانتیگراد بهمدت حداقل دو ماه پایدار باقی ماند.
سنتز سبز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاهی: برای سنتز سبز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره آبی گیاه اناریجه تهیه شده بهعنوان کاهنده و پایدارکننده، از هشت غلظت متوالی 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 (mg/ml) بهمنظور تعیین غلظت بهینهی عصاره برای سنتز نانوذرات طلا پایدار با اندازههای مناسب استفاده شد. حجم نهایی برای محلول واکنش 10 میلیلیتر درنظر گرفته شد و برای رقیقسازی و غلظتسازی عصاره، از آب دیونیزه استفاده شد. روند آزمایش بهاینصورت است که ابتدا مقدار آب دیونیزه مدنظر درون ویالها ریخته شد و سپس ویالها روی گرمکن همزندار مغناطیسی قرار داده شد و با تنظیم دور 600 (RPM) به دمای ۷۰ درجه سانتیگراد رسانیده شد. سپس معادل یک میلیگرم نمک طلا به هر یک از ویالها اضافهشد و پساز گذشت 2 دقیقه، به هر یک از ویالها مقدار مشخص شده از عصارهی آبی اناریجه به آرامی افزوده شد (19)، پس از گذشت 90 دقیقه با بررسی تغییر رنگ در هر یک از ویالها به تعیین و بررسی تولید نانوذرات پرداخته شد.
تعیین مشخصات نانوذرات طلای سنتز شده: ابتدا برای تایید سنتز نانوذرات طلای سنتز شده و تعیین ویژگی آنها از دستگاه طیف سنج UV-Visible موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه گیلان استفاده شد. جذب نانوذرات طلا در ناحیه مرئی حدود 500-600 نانومتر است (20)، برای بررسی کامل جذب و تغییرات آن، نانوذرات طلای سنتز شده در طیفهای جذبی بین محدوده طولموج ۴۰۰ تا ۸۰۰ نانومتر مورد بررسی قرار گرفتهشد. درصورت عملکرد مناسب عصاره آبی P.affinis و توانایی آن در احیای یونهای طلا و تبدیل آن به نانوذرات طلا در این محدوده، طیف جذبی حاصل از رزونانسپلاسمونسطحی (LSPR) نانوذرات طلا سنتز شده قابل مشاهده خواهد بود. بامقایسهی طیفجذبی نانوذرات طلا ایجاد شده بهوسیلهی غلظتهای مختلف از عصاره، اندازه، غلظت و میزان توزیع نانوذرات طلای تولید شده مورد مقایسه قرار گرفته شد و غلظت بهینه عصاره برای سنتز نانوذرات طلا بهدست آمد. بهمنظور تعیین میانگین اندازه، نحوه توزیع و میزان پایداری نانوذرات طلای سنتز شده از دستگاه اندازهگیری پتانسیلزتا یا تفرق دینامیک نور (DLS) موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه گیلان استفاده شد. این دستگاه علاوه بر اندازهگیری اندازه نانوذرات موجود در کلوئید و تعیین میانگین اندازه نانوذرات، شاخص عدم تجانس (PDI) را هم برای هر نمونه اندازهگیری میکند که نشاندهنده میزان یکنواختی یا عدم یکنواختی اندازه نانوذرات در یک کلوئید است (21). با استفاده از اندازهگیری مقدار پتاسیلزتا نیز به تعیین میزان پایداری نانوذرات سنتز شده پرداخته شد.
برای تعیین مورفولوژی نانوذرات طلای سنتز شده با استفادهاز غلظت بهینه بهدست آمده از عصاره، از میکروسکوپالکترونیروبشی (SEM) متعلق به دانشکدهفنی دانشگاه تهران، انستیتو نفت تهران استفاده شد. برای شناسایی گروههای عاملی موجود در عصاره که در فرآیند احیای یونهای طلا به نانوذرات طلا نقش ایفا نمودهاند و همچنین گروههایی که نانوذرات طلای سنتز شده را پوشش دادهاند و باعث پایداری آنها شدهاند از طیف سنج FTIR موجود در آزمایشگاه شیمی دانشکده علومپایه در دانشگاه گیلان استفاده شد. برای آنالیز FTIR، نانوذرات طلای تازه سنتز شده با استفاده از غلظت بهینه عصاره با دور RPM 8000 و بهمدت 10 دقیقه در 4 درجهسانتیگراد، سانتریفوژ شدند و با اضافه کردن آب دیونیزه به رسوب حاصل حاوی نانوذرات طلا، سوسپانسیون جدید تهیه شد. سپس جهت آمادهسازی و خشککردن نمونهها که شامل عصاره گیاهی و نانوذرات طلا سنتزشده بهوسیله عصاره گیاهی است، از روش فریزدرای استفاده شد و آنالیز FTIR بر روی آنها انجام شد.
سنجش سمیت سلولی: در این مطالعه به بررسی عملکرد ردهسلولی MCF-7 ) خریداری شده از بانک سلولی پاستور( مربوط به سرطان پستان در انسان، نسبت به عصاره آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده با استفادهاز این عصاره پرداخته شد. در مرحله اول، سلولهای MCF-7 درون چاهک کشت داده شدند و پلیت درون انکوباتور 37 درجه سانتیگراد همراه با CO2 5 درصد قرار داده شد. پساز گذشت 24 ساعت، عصارهی آبی گیاه P.affinis و نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیله غلظت بهینه از عصاره در پنج رقت زنجیرهای µg/ml 1000، 500، 250، 100، 50، 0 همراه با سه بار تکرار غلظت به چاهکهای دارای سلول اضافه شدند، همچنین سه چاهک پلیت برای بیشترین غلظت از نمک طلا ( HAuCl4.3H2O ) تعبیه شد تا اثر نمک طلا بر سلولها مورد بررسی قرار گیرد. تیمار در زمانهای مختلف 24، 48 و 72 ساعت صورت گرفت. پس از پایان زمان تیمار سلولها، آزمایش MTT انجام شد و نتایج تغییر رنگ نمونهها توسط دستگاه الایزا در طولموج 570 نانومتر خوانش شد. برای بررسی درصد بقا (Viability) سلولهای MCF-7 تیمار شده با عصاره و نانوذرات طلا، از رابطه 1 استفاده شد.
(1)% Viability = ×100
3- نتایج
با استفاده از آنالیز GC/MS، ترکیبات موجود در عصاره گیاه اناریجه تعیین شد. باتوجه به جدول 1 که نشاندهنده ترکیبات شناساییشده در آنالیز GC/MS است، ترکیبات غالب موجود در عصاره اناریجه شامل ترکیباتفنولی مختلف، ترپنها، ترکیبات فلاونوئیدی، ترکیبات آلکالوئیدی، گلیکوزیدی و لیپیدی است که همگی آنها، مخصوصا ترکیباتفنولی و آنتیاکسیدانتی عصاره گیاه اناریجه در سنتز نانوذرات طلای پایدار مشارکت دارند.
|
Name |
% |
|
4H-pyran-4-one-2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl ( DDMP ) |
17.902 |
|
P-Cymene |
10.535 |
|
Scoparone |
6.836 |
|
Benzenemethanol,alpha,alpha,4-trimethyl |
6.829 |
|
Tetrahydroquinoline |
6.605 |
|
6-Hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a- tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one ( HTT ) |
6.302 |
|
Oleic acid |
6.216 |
|
Benzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl) |
6.089 |
|
Hydroquinone |
5.987 |
|
Catechol |
5.090 |
|
Acetic acid |
4.048 |
|
N,N-Dimethylaminoethanol |
3.965 |
|
Caffeine |
3.562 |
|
Butyrolactone |
3.388 |
|
2-Hydroxy-1-(1'-pyrrolidiyl)-1-buten-3-one |
2.719 |
|
Linoelaidic acid |
2.676 |
|
4-(2,6,6-trimethylcyclohexa-1,3-dienyl)but-3-en-2-one |
2.169 |
|
2-Propenamide |
1.465 |
|
3-methyl-4-phenyl-1H-pyrrole |
0.892 |
|
Octadecanoic acid |
0.781 |
|
9H-pyrido(3,4-b)indole |
0.737 |
|
9-12 octadecadienoic acid(Z,Z) |
0.730 |
|
Phenol |
0.710 |
جدول 1: ترکیبات تشکیل دهنده عصاره گیاه اناریجه بهوسیله آنالیز GC/MS؛ ترتیب ترکیبات از بیشترین مقدار به کمترین مقدار طبقه بندی شده است.
ترکیبات شناسایی شده در این روش برای گیاه اناریجه طبق جدول1 بیان میکند که بیشتر ترکیبات عصاره شامل ترکیبات فنولی مانند اسکوپارون، ترکیبات فلاونوئیدی مانندDDMP ، مونوترپنها مانند p-cymene و مشتقات آن، ترکیبات آنتیاکسیدانت مانند هیدروکوئینون و HTT، لیپیدها شامل لینولئیکاسید، استئاریکاسید و اولئیکاسید و آلکالوئیدها مانند بتاکربولین میباشد. بهطورکلی عصاره برگ و ساقه گیاه P.affinis با توجه به متابولیتهای ثانویه موجود در آن، توانایی احیای یونهای طلا به نانوذرات طلا را دارد.
طیفسنجی مرئی- فرابنفش از نانوذرات حاصل از سنتز سبز
بهمنظور تعیین غلظت بهینه از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا، از غلظتهای مختلف عصاره استفاده شد. با افزایش غلظت عصاره آبی گیاه اناریجه از کمترین مقدار (mg/ml 2/0) تا بیشترین مقدار (mg/ml 3)، به ترتیب از a تا h، در دمای ثابت 70 درجه سانتیگراد، دور ثابت RPM 600 و زماندهی ثابت 90 دقیقه، تغییر رنگ از زرد کمرنگ به رنگهای آبی متمایل به طوسی، قرمز یاقوتی، بنفش و سپس آبی متمایلبه طوسی مشاهده شد (شکل 1). تغییر رنگ به سمت قرمز یاقوتی نشان دهندهی کاهش یونهای طلا (Au3+) به اتم طلا (Au0) و تشکیل نانوذرات طلا میباشد (22). که ناشی از ارتعاشات پلاسمون سطحی نانوذرات طلا است. بنابراین تغییر رنگ کلوئید به سمت قرمز و بنفش به عنوان شاهد اولیه تشکیل نانوذرات طلا میباشد و در ادامه این فرآیند اتفاق افتاده با مطالعهی دادههای حاصل از طیفسنجی مرئی-فرابنفش قابل بررسی است (20). حداکثر طولموج جذبی نانوذرات طلا سنتز شده در غلظتهای مختلف از عصاره گیاه اناریجه بین 500 تا 600 نانومتر ظاهر شد ( شکل 2)، بهطوریکه با استفادهاز غلظتهای 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 (mg/ml) از عصاره، حداکثر طولموج جذبی ( lmax ) برای نانوذرات طلای تولید شده بهترتیب از غلظت کم به زیاد عصاره 579، 532، 533، 533، 537، 537، 552 و 563 نانومتر و حداکثر میزان جذب آنها بهترتیب از راست به چپ 544/0، 870/0، 992/0، 985/0، 954/0، 999/0، 936/0 و 735/0 به دست آمد. باتوجه به نتایج حاصلاز تولید نانوذرات طلا بهوسیلهی غلظتهای مختلف عصاره گیاه اناریجه، تشکیل رنگهای مختلف در کلوئید و بررسی نتایج حاصلاز طیفسنج مرئی-فرابنفش آنها بیانگر آن است که مقدار عصارهی گیاهی مصرف شده، نقش مهمی در اندازه و غلظت نانوذرات سنتز شده و پراکندگی آنها دارد که باعث تغییر در موقعیت حداکثر طولموج جذبی در طیفسنج مرئی-فرابنفش میشود. در نمودار ایجاد شده از بررسی طیفسنج مرئی-فرابنفش برای نانوذرات طلای تولید شده در مطالعه حاضر (شکل 2)، با استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصاره منحنی با شدتجذب کمتر و ایجاد پیک وسیع نسبتبه سایر نمونهها ایجاد شده است و در مشاهدات بصری نیز تغییر رنگ کلوئید به آبی متمایلبه طوسی مشاهده شد. نتایج پژوهشها حاکیاز آن است که حداکثر طول موج جذبی تشکیل شدهی حاصلاز آنالیز طیفسنج مرئی-فرابنفش با شدت جذب کمتر به معنای تشکیل تعداد کمتر نانوذرات در طول فرآیند است (23)، بنابراین تشکیل تعداد بسیار کم از نانوذرات طلا بهدلیل استفاده از رقت کم عصاره به عنوان عامل کاهنده در این غلظت تایید شد. با افزایش غلظت عصاره اناریجه تا غلظت 5/1 mg/ml ، در محلول واکنش، حداکثر طولموج جذبی در محدودهی 500 تا 550 نانومتر مشاهده شد. بهطوریکه شدت پیک ایجاد شده برای نانوذرات طلای تولید شده در غلظت mg/ml 5/0 از عصاره، دارای پهنای نسبتاً کم است و با افزایش غلظت عصاره به mg/ml 75/0 و 1، شدت پیک بلندتری در طولموج 530 نانومتر، کاهش بیشتر پهنای زیر نمودار و متقارنتر شدن پیک مشاهده شد. افزایش شدت پیک نشان دهنده تولید نانوذرات بیشتر در محلول است. در ادامه این مطالعه، با افزایش بیشتر غلظت عصاره در مطالعه حاضر به mg/ml 2 و بیشتر از آن، با کاهش جذب و افزایش پهنای زیر نمودار همراه است، جابهجایی به سمت طول موجهای بلندتر حاصل بهدلیل به وجود آمدن تعدادی نانوذرات طلای تجمع یافته است که افزایش اندازه در تعدادی از نانوذرات طلا را به همراه دارد (24). بهینهترین غلظت از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا در این آزمایش مقدار mg/ml 75/0 و 1 بهدست آمد. زیرا حداکثر شدت پیک جذبی تشکیل شده در نمودار مرئی-فرابنفش برای نانوذرات تولید شده با استفاده از این غلظتها در طولموجهای پایینتر، همراه با پیک قلهایتر و مساحت زیر نمودار متقارنتر ظاهر شد. این نتیجه بیان کنندهی آن است که توزیع اندازه نانوذرات تولید شده در این غلظت از عصاره نسبت به سایر غلظتها بازده بیشتری دارد و دارای پلیدیسپرسیتی کمتر است.
شکل 1: طیف رنگی ایجاد شده توسط نانوذرات طلای تولید شده بهوسیلهی غلظتهای مختلف از عصاره اناریجه؛ تغییر رنگ a؛ b؛ c؛ d؛ e؛ f؛ g؛ h؛ به ترتیب در غلظت های mg/dl 3، 2، 1.5، 1.25، 1، 0.75، 0.5، 0.2 از عصاره آبی اناریجه ایجاد شد. از سمت چپ به راست با افزایش غلظت عصاره، رنگ نانوذرات طلای تشکیل شده از زرد کمرنگ به آبی متمایل به طوسی، قرمز و سپس بنفش بهدلیل تغییر در اندازه و خاصیت SPR نانوذرات، تغییر نمود.
نتایج حاصل از تفرق نور پویا نانوذرات طلای احیا شده توسط عصاره گیاه اناریجه
طبق نتایج بهدست آمده، با افزایش غلظت عصاره اضافه شده، میانگین اندازه در نانوذرات طلای تولید شده، افزایش یافت. نتایج بهدست آمده از آنالیز DLS کاملا با نمودار طیفسنجی مرئی-فرابنفش همخوانی دارد (شکل 3). یکیاز راههای سنجش پایداری نانوذرات تولید شده، بررسی پتاسیلزتای نانوذرات است. هرچه میزان قدرمطلق عدد حاصله بیشتر باشد، کلوئیدها پایدارترند و در نتیجه نانوذرات میل به تجمع و رسوب و مدت طولانیتری پایدار باقی میمانند. در این پژوهش بهجز در حالت استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصارهی اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا، سایر غلظتها دارای نانوذرات طلا پایداری بودند اما نانوذرات تولید شده با استفاده از غلظت mg/ml 1 از عصاره با داشتن پتانسیلزتای برابر با 61- میلیولت، دارای پایداری بسیار بالایی است (جدول 2).
نمونههایی که توزیع اندازه مناسب داشته باشند PDI آنها برابر با 1/0 تا 2/0 میباشد و عددهای بالاتر از این مقدار نشاندهندهی وجود عدم یکنواختی اندازه در یک کلوئید است. با مقایسه نمودارها و PDI بهدست آمده برای هر کلوئید توسط دستگاه DLS، این نتیجه گرفتهشد که در همه نمودارها به جز در نمودار d، توزیع اندازه نانوذرات دارای پلیدیسپرسیتی بسیار بالایی است. اما در نمودار d توزیع اندازه نانوذرات طلا نسبت به سایرین یکنواختتر است و دارای پلیدیسپرسیتی کمتری میباشد و میزان 7/0 برای آن گزارش شده است. نتیجهگیری نهایی حاصلاز مطالعات بر روی دادههای دستگاه DLS در این پژوهش به اینصورت است که نانوذرات تولید شده با استفاده از mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه، بهدلیل پایداری بیشتر (پتانسیلزتا برابر با منفی 61 میلیولت) و پلیدیسپرسیتی کمتر (برابر با 7/0) با میانگین اندازه 26 نانومتر بهعنوان غلظت بهینه از عصاره برای سنتز نانوذرات طلا در مراحل بعدی در این تحقیق تعیین شد.
جدول 2 : خلاصهای از نتایج حاصل از بررسی نانوذرات با استفاده از دستگاه DLS
|
shape |
The concentration of the extract used ( mg/ml) |
Average size of gold nanoparticles |
PDI |
Zeta potential (mV) |
Stability |
|
a |
0.2 |
14 |
8.46 |
13- |
Low stable |
|
b |
0.5 |
16 |
8.94 |
36- |
stable |
|
c |
0.75 |
24 |
2.60 |
39- |
stable |
|
d |
1 |
26 |
0.78 |
61- |
Very stable |
|
e |
1.25 |
37 |
2.30 |
41- |
stable |
|
f |
1.5 |
39 |
3.09 |
40- |
stable |
|
g |
2 |
96 |
1.82 |
37- |
stable |
|
h |
3 |
151 |
1.86 |
37- |
stable |
شکل 3. نمودار DLS حاصل از نانوذرات طلای تشکیل شده بهوسیلهی غلظتهای مختلف از عصاره آبی گیاه اناریجه؛ نمودار a (نانوذرات تولید شده بهوسیلهی mg/ml 2/0 از عصاره آبی اناریجه)، b ( mg/ml 5/0 )، c (mg/ml 75/0)، d (mg/ml 1)، e (mg/ml 25/1)، f (mg/ml 5/1)، g (mg/ml 2) و h (mg/ml 3) را نشان میدهد.
شکل 4، نشان داد که با اضافه کردن mg/ml 1 از عصاره به مخلوط واکنش، نانوذرات طلا تشکیل شده کروی شکل ایجاد شده است و دارای میانگین سایز تقریبا 20 نانومتر همراه با مقداری پراکندگی سایز میباشند. دادههای شکل 5، باتوجه به نتایج حاصل از SEM توسط نرمافزار digimizer بهدست آمده است و نشان دهندهی فراوانی و میانگین سایز نانوذرات طلا میباشد. میانگین اندازه نانوذرات طلای تولید شده با استفادهاز عصاره آبی گیاه اناریجه حدود 20 نانومتر بهدست آمد. که با نتایج حاصل از DLS همخوانی دارد.
شکل 4: تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانوذرات طلای سنتز شده با استفادهاز غلظت mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه؛ نانوذرات طلا دارای شکل کروی با میانگین اندازه حدود 20 نانومتر همراه با پلیدیسپرسیتی برابر 7/0 میباشند.
شکل 5: منحنی توزیع اندازه نانوذرات طلا حاصلاز آنالیز تصاویر SEM ؛ این نمودار توسط نرمافزار Digimizer رسم شده است.
برای مشخص نمودن گروههای عاملی غالب موجود در عصاره گیاه اناریجه و همچنین بررسی و تعیین گروههای عاملی از عصاره که در احیای یونهای طلا به اتمهای طلا و ایجاد پایداری آنها در کلوئید نقش داشتهاند از طیفسنج FTIR استفاده شد. نتایج بهدست آمده بهطور خلاصه در شکل 6و7 نشان داده شده است. به کمک مراجع موجود برای تفسیر نمودار FTIR میتوان طیف بهدست آمده را بررسی نمود و به شناسایی گروههای عاملی موجود در عصاره پرداخت. باتوجه به نمودار 3-6، طیف FTIR عصاره را قبل از احیا نمک طلا نشان میدهد که هر باند ایجاد شده در آن نشاندهنده وجود گروههای عاملی خاصی در عصاره است. جذب شدید در ناحیه 1-cm 3422، به نوسانات کششی گروه عاملی هیدروکسیل ( O-H ) مربوط میشود. جذب در 1-cm 2959، بیان کنندهی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره آسیل است بنابراین به وجود لیپیدهای موجود در عصاره اشاره دارد. جذب در ناحیه 1-cm 2930، نیز میتواند بیانکنندهی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی و لیپیدهای موجود در عصاره باشد و یا به آمینهای نوع دوم ( N-H ) که در پروتئینهای گیاه وجود دارد، مرتبط باشد. جذب در ناحیهی 1- cm1727، مربوطبه گروههای کربونیل (کشش (CO است. بنابراین اثبات کنندهی وجود گروههای کربونیل ساده مانند کربوکسیل و کتون در عصاره اناریجه هستند. تشکیل باند قوی در ناحیه 1-cm 1605 از FTIR عصاره اناریجه، مربوط به آمید I (N-H) است که در پروتئینهای عصاره گیاه اناریجه وجود دارد. همچنین میتواند نشان دهندهی وجود گروههای عاملی کربوکسیلات نیز باشد. جذب در 1-cm 1390، به وجود کربوکسیلات و یا گروههای فنولی حاوی پیوند O-H اشاره دارد، همچنین میتواند به ارتعاشات کششی C-N در آمینهای آلیفاتیک مربوط باشد. جذب در ناحیه 1-cm 1277، مربوط به وجود پروتئینها در عصاره میباشد. جذب در مجموعه پیکهای 1-cm 1126، 1074 و 987، به باند C-H اشاره دارد که میتواند مربوط به کربوهیدراتها و لیپیدهای عصاره باشد و یا به ارتعاشات کششی C-N در آمینهای آلیفاتیک یا الکلها و یا فنولها مربوط باشد. جذب در 1-cm 653 و 617، بیان کنندهی وجود گروههای C-H (استیلن یا آلکین)، ترکیبات الکلی (O-H) و یا ترکیبات دیسولفید (C-S) در عصاره است. برای یافتن گروههای عاملی شرکتکننده در احیای نانوذرات و شناسایی عوامل پوششدهنده آنها، آنالیز FTIR بر روی نانوذرات طلای سنتز شده نیز انجام شد (شکل7).
با استفاده از مقایسه دو طیف ایجاد شده در آنالیز FTIR مربوط به عصاره آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده، کم یا زیاد شدن شدت بعضیاز از جذبها و همچنین حذف یا بهوجود آمدن بعضی جذبهای دیگر مشاهده شد (شکل 8). با مقایسهی هر دو طیف FTIR تشخیص داده شدکه با تغییرات گروه COOH به OH، جذب قوی در ناحیه 1-cm 3432 و 1-cm 646 ظاهر شده است. پیک قوی در 1-cm 1637 احتمال زیاد به نشستن گروههای کربوکسیل و یا بهطورکلی گروههای کربونیل ساده و پروتئینها ( گروههای آمیدی ) برسطح نانوذرات است. مقایسه دوطیف بهدست آمده، نشان دهندهی مشارکت ترکیبات فنولی، لیپیدها، پروتئینها و ترکیبات دارای گروههای کربوکسیلات موجود در عصاره آبی گیاه اناریجه در احیا و سنتز نانوذرات طلا و پایداری آنها است.
شکل 6: نمودار FTIR عصاره آبی گیاه اناریجه؛ این نمودار نشان دهندهی پیکهای جذبی FTIR برای عصاره آبی گیاه اناریجه در نواحی مشخص شده است.
با مقایسهی دوطیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده (شکل 8)، میتوان نتیجه گرفت که با تغییرات گروه COOH به OH، پیک قوی در ناحیه 1-cm 3432 ظاهر شده است که نشان دهندهی کاهش یونهای طلا به کمک پروتئینها و کربوکسیلیک اسیدها و ترکیباتفنولی موجود در عصاره است، به علاوه گروههای OH برای پایداری نانوذرات طلا روی آنها قرار گرفته اند. همچنین وجود ترکیبات حاوی کربوکسیلیک اسید و آمینهای آزاد حاصل از پروتئینهای عصاره بر روی نانوذرات طلا باعث پایداری نانوذرات بهمدت طولانی شدند (25). بهطورکلی با بررسیهای انجام شده میتوان نتیجه گرفت که طیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات سنتز شده بهوسیلهی آن، بیشتر به وجود گروههای هیدروکسیل و آمیدی و کربونیل اشاره دارد که مربوط به ترکیبات فنولی و الکلی فراوان و پروتئینها و کربوهیدراتها و لیپیدها در عصاره است که نشان میدهد ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و آمیدی موجب احیا نمک طلا و پروتئینها و گلیکوزیدها و لیپیدها باعث پایداری نانوذرات طلا شده اند. همچنین، با مقایسه نتایج حاصلاز GC/MS و FTIR عصارهی گیاه اناریجه، وجود ترکیبات دارای گروههای عاملی شناسایی شده قابل قبول است.
از آنجایی که ترکیبات آنتیاکسیدانت و ضد سرطان بسیاری در عصاره گیاه وجود دارد و همین ترکیبات بیشترین سهم را در تولید نانوذرات طلا و پایداری آنها دارند، اثر سمیت سلولی نانوذرات طلا و عصاره آبی گیاه اناریجه با استفاده از روش MTT روی سلولهای سرطانی رده MCF-7 مربوط به سرطان پستان در انسان مورد ارزیابی قرار گرفتهشد. در این آزمایش از عصاره آبی گیاه اناریجه با غلظت mg/ml 1 و همچنین نانوذرات طلای سنتز شده با غلظت mg/ml 1/0 استفاده شده است. به منظور مقایسهی اثر سمیت عصاره آبی گیاه اناریجه بهتنهایی و نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیلهی غلظت mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه که ناشی از ترکیبات آنتیاکسیدان موجود در عصاره و سطح نانوذرات است از غلظتهای مشابه برای مقایسهی آنها استفاده شده است. همچنین سه چاهک پلیت برای بیشترین غلظت از نمک طلا ( یونهای طلا ) تعبیه شد تا اثر نمک طلا بر سلولها مورد بررسی قرار گیرد. خوانش نمونههای تیمار شده پساز مدت زمان تیمار 24، 48 و 72 ساعت، توسط دستگاه الایزا انجام شد و درصد زندهمانی سلولهای MCF-7 مورد ارزیابی قرار گرفته شد. در شکل 9، گذر میزان درصد زندهمانی سلولها، از مقدار کنترل، در غلظتهای کم از عصاره و نانوذرات، تحریک رشد و افزایش تعداد سلولها در هنگام تیمار سلولهای مورد نظر با غلظتهای µg/ml 250، 100، 50 طی 24 ساعت تیمار بهدست آمد اما کاهش درصد زندهمانی سلولها از مقدار کنترل در تیمار با غلظتهای بالا از عصاره و نانوذرات به وقوع پیوست. این نتیجه، در غلظتهای µg/ml 1000 و 500 از عصاره و نانوذرات طلا، به سمیت آنها بر روی سلولهای MCF-7 اشاره دارد و باعث توقف رشد یا کشته شدن سلولها شده است. در اغلب مواد آنتیاکسیدان و داروهای شیمیدرمانی نیز نتایج در غلظتهای کم و زیاد بدینصورت میباشد بهطوریکه غلظتهای کم از داروها و مواد آنتیاکسیدان باعث تحریک رشد سلولهای سرطانی میشود درحالیکه با افزایش غلظت آنها، اثر مهارکنندگی و توقف رشد را بر سلولهای سرطانی دارند (26). IC50 ( نیمه حداکثر غلطت بازدارندگی ) محاسبه شده برای عصاره µg/ml 2/627 و برای نانوذرات طلا µg/ml 5/710 بهدست آمد.
شکل 10، برای تیمار 48 ساعته همانند تیمار 24 ساعته، در غلظتهای پایین عصاره و نانوذرات افزایش رشد سلولها اتفاق افتاده است. اما با افزایش غلظت آنها مخصوصا افزایش غلظت نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیله عصاره آبی گیاه اناریجه، باعث توقف رشد سلولی و یا حذف سلولهای MCF-7 شده است. IC50 محاسبه شده برای عصاره µg/ml 3/ 631 و برای نانوذرات طلا µg/ml 2/384 طی 48 ساعت تیمار سلولی بهدست آمده است. این نتیجه نشان میدهد که افزایش غلظت نانوذرات طلا، سمیت قابل توجهی روی سلولهای MCF-7 طی تیمار 48 ساعت دارد. بهطوریکه با افزایش غلظت، درصد بقا سلولها بهشدت کاهش یافته است.
باتوجه به شکل 11، میتوان به این نتیجه رسید که اثر مطلوب سمیت عصاره به تنهایی و نانوذرات طلا روی سلولهای MCF-7 نسبت به تیمار در 48 ساعت تغییر چندانی نداشته است. IC50 محاسبه شده برای عصاره µg/ml 8/510 و برای نانوذرات طلا µg/ml 9/382 طی 72 ساعت بهدست آمده است. با بررسی هر سه زمان تیمار نتیجه گرفته شد که اثربخشترین زمان تیمار بهوسیلهی نانوذرات طلای سنتز شده و عصاره برای از بین بردن سلولهای سرطانی MCF-7، زمان 48 ساعت است، همچنین عملکرد نانوذرات طلا بهدلیل IC50 کمتر و در نتیجه نیاز به غلظت کمتر برای توقف رشد سلولهای سرطانی و یا حذف آنها نسبت به عصاره مناسبتر است.
شکل 9: نمودار درصد بقا سلولهای MCF-7 پساز 24 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه؛ درصد بقا سلولهای MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده بهوسیله عصاره گیاه اناریجه.
شکل 10: نمودار درصد بقا سلولهای MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه، درصد بقا سلولهای MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده بهوسیله عصاره گیاه اناریجه.
شکل 11: نمودار درصد بقا سلو های MCF-7 پس از 72 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه، درصد بقا سلولهای MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده بهوسیله عصاره گیاه اناریجه.
4- بحث
نانوذرات فلزی طلا بهدلیل داشتن خواص منحصربهفرد مانند سنتز آسان، نسبت سطح به جرم بالا، واکنش پذیری بالا و غیرسمی بودن در بسیاری از زمینهها از جمله برای درمان سرطان مورد استفاده قرار گرفته است (6, 7). در سالهای اخیر روش سنتز سبز و استفاده از گیاهان برای تولید نانوذرات فلزی بسیار مورد توجه قرار گرفته است که نسبت به روشهای دیگر ارزانتر، سادهتر و غیرسمی است (9). مقالهی حاضر شامل گزارش سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره آبی برگ و ساقه گیاه اناریجه ( Pimpinella affinis)، مشخصهیابی نانوذرات طلای سنتز شده و ارزیابی سمیت سلولی آنها بر رده سلول سرطانی MCF-7 است. همانطورکه گفته شد، تولید نانوذرات به این روش مقرونبهصرفه است و در زمان کوتاهی قابل انجام است. در این پژوهش، برای یافتن ترکیبات اساسی موجود در عصاره گیاه اناریجه، آنالیز GC/MS با استفادهاز عصاره گیاهی تهیه شده انجام شد. ترکیبات مهم شناساییشده شامل ترکیباتفنولی مانند اسکوپارون، ترکیبات فلاونوئیدی مانندDDMP ، مونوترپنها مانند p-cymene و مشتقات آن، ترکیبات آنتیاکسیدان مانند هیدروکوئینون و HTT، لیپیدها شامل لینولئیک اسید، استئاریک اسید و الئیک اسید و آلکالوئیدها مانند بتاکربولین میباشد. بهطورکلی عصاره برگ و ساقه گیاه اناریجه ( Pimpinella affinis ) باتوجه به متابولیتهای ثانویهای که دارد توانایی احیای یونهای طلا به نانوذرات طلا را دارد. از آنجایی که عوامل مختلف از جمله روش عصارهگیری، نوع حلال، موقعیت جغرافیایی و فصلی که گیاه تهیه شده است و خیلی از عوامل دیگر، در استخراج انواع ترکیبات و میزان استخراج ترکیبات از گیاهان تأثیر بسزایی دارد، در نتیجه ترکیبات بهدست آمده از عصاره گیاه اناریجه در این مقاله میتواند تا حدودی با نتایج حاصل از بررسیهای ترکیبات حاصل از آن در مقالات دیگر متفاوت باشد. اما بهطورکلی نتایج حاصل نشان میدهد، ترکیبات فنولی و آنتیاکسیدان فراوان در این گیاه وجود دارد. در مقالهای به وجود p-cymene و مشتقات آن و اکتادکانوئیک اسید در قسمتهای هوایی Pimpinella اشاره شده است (18). در مقالهای دیگر بیان شده است که Pimpinella affinis دارای ترکیبات مونوترپن زیادی مانند p-cymene و sesquiterpene میباشد (27). همچنین در مقالهای، ترکیبات فلاونوئیدی به عنوان ترکیبات موثر در ویژگیهای بیولوژیک گیاه اناریجه گزارش شده است (17).
طی تیمار نمک طلا با استفاده از غلظتهای مختلف عصاره آبی گیاه اناریجه در مشاهدات بصری، با افزایش غلظت عصاره در محلول واکنش تغییر رنگ کلوئید از زرد کمرنگ به آبی متمایل به طوسی، قرمز یاقوتی و بنفش اتفاق افتاد که باتوجه به گزارشاتی که از قبل توسط مقالات مختلف ثبت شده است، این تغییر رنگ نشان دهندهی کاهش یونهای طلا ( Au3+ ) به اتم طلا (Au0) و تشکیل نانوذرات طلا میباشد (22). همچنین در مقالهای دیگر، طی سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره برگ مگنولیا (Magnolia Kobus) در مشاهدات بصری، تغییر رنگ از بیرنگ به قرمز یاقوتی مشاهده شد. رنگ قرمز یاقوتی ایجاد شده ناشیاز ارتعاشات پلاسمون سطحی نانوذرات طلا است. کاهش یونهای طلا به نانوذرات طلا را میتوان در نتیجهی اضافهکردن عصاره به محلول واکنش و مشاهدهی تغییر رنگ محلول تشخیص داد و در ادامه این فرآیند اتفاق افتاده، با مطالعهی دادههای حاصل از طیفسنجی UV-Visible قابل بررسی و اثبات است (20). معمولاً برای بررسی خصوصیات اندازه نانوذرات از آنالیز طیف UV-Visible در محدودهی طولموج بین 200 تا 800 نانومتر استفاده میشود (13). ظهور پیک نمودار بین ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر در طیفسنج مرئی-فرابنفش بهدلیل پدیده رزونانسپلاسمونسطحی ناشیاز نوسانات جمعی الکترونها، تأییدکنندهی تشکیل نانوذرات طلا است که در بسیاری از مقالات گزارش شده است (13, 22, 28) و وابستگی زیادی به اندازه و شکل نانوذرات و همچنین محیط شیمیایی واکنش دارد (22). تغییر در هرکدام از این پارامترها منجر به جابهجایی در موقعیت پیک میشود. بنابراین یکی از راههای بهینهسازی پارامتر فرآیند واکنش برای بهدست آوردن حداکثر بازده از نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیلهی عصاره گیاهی، تعیین مقدار بهینه از عصاره مصرفی برای سنتز نانوذرات طلا میباشد (23). در این پژوهش، حداکثر طولموج جذبی نانوذرات طلا سنتز شده در غلظتهای مختلف از عصاره گیاه اناریجه بین 500 تا 600 نانومتر ظاهر شد و بدین صورت است که با استفاده از غلظتهای 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 ( mg/ml) از عصاره، حداکثر طولموج جذبی (lmax) برای نانوذرات طلای تولید شده بهترتیب از غلظت کم به زیاد عصاره 579، 532، 533، 533، 537، 537، 552 و 563 نانومتر و حداکثر میزان جذب آنها بهترتیب 544/0، 870/0، 992/0، 985/0، 954/0، 999/0، 936/0 و 735/0 بهدست آمد. باتوجه به مطالعات دیگر حداکثر طولموج جذبی حاصل از نانوذرات طلا در محدوده 500 تا 600 نانومتر ظاهر میشود (22). برای مثال در مقالات دیگر، حداکثر طول موج حاصل از سنتز نانوذرات طلا بهوسیلهی عصارهی Pelargonium graveolens در محدوده ی 538 نانومتر و یا بهوسیله عصاره Punica granatum در 568 نانومتر قرار دارد (13). این نتایج کاملا اثبات کنندهی صحت نتایج حاصلاز مقالهی حاضر میباشد. باتوجه به نتایج حاصلاز تولید نانوذرات طلا بهوسیلهی غلظتهای مختلف عصاره گیاه اناریجه، تشکیل رنگهای مختلف در کلوئید و بررسی نتایج حاصلاز طیفسنج UV-Visible آنها بیانگر آن است که مقدار عصارهی گیاهی مصرف شده، نقش مهمی در اندازه و غلظت نانوذرات سنتز شده دارد. همانطور که گفته شد، مقدار عصاره اضافه شده، بهعلت تغییر در اندازه و نحوهی پراکندگی نانوذرات سنتز شده باعث تغییر در موقعیت حداکثر طولموج جذبی در طیفسنج UV-Visible میشود. پیش از این پژوهشهایی بر مبنای تأثیر حجم عصاره مصرفی بر نانوذرات تشکیل شده ثبت شده است. نتایج پژوهشها حاکی از آن است که حداکثر طول موج جذبی تشکیل شدهی حاصل از آنالیز طیفسنج UV-Visible با شدت جذب کمتر بهمعنای تشکیل تعداد کمتر نانوذرات در طول فرآیند کاهش است و بالعکس، هرچه میزان جذب آن بیشتر باشد به معنای آن است که بازده سنتز نانوذرات بیشتر است. با افزایش غلظت عصاره تشکیل نانوذرات طلا سرعت میبخشد و کاهش غلظت آن، منجر به پراکندگی نانوذرات و ایجاد پیک وسیع در طول موجهای بیشتر میشود. افزایش رقت عصاره باعث تولید نانوذرات با ایجاد پیک قلهایتر میشود. این تفاسیر در مقالات مختلف از جمله در سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاه Hibiscus sabdariffa نیز صدق میکند (23).
در مقاله حاضر، با افزایش غلظت عصاره از مقدار mg/ml 5/0 به بالا، در محلول واکنش، در حداکثرطولموج جذبی نانوذرات طلای تولید شده red shift اتفاق افتاد و به سمت طول موجهای بیشتر جابهجا شد. این رویداد، نشان دهندهی افزایش در اندازه نانوذرات طلای تولید شده میباشد و با نتایج مطالعات نیومن منطبق است (28). در نمودار ایجاد شده از بررسی طیفسنج UV-Visible برای نانوذرات طلای تولید شده در غلظت mg/ml 2/0 از عصاره، پیک وسیع ایجاد شد و در مشاهدات بصری نیز تغییر رنگ کلوئید به آبی متمایلبه طوسی مشاهده شد که با پیکهای دیگر ایجاد شده در غلظتهای بالاتر از عصاره متفاوت بود. این رویداد نشان دهندهی تشکیل تعداد بسیار کم از نانوذرات طلا بهدلیل استفاده از رقت کم عصاره به عنوان عامل کاهنده میباشد. با افزایش غلظت عصاره اناریجه تا غلظت mg/ml 5/1، در محلول واکنش، بهعلت افزایش غلظت عصاره در محلول، شدت پیک نمودار یا شدت جذب در حداکثر طولموج جذبی در نمودار افزایش یافت. همچنین بهعلت جابهجایی حداکثر طولموج جذبی به سمت طول موجهای بلندتر و وقوع Red shift، افزایش در اندازهی نانوذرات طلا دیده شد و در غلظتهای بالاتر از عصاره (mg/ml 2 و 3)، ایجاد پیک با مساحت زیر نمودار وسیعتر و جابهجایی به سمت طولموجهای بزرگتر بهعلت وجود مقدار کمی نانوذرات تجمع یافته، ایجاد شد (24). حداکثر شدت پیک جذبی تشکیل شده در نمودار UV-Visible برای نانوذرات تولید شده با استفاده از غلظتهای mg/ml 75/0 و 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه، در طولموجهای پایینتر، همراه با پیک قلهایتر و مساحت زیر نمودار متقارنتر ظاهر شد. این نتیجه بیان کنندهی آن است که توزیع اندازه نانوذرات تولید شده در این غلظت از عصاره نسبت به سایر غلظتها مناسبتر و دارای پلیدیسپرسیتی کمتر است. همچنین بازده سنتز نانوذرات طلا با استفاده از این غلظت عصاره بیشتر از سایر غلظتها میباشد. بنابراین بهینهترین غلظت از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا در این آزمایش مقدار mg/ml 75/0 و 1 بهدست آمد. برای تأیید این تفاسیر بهدست آمده در پژوهش حاضر، به بررسی نتایج حاصل از مقالات دیگر پرداخته شد. در مقالهای بیان شده است که از کیتوزان ( دومین پلی ساکارید در طبیعت ) برای سنتز نانوذرات طلا استفاده شده است. با افزایش غلظت کیتوزان، تغییر رنگ محلول از صورتی به قرمز یاقوتی اتفاق افتاد و حداکثر طیف جذبی حاصل از نوسان پلاسمون سطحی نانوذرات در محدوده بین ۵۲۰ تا ۵۳۰ نانومتر ظاهر شد و نشان داده شد که با افزایش غلظت کیتوزان، شدت نوار پلاسمون سطحی نیز افزایش مییابد. همچنین ارتباط بین اندازهی نانوذرات و بیشینه طول موج جذبی در این مطالعه بررسی شده است و نشان داده است که افزایش غلظت کیتوزان از میزان 1/0%، 2/0%، 3/0%، 4/0% و 5/0% به ترتیب از راست به چپ دارای حداکثر جذب در طولموجهای 526، 526، 525، 524 و 525 نانومتر میباشد. با افزایش غلظت کیتوزان، شدت حداکثر پیک جذبی ایجاد شده افزایش مییابد و به سمت طولموجهای پایینتر جابهجا میشود و این نشان دهندهی کاهش اندازه نانوذرات تشکیل شده میباشد (28) در پژوهشی دیگر، طیف UV-Visible محلول کلوئیدی با استفاده از عصاره گیاه Hibiscus cannabinus برای سنتز نانوذرات طلا به دست آمد و با اضافه کردن مقدارهای مختلف 5، 10، 20 و 30 میلی لیتر از عصاره در محلول نمک طلا پس از 90 دقیقه، واکنش مورد بررسی قرار گرفت و این نتیجه گرفته شد که افزایش مقدار عصاره در محلول واکنش باعث جابهجایی پیک نمودار به سمت طول موجهای طولانیتر و ایجاد منحنی زیر نمودار باریکتر میشود (13).
پس از بررسی آنالیز طیف سنج UV-Visible، برای یافتن غلظت بهینه از عصاره و همچنین بررسی توزیع اندازه و میزان پایداری نانوذرات تولید شده بااستفاده از غلظتهای مختلف از عصاره گیاه اناریجه، به بررسی آنالیز حاصل DLS پرداخته شد. طبق نتایج به دست آمده، با افزایش غلظت عصاره، میانگین اندازه در نانوذرات طلای تولید شده، افزایش یافت. نتایج به دست آمده از آنالیز DLS کاملا با طیفهای بهدست آمده بهوسیلهی UV-Visible مطابقت داشت. بررسی دادههای حاصل از DLS، نشان داد که اندازه نانوذرات طلا تولید شده در غلظت mg/ml 1 از عصاره نسبت به سایر غلظتها بهترین نتیجه با پلیدیسپرسیتی کمتر را دارد و غلظت mg/ml 1 از عصاره به عنوان غلظت بهینه عصاره برای سنتز نانوذرات طلا در مراحل بعدی تعیین شد. نتایج حاصل از DLS در مقالهای که به بررسی و تعیین ویژگی نانوذرات طلای سنتزشده با استفادهاز چهار عصاره گیاهی Pelargonium graveolens، Punica granatum، Lippia citriodora وSalvia officinalis پرداخته است، نشان میدهد که نانوذرات سنتز شده با استفاده از P.graveolens، L.citriodora و S.fficinalis دارای محدوده اندازه 1 تا 8 نانومتر هستند درحالیکه نانوذرات سنتز شده بهوسیله عصاره P.granatum در محدوده ۳۰ تا 70 نانومتر میباشند. این نتایج بهدست آمده تأیید کنندهی نتایج حاصلاز طیف مرئی-فرابنفش آنها است. زیرا حداکثر طولموج جذبی سه نمونه اول به ترتیب در محدوده 538، 536 و 535 نانومتر ظاهر شد که نشان دهندهی ایجاد نانوذرات کوچکتر است و حداکثر طولموج حاصل از نانوذرات سنتز شده با استفادهاز عصاره گیاه P.granatum در طولموج 568 نانومتر ظاهر شد. طولموج بالاتر نشان دهنده ایجاد نانوذرات با اندازهی بزرگتر میباشد (29). یکیاز راههای سنجش پایداری نانوذرات تولید شده، بررسی پتاسیل زتای به دست آمده با استفادهاز دستگاه زتاسایزر است و طبق آن، هرچه میزان قدرمطلق عدد حاصله بیشتر باشد، کلوئیدها پایدارترند و در نتیجه نانوذرات میل به تجمع و رسوب و مدت طولانیتری پایدار باقی میمانند. در این مقاله بهجز در حالت استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصارهی اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا، سایر غلظتها با توجه به عدد پتاسیلزتا بهدست آمده، دارای نانوذرات پایداری بودند اما نانوذرات تولید شده با استفادهاز غلظت mg/ml 1 از عصاره با داشتن پتانسیل زتای برابر با 61- میلیولت، دارای پایداری بسیار بالایی است. در مقالهای که بر روی مقایسه سنتز نانوذرات طلا با استفاده از چهار گیاه مختلف مطالعه داشت، نانوذرات تهیه شده در تمام نمونهها دارای پتانسیلزتا منفی بود و در محدوده 10- تا 30- میلیولت بهدست آمد. بدینصورتکه نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیله عصاره گیاهان Pelargonium graveolens، Lippia citriodora وSalvia officinalis بهترتیب دارای پتانسیلزتا 23-، 17- و 20- میلیولت بودند که نزدیک به هم است، درحالیکه پتانسیل زتای عصاره گیاه P.granatum مقدار کمتری را نشان داد و برابر با 12- میلیولت بود که مطابق با نتایج میانگین قطر ذرات است و از ثبات کمتری برخوردار است و بنابراین تمایل بیشتری برای تجمع و تشکیل ذرات بزرگتر دارد (29).
برای شناسایی و تعیین مورفولوژی نانوذرات طلای سنتز شده، از غلظت بهینه عصاره آبی گیاه اناریجه برابر با mg/ml 1 و تحلیل نتایج حاصل از دستگاه SEM استفاده شد. بررسیهای حاصلاز SEM نشان داد که نانوذرات طلای سنتز شده بهصورت کروی با میانگین اندازه 20 نانومتر هستند و مقدار کمی پلیدیسپرسیتی دارند. میانگین اندازهی بهدست آمده کاملا با نتیجهی حاصل از DLS نمونه مطابقت دارد. SEM، قطر متوسط نانوذرات در یک تصویر را از روی ویژگیهای هندسی نانوذرات (مساحت، محیط و میانگین اندازه ) محاسبه میکند و امکان نمونه برداری از نانوذرات بدون مواد آلی اطراف آن را فراهم میکند. بنابراین اندازه بهدست آمده در آن همان اندازه اصلی نانوذرات است (29). نانوذرات طلا که با روش شیمیایی و سنتز سبز سنتز میشوند عمدتاً کروی هستند که در بسیاری از مقالات حاصل از سنتز سبز نانوذرات طلا اثبات شده است (20). بهدلیل اندازهگیری نانوذرات همراه با شعاع هیدرودینامیکی آنها در روش DLS، اندازه نانوذرات اندازهگیری شده به روش DLS میتواند تا 3/1 برابر اندازه قطر اصلی نانوذرات که بهروش SEM اندازهگیری میشوند، باشد. در مقالهای نیز نانوذرات نقره سنتز شده با روش DLS دارای اندازه متوسط ۷۸ نانومتر اندازهگیری شدند درحالیکه در روش میکروسکوپ الکترونی اندازه متوسط 60 نانومتر اندازهگیری شد و اختلاف اندازهی آنها نیز 3/1 به دست آمد که این نتایج کاملا با مشاهدات دیگر همخوانی دارد (24).
برای یافتن گروههای عاملی موجود در عصاره که در احیای نانوذرات طلا و پایداری آنها نقش داشتند، بر روی عصاره و نانوذرات طلای سنتز شده آنالیز FTIR انجام شد. نتابج حاصلاز مطالعات FTIR عصاره گیاه اناریجه و نانوذرات طلا تشکیل شده بهوسیله آن، نشان داد که وجود باند قوی در ناحیه 1-cm 3422، به نوسانات کششی گروه عاملی هیدروکسیل مربوط میشود. باند قوی در حوالی این ناحیه در بسیاریاز گیاهان دیگر از جمله گیاه M.kobus و R.rugosa تشکیل شده است که بهوجود ترکیباتفنولی و الکلهای آزاد در عصاره گیاه اشاره دارند (9, 20). جذب در ناحیه1-cm 2959، بیانکنندهی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی است بنابراین به وجود لیپیدهای موجود در عصاره اشاره دارد. جذب در ناحیهی 1-cm 2930، نیز میتواند بیانکنندهی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی و لیپیدهای موجود در عصاره باشد و یا به آمینهای نوع دوم (N-H) که در پروتئینهای گیاه وجود دارد، مرتبط باشد. این محدوده از پیکهای جذبی ایجادشده در آنالیز FTIR در نانوذرات سنتز شده با عصاره گیاه C.guianensis نیز وجود دارد (7). جذب در ناحیهی 1- cm1727، مربوط به گروههای کربونیل (کشش (CO است. بنابراین اثبات کنندهی وجود گروههای کربونیل ساده مانند کربوکسیل و کتون در عصاره اناریجه هستند. وجود این باند جذبی در مقالات دیگر نیز گزارش شده است ازجمله در مطالعهی سنتز نانوذرات با استفادهاز عصاره برگ Rosa rugosa به عنوان عامل کاهنده، باند قوی ایجادشده در 1-cm 1708 نشاندهندهی وجود کربوکسیلات در این گیاه میباشد که ممکن است مسئول کاهش یونهای فلزی به نانوذرات فلزی باشند. همچنین در مقالهای که به بررسی سنتز نانوذرات طلا با استفادهاز عصاره برگ Magnolia Kobus پرداخته شده است، وجود باند در ناحیهی 1-cm 1736 اشاره به وجود گروههای کربنیل در عصارهی گیاهی دارد (9, 20). تشکیل باند قوی در ناحیه1-cm 1605 از FTIR عصاره اناریجه، مربوط به آمید I (N-H) است که در پروتئینهای عصاره گیاه اناریجه وجود دارد. همچنین میتواند نشاندهندهی وجود گروههای عاملی کربوکسیلات نیز باشد. در گیاه R.rugosaو مگنولیا نیز تشکیل باند نزدیک به ناحیهی ذکر شده، به وجود گروههای آمین اشاره دارد (9, 20). جذب در ناحیهی 1-cm 1390، بهوجود کربوکسیلات و یا گروههای فنولی حاوی پیوند O-H اشاره دارد، همچنین میتواند به ارتعاشات کششی C-N در آمینهای آلیفاتیک مربوط باشد. جذب در این ناحیه در عصارهی حاصلاز گلهای C.guianensis نیز به چشم میخورد (7). جذب در ناحیه 1-cm 1277، مربوط به وجود پروتئینها در عصاره میباشد. جذب در مجموعه پیکهای 1-cm 1126، 1074 و 987، به باند C-H اشاره دارد که میتواند مربوط به کربوهیدراتهای عصاره باشد و یا به ارتعاشات کششی C-N در آمینهای آلیفاتیک یا الکلها و یا فنولها مربوط باشد. در FTIR حاصل از عصاره برگ R.rugosa نیز بیانشده که وجود باند در 1-cm ۱۰۴۱ نشان دهندهی وجود گروههای هیدروکسیلی ( آب و یا الکل آزاد ) میباشد (9). بهعلاوه در عصارهی گلهای C.guianensis نیز وجود باند در 1 -cm 1073 به آمینهای آلیفاتیک و وجود الکلها و فنولها اشاره دارد (7). در مقالهای دیگر نیز که مربوط به طیف FTIR حاصل از عصاره Centella asiatica است، ایجاد پیک در 1 -cm 1130 به وجود فنلها اشاره نموده است (25). جذب در 653 و 617 ( cm-1 )، بیان کنندهی وجود گروههای C-H (استیلن یا آلکین)، ترکیبات الکلی (O-H) و یا ترکیبات دیسولفید (C-S) در عصاره است.
در مقاله حاضر، با مقایسهی دوطیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده، میتوان نتیجه گرفت که با تغییرات گروه COOH به OH، پیک قوی در ناحیهیcm-1 3432 ظاهر شده است که نشان دهندهی کاهش یونهای طلا به کمک پروتئینها و کربوکسیلیک اسیدها و ترکیبات فنولی موجود در عصاره است، بهعلاوه گروههای OH برای پایداری نانوذرات طلا روی آنها قرار گرفته اند. این نتایج با نتایج حاصل از مطالعات نانوذرات با استفادهاز C.guianensis مطابقت دارد (7). همچنین وجود ترکیبات حاوی کربوکسیلیک اسید و آمینهای آزاد حاصل از پروتئینهای عصاره بر روی نانوذرات طلا باعث پایداری نانوذرات بهمدت طولانی شدند (25). بهطورکلی با بررسیهای انجام شده میتوان نتیجه گرفت که طیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات سنتز شده بهوسیلهی آن، بیشتر به وجود گروههای هیدروکسیل و آمیدی و کربونیل اشاره دارد که مربوط به ترکیبات فنولی و الکلی فراوان و پروتئینها و کربوهیدراتها و لیپیدها در عصاره است که نشان میدهد ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و آمیدی موجب احیا نمک طلا و پروتئینها و گلیکوزیدها و لیپیدها باعث پایداری نانوذرات طلا شده اند.
در نهایت، برای ارزیابی سمیت سلولی نانوذرات سنتز شده از روش MTT استفاده شد. نتایج حاصل از سمیت سلولی بهروش MTT برای عصاره آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلای سنتز شده بهوسیلهی عصاره آبی گیاه اناریجه نشان داد که عصاره و نانوذرات حاصل از آن، سمیت مطلوبی روی سلولهای سرطانی MCF-7 دارند و مناسبترین زمان اثربخشی آنها زمان تیمار در 48 ساعت بهدست آمد که طی آن، عملکرد نانوذرات طلا بهدلیل IC50 برابر با µg/ml 2/384 و در نتیجه نیاز به غلظت کمتر، برای متوقف کردن سلولهای سرطانی نسبت به عصاره با IC50 برابر با µg/ml 3/631 بیشتر و بهتر است. ارزیابی زنده ماندن سلولها بعد از تیمار با مادهی مورد نظر با استفاده از روش MTT در بسیاری از آنالیزها مورد استفاده قرار میگیرد. مانند مقالهای که اثرات نانوذرات سنتز شده بهوسیله عصاره C.guianensis را مورد بررسی قرار داد و اثبات کرد که نانوذرات در این مقاله دارای سمیت سلولی قابل توجه علیه سلولهای سرطانی HL60 دارند. بنابراین میتوان اینگونه نتیجه گرفت که متوقف کردن رشد سلول و یا کشتن سلول میتواند مکانیسم احتمالی ناشی از اثر سمیت نانوذرات طلای سنتز شده بهروش سبز باشد (7) همچنین بررسیها نشان میدهد که علت گذر میزان درصد زندهمانی سلولها، از مقدار کنترل، در برخی غلظتهای دارو در آنالیز MTT آن است که، بسیاری از داروهای ضدسرطان در غلظتهای کم برای سلولهای سرطانی نقش تغذیهای دارند و باعث افزایش رشد آنها میشوند. در نتیجه نمودار زندهمانی حاصل از آنها از میزان کنترل آنها افزایش مییابد، در صورتی که همان دارو در غلظتهای بالا به سلولهای سرطانی شوک وارد میکند و اثر سمیت سلولی دارد و در نهایت باعث توقف رشد و یا حذف سلولهای سرطانی میشود (26).
5- نتیجهگیری
امروزه یکی از چالشهای بزرگ بشر، یافتن راهی مناسب برای درمان بیماری سرطان است. فناوری نانو در سالهای اخیر توجه بسیاری را به خود جلب کرده است و در بسیاری از تحقیقات به مطالعه بر روی گیاهان برای یافتن راهی مؤثر برای درمان قطعی سرطان و بررسی مکانیسمهای مولکولی که توسط آن یک عامل باعث ایجاد سمیتسلولی در سلولهای سرطانی میشود، پرداخته شده است. استفاده از گیاهان در سنتزسبز یکی از روشهای سریع، ارزان و سالم برای دستیابی به نانوذرات مطلوب است. در این مطالعه، تشکیل نانوذرات طلا چند دقیقه پساز تیمار HAuCl4.3H2O با غلظتهای مختلف عصاره آبی برگ و ساقه گیاه اناریجه با نام علمی Pimpinella affinis به عنوان عامل احیاکننده و پایدارکننده، همراه با تغییر رنگ به سمت قرمز یاقوتی اتفاق افتاد. برای مشخصهیابی نانوذرات طلای سنتز شده از روش طیفسنجی مرئی-فرابنفش، دستگاه تفرق نور پویا، میکروسکوپالکترونیروبشی، تبدیل فوریه مادون قرمز استفاده شد. بررسی نتایج طیفسنجیUV-Visible و DLS، نشان داد که نانوذرات طلای سنتز شده با استفادهاز غلظت یک mg/ml از عصاره دارای حداکثر طولموججذبی nm 533 میانگین اندازه 26 نانومتر و پتانسیل زتا منفی 61 میلیولت بودند که اشاره به پایداری مطلوب آنها دارد و آن غلظت از عصاره به عنوان غلظت بهینه درنظر گرفته شد. تصاویر SEM نشان داد که نانوذرات طلا دارای شکل کروی همراه با پلیدیسپرسیتی برابر 7/0 بودند. نتایج حاصل از FTIR، نشان داد که ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و ترپنها بیشترین نقش را در احیا نمک طلا و پایداری نانوذرات طلا ایفا میکنند. پساز تهیه عصاره اناریجه مقداریاز آن برای تعیین ترکیبات عصاره با دستگاه GC/MS مورد بررسی قرار گرفته شد. ترکیبات اساسی شناساییشده در عصاره توسط روش GC/MS بهطورکلی ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی، ترپن ها، گلیکوزیدها و لیپیدها بهدست آمد که با نتایج حاصل از FTIR همخوانی دارد. در نهایت برای بررسی اثرات سمیتسلولی نانوذرات طلا و عصاره گیاه از روش رنگسنجی MTT بر روی رده سلولی MCF-7همراه با تیمارهای 24، 48 و 72 ساعت صورت گرفت. با بررسی دادهها این نتیجه حاصل شد که نانوذرات طلا سنتز شده بهوسیله عصاره گیاه اناریجه دارای سمیت بیشتری علیه سلولهای MCF-7 نسبت به عصاره گیاه بود. همچنین زمان تیمار ۴۸ ساعت برای سلولها در آنالیز MTT، به عنوان زمان بهینه برای سمیت نانوذرات طلا همراه با IC50 برابر با µg/ml 2/384 بهدست آمد. با استفاده از یافتههای فوق میتوان به این نتیجه رسید که گیاه اناریجه بهعلت داشتن خاصیت درمانی ضد سرطانی بالقوه و بومی کشور ایران بودن، یکی از گزینههای مناسب برای سنتز نانوذرات طلا باشد و میتوان با مطالعات و اصلاح سازیهای بیشتر بر روی نانوذرات سنتز شده با استفادهاز این گیاه، آنرا بهعنوان یکی از روشهای کارآمد به منظور رسیدنبه هدف درمان مناسب برای بیماری سرطان پستان در نظر گرفت. بنابراین، پژوهش حاضر میتواند بینش ارزشمندی در توسعه نانودرمانها برای یافتن راهی مؤثر و غیرسمی برای درمان سرطان مخصوصا سرطان پستان ارائه دهد.
-
