فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد، بیوشیمی، علوم‌پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 هیأت‌علمی، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم‌پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

چکیده

هدف: فناوری­نانو تأثیر به­سزایی در درمان بیماری سرطان دارد. روش­های ساخت نانوذرات به کمک مواد زیستی که به­آن­ها سنتز سبز می­گویند به­دلیل ارزان­تر و غیر­سمی بودن نسبت به سایر روش­ها برای سنتز نانوذرات برتری دارند. مواد و روش­ها: در این مطالعه، پس از تیمار محلول HAuCl4 با غلظت­های مختلف عصاره­ی­ آبی برگ و ساقه­ی گیاه اناریجه با نام علمی Pimpinella affinis، نانوذرات طلا تشکیل شدند. برای مشخصه­یابی نانوذرات طلای سنتز شده از  طیف­سنجی UV-Visible، دستگاه DLS، SEM و FTIR و همچنین از دستگاه GC/MS برای تعیین ترکیبات عصاره استفاده­ شد. آثار سمیت سلولی نانوذرات طلا و عصاره­ی گیاهی با استفاده از رنگ­سنجیMTT بر روی رده­سلولی MCF-7 همراه با تیمارهای 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: نانوذرات طلای سنتز شده با استفاده از غلظت 1 mg/ml از عصاره به عنوان غلظت بهینه در نظر گرفته­ شد که دارای میانگین اندازه 20 نانومتر و پتانسیل­زتا 61- میلی­ولت بودند. نانوذرات طلا دارای شکل کروی همراه با چندپراکندگی برابر 7/0 بودند و ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و ترپن­ها بیشترین نقش را در تشکیل و پایداری نانوذرات طلا ایفا نمودند. ترکیبات اساسی شناسایی ­شده در عصاره توسط روش GC/MS شامل ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و ترپن­ها بود. در روش MTT، برتری سمیت­سلولی نانوذرات طلا علیه سلول­های MCF-7 نسبت ­به عصاره و زمان تیمار ۴۸ ساعت، همراه با IC50 برابر با µg/ml 2/384 به­دست آمد. نتیجه­گیری: یافته­های فوق نشان می دهد که استفاده­ از گیاه اناریجه در ساخت نانوذرات طلا می­تواند برای درمان سرطان پستان مؤثر واقع شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Green Synthesis of Gold Nanoparticles Using Pimpinella affinis Leaf and Stem Extracts and Evaluation of Their Cytotoxic Effects Against Human Breast Cancer Cells Under In-vitro Condition

نویسندگان [English]

  • K Esmailpour 1
  • , M Shourian 2

1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Guilan, Rasht, 4199613776, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Guilan, Rasht, 4199613776, Iran

چکیده [English]

Aim: Nowadays, one of the great challenges of mankind is to find a suitable way for the treatment of cancer. Recent developments show that nanotechnology has a significant impact on the prevention, diagnosis and treatment of cancer. In nanotechnology, there are different physical and chemical methods to produce nanoparticles but mostly chemical methods are used. The nanoparticles produced using these methods are harmful to health due to the absorption of chemical species on their surface. In order to eliminate this big problem, biological methods such as the use of fungi, bacteria and plants have replaced other methods for the synthesis of nanoparticles which is called green synthesis. It is cheaper, simpler and non-toxic than other methods. The use of plants for the synthesis of nanoparticles has become more important than other biological methods due to the elimination of the difficult step of cell culture maintenance.
Material and Methods: In this study, gold nanoparticles were formed after treating the HAuCl4 solution with the aqueous extract of Anarijeh plant with the scientific name Pimpinella affinis. In this research, different amounts of aqueous extracts of leaves and stems of Pimpinella affinis were used for the synthesis of gold nanoparticles. UV-Visible spectroscopy and DLS methods were used to evaluate nanoparticles and determine their average size and stability. Also, SEM method was used to investigate their morphology. FTIR method was used to determine the functional groups of the aqueous extract and synthesized gold nanoparticles; in addition GC/MS device was used to determine the composition of the extract. Finally, MTT analysis was used to investigate the cytotoxic effects of nanoparticles on MCF-7 cell line along with treatments of 24, 48 and 72 hours.
Results: The results of the analysis were showed that the optimal concentration of the Pimpinella affinis extract for the synthesis of gold nanoparticles is 1 mg/ml. The synthesized gold nanoparticles using the mentioned concentration of the extract have an average size of 20 nanometers with a zeta potential of -61 mV which has the best stability. They had a spherical shape with a polydispersity equal to 0.7. The results of FTIR analysis show the presence of hydroxyl, simple carbonyl groups and hydrocarbon functional groups in the compounds of the extract. Experiments showed that phenolic and carboxylic compounds play the most important role in the reduction of gold salt. Also, proteins and lipids have made gold nanoparticles stable. The essential compounds identified in the extract by GC/MS method include Phenolic and flavonoid compounds and terpenes which are confirmed by the FTIR spectrum. The treatment time of 48 hours for MCF-7 cell line is the best time for the toxicity of nanoparticles with IC50 equal to 384.2 µg/ml, which was determined by MTT analysis.
Conclusion: According to the above findings, it can be concluded that Pimpinella affinis is one of the suitable options for the synthesis of gold nanoparticles, and it can be done with more studies on nanoparticles synthesized using this plant, considered it as one of the efficient methods to achieve the goal of proper treatment for breast cancer.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Breast cancer
  • Gold nanoparticle
  • Green synthesis
  • Pimpinella affinis
  • MCF-7 cell line

مقدمه

سرطان یک بیماری مخرب است که مرگ و میر سالانه آن در حال افزایش است و درمان آن جزء یکی از بزرگ­ترین چالش‌ها برای بشر می­باشد (1). از بین انواع سرطان­ها، سرطان پستان شایع‫ترین سرطان در بین زنان و دومین علت اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان است (2). تا به امروز شایع­ترین درمان‌های سرطان محدود به شیمی­درمانی، پرتو­درمانی و جراحی است که علی­رغم پیشرفت­های زیادی که داشته­اند، درمان سرطان هنوز دارای معایب بزرگی است. مهم­ترین مضراتی که در درمان­های کنونی سرطان با آن روبه­رو هستیم شامل: غلظت ناکافی داروها برای وارد شدن به محل تومور، توزیع عمومی و غیر اختصاصی عوامل ضد­توموری در بدن، آسیب به بافت­های سالم، سمیت عمومی و عوارض جانبی طولانی مدت است. در مجموع، همه این عوامل کاربرد بالینی روش­های ذکر­شده را محدود می­سازد، بنابراین به روش­های درمانی کارآمدتر و مناسب­تری برای درمان سرطان در انسان نیاز است (1, 3). مسئله کلیدی در درمان سرطان، دست­یابی به غلظت مناسب عامل درمانی در محل­های تومور با هدف از بین­بردن سلول­های سرطانی و در عین­ حال به حداقل رساندن آسیب به سلول­های طبیعی است که در این راستا نانو­فناوری سرطان، انقلابی جدید برای درمان سرطان به­وجود آورده است. فناوری نانو شامل دست­کاری و ایجاد مواد در مقیاس نانو برای تولید محصولات با خواص جدید است. پیشرفت­های اخیر نشان می‌دهد که فناوری نانو تاثیر به­سزایی در پیشگیری، تشخیص و درمان بیماری سرطان خواهد داشت (3). خروجی اصلی فناوری نانو، توسعه مواد جدید در مقیاس نانومتر از جمله نانوذرات است. نانوذرات، ذراتی با اندازه­های کمتر از میکرون و معمولا بین 10 تا 100 نانومتر هستند. عملکرد نانوذرات هم به مقادیر قابل اندازه­گیری آن­ها مانند جرم، حجم و بار الکتریکی و هم به ویژگی­های درونی آن­ها مانند واکنش­پذیری بستگی دارد (4). از خواص عمده نانوذرات می­توان به داشتن تنوع زیاد، ویژگی­های سطحی منحصر به فرد، واکنش پذیری بسیار بالا، حلالیت بالا، سمیت کم، دسترسی زیستی و استفاده از روش­های سریع­تر و ارزان­تر برای تولید آن­ها اشاره نمود. استفاده از نانوذرات راه­کاری قانع کننده برای حذف تدریجی سلول­های سرطانی بدون آسیب جدی به سلول­های طبیعی را فراهم می­کند (5, 6). نانوذرات می­توانند ذرات فلزی و غیرفلزی باشند. نانوذرات فلزی دارای اشکال هندسی مختلف هستند اما معمولاً به‫صورت کروی هستند و در حالت یونی، سیستم­های کلوئیدی را تشکیل می­دهند (4). از بین نانوذرات مختلف، نانوذرات فلزی طلا (GNPs  ) به‫دلیل داشتن خواص منحصر به فرد مانند ضریب جذب قوی فتوالکتریک، سهولت در سنتز، نسبت سطح به جرم بالا، عدد اتمی بالا (Z=79  )، فعالیت بالای نانوذرات طلا و تمایل زیاد آن­ها به اتصال به بیومولکول­ها و ماکرومولکو­ل­ها، به‫طور خاص در بسیاری از زمینه­ها از جمله در درمان سرطان مورد استفاده قرار می­گیرد (6, 7). برای تولید نانوذرات به‫طور­کلی روش­های مختلف فیزیکی و شیمیایی وجود دارد و به دو نوع اصلی روش­های پایین به بالا ( bottom up methods ) و روش­های بالا به پایین ( top-down methods ) دسته بندی می­شوند. مشکل اصلی روش بالا به پایین، تغییر در شیمی سطح و خواص فیزیکو­شیمیایی نانوذرات است و نانوذرات با کیفیت مناسب سنتز نمی­شود و به‫طور کلی اکثر روش­های سنتز نانوذرات، پیچیده و زمان­بر می­باشند. علاوه­براین، سنتز نانوذرات طلا با روش­های شیمیایی به‫علت جذب گونه­های شیمیایی بر روی سطح نانوذرات ممکن است اثرات نامطلوب زیستی ایجاد کند و در نهایت برای سلامتی مضر باشد. اما سنتز نانوذرات با استفاده از میکروارگانیسم­ها یا گیاهان که در دسته­ی سنتز نانوذرات به روش پایین به بالا قرار دارند به‫طور بالقوه می­توانند این مشکلات را مرتفع سازند (8). در سال­های اخیر از گیاهان، جلبک­ها، قارچ­ها، باکتری­ها برای تولید نانوذرات فلزی استفاده شده است که به آن سنتز سبز می گویند و نسبت­به سایر روش­ها، ارزان­تر، ساده­تر و غیر­سمی است (9, 10). در میان موجودات زنده مختلف که مورد مطالعه قرار می‌گیرد، گیاهان در سنتز نانوذرات فلزی به‫دلیل مزیتی که نسبت به سایر فرآیندهای بیولوژیکی دارند از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند و آن مزیت، حذف مرحله پیچیده نگه‫داری کشت سلولی است. همچنین سنتز نانوذرات با استفاده از گیاهان به‫دلیل سادگی، عدم بیماری­زایی و سازگاری با محیط زیست اهمیت زیادی پیدا کرده است (8). علاوه بر آن وجود ترکیبات گیاهی در نانوذرات باعث جلوگیری از اثرات مخرب عوامل محیطی مانند نوسان pH، حمله آنزیمی و تخریب بیوشیمیایی احتمالی می­شود. از طرفی شواهد نشان می‌دهد که ترکیبات ساختاری متنوعی که از گیاهان به‫دست می‌آید قادر به پیشگیری و درمان سرطان است. فعالیت درمانی این عوامل به کلاس‌های ساختاری مختلفی از جمله آلکالوئیدها، ترپنوئید­ها، ترکیبات گوگردی ارگانو و پلی­فنول­ها تعلق دارد. از رایج­ترین پلی­فنول­های طبیعی می­توان به اسیدهای فولیک و فلاونوئیدها اشاره نمود. فلاونوئیدها حدود دو سوم ترکیبات پلی­فنولی را تشکیل می‌دهند. طیف وسیعی از خواص ضد­توموری به این عوامل مشتق شده از گیاهان نسبت داده شده است و شامل خواص آنتی­اکسیدانی، ضد­ تکثیر، ضد حساسیت، ضد فعالیت­های متاستاتیک و ضدالتهاب می­شوند. از طرفی بیشتر داروهای شیمی­درمانی که در­حال­حاضر در محیط­های بالینی مورد استفاده قرار می­گیرد، محصولات طبیعی یا مشتقات نیمه­سنتزی این ترکیبات موجود در گیاهان است اما علی­رغم فواید مهم آن­ها برای سلامتی، اثربخشی محصولات طبیعی به‫دلیل حلالیت کم در آب، جذب کم، دسترسی کم و ماندگاری کوتاه­مدت در سیستم بیولوژیکی تضعیف می­شود و برای از بین بردن این ضعف­ها از نانو فرمولاسیون به عنوان حامل دارو برای درمان استفاده می­شود. در نتیجه، ادغام گیاه‌درمانی و فناوری­نانو در هدف­های درمان بالینی می­تواند پاسخ دارویی و نتیجه بالینی بهتری را برای بیماران به ارمغان آورد (1, 11). تاکنون سنتز نانوذرات طلا با استفاده از گیاهان متعددی در خارج و داخل ایران انجام شده است ازجمله: سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاهان Magnolia Kobus، Hibiscus، Punica granatum، coriander، Pelargoniumgraveolens، Nasturtium nasturtium و میوه Sambucus ebulus که تعدادی از آن­ها از نظر خواص ضد­سرطانی نانوذرات طلای سنتز شده مورد بررسی قرار گرفته­ شده است (12, 13) مانند سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره Couroupita guianensis، Curcumae Kwangsiensis و چغندر (7, 14, 15).

در این پژوهش از عصاره ساقه و برگ گیاه  Pimpinella affinis با نام محلی اناریجه برای سنتز سبز نانوذرات طلا  استفاده شده است. P.affinis یکی از گونه­های مهم خانواده Apiaceae است. گیاهی معطر، دو ساله با ارتفاع ۲۰ تا ۱۱۰ سانتی متر با گل آذین­های سفید و میوه­های بیضی شکل که در مناطق مختلف ترکمن، ایران، افغانستان، عراق، سوریه و فلسطین رشد می­کند و در ایران به‫صورت وحشی بیشتر در مناطق شمالی با هوای سرد پراکنده است (16). از این گیاه در طب عامیانه ایران به‫عنوان مسکن، مدر، اشتها آور، آرام­بخش، ضد اسپاسم، ضد میکروب، ضد قارچ، آنتی اکسیدانت و افزایش دهنده شیر مادر مورد استفاده قرار می‌گیرد (17). بنابراین یکی­از دلایل گزینش گیاه مذکور، بومی بودن آن است، از طرفی تا آن­جایی‫که می‫دانیم توجه بسیار کمی به کاربردهای بالینی نانوذرات سنتز شده به‫وسیله این گیاه مخصوصا در درمان سرطان شده است و در این زمینه روی گیاه مذکور مطالعات چندانی صورت نگرفته است. علاوه ­بر­این اناریجه گیاهی دارویی است و در طب سنتی ایران کاربرد فراوان دارد. این گیاه دارای منابع ارزشمندی ازمتابولیت­های ثانویه مختلف است (18). متابولیت­های ثانویه به­خصوص ترکیبات فنولی موجود در آن، خاصیت آنتی­اکسیدانتی فوق العاده­ای دارند و به همین علت این گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. به‫علت داشتن خاصیت آنتی­اکسیدانتی قوی، عصاره­ی گیاه اناریجه با احیای نمک طلا می­تواند نانوذرات کاربردی با اندازه مناسب را تولید کند و نیز به‫علت قرارگیری عوامل آنتی­اکسیدانت گیاه برروی نانوذرات طلای سنتز شده، می­تواند به‫صورت غیر مستقیم اثر سمیت­سلولی روی سلول­های سرطانی داشته باشد. در نتیجه عصاره آبی  P.affinis می‌تواند با سنتز و تثبیت نانوذرات طلا، برای اصلاح­سازی نانوداروهای ضدسرطان و در نهایت در تولید دارویی موثر برای درمان سرطان کمک کننده باشد. بنابراین به‫علت شیوع فراوان و روز افزون سرطان مخصوصا سرطان پستان بر آن شدیم تا در این پژوهش، نانوذرات طلا بر پایه عصاره آبی ساقه و برگ گیاه اناریجه را ساخته و به بررسی خصوصیات و ویژگی­های نانوذرات طلا سنتز شده بپردازیم و اثرات سمیت آن­ها را بر روی رده سلولی MCF-7 در سرطان پستان مورد بررسی قرار دهیم. در این پژوهش، پس از عصاره­گیری از گیاه اناریجه، برای شناسایی ترکیبات درون عصاره از دستگاه  GC/MSاستفاده شده است. سپس برای تعیین خصوصیات نانوذرات سنتز شده از روش­های طیف سنجی فرابنفش-مرئی (UV-Visible)، دستگاه تفرق نور پویا (DLS)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و طیف سنج فوریه مادون قرمز ( FTIR ) استفاده شده است و در نهایت از غلظت بهینه­ی نانوذرات طلای سنتز شده برای بررسی سمیت­سلولی آن­ها بر روی رده­ سلول­های سرطانی MCF-7 در سرطان پستان در انسان به‫وسیله آزمایشMTT assay  با تیمارهای 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفته شد.

 

2- مواد و روش­ها

 تهیه عصاره آبی گیاه اناریجه: ساقه و برگ گیاه P.affinis از منطقه رحیم­آباد در شهرستان رودسر واقع در استان گیلان تهیه شدند. پس­از آن، نمونه­های جمع آوری شده کاملا با آب شهری شستشو داده شدند و در محیط سایه، زمان داده شد تا کاملا خشک شوند. پس از خشک شدن، گیاه توسط آسیاب خانگی به‫صورت پودر تهیه شد. برای تهیه عصاره، ابتدا مقدار 5/2 گرم از پودر برگ و ساقه گیاه به ۲۵ میلی­لیتر آب دیونیزه در حال جوش اضافه شد و خروجی ارلن توسط فویل پوشانیده شد. نمونه به‫مدت ۳۰ دقیقه در دمای جوش باقی ­ماند. پس از سرد شدن نمونه، مخلوط حاصل دو بار از کاغذ صافی، به‫منظور حذف­کردن ذرات جامد موجود در نمونه و تهیه­ی یک عصاره با درصد­خلوص بالا و شفاف، عبور داده شد. عصاره حاصل در دمای 4 درجه سانتی­گراد به‫مدت حداکثر 4 روز و در دمای 18- درجه سانتی­گراد به‫مدت حداقل دو ماه پایدار باقی ماند.

 سنتز سبز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاهی: برای سنتز سبز نانوذرات طلا  با استفاده از عصاره­ آبی گیاه اناریجه تهیه شده به‫عنوان کاهنده و پایدارکننده، از هشت غلظت متوالی 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 (mg/ml) به‫منظور تعیین غلظت بهینه­ی عصاره برای سنتز نانوذرات طلا پایدار با اندازه­های مناسب استفاده شد. حجم نهایی برای محلول واکنش 10 میلی­لیتر درنظر گرفته شد و برای رقیق­سازی و غلظت­سازی عصاره، از آب دیونیزه استفاده شد. روند آزمایش به­این­صورت است که ابتدا مقدار آب دیونیزه مدنظر درون ویال­ها ریخته شد و سپس ویال­ها روی گرمکن همزن­دار مغناطیسی قرار داده شد و با تنظیم دور 600 (RPM) به دمای ۷۰ درجه سانتی­گراد رسانیده شد. سپس معادل یک میلی­گرم نمک طلا به هر یک از ویال­ها اضافه­شد و پس­از گذشت 2 دقیقه، به هر یک از ویال­ها مقدار مشخص شده از عصاره­ی آبی اناریجه به آرامی افزوده شد (19)، پس از گذشت 90 دقیقه با بررسی تغییر رنگ در هر یک از ویال­ها به تعیین و بررسی تولید نانوذرات پرداخته شد.

 تعیین مشخصات نانوذرات طلای سنتز شده: ابتدا برای تایید سنتز نانوذرات طلای سنتز شده و تعیین ویژگی آن­ها از دستگاه طیف سنج UV-Visible موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه گیلان استفاده شد. جذب نانوذرات طلا در ناحیه مرئی حدود 500-600 نانومتر است (20)، برای بررسی کامل جذب و تغییرات آن، نانوذرات طلای سنتز شده در طیف­های جذبی بین محدوده طول­موج ۴۰۰ تا ۸۰۰ نانومتر مورد بررسی قرار گرفته­شد. درصورت عمل‫کرد مناسب عصاره آبی P.affinis و توانایی آن در احیای یون­های طلا و تبدیل آن به نانوذرات طلا در این محدوده، طیف جذبی حاصل از رزونانس­پلاسمون­سطحی (LSPR) نانوذرات طلا سنتز شده قابل­ مشاهده خواهد بود. با­مقایسه­ی طیف­جذبی نانوذرات طلا ایجاد شده به­وسیله­ی غلظت­های مختلف­ از عصاره،  اندازه، غلظت و میزان توزیع نانوذرات طلای تولید شده مورد مقایسه قرار گرفته شد و غلظت بهینه عصاره برای سنتز نانوذرات طلا به­دست آمد. به­منظور تعیین میانگین اندازه، نحوه توزیع و میزان پایداری نانوذرات طلای سنتز شده از دستگاه اندازه­گیری پتانسیل­زتا یا تفرق دینامیک نور (DLS) موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه گیلان استفاده شد. این دستگاه علاوه بر اندازه­گیری اندازه نانوذرات موجود در کلوئید و تعیین میانگین اندازه نانوذرات، شاخص عدم تجانس (PDI) را هم برای هر نمونه اندازه­گیری می­کند که نشان­دهنده میزان یکنواختی یا عدم یکنواختی اندازه نانوذرات در یک کلوئید است (21). با استفاده از اندازه­گیری مقدار پتاسیل­زتا نیز به تعیین میزان پایداری نانوذرات سنتز شده پرداخته شد.

برای تعیین مورفولوژی نانوذرات طلای سنتز شده با استفاده­از غلظت بهینه به­دست آمده از عصاره، از میکروسکوپ­الکترونی­روبشی (SEM) متعلق به دانشکده­فنی دانشگاه تهران، انستیتو نفت تهران استفاده شد. برای شناسایی گروه­های عاملی موجود در عصاره که در فرآیند احیای یون­های طلا به نانوذرات طلا نقش ایفا نموده­اند و همچنین گروه­هایی که نانوذرات طلای سنتز شده را پوشش داده­اند و باعث پایداری آن­ها شده­اند از طیف سنج FTIR موجود در آزمایشگاه شیمی دانشکده علوم­پایه در دانشگاه گیلان استفاده شد. برای آنالیز FTIR، نانوذرات طلای تازه سنتز شده با استفاده از غلظت بهینه عصاره با دور RPM 8000 و به‫مدت 10 دقیقه در 4 درجه­سانتی­گراد، سانتریفوژ شدند و با اضافه کردن آب دیونیزه به رسوب حاصل حاوی نانوذرات طلا، سوسپانسیون جدید تهیه شد. سپس جهت آماده­سازی و خشک­کردن نمونه­ها که شامل عصاره گیاهی و نانوذرات طلا سنتزشده به‫وسیله عصاره گیاهی است، از روش فریزدرای استفاده شد و آنالیز FTIR بر روی آن­ها انجام شد.

 سنجش سمیت سلولی: در این مطالعه به بررسی عمل‫کرد رده­سلولی MCF-7 ) خریداری شده از بانک سلولی پاستور( مربوط به سرطان پستان در انسان، نسبت به عصاره آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده با­ استفاده­از این عصاره پرداخته شد. در مرحله اول، سلول­های MCF-7 درون چاهک کشت داده شدند و پلیت درون انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد همراه با CO2 5 درصد قرار داده شد. پس­از گذشت 24 ساعت، عصاره­ی آبی گیاه P.affinis و نانوذرات طلای سنتز شده به‫وسیله غلظت بهینه از عصاره در پنج رقت زنجیره­ای µg/ml 1000، 500، 250، 100، 50، 0 همراه با سه بار تکرار غلظت به چاهک­های دارای سلول اضافه شدند، همچنین سه چاهک پلیت برای بیشترین غلظت از نمک طلا ( HAuCl4.3H2O ) تعبیه شد تا اثر نمک طلا بر سلول­ها مورد بررسی قرار گیرد. تیمار در زمان­های مختلف 24، 48 و 72 ساعت صورت گرفت. پس از پایان زمان تیمار سلول­ها، آزمایش MTT انجام شد و نتایج تغییر رنگ نمونه­ها توسط دستگاه الایزا در طول­موج 570 نانومتر خوانش شد. برای بررسی درصد بقا (Viability) سلول­ها­ی MCF-7 تیمار شده با عصاره و نانوذرات طلا، از رابطه 1 استفاده شد.

(1)% Viability =     ×100                                                                                 

 

 

3- نتایج

 نتایج حاصل از کروماتوگرافی گازی/طیف­سنج جرمی

با استفاده از آنالیز GC/MS، ترکیبات موجود در عصاره گیاه اناریجه تعیین شد. باتوجه­ به جدول 1 که نشان­دهنده ترکیبات شناسایی­شده در آنالیز GC/MS است، ترکیبات غالب موجود در عصاره اناریجه شامل ترکیبات­فنولی مختلف، ترپن­ها، ترکیبات فلاونوئیدی، ترکیبات آلکالوئیدی، گلیکوزیدی و لیپیدی است که همگی آن­ها، مخصوصا ترکیبات­فنولی و آنتی­اکسیدانتی عصاره گیاه اناریجه در سنتز نانوذرات طلای پایدار مشارکت دارند.

 

Name

%

4H-pyran-4-one-2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl ( DDMP )

17.902

P-Cymene

10.535

Scoparone

6.836

Benzenemethanol,alpha,alpha,4-trimethyl

6.829

Tetrahydroquinoline

6.605

6-Hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a- tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one

( HTT )

6.302

Oleic acid

6.216

Benzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl)

6.089

Hydroquinone

5.987

Catechol

5.090

Acetic acid

4.048

N,N-Dimethylaminoethanol

3.965

Caffeine

3.562

Butyrolactone

3.388

2-Hydroxy-1-(1'-pyrrolidiyl)-1-buten-3-one

2.719

Linoelaidic acid

2.676

4-(2,6,6-trimethylcyclohexa-1,3-dienyl)but-3-en-2-one

2.169

2-Propenamide

1.465

3-methyl-4-phenyl-1H-pyrrole

0.892

Octadecanoic acid

0.781

9H-pyrido(3,4-b)indole

0.737

9-12 octadecadienoic acid(Z,Z)

0.730

Phenol

0.710

جدول 1: ترکیبات تشکیل دهنده عصاره گیاه اناریجه به­وسیله آنالیز GC/MS؛ ترتیب ترکیبات از بیشترین مقدار به کمترین مقدار طبقه بندی شده است.

 

ترکیبات شناسایی شده در این روش برای گیاه اناریجه طبق جدول1 بیان می­کند که بیشتر ترکیبات عصاره شامل ترکیبات فنولی مانند اسکوپارون، ترکیبات فلاونوئیدی مانندDDMP ، مونوترپن­ها مانند p-cymene و مشتقات آن، ترکیبات آنتی‫اکسیدانت مانند هیدروکوئینون و HTT، لیپیدها شامل لینولئیک­اسید، استئاریک­اسید و اولئیک­اسید و آلکالوئیدها مانند بتاکربولین می­باشد. به­طور­کلی عصاره برگ و ساقه گیاه P.affinis با توجه به متابولیت­های ثانویه­ موجود در آن، توانایی احیای یون­های طلا به نانوذرات طلا را دارد.

طیف­سنجی مرئی- فرابنفش از نانوذرات حاصل از سنتز سبز

به­منظور تعیین غلظت بهینه از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا، از غلظت­های مختلف عصاره استفاده شد. با افزایش غلظت عصاره آبی گیاه اناریجه از کمترین مقدار (mg/ml 2/0) تا بیشترین مقدار (mg/ml 3)، به ترتیب از a تا h، در دما­ی ثابت 70 درجه سانتی­گراد، دور ثابت RPM 600 و زمان­دهی ثابت 90 دقیقه، تغییر رنگ از زرد کم­رنگ به رنگ­های آبی متمایل به طوسی، قرمز یاقوتی، بنفش و سپس آبی متمایل­به طوسی مشاهده شد (شکل 1). تغییر رنگ به سمت قرمز یاقوتی نشان دهنده­ی کاهش یون­های طلا (Au3+) به اتم طلا (Au0) و تشکیل نانوذرات طلا می­باشد (22). که ناشی از ارتعاشات پلاسمون سطحی نانوذرات طلا است. بنابراین تغییر رنگ کلوئید به سمت قرمز و بنفش به عنوان شاهد اولیه تشکیل نانوذرات طلا می­باشد و در ادامه این فرآیند اتفاق افتاده با مطالعه­ی داده­های حاصل از طیف­سنجی مرئی-فرابنفش قابل بررسی است (20). حداکثر طول­موج جذبی نانوذرات طلا سنتز شده در غلظت­های مختلف از عصاره گیاه اناریجه بین 500 تا 600 نانومتر ظاهر شد ( شکل 2)، به­طوری­که با استفاده­از غلظت­های 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 (mg/ml) از عصاره، حداکثر طول­موج جذبی ( lmax ) برای نانوذرات طلای تولید شده به­ترتیب از غلظت کم به زیاد عصاره 579، 532، 533، 533، 537، 537، 552 و 563 نانومتر و حداکثر میزان جذب آن­ها به­ترتیب از راست به چپ 544/0، 870/0، 992/0، 985/0، 954/0، 999/0، 936/0 و 735/0 به دست آمد. با­توجه به نتایج حاصل­از تولید نانوذرات طلا به‫وسیله­ی غلظت­های مختلف عصاره گیاه اناریجه، تشکیل رنگ­های مختلف در کلوئید و بررسی نتایج حاصل­از طیف­سنج مرئی-فرابنفش آن­ها بیانگر آن است که مقدار عصاره­ی گیاهی مصرف شده، نقش مهمی در اندازه و غلظت نانوذرات سنتز شده و پراکندگی آن­ها دارد که باعث تغییر در موقعیت حداکثر طول­موج جذبی در طیف­سنج مرئی-فرابنفش می­شود. در نمودار ایجاد شده از بررسی طیف­سنج مرئی-فرابنفش برای نانوذرات طلای تولید شده در مطالعه حاضر (شکل 2)، با استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصاره منحنی با شدت­جذب کمتر و ایجاد پیک وسیع نسبت­به سایر نمونه­ها ایجاد شده است و در مشاهدات بصری نیز تغییر رنگ کلوئید به آبی متمایل­به طوسی مشاهده شد. نتایج پژوهش­ها حاکی­از آن است که حداکثر طول موج جذبی تشکیل شده­ی حاصل­از آنالیز طیف­سنج مرئی-فرابنفش با شدت جذب کمتر  به معنای تشکیل تعداد کمتر نانوذرات در­ طول فرآیند است (23)، بنابراین تشکیل تعداد بسیار کم از نانوذرات طلا به‫دلیل استفاده از رقت کم عصاره به عنوان عامل کاهنده در این غلظت تایید شد. با افزایش غلظت عصاره اناریجه تا غلظت 5/1 mg/ml ، در محلول واکنش، حداکثر طول­موج جذبی در محدوده­ی 500 تا 550 نانومتر مشاهده شد. به­طوری­که شدت پیک ایجاد شده برای نانوذرات طلای تولید شده در غلظت mg/ml 5/0 از عصاره، دارای پهنای نسبتاً کم است و با افزایش غلظت عصاره به mg/ml 75/0 و 1، شدت پیک بلندتری در طول­موج 530 نانومتر، کاهش بیشتر پهنای زیر نمودار و متقارن­تر شدن پیک مشاهده شد. افزایش شدت پیک نشان دهنده تولید نانوذرات بیشتر در محلول است. در ادامه این مطالعه، با افزایش بیشتر غلظت عصاره در مطالعه حاضر به mg/ml 2 و بیشتر­ از آن، با کاهش جذب و افزایش پهنای زیر نمودار همراه است، جابه­جایی به سمت طول موج­های بلندتر حاصل به‫دلیل به وجود آمدن تعدادی نانوذرات طلای تجمع یافته است که افزایش اندازه در تعدادی از نانوذرات طلا را به همراه دارد (24). بهینه­ترین غلظت از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا در این آزمایش مقدار mg/ml 75/0 و 1 به­دست آمد. زیرا حداکثر شدت پیک جذبی تشکیل شده در نمودار مرئی-فرابنفش برای نانوذرات تولید شده با استفاده از این غلظت­ها در طول­موج­های پایین­تر،  همراه با پیک قله­ای­تر و مساحت زیر نمودار متقارن­تر ظاهر شد. این نتیجه بیان کننده­ی آن است که توزیع اندازه نانوذرات تولید شده در این غلظت از عصاره نسبت به سایر غلظت­ها بازده بیشتری دارد و دارای پلی­دیسپرسیتی کمتر است.

 

 

شکل 1: طیف رنگی ایجاد شده توسط نانوذرات طلای تولید شده به‫وسیله­ی غلظت­های مختلف از عصاره اناریجه؛ تغییر رنگ a؛ b؛ c؛ d؛ e؛ f؛ g؛ h؛ به ترتیب در غلظت های mg/dl 3، 2، 1.5، 1.25، 1، 0.75، 0.5، 0.2 از عصاره آبی اناریجه ایجاد شد. از سمت چپ به راست با افزایش غلظت عصاره، رنگ نانوذرات طلای تشکیل شده از زرد کمرنگ به آبی متمایل به طوسی، قرمز و سپس بنفش به‫دلیل تغییر در اندازه و خاصیت SPR نانوذرات، تغییر نمود.

 

 

شکل 2:  طیف جذبی مرئی-فرابنفش  نانوذرات طلای تولید شده؛ در نتیجه­ی واکنش نمک طلا با غلظت­های مختلف از عصاره آبی برگ و ساقه­ی گیاه اناریجه پیک هایی در طول موج 600-500 نانومتر ایجاد شد.

 

نتایج حاصل از تفرق نور پویا نانوذرات طلای احیا شده توسط عصاره گیاه اناریجه

طبق نتایج به­دست آمده، با افزایش غلظت عصاره اضافه شده، میانگین اندازه در نانوذرات طلای تولید شده، افزایش یافت. نتایج به­دست آمده از آنالیز DLS کاملا با نمودار طیف­سنجی مرئی-فرابنفش هم­خوانی دارد (شکل 3). یکی­از راه­های سنجش پایداری نانوذرات تولید شده، بررسی پتاسیل­زتای نانوذرات است. هرچه میزان قدرمطلق عدد حاصله بیشتر باشد، کلوئید­ها پایدارترند و در نتیجه نانوذرات میل به تجمع و رسوب و مدت طولانی‌تری پایدار باقی می­مانند. در این پژوهش به­جز در حالت استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصاره­ی اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا­، سایر غلظت­ها دارای نانوذرات طلا پایداری بودند اما نانوذرات تولید شده با استفاده از غلظت mg/ml 1 از عصاره با داشتن پتانسیل­زتای برابر با 61- میلی­ولت، دارای پایداری بسیار بالایی است (جدول 2).

نمونه­هایی که توزیع اندازه مناسب داشته باشند PDI آن­ها برابر با 1/0 تا 2/0 می­باشد و عددهای بالاتر از این مقدار نشان­دهنده­ی وجود عدم یکنواختی اندازه در یک کلوئید است. با مقایسه نمودارها و PDI به­دست آمده برای هر کلوئید توسط دستگاه DLS، این نتیجه گرفته­شد که در همه نمودار­ها به جز در نمودار d، توزیع اندازه نانوذرات دارای پلی­دیسپرسیتی بسیار بالایی است. اما در نمودار d توزیع اندازه نانوذرات طلا نسبت به سایرین یکنواخت­تر است و دارای پلی­دیسپرسیتی کمتری می­باشد و میزان 7/0 برای آن گزارش شده است. نتیجه­گیری نهایی حاصل­از مطالعات بر روی داده­های دستگاه DLS در این پژوهش به این­صورت است که نانوذرات تولید شده با استفاده از mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه، به‫دلیل پایداری بیشتر (پتانسیل­زتا برابر با منفی 61 میلی­ولت) و پلی­دیسپرسیتی کمتر (برابر با 7/0) با میانگین اندازه 26 نانومتر به‫عنوان غلظت بهینه از عصاره برای سنتز نانوذرات طلا در مراحل بعدی در این تحقیق تعیین شد.

 

 

 

جدول 2 : خلاصه­ای از نتایج حاصل از بررسی نانوذرات با استفاده از دستگاه DLS

shape

The concentration of the extract used

(  mg/ml)

Average size of gold nanoparticles

PDI

Zeta potential

(mV)

Stability

a

0.2

14

8.46

13-

Low stable

b

0.5

16

8.94

36-

stable

c

0.75

24

2.60

39-

stable

d

1

26

0.78

61-

Very stable

e

1.25

37

2.30

41-

stable

f

1.5

39

3.09

40-

stable

g

2

96

1.82

37-

stable

h

3

151

1.86

37-

stable

 

 

 

 

 

شکل 3. نمودار DLS حاصل از نانوذرات طلای تشکیل شده به­وسیله­ی غلظت­های مختلف از عصاره آبی گیاه اناریجه؛ نمودار a (نانوذرات تولید شده به‫وسیله­ی mg/ml 2/0 از عصاره آبی اناریجه)، b ( mg/ml 5/0 )، c (mg/ml 75/0)، d (mg/ml 1)، e (mg/ml 25/1)، f (mg/ml 5/1)، g (mg/ml 2) و h (mg/ml 3)  را نشان می­دهد.

 نتایج میکروسکوپ الکترونی روبشی حاصل از نانوذرات سبز اناریجه

شکل 4، نشان داد که با اضافه کردن mg/ml 1 از عصاره به مخلوط واکنش، نانوذرات طلا تشکیل شده کروی شکل ایجاد شده است و دارای میانگین سایز تقریبا 20 نانومتر همراه با مقداری پراکندگی سایز می­باشند. داده­های شکل 5، با­توجه به نتایج حاصل از SEM توسط نرم­افزار digimizer به­دست آمده است و نشان دهنده­ی فراوانی و میانگین سایز نانوذرات طلا می­باشد. میانگین اندازه نانوذرات طلای تولید شده با استفاده­از عصاره آبی گیاه اناریجه حدود 20 نانومتر به­دست آمد. که با نتایج حاصل از DLS هم­خوانی دارد.

 

شکل 4: تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانوذرات طلای سنتز شده با استفاده­از غلظت mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه؛ نانوذرات طلا دارای شکل کروی با میانگین اندازه حدود 20 نانومتر همراه با پلی­دیسپرسیتی برابر 7/0 می­باشند.

 

 

شکل 5:  منحنی توزیع اندازه نانوذرات طلا حاصل­از آنالیز تصاویر SEM ؛ این نمودار توسط نرم­افزار Digimizer رسم شده است.

 

نتایج حاصل از طیف­سنج فوریه مادون قرمز

برای مشخص نمودن گروه­های عاملی غالب موجود در عصاره گیاه اناریجه و همچنین بررسی و تعیین گروه­های عاملی از عصاره که در احیای یون­های طلا به اتم­های طلا و ایجاد پایداری آن­ها در کلوئید نقش داشته­اند از طیف­سنج FTIR استفاده شد. نتایج به­دست آمده به‫طور خلاصه در شکل 6و7 نشان داده شده است. به کمک مراجع موجود برای تفسیر نمودار FTIR  می­توان طیف به­دست آمده را بررسی نمود و به شناسایی گروه­های عاملی موجود در عصاره پرداخت. باتوجه به نمودار 3-6، طیف FTIR عصاره را قبل از احیا نمک طلا نشان می­دهد که هر باند ایجاد شده در آن نشان­دهنده وجود گروه­های عاملی خاصی در عصاره است. جذب شدید در ناحیه­ 1-cm 3422، به نوسانات کششی گروه عاملی هیدروکسیل ( O-H ) مربوط می­شود. جذب در 1-cm 2959، بیان کننده­ی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره آسیل است بنابراین به وجود لیپید­های موجود در عصاره اشاره دارد. جذب در ناحیه­ 1-cm 2930، نیز می­تواند بیان­کننده­ی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی و لیپیدهای موجود در عصاره باشد و یا به آمین­های نوع دوم ( N-H ) که در پروتئین­های گیاه وجود دارد، مرتبط باشد. جذب در ناحیه­ی 1- cm1727، مربوط­به گروه­های کربونیل (کشش (CO است. بنابراین اثبات کننده­ی وجود گروه­های کربونیل ساده مانند کربوکسیل و کتون در عصاره اناریجه هستند. تشکیل باند قوی در ناحیه 1-cm 1605 از FTIR عصاره اناریجه، مربوط به آمید I (N-H) است که در پروتئین­های عصاره گیاه اناریجه وجود دارد. همچنین می­تواند نشان دهنده­ی وجود گروه­های عاملی کربوکسیلات نیز باشد. جذب در 1-cm 1390، به وجود کربوکسیلات و یا گروه­های فنولی حاوی پیوند O-H اشاره دارد، همچنین می­تواند به ارتعاشات کششی C-N در آمین­های آلیفاتیک مربوط باشد. جذب در ناحیه­ 1-cm 1277، مربوط به وجود پروتئین­ها در عصاره می­باشد. جذب در مجموعه پیک­های 1-cm 1126، 1074 و 987، به باند C-H اشاره دارد که می­تواند مربوط به کربوهیدرات­ها و لیپیدهای عصاره باشد و یا به ارتعاشات کششی C-N در آمین­های آلیفاتیک یا الکل­ها و یا فنول­ها مربوط باشد. جذب در 1-cm 653 و 617، بیان­ کننده­ی وجود گروه­های C-H (استیلن یا آلکین)، ترکیبات الکلی (O-H) و یا ترکیبات دی­سولفید (C-S) در عصاره است. برای یافتن گروه­های عاملی شرکت­کننده در احیای نانوذرات و شناسایی عوامل پوشش­دهنده آن­ها، آنالیز FTIR بر روی نانوذرات طلای سنتز شده نیز انجام شد (شکل7).

با استفاده از مقایسه دو طیف ایجاد­ شده در آنالیز FTIR مربوط ­به عصاره­ آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده، کم یا زیاد شدن شدت بعضی­از از جذب­ها و همچنین حذف یا به­وجود آمدن بعضی جذب­های دیگر مشاهده شد (شکل 8). با مقایسه­ی هر دو طیف FTIR تشخیص داده شدکه با تغییرات گروه COOH به OH، جذب قوی در ناحیه 1-cm  3432 و 1-cm  646 ظاهر شده است. پیک قوی در 1-cm 1637 احتمال زیاد به نشستن گروه­های کربوکسیل و یا به­طورکلی گروه­های کربونیل ساده و پروتئین­ها ( گروه­های آمیدی ) برسطح نانوذرات است. مقایسه دوطیف به­دست آمده، نشان دهنده­ی مشارکت ترکیبات فنولی، لیپیدها، پروتئین­ها و ترکیبات­ دارای گروه­های کربوکسیلات موجود در عصاره آبی گیاه اناریجه در احیا و سنتز نانوذرات طلا و پایداری آن­ها است.

 

شکل 6: نمودار FTIR عصاره آبی گیاه اناریجه؛ این نمودار نشان دهنده­ی پیک­های جذبی FTIR برای عصاره آبی گیاه اناریجه در نواحی مشخص شده است.

 

شکل 7:  نمودار FTIR نانوذرات طلا؛ نانوذرات طلای ظیف­سنجی شده، با استفاده از mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه تولید شده­اند.

 

 

 

شکل 8: ادغام دو نمودار FTIR عصاره و نانوذرات طلا، به منظور یافتن تغییرات قبل و پس از سنتز نانوذرات طلا

 

 با مقایسه­ی دوطیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده (شکل 8)، می­توان نتیجه گرفت که با تغییرات گروه COOH به OH، پیک قوی در ناحیه 1-cm ­3432 ظاهر شده است که نشان دهنده­ی کاهش یون­های طلا به کمک پروتئین­ها و کربوکسیلیک ­­اسیدها و ترکیبات­فنولی موجود در عصاره است، به علاوه گروه­های OH برای پایداری نانوذرات طلا روی آن­ها قرار گرفته­ اند. همچنین وجود ترکیبات حاوی کربوکسیلیک­ اسید و آمین­های آزاد حاصل از پروتئین­های عصاره بر روی نانوذرات طلا باعث پایداری نانوذرات به‫مدت طولانی شدند (25). به­طور­کلی با بررسی­های انجام شده می­توان نتیجه گرفت که طیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات سنتز شده به‫وسیله­ی آن، بیشتر به وجود گروه­های هیدروکسیل و آمیدی و کربونیل اشاره دارد که مربوط به ترکیبات فنولی و الکلی فراوان و  پروتئین­ها و کربوهیدرات­ها و لیپید­ها در عصاره است که نشان می­دهد ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و آمیدی موجب احیا نمک طلا و پروتئین­ها و گلیکوزید­ها و لیپیدها باعث پایداری نانوذرات طلا شده اند. همچنین، با مقایسه نتایج حاصل­از GC/MS و FTIR عصاره­ی گیاه اناریجه، وجود ترکیبات دارای گروه­های عاملی شناسایی شده قابل قبول است.

 نتایج آزمایش سمیت­ سلولی 

از آن­جایی که ترکیبات آنتی­اکسیدانت و ضد سرطان بسیاری در عصاره گیاه وجود دارد و همین ترکیبات بیشترین سهم را در تولید نانوذرات طلا و پایداری آن­ها دارند، اثر سمیت سلولی نانوذرات طلا و عصاره آبی گیاه اناریجه با استفاده از روش MTT روی سلول­های سرطانی رده MCF-7 مربوط به سرطان پستان در انسان مورد ارزیابی قرار گرفته­شد. در این آزمایش از عصاره آبی گیاه اناریجه با غلظت mg/ml 1 و همچنین نانوذرات طلا­ی سنتز شده با غلظت mg/ml 1/0 استفاده شده است. به منظور مقایسه­ی اثر سمیت عصاره آبی گیاه اناریجه به­تنهایی و نانوذرات طلای سنتز شده به­وسیله­ی غلظت mg/ml 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه که ناشی از ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره و سطح نانوذرات است از غلظت­های مشابه برای مقایسه­ی آن­ها استفاده شده است. همچنین سه چاهک پلیت برای بیشترین غلظت از نمک طلا ( یون­های طلا ) تعبیه شد تا اثر نمک طلا بر سلول­ها مورد بررسی قرار گیرد. خوانش نمونه­ها­ی تیمار شده پس­­از مدت زمان تیمار 24، 48 و 72 ساعت، توسط دستگاه الایزا انجام شد و درصد زنده­مانی سلول­های MCF-7 مورد ارزیابی قرار گرفته شد. در شکل 9، گذر میزان درصد زنده­مانی سلول­ها، از مقدار کنترل، در غلظت­های کم از عصاره و نانوذرات، تحریک رشد و افزایش تعداد سلول­ها در هنگام تیمار سلول­های مورد نظر با غلظت­های µg/ml 250، 100، 50 طی 24 ساعت تیمار به­دست آمد اما کاهش درصد زنده­مانی سلول­ها از مقدار کنترل در تیمار با غلظت­های بالا از عصاره و نانوذرات به وقوع پیوست. این نتیجه، در غلظت­های µg/ml 1000 و 500 از عصاره و نانوذرات طلا، به سمیت آن­ها بر روی سلول­های MCF-7  اشاره دارد و باعث توقف رشد یا کشته شدن سلول­ها شده است. در اغلب مواد آنتی­اکسیدان و داروهای شیمی­درمانی نیز نتایج در غلظت­های کم و زیاد بدین­صورت می­باشد به­طوری­که غلظت­های کم از داروها و مواد آنتی­اکسیدان باعث تحریک رشد سلول­های سرطانی می­شود درحالی­که با افزایش غلظت آن­ها، اثر مهارکنندگی و توقف رشد را بر سلول­های سرطانی دارند (26).  IC50 ( نیمه حداکثر غلطت بازدارندگی ) محاسبه شده برای عصاره µg/ml 2/627 و برای نانوذرات طلا µg/ml 5/710 به­دست آمد.

شکل 10، برای تیمار 48 ساعته همانند تیمار 24 ساعته، در غلظت­های پایین عصاره و نانوذرات افزایش رشد سلول­ها اتفاق افتاده است. اما با افزایش غلظت آن­ها مخصوصا افزایش غلظت نانوذرات طلای سنتز شده به­وسیله عصاره آبی گیاه اناریجه، باعث توقف رشد سلولی و یا حذف سلول­های MCF-7  شده است. IC50 محاسبه شده برای عصاره µg/ml 3/ 631 و برای نانوذرات طلا µg/ml 2/384 طی 48 ساعت تیمار سلولی به­دست آمده است. این نتیجه نشان می­دهد که  افزایش غلظت نانوذرات طلا، سمیت قابل توجهی روی سلول­های MCF-7 طی تیمار 48 ساعت دارد. به­طوری­که با افزایش غلظت، درصد بقا سلول­ها به­شدت کاهش یافته است.

باتوجه به شکل 11، می­توان به این نتیجه رسید که اثر مطلوب سمیت عصاره به تنهایی و نانوذرات طلا روی سلول­های MCF-7 نسبت به تیمار در 48 ساعت تغییر چندانی نداشته است. IC50 محاسبه شده برای عصاره µg/ml 8/510 و برای نانوذرات طلا µg/ml 9/382 طی 72 ساعت به­دست آمده است. با بررسی هر سه زمان تیمار نتیجه گرفته شد که اثربخش­ترین زمان تیمار به‫وسیله­ی نانوذرات طلای سنتز شده و عصاره برای از بین بردن سلول­های سرطانی MCF-7، زمان 48 ساعت است، همچنین عملکرد نانوذرات طلا به‫دلیل IC50 کمتر و در نتیجه نیاز به غلظت کمتر برای توقف رشد سلول­های سرطانی و یا  حذف آن­ها نسبت به عصاره مناسب­تر است.

 

 

شکل 9:  نمودار درصد بقا سلول­های MCF-7 پس­از 24 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه؛ درصد بقا سلول­های MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت­ مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده به‫وسیله عصاره گیاه اناریجه.

 

 

شکل 10: نمودار درصد بقا سلول­های MCF-7  پس از 48 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه، درصد بقا سلول­های MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده به‫وسیله عصاره گیاه اناریجه.

 

 

شکل 11: نمودار درصد بقا سلو های MCF-7  پس از 72 ساعت تیمار با نانوذرات طلا و عصاره اناریجه، درصد بقا سلول­های MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار شدن توسط پنج غلظت مختلف عصاره و نانوذرات طلا سنتز شده به‫وسیله عصاره گیاه اناریجه.

4- بحث

نانوذرات فلزی طلا به‫دلیل داشتن خواص منحصر­به­فرد مانند سنتز آسان، نسبت سطح به جرم بالا، واکنش پذیری بالا و غیرسمی بودن در بسیاری از زمینه‌ها از­ جمله برای درمان سرطان مورد استفاده قرار گرفته است (6, 7). در سال‌های اخیر روش سنتز سبز و استفاده از گیاهان برای تولید نانوذرات فلزی بسیار مورد توجه قرار گرفته است که نسبت به روش­های دیگر ارزان­تر، ساده­تر و غیرسمی است (9). مقاله­ی حاضر شامل گزارش سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره آبی برگ و ساقه گیاه اناریجه (  Pimpinella affinis)، مشخصه­یابی نانوذرات طلای سنتز شده و ارزیابی سمیت سلولی آن­ها بر رده سلول سرطانی MCF-7 است. همان­طور­که گفته شد، تولید نانوذرات به این روش مقرون­به­صرفه است و در زمان کوتاهی قابل انجام است. در این پژوهش، برای یافتن ترکیبات اساسی موجود در عصاره گیاه اناریجه، آنالیز GC/MS با استفاده­از عصاره گیاهی تهیه شده انجام شد. ترکیبات مهم شناسایی­شده شامل ترکیبات­فنولی مانند اسکوپارون، ترکیبات فلاونوئیدی مانندDDMP ، مونوترپن­ها مانند p-cymene و مشتقات آن، ترکیبات آنتی­اکسیدان مانند هیدروکوئینون و HTT، لیپیدها شامل لینولئیک اسید، استئاریک اسید و الئیک اسید و آلکالوئیدها مانند بتاکربولین می­باشد. به­طور­کلی عصاره برگ و ساقه گیاه اناریجه ( Pimpinella affinis ) با­توجه به متابولیت­های ثانویه­ای که دارد توانایی احیای یون­های طلا به نانوذرات طلا را دارد. از آن­جایی که عوامل مختلف از جمله روش عصاره­گیری، نوع حلال، موقعیت جغرافیایی و فصلی که گیاه تهیه شده است و خیلی از عوامل دیگر، در استخراج انواع ترکیبات و میزان استخراج ترکیبات از گیاهان تأثیر بسزایی دارد، در نتیجه ترکیبات به­دست آمده از عصاره گیاه اناریجه در این مقاله می­تواند تا حدودی با نتایج حاصل از بررسی­های ترکیبات حاصل از آن در مقالات دیگر متفاوت باشد. اما به­طور­کلی نتایج حاصل نشان می‌دهد، ترکیبات فنولی و آنتی­اکسیدان فراوان در این گیاه وجود دارد. در مقاله‌ای به وجود p-cymene و مشتقات آن و اکتادکانوئیک اسید در قسمت­های هوایی Pimpinella اشاره شده است (18). در مقاله­ای دیگر بیان شده است که Pimpinella affinis دارای ترکیبات مونوترپن زیادی مانند p-cymene و sesquiterpene می­باشد (27). همچنین در مقاله­ای، ترکیبات فلاونوئیدی به عنوان ترکیبات موثر در ویژگی­های بیولوژیک گیاه اناریجه گزارش شده است (17).

طی تیمار نمک طلا با استفاده از غلظت­های مختلف عصاره آبی گیاه اناریجه در مشاهدات بصری، با افزایش غلظت عصاره در محلول واکنش تغییر رنگ کلوئید از زرد کمرنگ به آبی متمایل به طوسی، قرمز یاقوتی و بنفش اتفاق افتاد که باتوجه­ به گزارشاتی که از قبل توسط مقالات مختلف ثبت شده است، این تغییر رنگ نشان دهنده­ی کاهش یون­های طلا ( Au3+ ) به اتم طلا (Au0) و تشکیل نانوذرات طلا می­باشد (22). همچنین در مقاله­ای دیگر، طی سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره برگ مگنولیا (Magnolia Kobus) در مشاهدات بصری، تغییر رنگ از بی­رنگ به قرمز یاقوتی مشاهده شد. رنگ قرمز یاقوتی ایجاد شده ناشی­از ارتعاشات پلاسمون سطحی نانوذرات طلا است. کاهش یون­های طلا به نانوذرات طلا را می­توان در نتیجه­ی اضافه­کردن عصاره به محلول واکنش و مشاهده­ی تغییر رنگ محلول تشخیص داد و در ادامه­ این فرآیند اتفاق افتاده، با مطالعه­ی داده­های حاصل از طیف­سنجی UV-Visible قابل بررسی و اثبات است (20). معمولاً برای بررسی خصوصیات اندازه نانوذرات از آنالیز طیف UV-Visible در محدوده­ی طول­موج بین 200 تا 800 نانومتر استفاده می­شود (13). ظهور پیک نمودار بین ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر در طیف­سنج مرئی-فرابنفش به‫دلیل پدیده رزونانس­پلاسمون­سطحی ناشی­از نوسانات جمعی الکترون­ها، تأییدکننده­ی تشکیل نانوذرات طلا است که در بسیاری از مقالات گزارش شده است (13, 22, 28) و وابستگی زیادی به اندازه و شکل نانوذرات و همچنین محیط شیمیایی واکنش دارد (22). تغییر در هر­کدام از این پارامتر­ها منجر به جابه­جایی در موقعیت پیک می­شود. بنابراین یکی از راه­های بهینه­سازی پارامتر فرآیند واکنش برای به­دست آوردن حداکثر بازده از نانوذرات طلای سنتز شده به‫وسیله­ی عصاره گیاهی، تعیین مقدار بهینه ­از عصاره مصرفی برای سنتز نانوذرات طلا می­باشد (23). در این پژوهش، حداکثر طول­موج جذبی نانوذرات طلا سنتز­ شده در غلظت­های مختلف از عصاره گیاه اناریجه بین 500 تا 600 نانومتر ظاهر شد و بدین صورت است که با استفاده از غلظت­های 2/0، 5/0، 75/0، 1، 25/1، 5/1، 2 و 3 (  mg/ml) از عصاره، حداکثر طول­موج جذبی (lmax) برای نانوذرات طلای تولید شده به­ترتیب از غلظت کم به زیاد عصاره 579، 532، 533، 533، 537، 537، 552 و 563 نانومتر و حداکثر میزان جذب آن­ها به­ترتیب 544/0، 870/0، 992/0، 985/0، 954/0، 999/0، 936/0 و 735/0 به­دست آمد. با­توجه به مطالعات دیگر حداکثر طول­موج جذبی حاصل از نانوذرات طلا در محدوده 500 تا 600 نانومتر ظاهر می­شود (22). برای مثال در مقالات دیگر، حداکثر طول موج حاصل از سنتز نانوذرات طلا به‫وسیله­ی عصاره­ی Pelargonium graveolens در محدوده ی 538 نانومتر و یا به‫وسیله عصاره Punica granatum در 568 نانومتر قرار دارد (13). این نتایج کاملا اثبات کننده­ی صحت نتایج حاصل­از مقاله­ی حاضر می­باشد. باتوجه به نتایج حاصل­از تولید نانوذرات طلا به‫وسیله­ی غلظت­های مختلف عصاره گیاه اناریجه، تشکیل رنگ­های مختلف در کلوئید و بررسی نتایج حاصل­از طیف­سنج UV-Visible آن­ها بیانگر آن است که مقدار عصاره­ی گیاهی مصرف شده، نقش مهمی در اندازه و غلظت نانوذرات سنتز شده دارد. همان­طور­ که گفته شد، مقدار عصاره اضافه شده، به‫علت تغییر در اندازه و نحوه­ی پراکندگی نانوذرات سنتز شده باعث تغییر در موقعیت حداکثر طول­موج جذبی در طیف­سنج UV-Visible می­شود. پیش از این پژوهش­هایی بر مبنای تأثیر حجم عصاره مصرفی بر نانوذرات تشکیل شده ثبت شده است. نتایج پژوهش­ها حاکی از آن است  که حداکثر طول موج جذبی تشکیل شده­ی حاصل از آنالیز طیف­سنج UV-Visible با شدت جذب کمتر  به­معنای تشکیل تعداد کمتر نانوذرات در طول فرآیند کاهش است و بالعکس، هرچه میزان جذب آن بیشتر باشد به معنای آن است که بازده سنتز نانوذرات  بیشتر است. با افزایش غلظت عصاره تشکیل نانوذرات طلا سرعت می­بخشد و کاهش غلظت آن، منجر به پراکندگی نانوذرات و ایجاد پیک وسیع در طول موج­های بیشتر می­شود. افزایش رقت عصاره باعث تولید نانوذرات با ایجاد پیک قله­ای­تر می­شود. این تفاسیر در مقالات مختلف از جمله در سنتز نانوذرات طلا با استفاده از عصاره گیاه Hibiscus sabdariffa نیز صدق می­کند (23).

در مقاله حاضر، با افزایش غلظت عصاره از مقدار mg/ml 5/0 به بالا، در محلول واکنش، در حداکثرطو­ل­موج جذبی نانوذرات طلای تولید شده red shift اتفاق افتاد و به سمت طول موج­های بیشتر جابه­جا شد. این رویداد، نشان دهنده­ی افزایش در اندازه نانوذرات طلای تولید شده می­باشد و با نتایج مطالعات نیومن منطبق است (28). در نمودار ایجاد شده از بررسی طیف­سنج UV-Visible برای نانوذرات طلای تولید شده در غلظت mg/ml 2/0 از عصاره، پیک وسیع ایجاد شد و در مشاهدات بصری نیز تغییر رنگ کلوئید به آبی متمایل­به طوسی مشاهده شد که با پیک­های دیگر ایجاد شده در غلظت­های بالاتر از عصاره متفاوت بود. این رویداد نشان دهنده­ی تشکیل تعداد بسیار کم از نانوذرات طلا به‫دلیل استفاده از رقت کم عصاره به عنوان عامل کاهنده می­باشد. با افزایش غلظت عصاره اناریجه تا غلظت mg/ml 5/1، در محلول واکنش، به‫علت افزایش غلظت عصاره در محلول، شدت پیک نمودار یا شدت جذب در حداکثر طول­موج جذبی در نمودار افزایش یافت. همچنین به­علت جابه­جایی حداکثر طول­موج جذبی به سمت طول­ موج­های بلندتر و وقوع Red shift، افزایش در اندازه­ی نانوذرات طلا دیده شد و در غلظت­های بالاتر از عصاره (mg/ml 2 و 3)، ایجاد پیک با مساحت زیر نمودار وسیع­تر و جابه­­جایی به سمت طول­­موج­های بزرگتر به‫علت وجود مقدار کمی نانوذرات تجمع یافته، ایجاد شد (24). حداکثر شدت پیک جذبی تشکیل شده در نمودار UV-Visible برای نانوذرات تولید شده با استفاده از غلظت­های mg/ml 75/0 و 1 از عصاره آبی گیاه اناریجه، در طول­موج­های پایین­تر،  همراه با پیک قله­ای­تر و مساحت زیر نمودار متقارن­تر ظاهر شد. این نتیجه بیان کننده­ی آن است که توزیع اندازه نانوذرات تولید شده در این غلظت از عصاره نسبت به سایر غلظت­ها مناسب­تر و دارای پلی­دیسپرسیتی کمتر است. همچنین بازده سنتز نانوذرات طلا با استفاده از این غلظت عصاره بیشتر از سایر غلظت­ها می­باشد. بنابراین بهینه­ترین غلظت از عصاره آبی گیاه اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا در این آزمایش مقدار mg/ml 75/0 و 1 به­دست آمد. برای تأیید این تفاسیر به­دست آمده در پژوهش حاضر، به بررسی نتایج حاصل از مقالات دیگر پرداخته شد. در مقاله‌ای بیان شده است که از کیتوزان ( دومین پلی ساکارید در طبیعت ) برای سنتز نانوذرات طلا استفاده شده است. با افزایش غلظت کیتوزان، تغییر رنگ محلول از صورتی به قرمز یاقوتی اتفاق افتاد و حداکثر طیف جذبی حاصل از نوسان پلاسمون سطحی نانوذرات در محدوده بین ۵۲۰ تا ۵۳۰ نانومتر ظاهر شد و نشان داده شد که با افزایش غلظت کیتوزان، شدت نوار پلاسمون سطحی نیز افزایش می‌یابد. همچنین ارتباط بین اندازه­ی نانوذرات و بیشینه طول موج جذبی در این مطالعه بررسی شده است و نشان داده است که افزایش غلظت کیتوزان از میزان 1/0%، 2/0%، 3/0%، 4/0% و 5/0%  به ترتیب از راست به چپ دارای حداکثر جذب در طول­موج­های 526، 526، 525، 524 و 525 نانومتر می­باشد. با افزایش غلظت کیتوزان، شدت حداکثر پیک جذبی ایجاد شده افزایش می­یابد و به سمت طول­موج­های پایین­تر جابه­جا می­شود و این نشان دهنده­ی کاهش اندازه نانوذرات تشکیل شده می­باشد (28) در پژوهشی دیگر، طیف UV-Visible محلول کلوئیدی با استفاده از عصاره گیاه Hibiscus cannabinus برای سنتز نانوذرات طلا به دست آمد و با اضافه کردن مقدار­های مختلف 5، 10، 20 و 30 میلی لیتر از عصاره در محلول نمک طلا پس از 90 دقیقه، واکنش مورد بررسی قرار گرفت و این نتیجه گرفته شد که افزایش مقدار عصاره در محلول واکنش باعث جابه­جایی پیک نمودار به سمت طول موج­های طولانی­تر و ایجاد منحنی زیر نمودار باریک­تر می­شود (13).

پس از بررسی آنالیز طیف سنج UV-Visible، برای یافتن غلظت بهینه از عصاره و همچنین بررسی توزیع اندازه و میزان پایداری نانوذرات تولید شده بااستفاده­ از غلظت­های مختلف از عصاره گیاه اناریجه، به بررسی آنالیز حاصل DLS پرداخته شد. طبق نتایج به دست آمده، با افزایش غلظت عصاره، میانگین اندازه در نانوذرات طلای تولید شده، افزایش یافت. نتایج به دست آمده از آنالیز DLS کاملا با طیف­های به­دست آمده به‫وسیله­ی UV-Visible مطابقت داشت. بررسی داده­های حاصل از DLS، نشان داد که اندازه نانوذرات طلا تولید شده در غلظت mg/ml 1 از عصاره نسبت به سایر غلظت­ها بهترین نتیجه با پلی­دیسپرسیتی کمتر را دارد و غلظت mg/ml 1 از عصاره به عنوان غلظت بهینه عصاره برای سنتز نانوذرات طلا در مراحل بعدی تعیین شد. نتایج حاصل از DLS در مقاله­ای که به بررسی و تعیین ویژگی نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده­از چهار عصاره گیاهی Pelargonium graveolens، Punica granatum، Lippia citriodora وSalvia officinalis  پرداخته است، نشان می­دهد که نانوذرات سنتز شده با استفاده از P.graveolens، L.citriodora و S.fficinalis دارای محدوده اندازه 1 تا 8 نانومتر هستند در­حالی­که نانوذرات سنتز شده به­وسیله عصاره P.granatum در محدوده ۳۰ تا 70 نانومتر می­باشند. این نتایج به­دست آمده تأیید کننده­ی نتایج حاصل­از طیف مرئی-فرابنفش آن­ها است. زیرا حداکثر طول­موج جذبی سه نمونه اول به ترتیب در محدوده 538، 536 و 535 نانومتر ظاهر شد که نشان دهنده­ی ایجاد نانوذرات کوچک­تر است و حداکثر طول­موج حاصل از نانوذرات سنتز شده با­ استفاده­از عصاره گیاه P.granatum در طول­موج 568 نانومتر ظاهر شد. طول­موج بالاتر نشان دهنده ایجاد نانوذرات با اندازه­ی بزرگتر می­باشد (29). یکی­از راه­های سنجش پایداری نانوذرات تولید شده، بررسی پتاسیل زتای به دست آمده با استفاده­از دستگاه زتاسایزر است و طبق آن، هرچه میزان قدرمطلق عدد حاصله بیشتر باشد، کلوئید­ها پایدارترند و در نتیجه نانوذرات میل به تجمع و رسوب و مدت طولانی‌تری پایدار باقی می­مانند. در این مقاله به­جز در حالت استفاده از غلظت mg/ml 2/0 از عصاره­ی اناریجه برای سنتز نانوذرات طلا­، سایر غلظت­ها با توجه به عدد پتاسیل­زتا به­دست آمده، دارای نانوذرات پایداری بودند اما نانوذرات تولید شده با استفاده­از غلظت mg/ml 1 از عصاره با داشتن پتانسیل زتای برابر با 61- میلی­ولت، دارای پایداری بسیار بالایی است. در مقاله­ای که بر روی مقایسه سنتز نانوذرات طلا با استفاده از چهار گیاه مختلف مطالعه داشت، نانوذرات تهیه شده در تمام نمونه­ها دارای پتانسیل­زتا منفی بود و در محدوده 10- تا 30- میلی­ولت به­دست آمد. بدین­صورت­که نانوذرات طلای سنتز شده به­وسیله عصاره گیاهان Pelargonium graveolens، Lippia citriodora  وSalvia officinalis  به­ترتیب دارای پتانسیل­زتا 23-، 17- و 20-  میلی­ولت بودند که نزدیک به هم است، در­حالی­که پتانسیل زتای عصاره گیاه P.granatum مقدار کمتری را نشان داد و برابر با 12- میلی­ولت بود که مطابق با نتایج میانگین قطر ذرات است و از ثبات کمتری برخوردار است و بنابراین تمایل بیشتری برای تجمع و تشکیل ذرات بزرگتر دارد (29).

برای شناسایی و تعیین مورفولوژی نانوذرات طلای سنتز شده، از غلظت بهینه عصاره آبی گیاه اناریجه برابر با mg/ml 1 و تحلیل نتایج حاصل از دستگاه SEM استفاده شد. بررسی­های حاصل­از SEM نشان داد که نانوذرات طلای سنتز شده به‫صورت کروی با میانگین اندازه 20 نانومتر هستند و مقدار کمی پلی­دیسپرسیتی دارند. میانگین اندازه­ی به­دست آمده کاملا با نتیجه­ی حاصل از DLS نمونه مطابقت دارد. SEM، قطر متوسط نانوذرات در یک تصویر را از روی ویژگی­های هندسی نانوذرات (مساحت، محیط و میانگین اندازه ) محاسبه می­کند و امکان نمونه برداری از نانوذرات بدون مواد آلی اطراف آن را فراهم می­کند. بنابراین اندازه به­دست آمده در آن همان اندازه اصلی نانوذرات است (29). نانوذرات طلا که با روش شیمیایی و سنتز سبز سنتز می­شوند عمدتاً کروی هستند که در بسیاری از مقالات حاصل از سنتز سبز نانوذرات طلا اثبات شده است (20). به­دلیل اندازه­گیری نانوذرات همراه با شعاع هیدرودینامیکی آن­ها در روش DLS، اندازه نانوذرات اندازه­گیری شده به روش DLS می­تواند تا 3/1 برابر اندازه قطر اصلی نانوذرات که به­روش SEM اندازه­گیری می­شوند، باشد. در مقاله­ای نیز نانوذرات نقره سنتز شده با روش DLS دارای اندازه متوسط ۷۸ نانومتر اندازه‌گیری شدند درحالی­که در روش میکروسکوپ الکترونی اندازه متوسط 60 نانومتر اندازه­گیری شد و اختلاف اندازه­ی آن­ها نیز 3/1 به دست آمد که این نتایج کاملا با مشاهدات دیگر هم­خوانی دارد (24).

برای یافتن گروه­های عاملی موجود در عصاره که در احیای نانوذرات طلا و پایداری آن­ها نقش داشتند، بر روی عصاره و نانوذرات طلای سنتز شده آنالیز FTIR انجام شد. نتابج حاصل­از مطالعات FTIR عصاره گیاه اناریجه و نانوذرات طلا تشکیل شده به‫وسیله آن، نشان داد که وجود باند قوی در ناحیه 1-cm 3422، به نوسانات کششی گروه عاملی هیدروکسیل مربوط می­شود. باند قوی در حوالی این ناحیه در­ بسیاری­از گیاهان دیگر از جمله گیاه M.kobus و R.rugosa تشکیل شده است که به­وجود ترکیبات­فنولی و الکل­های آزاد در عصاره گیاه اشاره دارند (9, 20). جذب در ناحیه1-cm 2959، بیان­کننده­ی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی است بنابراین به وجود لیپید­های موجود در عصاره اشاره دارد. جذب در ناحیه­ی 1-cm 2930، نیز می­تواند بیان­کننده­ی وجود نوسانات کششی پیوندهای C-H در زنجیره هیدروکربنی و لیپیدهای موجود در عصاره باشد و یا به آمین­های نوع دوم (N-H) که در پروتئین­های گیاه وجود دارد، مرتبط باشد. این محدوده از پیک­های جذبی ایجاد­شده در آنالیز FTIR در نانوذرات سنتز شده با عصاره گیاه C.guianensis نیز وجود دارد (7). جذب در ناحیه­ی 1- cm1727، مربوط به گروه­های کربونیل (کشش (CO است. بنابراین اثبات کننده­ی وجود گروه­های کربونیل ساده مانند کربوکسیل و کتون در عصاره اناریجه هستند. وجود این باند جذبی در مقالات دیگر نیز گزارش شده است ازجمله در مطالعه­ی سنتز نانوذرات با استفاده­از عصاره برگ Rosa rugosa به عنوان عامل کاهنده، باند قوی ایجاد­شده در 1-cm 1708 نشان­دهنده­ی وجود کربوکسیلات در این گیاه می­باشد که ممکن است مسئول کاهش یون­های فلزی به نانوذرات فلزی باشند. همچنین در مقاله­ای که به بررسی سنتز نانوذرات طلا با استفاده­از عصاره برگ Magnolia Kobus پرداخته شده است، وجود باند در ناحیه­ی 1-cm 1736 اشاره به وجود گروه­های کربنیل در عصاره­ی گیاهی دارد (9, 20). تشکیل باند قوی در ناحیه1-cm 1605 از FTIR عصاره اناریجه، مربوط به آمید I (N-H) است که در پروتئین­های عصاره گیاه اناریجه وجود دارد. همچنین می­تواند نشان­دهنده­ی وجود گروه­های عاملی کربوکسیلات نیز باشد. در گیاه  R.rugosaو مگنولیا نیز تشکیل باند نزدیک به ناحیه­ی ذکر شده، به وجود گروه­های آمین اشاره دارد (9, 20). جذب در ناحیه­ی 1-cm 1390، به­وجود کربوکسیلات و یا گروه­های فنولی حاوی پیوند O-H اشاره دارد، همچنین می­تواند به ارتعاشات کششی C-N در آمین­های آلیفاتیک مربوط باشد. جذب در این ناحیه در عصاره­ی حاصل­از گل­های C.guianensis نیز به چشم می­خورد (7). جذب در ناحیه­ 1-cm 1277، مربوط به وجود پروتئین­ها در عصاره می­باشد. جذب در مجموعه پیک­های 1-cm 1126، 1074 و 987، به باند C-H اشاره دارد که می­تواند مربوط به کربوهیدرات­های عصاره باشد و یا به ارتعاشات کششی C-N در آمین­های آلیفاتیک یا الکل­ها و یا فنول­ها مربوط باشد. در FTIR حاصل از عصاره برگ R.rugosa  نیز بیان­شده که وجود باند در 1-cm ۱۰۴۱ نشان دهنده­ی وجود گروه­های هیدروکسیلی ( آب و یا الکل آزاد ) می­باشد (9). به­علاوه در عصاره­ی گل­های C.guianensis نیز وجود باند در 1 -cm 1073 به آمین­های آلیفاتیک و وجود الکل­ها و فنول­ها اشاره دارد (7). در مقاله­ای دیگر نیز که مربوط به طیف FTIR حاصل از عصاره Centella asiatica است، ایجاد پیک در 1 -cm 1130 به وجود فنل­ها اشاره نموده است (25). جذب در 653 و 617 ( cm-1 )، بیان کننده­ی وجود گروه­های C-H (استیلن یا آلکین)، ترکیبات الکلی (O-H) و یا ترکیبات دی­سولفید (C-S) در عصاره است.

در مقاله حاضر، با مقایسه­ی دوطیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات طلا سنتز شده، می­توان نتیجه گرفت که با تغییرات گروه COOH به OH، پیک قوی در ناحیه­یcm-1  3432 ظاهر شده است که نشان دهنده­ی کاهش یون­های طلا به کمک پروتئین­ها و کربوکسیلیک اسیدها و ترکیبات فنولی موجود در عصاره است، به­علاوه گروه­های OH برای پایداری نانوذرات طلا روی آن­ها قرار گرفته­ اند. این نتایج با نتایج حاصل از مطالعات نانوذرات با استفاده­از C.guianensis مطابقت دارد (7). همچنین وجود ترکیبات حاوی کربوکسیلیک اسید و آمین­های آزاد حاصل از پروتئین­های عصاره بر روی نانوذرات طلا باعث پایداری نانوذرات به‫مدت طولانی شدند (25). به­طور­کلی با بررسی­های انجام شده می­توان نتیجه گرفت که طیف FTIR حاصل از عصاره اناریجه و نانوذرات سنتز شده به‫وسیله­ی آن، بیشتر به وجود گروه­های هیدروکسیل و آمیدی و کربونیل اشاره دارد که مربوط به ترکیبات فنولی و الکلی فراوان و  پروتئین­ها و کربوهیدرات­ها و لیپید­ها در عصاره است که نشان می­دهد ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و آمیدی موجب احیا نمک طلا و پروتئین­ها و گلیکوزید­ها و لیپیدها باعث پایداری نانوذرات طلا شده اند.

در نهایت، برای ارزیابی سمیت سلولی نانوذرات سنتز شده از روش MTT استفاده شد. نتایج حاصل از سمیت سلولی به‫روش MTT برای عصاره آبی گیاه اناریجه و نانوذرات طلای سنتز شده به‫وسیله­ی عصاره آبی گیاه اناریجه نشان داد که عصاره و نانوذرات حاصل از آن، سمیت مطلوبی روی سلول­های سرطانی MCF-7 دارند و مناسب­ترین زمان اثربخشی آن­ها زمان تیمار در 48 ساعت به­دست آمد که طی آن، عملکرد نانوذرات طلا به‫دلیل IC50 برابر با µg/ml 2/384 و در نتیجه نیاز به غلظت کمتر، برای متوقف کردن سلول­های سرطانی نسبت به عصاره با IC50 برابر با µg/ml 3/631 بیشتر و بهتر است. ارزیابی زنده ماندن سلول­ها بعد از تیمار با ماده­ی مورد نظر با استفاده از روش MTT در بسیاری از آنالیزها مورد استفاده قرار می­گیرد. مانند مقاله­ای که اثرات نانوذرات سنتز شده به­وسیله عصاره C.guianensis را مورد بررسی قرار داد و اثبات کرد که نانوذرات در این مقاله دارای سمیت سلولی قابل توجه­ علیه سلول­های سرطانی HL60 دارند. بنابراین می­توان این­گونه نتیجه گرفت که متوقف کردن رشد سلول و یا کشتن سلول می­تواند مکانیسم احتمالی ناشی از اثر سمیت نانوذرات طلای سنتز شده به­روش سبز باشد (7) همچنین بررسی­ها نشان می­دهد که علت گذر میزان درصد زنده­مانی سلول­ها، از مقدار کنترل، در برخی غلظت­های دارو در آنالیز MTT آن است که، بسیاری از داروهای ضدسرطان در غلظت­های کم برای سلول­های سرطانی نقش تغذیه­ای دارند و باعث افزایش رشد آن­ها می­شوند. در نتیجه نمودار زنده­مانی حاصل از آن­ها از میزان کنترل آن­ها افزایش می­یابد، در صورتی که همان دارو در غلظت­های بالا به سلول­های سرطانی شوک وارد می­کند و اثر سمیت سلولی دارد و در نهایت باعث توقف رشد و یا حذف سلول­های سرطانی می­شود (26).

5- نتیجه­گیری

امروزه یکی از چالش‌های بزرگ بشر، یافتن راهی مناسب برای درمان بیماری سرطان است. فناوری نانو در سال­های اخیر توجه بسیاری را به خود جلب کرده است و در بسیاری از تحقیقات به مطالعه بر روی گیاهان برای یافتن راهی مؤثر برای درمان قطعی سرطان و بررسی مکانیسم­های مولکولی که توسط آن یک عامل باعث ایجاد سمیت­سلولی در سلول­های سرطانی می­شود، پرداخته شده است. استفاده از گیاهان در سنتز­سبز یکی از روش­های سریع، ارزان و سالم برای دست­یابی به نانوذرات مطلوب است. در این مطالعه، تشکیل نانوذرات طلا چند دقیقه پس­از تیمار HAuCl4.3H2O با غلظت­های مختلف عصاره آبی برگ و ساقه گیاه اناریجه با نام علمی Pimpinella affinis به عنوان عامل احیا­کننده و پایدارکننده، همراه با تغییر رنگ به سمت قرمز یاقوتی اتفاق افتاد. برای مشخصه­یابی نانوذرات طلای سنتز شده از روش طیف­سنجی مرئی-فرابنفش، دستگاه تفرق نور پویا، میکروسکوپ­الکترونی­روبشی، تبدیل فوریه مادون قرمز استفاده شد. بررسی نتایج طیف­سنجیUV-Visible و DLS، نشان داد که نانوذرات طلای سنتز شده با استفاده­از غلظت یک mg/ml از عصاره دارای حداکثر طول­موج­جذبی nm 533 میانگین اندازه 26 نانومتر و پتانسیل زتا منفی 61 میلی­ولت بودند که اشاره به پایداری مطلوب آن­ها دارد و آن غلظت از عصاره به عنوان غلظت بهینه درنظر گرفته شد. تصاویر SEM نشان داد که نانوذرات طلا دارای شکل کروی همراه با پلی­دیسپرسیتی برابر 7/0 بودند. نتایج حاصل از FTIR، نشان داد که ترکیبات فنولی و کربوکسیلی و ترپن­ها  بیشترین نقش را در احیا نمک طلا و پایداری نانوذرات طلا ایفا می­کنند. پس­از تهیه عصاره اناریجه مقداری­از آن برای تعیین ترکیبات عصاره با دستگاه GC/MS مورد بررسی قرار گرفته شد. ترکیبات اساسی شناسایی­شده در عصاره توسط روش GC/MS به­طور­کلی ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی، ترپن ها، گلیکوزیدها و لیپید­ها به­دست آمد که با نتایج حاصل از FTIR هم­خوانی دارد. در نهایت برای بررسی اثرات سمیت­سلولی نانوذرات طلا و عصاره گیاه از روش رنگ­سنجی MTT بر روی رده سلولی MCF-7همراه با تیمارهای 24، 48 و 72 ساعت صورت گرفت. با بررسی داده­ها این نتیجه حاصل­ شد که نانوذرات طلا سنتز شده به‫وسیله عصاره گیاه اناریجه دارای سمیت بیشتری علیه سلول­های MCF-7  نسبت به عصاره گیاه بود. همچنین زمان تیمار ۴۸ ساعت برای سلول­ها در آنالیز MTT، به عنوان زمان بهینه برای سمیت نانوذرات طلا همراه با IC50 برابر با µg/ml 2/384 به­دست آمد. با استفاده از یافته­های فوق می‌توان به این نتیجه رسید که گیاه اناریجه به‫علت داشتن خاصیت درمانی ضد سرطانی بالقوه و بومی کشور ایران بودن، یکی از گزینه­های مناسب برای سنتز نانوذرات طلا باشد و می­توان با مطالعات و اصلاح سازی­های بیشتر بر روی نانوذرات سنتز شده با­ استفاده­از این گیاه، آن­را به­عنوان یکی از روش­های کارآمد به منظور رسیدن­به هدف درمان مناسب برای بیماری سرطان پستان در نظر گرفت. بنابراین، پژوهش حاضر می­تواند بینش ارزشمندی در توسعه نانودرمان­ها برای یافتن راهی مؤثر و غیرسمی برای درمان سرطان مخصوصا سرطان پستان ارائه دهد.

-

  1. Kashyap D, Tuli HS, Yerer MB, Sharma A, et al., editors. Natural product-based nanoformulations for cancer therapy: Opportunities and challenges. Seminars in cancer biology; 2021: Elsevier.
  2. El-Sahli S, Hua K, Sulaiman A, Chambers J, et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell death & disease. 2021 1;12(1):1-10.
  3. Misra R, Acharya S, Sahoo SK. Cancer nanotechnology: application of nanotechnology in cancer therapy. Drug discovery today. 2010 19-20;15(19-20):842-50.
  4. Strambeanu N, Demetrovici L, Dragos D, Lungu M. Nanoparticles: Definition, classification and general physical properties. Nanoparticles' promises and risks: Springer; 2015. p. 3-8.
  5. McNeil SE. Nanoparticle therapeutics: a personal perspective. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2009 3;1(3):264-71.
  6. Rosa S, Connolly C, Schettino G, Butterworth KT, et al. Biological mechanisms of gold nanoparticle radiosensitization. Cancer nanotechnology. 2017 1;8(1):1-25.
  7. Geetha R, Ashokkumar T, Tamilselvan S, Govindaraju K, et al. Green synthesis of gold nanoparticles and their anticancer activity. Cancer Nanotechnology. 2013 4;4(4):91-8.
  8. Philip D. Synthesis and spectroscopic characterization of gold nanoparticles. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2008 1;71(1):80-5.
  9. Dubey SP, Lahtinen M, Sillanpää M. Green synthesis and characterizations of silver and gold nanoparticles using leaf extract of Rosa rugosa. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2010 1-3;364(1-3):34-41.
  10. Bahare HD, Ataollah SSS, Maryam A. Evaluation of metalloproteinase matrix MMP9 gene expression and effect of silver nanoparticles toward Colon cancer cell line (HT29) Journal of Cell & Tissue (JCT). 2019 4 1.13;9(4):344-52.
  11. Zahra G, Adeleh D, Said A, Maryam S. Evaluation of the anticancer effects of Samarium nanoparticles synthesized by extract of ginger on HCT116 colorectal cancer cells. Journal of Cell & Tissue (JCT). 2020 4 29 Feb.;10(4):202-13.
  12. Ebrahimzadeh MA, Alizadeh SR, Hashemi Z. Green synthesis of gold nanoparticles using Sambucus ebulus fruit extract, characterization, and antileishmanial, antibacterial, antioxidant, and photocatalytic activities. European Journal of Chemistry. 2023 2;14(2):223-30.
  13. Ahmed S, Ikram S. Biosynthesis of gold nanoparticles: a green approach. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2016;161:141-53.
  14. Chen J, Li Y, Fang G, Cao Z, et al. Green synthesis, characterization, cytotoxicity, antioxidant, and anti-human ovarian cancer activities of Curcumae kwangsiensis leaf aqueous extract green-synthesized gold nanoparticles. Arabian Journal of Chemistry. 2021 3;14(3):103000.
  15. Haraty Rad S, Sorinezami Z, Ghaffari Moghaddam M, Khajeh M, et al. Green synthesis of gold nanoparticles with beet extract and investigation of its anti-cancer properties. Nanoscale. 2022 1;9(1):128-35.
  16. Askari F, Sefidkon F, Sharifi Ashorabadi E. Effects of planting date and seed origin on yield, essential oil and compositions content of Pimpinella affinis Ledeb. in Iran. Iranian Journal of Natural Resources Research. 2012 1;1(1):24-30.
  17. Esmaili F, Tajik H, Mehdizadeh T, Mayeli M. Determination and comparison of antioxidant activity and phenolic content of Pimpinella affinis hydroethanolic extract and essential oil. Studies in Medical Sciences. 2017 5;28(5):311-20.
  18. Nasır A, Yabalak E. Investigation of antioxidant, antibacterial, antiviral, chemical composition, and traditional medicinal properties of the extracts and essential oils of the Pimpinella species from a broad perspective: a review. Journal of Essential Oil Research. 2021 5;33(5):411-26.
  19. Shourian M, Ghourchian H, Boutorabi M. Ultra-sensitive immunosensor for detection of hepatitis B surface antigen using multi-functionalized gold nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 2015;895:1-11.
  20. Song JY, Jang H-K, Kim BS. Biological synthesis of gold nanoparticles using Magnolia kobus and Diopyros kaki leaf extracts. Process Biochemistry. 2009 10;44(10):1133-8.
  21. Bhattacharjee S. DLS and zeta potential–what they are and what they are not? Journal of controlled release. 2016;235:337-51.
  22. Pandey S, Oza G, Mewada A, Sharon M. Green synthesis of highly stable gold nanoparticles using Momordica charantia as nano fabricator. Arch Appl Sci Res. 2012 2;4(2):1135-41.
  23. Mishra P, Ray S, Sinha S, Das B, et al. Facile bio-synthesis of gold nanoparticles by using extract of Hibiscus sabdariffa and evaluation of its cytotoxicity against U87 glioblastoma cells under hyperglycemic condition. Biochemical Engineering Journal. 2016;105:264-72.
  24. Maliszewska I, Szewczyk K, Waszak K, editors. Biological synthesis of silver nanoparticles. Journal of Physics: Conference Series; 2009: IOP Publishing.
  25. Das RK, Borthakur BB, Bora U. Green synthesis of gold nanoparticles using ethanolic leaf extract of Centella asiatica. Materials Letters. 2010 13;64(13):1445-7.
  26. Calabrese EJ. Hormesis: a revolution in toxicology, risk assessment and medicine: Re‐framing the dose–response relationship. EMBO reports. 2004 S1;5(S1):S37-S40.
  27. Rahmani B, Shiraz NZ, Masnabadi N, Masoudi S, et al. Volatile Constituents of Alococarpum erianthum (DC) H. Riedl & Kuber. Ferula ovina (Boiss.) Boiss. and Pimpinella affinis Ledeb. Three Umbelliferae Herbs Growing Wild in Iran. Journal of Essential Oil Research. 2008 3;20(3):232-5.
  28. Malathi S, D Balakumaran M, T Kalaichelvan P, Balasubramanian S. Green synthesis of gold nanoparticles for controlled delivery. Advanced Materials Letters. 2013 12;4(12):933-40.
  29. Elia P, Zach R, Hazan S, Kolusheva S, et al. Green synthesis of gold nanoparticles using plant extracts as reducing agents. International journal of nanomedicine. 2014;9:4007.