فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دکتری،گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران

2 دانشیار،گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران

3 استاد،گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران

4 استادیار،گروه بیوفیزیک، دانشکده فناوری‫های نوین، دانشگاه محقق اردبیلی، نمین، ایران

چکیده

هدف: مهندسی بافت به‫ روش‌هایی اطلاق می‌شود که مبتنی بر استفاده از داربست‌ها، سلول‫ها و مولکول‌های فعال بیولوژیکی برای تولید بافت‌های دارای عملکرد مشخص است. هدف آن قابلیت بازسازی، نگه‫داری و بهبود بافت آسیب‌دیده یا کل اندام است. هدف از این مطالعه تولید نانو داربست پلی کاپرولاکتان /کتیرا/سیلیمارین و بررسی زنده مانی سلول‫های PC12 بر روی داربست تحت تنش اکسیداتیو می باشد. مواد و روشها: به‫منظور تهیه نانو داربست، محلول پلی کاپرولاکتان 7 درصد (حل شده در استیک اسید)، محلول کتیرا 7/0 درصد وزنی (‫حل شده در استیک اسید‫) ومحلول سیلیمارین با غلظت 9/0 درصد وزنی مخلوط شد، سپس توسط دستگاه الکتروریسی داربست تهیه شد. مورفولوژی داربست توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی و ساختار شیمیایی داربست توسط طیف سنجی FTIR مورد ارزیابی قرار گرفت. برای بررسی خواص آنتی اکسیدانتی داربست از گلوگز 80 میلی‫گرم بر لیتر و H2O2 ،150 مایکرو‫لیتر استفاده شد. نتایج: بررسی مورفولوژی و ساختار شیمیایی داربست، نشان دهنده تخلخل مناسب داربست پلی کاپرولاکتان /کتیرا و بارگذاری موفق سیلیمارین بر روی داربست  بود. ارزیابی خواص اکسیدانتی داربست بعد از گذشت 24 ساعت از کشت سلول‫های PC12 بر روی آن نشان دهنده افزایش زنده‫مانی سلول‫ها بر روی داربست و خواص آنتی اکسیدانتی مناسب داربست بود. نتیجه گیری: نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که غنی سازی داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا با سیلیمارین باعث افزایش توان تکثیر و زنده مانی سلول‫های PC12  تحت تنش اکسیداتیو شد. از این رو این داربست می­تواند کاندیدی مناسب برای مهندسی بافت در شرایطی با تنش­های اکسیداتیو بالا باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Polycaprolactan/ tragacanth nanoscaffold enriched with sililymarin as a protector of neural progenitor cells under oxidative stress conditions

نویسندگان [English]

  • R Najafi 1
  • A Asadi 2
  • S Zahri 3
  • A Abdolmaleki 4

1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran

3 Department of Biology, Faculty of Science, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran

4 Department of Biophysics, Faculty of Advanced Technologies, University of Mohaghegh Ardabili, Namin, Iran

چکیده [English]

Aim: Tissue engineering refers to methods that are based on the use of scaffolds, cells and biologically active molecules to produce tissues with specific functions. The purpose of tissue engineering is to build structures that can regenerate, maintain and improve damaged tissue or the whole organ. Today, by using tissue engineering methods, various natural and synthetic scaffolds have been designed that can be used for nerve grafts. The physical, chemical and biological properties of the scaffold must be similar to the extracellular matrix of the body in order to avoid adhesion, growth and support the differentiation of cells. An ideal neural scaffold should have biodegradability, biocompatibility and proper tensile strength. Recently, the use of polycaprolactan as a suitable biodegradable material has been evaluated in many fields of tissue engineering. Antioxidants are among the substances, which seem to be able to prevent neuronal death by reducing the amount of ROS. Flavonoids include many compounds that have various biological effects in the body. Silymarin (Silybum marianum) is a flavonoid that has many effects, including anti-cancer effects and antioxidant properties. Tragacanth is a known natural polymer that has excellent biological properties such as biodegradability, biocompatibility, antibacterial and wound healing ability. It is obtained from the stems and branches of the Asian species tragacanth. It has outstanding structural stability against heat and acidity. The aim of this study is to produce polycaprolactan/ tragacanth /silymarin nanoscaffolds and to investigate the viability of pc12 cells on the scaffold under oxidative stress. Considering that silymarin has antioxidant properties, the use of polycaprolactan/ tragacanth /silymarin nanoscaffolds can prevent neuropathy of nerve cells.
Material and Methods: Scaffolds used in this research were prepared using the electrophoretic method. For this purpose, an electrospinning machine was used, which is equipped with a rotary collector with a thickness of 70 mm and a width of 50 mm. In order to prepare a polycaprolactan/ tragacanth nanoscaffold and load silymarin on it, a 7% polycaprolactan solution (dissolved in acetic acid), 0.7% by weight tragacanth solution (dissolved in acetic acid) and 0.9% by weight silymarin solution were mixed by a magnetic stirrer for 20 minutes, and in order to make the solution uniform, sodium didecyl sulfate (SDS) with a concentration 1 percent by weight of the solvent was added to the solution and the suspension was homogenized for 20 minutes with an ultrasonic device, then the scaffold was prepared by an electrospinning device. . The nanofibers were collected in a period of 6 hours, the sample collection speed was 1 ml per hour, and the nanofiber samples were collected by rotating at 250 rpm. The distance between the injection needle and the scaffold is 12 cm and this process is done at a voltage of 15 kV. The morphology of the scaffold was evaluated by scanning electron microscope (SEM) and the chemical structure of the scaffold was evaluated by FTIR spectroscopy. To investigate the antioxidant properties of the scaffold, glucose 80 mg/L and H2O2, 150 macro L were used.
Results: Examining the morphology and chemical structure of the scaffold showed the proper porosity of the polycaprolactan/ tragacanth scaffold and the successful loading of silymarin on the scaffold. Evaluation of the oxidant properties of the scaffold after 24 hours of PC12 cell culture on it showed the increase in cell viability on the scaffold and the appropriate antioxidant properties of the scaffold.
Conclusion: The results of this research showed that the enrichment of polycaprolactan/ tragacanth scaffold with silymarin increased the proliferation and survival of PC12 cells under oxidative stress. Therefore, this scaffold can be a suitable candidate for tissue engineering in oxidative stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • scaffold
  • silymarin
  • tissue engineering
  • tragacanth
  • electrospinning

- مقدمه
نانوالیاف پلیمرهای زیست سازگار دارای برنامه‫های کاربردی در زیست پزشکی، شامل پانسمان زخم (1)، دارو رسانی و داربست مهندسی بافت می‌باشد. خواص منحصر به‫فرد نانوالیاف، مانند نسبت سطح به حجم بالا (2)، اندازه منافذ مناسب (3)، تخلخل نفوذپذیری و سهولت ساخت، چنین موادی را به‫منظور درمان کاربردی ساخته است. الکتروریسی یکی از انعطاف پذیرترین و ساده‫ترین تکنیک‫هایی است که امکان تولید الیاف با قطرهای مختلف از ده‫ها نانومتر تا چند میکرومتر را دارد (4و5). سیلیمارین حاوی مخلوطی از فلاونولیگنان‫های فعال و فلاونوئیدها است. سیلیمارین در درمان طیف وسیعی از بیماری‫های از جمله بیماری‫های کبدی استفاده شده است. فلاونولیگنان‫ها و فلاونوئیدهای اصلی در سیلیمارین به‫عنوان ترکیباتی که دارای فعالیت‫های دارویی زیادی هستند شناخته شده‫اند (6). از نظر بیوشیمیایی، سیلیمارین در برابر رادیکال‫های آزاد خواص آنتی اکسیدانتی دارد (7). سیلیمارین عمدتا از شش فلاونولیگنان، سیلیبین (سیلیبین A وb‫) ایزوسیلیبین (ایزوسیلیبین A و B)، سیلی کریستین، ایزوسیلی کریستین، سیلیدیانین و سیلیمونین تشکیل شده است و سایر فلاونوئیدها مانند تاکسیفولین، کورستین، دی هیدروکمپفرول، کامپفرول، آپیژنین، نارینگین، اریودکتیول و کریزواریول نیز در ترکیب سیلیمارین وجود دارد. باقیمانده سیلیمارین (20 تا 30 درصد) از ترکیباتی تشکیل شده است که شامل 5و7-دی هیدروکسی کرومون، دهیدروکنیفریل الکل، (60 درصد اسید لینولئیک، 30 درصد اسید اولئیک، 9 درصد اسید پالمیتیک)، توکوفرول، استرول‫ها (کلسترول، کامپسترول، استیگماسترول و سیتوسترول)، قندها (آرابینوز، رامنوز، زایلوز و گلوکز) و پروتئین‫ها است (8و9و10). صمغ‫ها گروهی از پلی ساکاریدها هستند که به‫طور طبیعی می‫توانند توسط گیاهان (درختان و بوته‫ها، دانه‫ها و غده‫ها)، جلبک‫های قرمز و جلبک‫های دریایی قهوه‫ای یا منابع میکروبی تولید شوند (11). صمغ کتیرا به‫صورت تراوش خشک شده از ساقه و شاخه‫های صمغ گون استخراج می‫شود و بسیار آب‫دوست، زیست سازگار، دارای ثبات ساختاری برجسته در برابر گرما، اسیدیته و پیری است. برای مصرف خوراکی بی‫خطر است. از نظر شیمیایی، از دو بخش تشکیل شده است: بخش محلول در آب و بخش بسیار منشعب (30 تا 40 درصد) به‫نام تراگاکانتین (شامل قندهایی مانند ال-آرابینوز، ال-فوکوز، دی-مانوز، دی-گلوکز، دی-گالاکتوز و d -گزیلوز) و بخش نامحلول اما قابل تورم در آب (60 تا 70) به‫نام تراگاکانتیک اسید یا باسورین (متشکل از ال-فروکتوز، دی-گزیلوز، دی-گالاکترونیک اسید، دی گالاکتوز و ال-رامنوز) (12). صمغ کتیرا به‫عنوان یک مولکول مفید مشتق شده از گیاه کاربردهای گسترده ای مرتبط با مراقبت‫های بهداشتی، مانند لوسیون‫های خارجی کرم‫های مو و دست  دارد (13 و 14). صمغ کتیرا به‫دلیل پایداری قابل توجه در محدوده وسیعی از pH و دما، معمولا به‫عنوان یک امولسی فایر در مواد غذایی، داروها و صنایع مرتبط با ماندگاری فوق العاده طولانی استفاده می‫شود (15). بر این اساس، صمغ کتیرا به‫طور کلی به‫عنوان یک ماده ایمن توسط سازمان غذا و دارو شناخته شده است. همچنین تجزیه پذیری در سیستم‫های زنده صمغ کتیرا را به یک ماده بسیار جالب در مهندسی بافت و استراتژی‫های پزشکی بازساختی تبدیل می‫کند (16). علاوه بر کاربردهای ترمیم بافت نرم، صمغ کتیرا در بازسازی بافت‫های سخت به تنهایی یا درون کامپوزیت‫ها استفاده می‫شود. به‫عنوان مثال، حائری و همکاران (17) گزارش داد که صمغ کتیرا می‫تواند به‫عنوان یک بستر مناسب برای ترویج چسبندگی، تکثیر و تمایز استخوانی سلول‫های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی باشد  سیلیمارین به‫دلیل خواص ضد التهابی و فعالیت آنتی اکسیدانتی خود به‫خوبی شناخته شده است، اما همچنین مجموعه ای از فعالیت‫های بیولوژیکی و دارویی مثبت مانند تحریک سنتز پروتئین، محافظت از قلب، محافظت عصبی، نوروتروفیک و تعدیل سیستم ایمنی را اعمال می‫کند. سیلیمارین همچنین اثرات ضد سرطانی در رده‫های سلولی سرطان انسان، و به‫ویژه در متابولیسم کبد، بازسازی سلولی در آسیب سمی کبد اعمال می‫کند (18). همچنین در پژوهش دیگری نشان داده شده است سیلیمارین فعالیت ضد دیابتی را نشان می‫دهد و اثرات کاهش چربی خون و ضد فیبروتیک در بیماری التهابی مزمن کبدی نیز دارد (19). مطالعه حاضر در نظر دارد اثر آنتی اکسیدانتی داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا، غنی شده با سیلیمارین را بر میزان محافظت سلولی به‫دنبال ایجاد تنش اکسیداتیو توسط میزان بالای گلوکز و H2O2 را بر سلول‫های PC12  کشت شده روی داربست مورد بررسی قرار دهد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
2- مواد و روش‫ها‬‬‬‬‬
طراحی مطالعه: مطالعه حاضر از نوع تجربی به‫صورت in vitro می‫باشد که در آزمایشگاه تحقیقاتی نانوزیست فناوری دانشگاه محقق اردبیلی و با کد اخلاقی (IR.UMA.REC.1401.022) و حمایت مالی دانشگاه محقق اردبیلی انجام شده است.‬‬‬‬‬‬
تهیه نانو داربست: نانو داربست‫های مورد استفاده در این تحقیق با استفاده از روش الکتروریسی تهیه شدند. برای این منظور از دستگاه الکتروریسی فناوران نانو ساخت ایران استفاده شد که این دستگاه مجهز به یک جمع کننده دوار با ضخامت 70mm و پهنای 50mm می‫باشد. به‫طور خلاصه به‫منظور تهیه نانو داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا و بارگذاری سیلیمارین بر روی آن، محلول پلی کاپرولاکتان 7 درصد (حل شده در استیک اسید)، محلول کتیرا 7/0 درصد وزنی (حل شده در استیک اسید) و محلول سیلیمارین با غلظت 9/0 درصد وزنی مخلوط شد، و به‫منظور یکنواخت شدن محلول، سدیم دو دسیل سولفات (SDS) با غلظت 1 درصد وزنی نسبت به حلال به محلول اضافه شد سپس سوسپانسیون به‫مدت 15 دقیقه با دستگاه اولتراسونیک هموژنایز گردید و برای ساخت نانو الیاف در دستگاه الکتروریسی قرار داده شد. نانوالیاف در بازه زمانی 6 ساعت جمع‫آوری شدند که سرعت جمع‫آوری نمونه‫ها 1 میلی‫لیتر در ساعت بود و فاصله سوزن تزریق تا داربست12 سانتی متر و در ولتاژ kV 15 این فرآیند انجام شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بررسی مورفولوژی و فراساختار نانو داربست: برای بررسی خواص سطحی و اندازه گیری قطر نانو داربست از میکروسکوپ الکترونی روبشی(SEM) استفاده شد. ابتدا نمونه‫ها با طلا پوشش‫دهی شده و تصویربرداری انجام شد.‬‬‬‬‬
بررسی ویژگی‫‫های شیمیایی نانو داربست‫ها: جهت تشخیص ساختار شیمیایی داربست تهیه شده، از طیف سنجی  FTIR  (اسپکترومتری مادون قرمز تبدیل فوریه) استفاده شد. بدین‫منظور طیف FTIR  در محدوده طول موج 400-4000 CM-1 توسط دستگاه طیف سنج SHIMADZU ساخت کشور ژاپن تهیه شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بررسی تعداد و قطر منافذ داربست: تعداد و قطر منافذ داربست سطح داربست توسط image j مورد ارزیابی قرار گرفت که نشان دهنده‫‫ی قطر مناسب منافذ داربست برای کشت سلول بود.‬‬‬‬‬
آماده سازی و استریل نمودن داربست پیش از کشت سلول: پیش از کشت سلول، داربست‫های تهیه شده به قطعات 1 سانتی‫متر مربع بریده شده و در داخل چاهک‫های پلیت 24 خانه قرار داده شدند. داربست‫های داخل چاهک دوبار و هر بار به‫مدت 10 دقیقه توسط بافر (نمکِ فسفات با خاصیت بافری) PBS حاوی آنتی بیوتیک پنی سیلین/ استرپتومایسین شستشو داده شدند. سپس داربست‫ها زیر هود به‫مدت 20 دقیقه زیر اشعه UV قرار گرفتند. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
کشت سلول: در این پژوهش سلول‫های (PC12) از انیستیتو پاستور ایران تهیه شدند. سلول‫های تهیه شده در محیط کشت RPMI (محصول شرکت Gibco، انگلستان) حاوی 10 درصد سرم جنین اسب و 5 درصد سرم جنین گاوی (محصول شرکتGibco ، انگلستان) و100 واحد برمیلی‫لیتر آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین (محصول شرکتGibco ، انگلستان) کشت داده شد و در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد CO2 قرار داده شدند. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بررسی اتصال سلول‫های PC12 بر روی داربست: پس از استریل کردن داربست‫ها تعداد 50000 سلول PC12 بر روی هر یک از داربست‫ها در پلیت 24 خانه در بازه کشت داده شد. سپس نمونه‌های داربست حاوی سلول فیکس شدند و پس از طی مراحل خشک کردن نمونه‫ها به‫منظور بررسی اتصال سلول‫ها به داربست توسط میکروسکوپ الکترونی SEM تصویربرداری شدند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
قرار دادن سلول‫ها تحت تنش اکسیداتیو (گلوکزوH2O2): برای بررسی خواص آنتی اکسیدانتی داربست، به‫دنبال کشت سلول‫ها و 24 ساعت بعد از رشد، در بررسی اثرات آنتی اکسیدانتی در مقابل تنش اکسیداتیو با گلوکز، به غلظت 80 میلی گرم بر لیتر گلوگز جهت ایجاد مرگ به محیط کشت شاهد و حاوی داربست اضافه شد و همچنین برای بررسی اثرات آنتی اکسیدانتی در مقابل تنش اکسیداتیو با H2O2 ، 24 ساعت بعد از کشت سلول،150 میکرولیتر H2O2 به محیط کشت اضافه شد و 24 ساعت بعد سلول‫ها از نظر توان حیاتی و نقش آنتی اکسیدانتی داربست مورد بررسی قرار گرفتند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3- آنالیز آماری
تمام آزمایش ها در سه تکرار انجام شد و داده‫ها به‫صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان شدند. نمودارها با استفاده از نرم‏افزار اکسل رسم شد. مقدار( p<0.05) از نظر آماری معنی‫دار در نظر گرفته شد.‬‬‬‬‬‬
4- نتایج
بررسی مورفولوژی سلول PC12
بررسی سلول‫های کشت شده توسط میکروسکوپ فاز معکوس نشان داد که سلول‫های کشت شده در محیط (Roswell Park Memorial Institute) RPMI رشد کافی داشته و از نظرمورفولوژی دوکی شکل بودند (شکل ۱).‬‬‬‬‬‬

 

 

 

شکل 1: سلول‫های PC12 کشت داده شده در محیط کشت RPMI‬‬. بزرگنمایی ×400‬
بررسی مورفولوژی و فراساختار نانو داربست
نتایج حاصل از فراساختار داربست‌ها و بررسی قطر الیاف توسط تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) نشان داد که داربست‌ها در مقیاس نانو تهیه شده اند، همچنین بررسی سطح داربست‌ها نشان دهنده تخلخل مناسب جهت رشد و اتصال سلول‫ها بر روی داربست می باشد (شکل 2و3). ‬‬‬
 
شکل 2: تصاویر SEM از داربست الکتروریسی شده سیلیمارین/PCL /کتیرا قبل از کشت سلول ، همان‫طور که در شکل مشاهده می شود داربست دارای سطح صاف و تخلخل مناسب برای کشت سلول می‫باشد.‬‬‬‬‬‬
 
 شکل 3: میکرو گراف SEM از داربست سیلیمارین/پلی کاپرولاکتان بعد از کشت سلول
بررسی اندازه منافذ داربست‫ها‬‬‬
برای بررسی اندازه منافذ و تعداد منافذ داربست‫ها بر روی داربست پلی کاپرولاکتان /کتیرا/سیلیمارین از نرم افزار image j استفاده شد که نتایج نشان دهنده تخلخل مناسب داربست برای رشد و چسبندگی سلول بود (شکل 4).‬‬‬

 
شکل 4: تصویر چگونگی توزیع منافذ داربست سیلیمارین/ پلی کاپرولاکتون/کتیرا .(A تصویر SEM (B تصویر گرافیکی از موقعیت منافذ  (C نمودار توزیع منافذ
بررسی ساختار شیمیایی نانو داربست‫ها توسط طیف سنجی FTIR ‬‬‬
همان‫طور که در شکل 3 نشان داده شده است به‫طور کلی طیف جذبی پلی کاپرولاکتان دارای سه پیک شاخص در اعداد موج cm-1  1730  ،2865  و 2947  می‫باشد که به‫ترتیب نشان دهنده وجود ارتعاش کششی پیوند های –C=O و ارتعاش پیوندهای –CH2 می‫باشد. و از پیک‫های شاخص سیلیمیارین در اعداد طول موج cm-1 ،1043 ،1103 ،1242 نشان دهنده ارتعاش پیوندهای-C-O  ، 1731 نشان دهنده –COOH کربوکسیلیک اسید ،Cm-1 1508 نشان دهنده C=C  آروماتیک و3442 مربوط به کشش –O-H در ساختار سیلیمارین قابل تشخیص می‫باشد که نشان دهنده پوشش‫دهی مناسب نانو داربست پلی کاپرولاکتان با سیلیمارین می‫باشد (19و20).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
نوارهای جذب اصلی موجود در طیف صمغ به‫ترتیب 3432، 2936، 2128، 1738، 1637، 1427، 1243، 1165، 1079 و 1039، 1 سانتی‫متر بودند. گسترده نوار مشاهده شده در 3432 Cm-1 را می‫توان به ارتعاشات کششی گروه‫های O-H در کتیرا اختصاص داد. نوارها در 2936 cm-1 مربوط به ارتعاشات کششی گروه‫های متیلن نامتقارن و متقارن هستند . نوار پهن در 2128 Cm-1 از گونه‫های مختلف کربونیل صمغ ناشی می‫شود. نوار 1738 را می‫توان به ارتعاشات کششی کربونیل در آلدئیدها، کتون ها و اسید کربوکسیلیک اختصاص داد. نوار قوی‌تر یافت شده در 1637 سانتی‌متر می‌تواند به کشش نامتقارن مشخصه گروه کربوکسیلات اختصاص داده شود. کشش متقارن گروه کربوکسیلات را می‫توان به باندهای موجود نسبت داد در 1427، 1 سانتی‫متر. پیک 1243 و 1165و1079 و 1039 Cm-1 به‫ترتیب به‫دلیل ارتعاشات کششی C-O پلی ال ها، اتر و گروه‫های الکلی بودند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 

شکل5: طیف سنجی FTIR نانو داربست پلی کاپرولاکتون /سیلیمارین/کتیرا
زیست سازگاری نانو داربست 
نتایج حاصل از رشد و تکثیر سلول‫ها بر روی نانو داربست در دو بازه زمانی 24 و 48 ساعت پس ازکشت سلول‫ها نشان داد که زنده‫مانی سلول‫ها در نانو داربست پلی کاپرو لاکتان/کتیرا حاوی سیلیمارین نسبت به گروه کنترل به‫طور معنی‫داری افزایش یافته است. همچنین نانو داربست سمیتی بر روی سلول‫های کشت شده نداشت (نمودار 1). همچنین بررسی اتصال و چسبندگی سلول‫ها بر روی داربست نشان داد که سلول‫ها به‫طور یکنواخت توزیع شده و به‫دلیل تخلخل مناسب به‫طور کامل به داربست متصل شده و بر روی آن گسترش یافته‫اند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 

 

نمودار 1: نتایج حاصل از تست MTT، میزان زنده مانی سلولی داربست، پلی کاپرولاکتون/کتیرا/سیلیمارین و گروه کنترل بعد از 48 ساعت در طول موج  570 نانومتر می‫باشد. داده‫ها به‫صورت میانگین ± انحراف استاندارد نمایش داده شده است  (3بار تکرار) مقدار( p<0.05) در مقایسه با گروه کنترل معنی‫دار در نظر گرفته شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بررسی آنتی اکسیدانتی داربست پلی کاپرو لاکتان /کتیرا/سیلیمارین
برای بررسی خواص آنتی اکسیدانتی داربست از گلوکز با غلظت 80 میلی‫گرم بر لیتر و H2O2 به مقدار 150 ماکرو لیتر استفاده شد. بعد از کشت سلول روی داربست، سلول‫ها به‫مدت 24 ساعت به‫صورت جداگانه تحت تنش اکسیداتیو گلوکز و H2O2 قرار گرفت. نتایج حاصل از MTT نشان دهنده توان حیاتی بالا و معنادار داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا غنی شده با سیلیمارین تحت تنش اکسیداتیو نسبت به گروه کنترل تحت تنش بود (نمودار2).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 


نمودار2:  نمودار حاصل از تست MTT میزان زنده مانی سلولی داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا/سیلیمارین وگروه کنترل بدون داربست که تحت تنش اکسیداتیو گلوکز و H2O2 قرار گرفت. مقدار( p<0.05) در مقایسه با گروه کنترل معنی دار در نظر گرفته شد.
5- بحث
مهندسی بافت با هدف ترمیم بافت از طریق استفاده از  ابزار بیولوژیکی مثل سلول‫ها و همچنین به‫کمک  ابزارهای سنتتیک مؤثر، برای طراحی داربست می‫باشد. در بافت کامل یک جاندار، سلول‫ها در ریز محیط های سه بعدی قرار می‫گیرند و اطرافشان توسط ماتریکس خارج سلولی و سلول‫ها احاطه می شود (21و22). در این کار از روش الکترولیز برای انتخاب پلیمر پلی کاپرولاکتون به‫عنوان ماده داربست استفاده شد. این پلیمر که خطی و آبگریز است، به‫دلیل کیفیت فیزیکی برجسته، در دسترس بودن و زیست سازگاری، اغلب در مهندسی بافت استفاده می‫شود. همچنین تصور می شود که این ماده قابل استفاده برای استفاده در پزشکی است. سیلیمارین، یک فلاونوئید با فواید متعدد، از جمله تاثیر ضد سرطانی و قابلیت‫های آنتی اکسیدانتی، نیز به‫عنوان یک عامل بارگذاری مورد استفاده قرار گرفت. مهم‫ترین جزء سیلیمارین که عصاره‫ای است از ایزومرهای متعدد تشکیل شده و تقریبا 80 درصد از این عصاره را تشکیل می‫دهد، سیلی بینین است (23). کتیرا یک پلیمر طبیعی است و از آن‫جایی‫که برخی از پلیمرهای طبیعی در ساختار ماتریکس خارج سلولی یافت می‫شود، می‫توان از آن در مهندسی بافت استفاده کرد زیرا چسبندگی سلولی قوی دارد. کتیرا محیط مساعدی را برای رشد سلولی در بدن انسان ایجاد می‫کند در حالی‫که هیچ اثر حساس کننده، جهش زا، سرطان زا، نقص جنینی یا سمی روی آن ندارد. همچنین کتیرا در بهبود و بازسازی زخم بسیار موفق می‫باشد. اجزای فعال کتیرا (باسورین) به ساخت سریع کلاژن و بهبود زخم‫ها کمک می‫کند. کتیرا علاوه بر قابلیت تنظیم رهاسازی داروها در دارورسانی، دارای ویژگی‫های ضد باکتری و التیام دهنده است. علاوه بر این، خواص ضد باکتریایی کتیرا آن را برای سیستم‫های ضد میکروبی و پانسمان زخم مفید می کند (24). تصاویر حاصل از SEM نشان دهنده اتصال مناسب سلول‫ها بر روی داربست بود همچنین نتایج حاصل از MTT سلول‫ها بر روی داربست قبل و بعد از تنش اکسیداتیو نشان از توانایی بالای داربست پلی کاپرولاکتان/کتیرا/سیلیمارین در زنده مانی سلول‫ها تحت تنش اکسیداتیو بود. آسیب شناسی آمیلوئید بتا در هر دو سیستم in vitro و in vivo به خوبی گزارش شده است. در مدل موش تراریخته AD (بیماری آلزایمر)، الیگومریزاسیون آمیلوئید بتا ناشی از بیان بیش از حد APP (پیش ساز پروتئین آمیلوئید) به‫طور بالقوه توسط سیلیمارین مهار شد (25). علاوه بر این، تجویز سیلیمارین در حیوانات نیز برای پاکسازی رسوبات فیبریلار آمیلوئید بتا گزارش شده است. در سیستم آزمایشگاهی، فیبریلیزاسیون و تجمع آمیلوئید بتا پس از انکوباسیون پپتیدهای آمیلوئید بتا با سیلیمارین به‫طور قابل توجهی کاهش یافت (26). همچنین نشان داده شده است که سیلیمارین پتانسیل بازگرداندن استرس اکسیداتیو ناشی از آمیلوئید بتا وزنده ماندن سلولی را دارد. کاهش سمیت آمیلوئید بتا توسط سیلیمارین به‫دلیل خاصیت آنتی اکسیدانتی آن گزارش شده است (27). سیلیمارین با افزایش فعالیت نشانگرهای آنتی اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی، استرس اکسیداتیو و سمیت عصبی ناشی از استامینوفن و منگنز را در مدل های حیوانی خنثی می‫کند (28و29). سیلیمارین با کاهش اکسیداسیون لیپید و پروتئین، و همچنین با فعال کردن فعالیت استیل کولین استراز، و بیان ژن سنتاز نیتریک اکسید القایی، اثرات محافظت کننده عصبی خود را در سمیت عصبی ناشی از منگنز ایجاد می‫کند (30). در هیپوکامپ و قشر مغز جوندگان مسن، سیلیمارین با مهار بالقوه تشکیل رادیکال‌های اکسیژن و پراکسیل همراه با محصولات اکسیداسیون پروتئین، محافظ عصبی در برابر آسیب های اکسیداتیو را اعمال می‫کند (31). تجویز سیلیمارین در یک مدل حیوانی انسفالوپاتی تولید شده توسط اسید 4 پنتنوئیک، فعالیت تنفسی در میتوکندری مغز را افزایش داد و پراکسیداسیون لیپیدی را مهار کرد (32) به‫طور کلی، نتایج میکروسکوپ الکترونی SEM و آزمون MTT نشان داد که داربست پلی‌کاپرولاکتان/سیلی‌مارین بسیار سازگارتر از داربست پلی‌کاپرولاکتان/کتیرا است. به‫منظور اعمال مهندسی بافت عصبی در ترمیم آسیب‫های عصبی، به‫نظر می‫رسد داربست پلی کاپرولاکتان/سیلیمارین می‫تواند یک نامزد امیدوارکننده باشد (33). نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که داربست‌های الیاف PCL حاوی میکروسفرهای کلاژن/ نانوذرات Bioglass 58S/3% و 10 درصد (جرم-جرم) می‌توانند انتخاب مناسبی برای ترمیم عیوب استخوانی باشند. مطالعات بیشتری باید در آینده برای ارزیابی عملکرد in vivo داربست‫های الیاف PCL حاوی میکروسفرهای کلاژن / نانوذرات Bioglass 58S حاوی 3 درصد وزنی و 10 درصد وزنی برای بازسازی نقص‫های استخوانی انجام شود (34). در مطالعه ای دیگر، داربست بسیار متخلخل از ژلاتین/کتیرا/نانو هیدروکسی آپاتیت با خواص مکانیکی مشابه استخوان اسفنجی از طریق خشک کردن انجمادی ساخته شد. داربست قابل تجزیه زیستی بود زیرا 10 درصد وزن اولیه خود را پس از 4 هفته خیساندن در PBS  از دست داده است. داربست زیست فعال بود. داربست ژلاتین/کتیرا/نانو هیدروکسی آپاتیت حاوی کوئرستین به‫طور بالقوه باعث ایجاد استخوان و مناسب برای بازسازی استخوان است (35). کامپوزیت‫های نانو این توانایی را دارند که دارورسانی بهتری داشته باشند و همچنین در هنگام استفاده در ساخت داربست به بهبود تکثیر سلولی کمک می‫کنند. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
پلی ساکاریدهای صمغ، در صورت استفاده به‫عنوان کامپوزیت با سایر مواد زیستی پتانسیل بهبود خواص فیزیکی، مکانیکی و بیولوژیکی داربست ساخته شده را دارند و می توان بر سمیت سلولی بیومواد مختلف با مخلوط کردن آن‫ها با پلی ساکاریدهای صمغ طبیعی غلبه کرد (36).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬


6- نتیجه گیری
نتایج به‫دست آمده از میکروسکوپ الکترونی SEM و همچنین تست MTT، زیست سازگاری بالای داربست پلی کاپرولاکتان/سیلیمارین/ کتیرا وتخلخل مناسب داربست را نسبت به گروه کنترل نشان داد. همچنین بررسی MTT داربست تحت تنش اکسیداتیو با گلوکز بالا و H2O2 نشان دهنده توان آنتی اکسیدانتی بالای داربست بر سلول‫های PC12  بود. بنابراین به‫نظر می‫رسد که داربست پلی کاپرولاکتان/سیلیمارین/کتیرا می‫تواند کاندیدای امیدوارکننده ای برای کاربرد در مهندسی بافت عصبی باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
7-  ﺗﺸﮑﺮ و ﻗﺪرداﻧﯽ 
نویسندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از دانشگاه محقق اردبیلی به‌دلیل حمایت مالی و فراهم آوردن تجهیزات اعلام می‌دارند.

-

  1. Neamnark A, Sanchavanakit N, Pavasant P, et al. In vitro biocompatibility of electrospun hexanoyl chitosan fibrous scaffolds towards human keratinocytes and fibroblasts. Eur Polym. 2008; 44(7): 2060–2067.
  2. Abdelhady S, Honsy K , Kurakula M,et al. Electro spun- nanofibrous mats: a modern wound dressing matrix with a potential of drug delivery and therapeutics. J Eng FibersFabrics. 2015; 10(4): 179–193.
  3. Gouda M, Hebeish A , Aljafari AL,et al. Synthesis and char-acterization of novel drug delivery system based on cellu-lose acetate electrospun nanofiber mats. J Ind Textile. 2014;43(3):319_329
  4. Nawalakhe RG, Hudson SM, Mohamed Seyam AF, et al. Development of electrospun iminochitosan for improved wound healing application. J Eng Fibers Fabrics. 2012; 7(2): 47–55.
  5. Han X, Xing Z, Si S, et al. Electrospun grape seed polyphe-nols/gelatin composite fibers contained silver nanoparticles as biomaterials. Fibers Polym. 2014; 15(12): 2572–2580
  6. Chambers C.S, Holečková V, Petrásková L, Biedermann D, et al. The silymarin composition… and why does it matter?  Food Res Int. 2017;100: 339-353
  7. SURAI, Peter F. Silymarin as a natural antioxidant: an overview of the current evidence and perspectives. Antioxidants. 2015; 4(1): 204-247.‏

8.BIJAK M. Silybin, a major bioactive component of milk thistle (Silybum marianum L. Gaernt.) Chemistry, bioavailability, and metabolism. Molecules. 2017; 22(11): 1942_1958.‏

  1. KREN V, et al. Silybin and silymarin-new effects and applications. Biomed papers, 2005; 149(1): 29-41.‏
  2. Wellington K, Jarvis B. Silymarin: a review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs, 2001; 15: 465-489.‏
  3. Nussinovitch A. Plant gum exudates of the world: sources, distribution, properties, and applications. CRC Press; 2009; 12: 21_40
  4. Carpentier J, Conforto E, Chaigneau C, Vendeville JE, et al. Complex coacervation of pea protein isolate and tragacanth gum: Comparative study with commercial polysaccharides. Innovative Food Sci Emerging Technol. 2021;5(1):1026_1041.
  5. Zarshenas M, Arabzadeh A, Tafti M.A, Kordafshari G, et al. Application of herbal exudates in traditional Persian medicine. Galen Med. J. 2013;1:78–83.
  6. Whistler, R.L. Exudate gums. In Industrial Gums; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 1993; 5: 309–339.
  7. Mohamadnia Z, Zohuriaan-Mehr M.J, Kabiri K, Razavi-Nouri M. Tragacanth gum-graft-polyacrylonitrile: Synthesis, characterization and hydrolysis. J. Polym. Res. 2008;15:173–180
  8. Kaith B.S, Jindal R, Kumar V. Biodegradation of Gum tragacanth acrylic acid based hydrogel and its impact on soil fertility. Polym Degrad Stab. 2015;115:24–31.
  9. Haeri S.M.J, Sadeghi Y, Salehi M, Farahani R.M, et al. Osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells on gum tragacanth hydrogel. Biologicals 2016; 44:123–128.
  10. Kulanthaivel S, Sharan Rathnam V.S, Agarwal T, Pradhan S, et al. Gum tragacanth–alginate beads as proangiogenic–osteogenic cell encapsulation systems for bone tissue engineering. J Mater Chem B. 2017; 5:4177–4189.
  11. Javed S,Kohli K,Ali M. Reassessing bioavailability of silymarin. Alternative medicine review, 2011; 16(3): 239_250.‏
  12. Gillessen A, Schmidt H. Silymarin as supportive treatment in liver diseases: A narrative review. Advances in therapy. 2020; 37(4): 1279-1301.‏
  13. 21. He L, Liao S, Quan D, Ma K, et al. Synergistic effects of electrospun PLLA fiber dimension and pattern on neonatal mouse cerebellum C17. 2 stem cells. Acta Biomater.2010;6(8):2960-2969.
  14. 22. Abbaszadeh S, Asadi A, Zahri S, Abdolmaleki A, et al. Does Phenytoin Have Neuroprotective Role and Affect Biocompatibility of Decellularized Sciatic Nerve Scaffold? Gene Cell Tissue.2021;8(1):1087_1097.

 

  1. Sharifi F, Irani S, Zandi M. Synthesis and surface modification of polycaprolactone nanofibers for tissue engineering. J Ardabil university of medical sci. 2014;14(3):217-228.‏
  2. Asadi A, Zahri S ,Abdolmaleki A. Biosynthesis, characterization and evaluation of the supportive properties and biocompatibility of DBM nanoparticles on a tissue-engineered nerve conduit from decellularized sciatic nerve. Regenerative Therapy.2020;14: 315-321.
  3. Murata N, Murakami K, Ozawa Y. Silymarin attenuated the amyloid-β plaque burden and improved behavioral abnormalities in an Alzheimer's disease mouse model. Biosci Biotechnol Biochem.2010;74: 2299– 2306.
  4. Yin F, Liu J, Ji X, Wang Y, et al. Silibinin: A novel inhibitor of Aβ aggregation. Neurochem Int.2011;58: 399– 403.
  5. Lu P, Mamiya T, Lu LL. Silibinin prevents amyloid beta peptide-induced memory impairment and oxidative stress in mice. Br J Pharmacol.2009;157:1270–1277.
  6. Nencini C, Giorgi G, Micheli L. Protective effect of Silymarin on oxidative stress in rat brain. Phytomedicine. 2007;14:129– 135.
  7. Chtourou Y, Fetoui H, Garoui el M, Boudawara T, et al. Improvement of cerebellum redox states and cholinergic functions contribute to the beneficial effects of Silymarin against manganese-induced neurotoxicity. Neurochem Res.2012;37:469– 479.
  8. Chtourou Y, Fetoui H, Sefi M. Silymarin, a natural antioxidant, protects cerebral cortex against manganese-induced neurotoxicity in adult rats. Biometals. 2010;23:985– 996.
  9. Galhardi F, Mesquita K, Monserrat JM, Barros DM. Effect of Silymarin on biochemical parameters of oxidative stress in aged and young rat brain. Food Chem Toxicol. 2009;47:2655– 2660.
  10. Vengerovskii AI, Khazanov VA, Eskina KA, Vasilyev KY. Effects of Silymarin (hepatoprotector) and succinic acid (bioenergy regulator) on metabolic disorders in experimental diabetes mellitus. Bull Exp Biol Med. 2007;144:53– 56.
  11. Najafi R, Asadi A, Zahri S, Abdolmaleki A. Comparison of Biocompatibility and Morphology of PC12 Cell Line on a Polycaprolactane/Silymarin Scaffold and a Polycaprolactane/Tragacanth Scaffold. Gene, Cell and Tissue J.2022;1(25):1–10
  12. 34. Sahrapeyma H, Asefnejad A, Azami M, Sadroddiny E. Structural and morphological investigation of polycaprolactone multi-component scaffold containing collagen microsphere/bioglass nanoparticles. Nanomed Res J. 2022;7(4):338-349.‏
  13. Madani P, Hesaraki S, Saeedifar M, Ahmadi Nasab N. The controlled release, bioactivity and osteogenic gene expression of Quercetin-loaded gelatin/tragacanth/nano-hydroxyapatite bone tissue engineering scaffold. J Biomater Sci Polym Ed. 2023; 34(2):217-242.‏
  14. Koyyada A, Orsu P. Natural gum polysaccharides as efficient tissue engineering and drug delivery biopolymers. J Drug Delivery Sci Technol. 2021;63:1024-31.‏