نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرمآباد، ایران
2 استاد، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرمآباد، ایران
3 استادیار، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرمآباد، ایران
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق جمعآوری و شناسایی فوزاریومهای مرتبط با گیاهان تیره کدوئیان در مناطق کشت این محصولات در استان تهران و ارزیابی چندشکلی ITS-rDNA RFLP به عنوان یک نشانگر مولکولی در بررسی روابط خویشاوندی این گروه از فوزاریومها میباشد. مواد و روشها: در طول فصل زراعی از مناطق عمدهی کشت محصولات جالیزی استان تهران، از محل ریشه، طوقه، ساقه تا ارتفاع 15 سانتیمتری و همچنین خاک اطراف گیاه (ریزوسفر)، نمونهبرداری ها بهعمل آمد. جدایههای قارچی بر روی محیطکشت PPA کشت، و به روش تک اسپور کردن خالص سازی شده و سپس بر اساس ویژگیهای ریختشناسی شناسایی شدند. DNA ژنومی قارچها استخراجشد. ناحیه ژنومی rDNA ITS جدایههای فوزاریوم با استفاده از پرایمرهای ITS1 و ITS4، تکثیر شد. محصولاتPCR با استفاده از آنزیمهای Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι مورد هضم قرار گرفتند و سپس بر روی ژل آگارز 5/2 درصد بارگذاریشدند. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار NTSYS-PC V2.02 انجام شد. بدین نحو که ابتدا یک ماتریکس داده از وجود (1) یا عدم وجود (0) هر باند برای هر جدایه ترسیم شد. سپس با استفاده از ضریب شباهت SM، ماتریکس فاصله ژنتیکی تولید و بر اساس مقیاس SAHN و روش UPGMA دندوگرام شباهت جدایهها ترسیمشد. نتایج: در مجموع تعداد 95 جدایه فوزاریوم متعلق به گونههای Fusarium solani و F. oxysporum شناسایی شد که از این تعداد، 45 جدایه متعلق به F. solani و 50 جدایه به عنوان F. oxysporum تشخیص داده شد. از تکثیر ناحیه بین ITS1 و ITS4 در جدایههای F. oxysporum یک ناحیهی bp 25±550 و در جدایههای F. solani ، ناحیهای به اندازهی bp 25±575 بهدست آمد.آنزیم Bgl ΙΙ فاقد جایگاه برشی در ناحیهی ITS بود. آنزیم Sma Ι در گونههای F. oxysporum بدون جایگاه برشی، ولی در گونههای F. solani دارای یک جایگاه برشی بود و دو قطعهی 350 و 230 جفت بازی تولیدشد. آنزیم Mbo Ι در برخی جدایههای تشخیصدادهشده به نام F. oxysporum چهار باند (bp 180،bp 160، bp 130و bp 90 )تولید کرد که این جدایهها به عنوان F. redolens تشخیص دادهشدند و در دیگر جدایههای F. oxysporum دو باند bp 320 و bp 190 تولید شد. آنزیم Mbo Ι در جدایههای F. solani به استثنای چند جدایه فاقد جایگاه برشی بود. نتیجهگیری: به نظر میرسد، استفاده از روش rDNA-RFLP با استفاده از آنزیمهای برشی Sma I و Mbo I میتواند روش مناسبی برای تفکیک گونههای فوزاریوم متعلق به دو بخش Elegans و Martiella-Ventricosum از همدیگر و همچنین بررسی تنوع داخل یا بین گونهای در بخش Elegans باشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Investigation of ITS-rDNA polymorphisms in Fusarium of Elegans and Martiella-Ventricosum sections related to Cucurbits using RFLP marker in Tehran province
نویسندگان [English]
- FA Khazaee 1
- M Darvishnia 2
- E Bazgir 3
1 Ph.D. student, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran.
2 Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran
3 Assistant Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to collect and identify Fusarium of Elegans and Martiella-Ventricosum sections related to cucurbits plant in Tehran province and evaluation the efficiency of ITS-RDNA RFLP polymorphisms as a molecular marker in assessment of relationships between these Fusaria. Materials and Methods: During the cropping season, sampling from cucurbit field was done from the root, crown, stem up to height of 15 cm, as well as the soil (rhizosphere). Fungal isolates were cultured on PPA culture medium, purified by single sporulation method, and then identified based on morphological characteristics. Genomic DNA of fungi was extracted. The genomic DNA of Fusarium isolates was extracted and ITS-rDNA region was amplified with ITS1 and ITS4 primers. PCR products were digested with SmaI, BglΠ and MboI restriction enzymes and then loaded on 2.5% agarose gel. Data analyses were performed by NTSYS-PC V2.02 software. At first, a data matrix of the presence (1) or absence (0) of each band was drawn for each isolate. Then using the SM similarity coefficient, the genetic distance matrix was produced and the similarity dendogram of isolates was drawn based on the SAHN coefficient and the UPGMA method. Results: A total of 95 Fusarium isolates belonging to species of Fusarium solani and Fusarium oxysporum were identified. Of which, 45 isolates belonging to F. solani and 50 isolates were identified as F. oxysporum. In this research, based on morphological characteristics, F. redolens isolates were not differentiated from F. oxysporum isolates and both were placed under F. oxysporum group. PCR reproduction of ITS region result in fragments in size of 550±25 bp in F. oxysporum isolates, and 575±25 bp in F. solani isolates. Bgl Π enzyme had no cleavage site in ITS products in both species, neither in F. solani nor in F. oxysporum. SmaI enzyme had one cleavage site in F. solani isolates and produced two fragments (350bp and 230bp) but had no cleavage site in F. oxysporum isolates. The MboI enzyme in some F. oxysporum isolates produced four fragments (180bp, 160bp, 130 bp and 90 bp), so these isolates called as Fusarium redolens. MboI enzyme in others Fusarium oxysporum isolates produced two bands (320 bp and 190 bp). MboI enzyme had no restriction site in F. solani isolates. Conclusion: It seems that the use of rDNA-ITS RFLP marker is a suitable method to differentiate Fusarium species belonging to section Elegance from those of Martiella-Ventricosum sections. It is more efficient method for studying diversity within and between species in section Elegans.
کلیدواژهها [English]
- Cucurbit
- Fusarium
- Elegans
- Martiella-Ventricosum
- rDNA-ITS-RFLP
- مقدمه
گیاهان خانواده کدوییان (Cucurbitaceae) یا گیاهان جالیزی، یکی از مهمترین گروههای گیاهی هستند که در ایران و بهخصوص استان تهران کشت میشوند. از مهمترین گونههای اقتصادی این خانواده میتوان به هندوانه ((Citrullus lunatus L. خیار (Cucumis sativus L. )، طالبی (C. melo var. cantalupenses ) و خربزه (C. melo var. inodorus) اشاره کرد. استان تهران با دارابودن بیش از 5000 هکتار زمین زیر کشت جالیز، یکی از استانهای مهم در تولید این محصولات میباشد (1). گونههای مختلف فوزاریوم مهمترین عوامل بیماریزای خاکزاد و همچنین بذرزاد هستند که باعث پوسیدگیها و پژمردگیها در بیش از 80 گونهگیاهی و از جمله کدوییان میشوند (2). از مهمترین این عوامل بیماریزا میتوان به Fusarium oxysporum f.sp. melonis, (بیمارگر گروه ملونها) F. proliferatumو F. solani f.sp. cucurbitae (عامل پوسیدگی طوقه و ریشهی ملونها، کدو خورشتی، کدو حلوایی و میوهی کدو حلوایی) اشارهکرد (4،3).
Wollenweber و Reinking در سال 1935 گونههای فوزاریوم موجود را در شانزده بخش قرار دادند. در این تقسیمبندی، بخش Elegans شامل گونههای F. oxysporum و F. redolens و بخش Martierella شامل تک گونهی F. solani بود. بعدا Snyder و Hansen (1941)، همهی گونهها، نژادها و فرم مخصوصها را از بخشهای Martiella و Ventricosum به F. solani منتقل کردند و این چیدمان به طور وسیعی مورد استفاده قرارگرفت (5).
تشخیص ساختار جمعیتی قارچهای بیمارگر در جهت دانستن زیستشناسی موجود و توسعه راهکارهای کنترل بیماری (6) و همچنین مطالعات مولکولی بین افراد که جزیی از این ساختار جمعیتی میباشند بسیار مهم است (7).
گروه مرکب F. solani دارای دامنه میزبانی گسترده و تنوع بالایی در بیماریزایی و ریختشناسی است (8). هر چند که سیستم ردهبندی بر مبنای ریختشناسی تنها، ابزار دقیقی در جهت شناسایی گروه F. solani و یا فهم روابط بین جدایههای این گروه را فراهم نمیکند. لذا داشتن یک دستاورد مولکولی در جهت نیل به این هدف، میتواند امیدوارکننده باشد (10،9). وجود تنوع زیاد در گونهها، خصوصاَ درشرایط محیطی مختلف، دانشمندان علم ردهبندی را بر آن داشته است تا ویژگیهای خاص دارای اهمیت را در ردهبندی گونهها مورد توجه قرار دهند. بههمین دلیل، روشها و کلیدهای مختلفی برای شناسایی گونهها ارائه شدهاست (5). شناسایی گونههای فوزاریوم عمدتا بر اساس ویژگیهای متمایز کنندهی شکل و اندازهی ماکرو و میکروکنیدیها، وجود یا عدم وجود کلامیدوسپور و همچنین خصوصیات ظاهری پرگنهها، رنگدانهها و سرعت رشد بر روی محیطهای کشت آگار بنا شده است (5). از میان روشهایی که توسط محققین در جهت تجزیه و تحلیلهای تبارشناسی گونههای F. solani استفاده میشود، میتوان به مواردی مانند ناحیههای بین ژنی در DNA ریبوزومی (rDNA-IGS)، ناحیههای نسخهبرداری شده میانژنی (rDNA-ITS)، ژن زیر واحد بزرگ RNA (LSU) و فاکتور آلفای طویلشدن ترجمه (tef-α) اشاره کرد (11).
واحدهای تکرار شوندهی DNA ریبوزومی (rDNA) شامل توالیهای ژنی و غیر ژنی یا فاصلهها میباشند. هر واحد تکراری شامل یک کپی از ژنهای 18S, 5.8S, 28S و دو فاصله، یعنی فاصلهی بین نواحی نسخهبرداری شونده (ITS2 وITS1)(Internal Transcribed Spacer) و فاصلهی بین دو ژن (IGS)( Intergenic spacer) میباشد. ژنهای rDNA بهدلیل اینکه از حفاظت شدگی خیلی بالایی برخوردار هستند، در جهت مطالعات تکاملی در سطوح بالا مورد استفاده قرار میگیرند. در حالیکه فاصلههای بین نواحی نسخهبرداری شده ITS2) و (ITS1 بسیار متغیر هستند و لذا در بررسیها جهت مطالعه روابط خویشاوندی در
سطح گونه از آنها استفاده میشود. بنابراین بهدلیل سودمندی ناحیه ITS در علم سیستماتیک و تاکسونومی، در ردهبندی دیگر گونههای قارچی نیز مورد استفاده قرار میگیرد (13،12). ناحیه rDNA-ITS احتمالا بیشترین ناحیهای است که از DNA قارچها، توالییابی شدهاست. نواحی rDNA-ITS و rDNA-IGS بیشترین درجهی تنوع را در مقایسه با دیگر نواحی ژنومی مانند LSU و SSU از خود نشان دادهاند (14). آغازگرهای مختلفی از جمله آغازگرهای ITS1 و ITS4 جهت مطالعه این قارچها استفاده شدهاند (15). برای بررسی میزان شباهت ژنومی بین گونههای فوزاریوم، ناحیهی ITS تکثیر شده با استفاده از آنزیمهای برشی متعددی مورد برش (هضم) قرار میگیرند. از جملهی آنزیمهایی که کاربرد بیشتر در مطالعات ژنتیکی قارچها دارند میتوان به, SmaΙ, HinfΙ, ,SphΙ, HaeΙΙΙ, BglΙΙ, HindΙΙΙ, MspΙ, MobΙ, SacΙ, SalΙI, HincI, XhoΙ, EcoRIIPstΙ و ... اشاره کرد (17، 16، 11). در این پژوهش نیز از سه آنزیم برشی Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι جهت هضم توالیهای ITS استفاده شد. پژوهش حاضر با هدف جمعآوری و شناسایی فوزاریومهای مرتبط با گیاهان تیره کدوئیان در مناطق کشت این محصولات در استان تهران و همچنین ارزیابی کارایی ناحیهی ژنومی ITS بهعنوان یک نشانگر مولکولی در بررسی روابط خویشاوندی این گروه از فوزاریومها، انجام گرفت.
- مواد و روشها
جمعآوری و جداسازی قارچها: در طول فصل زراعی 97-1396 از مناطق عمدهی کشت محصولات جالیزی استان تهران، نمونهبرداری ها بهعمل آمد. از ریشه، طوقه و ساقه تا ارتفاع 15 سانتیمتری و همچنین از خاک اطراف گیاه (ریزوسفر تا عمق 10 تا 20 سانتیمتری و فاصله 15 سانتی متری از گیاه)، بهعنوان نمونه جمعآوری شد (جدول 1).
تعداد جدایه |
شماره جدایه |
گیاه میزبان |
منطقه/ بخش |
3 |
F 791, F 779, F 781 |
خربزه |
پاکدشت |
13 |
F 670, F 654, F 72, F73, F 51, F 134, F 770, F 771, F 82, F 84, F 91, F 92, F 20 |
خیار گلخانه |
پیشوا |
5 |
F 736, F 36, F 1002, F 1004, F 1006 |
خربزه |
پیشوا |
2 |
F 800, F 805 |
هندوانه |
پیشوا |
20 |
F 718, F 696, F 698, F 756, F 725, F 727, F 731, F 753, F 623, F 624, F 626, F 627, F 620, F 622, F 633, F 628, F 632, F 743, F 744, F 746 |
کدو خورشتی |
پیشوا |
8 |
F 643, F 645, F 653, F 47, F 63, F 64, F 66, F 123 |
خیار گلخانه |
جوادآباد |
2 |
F 180, F 183 |
خیار زمینی |
جوادآباد |
12 |
F 710, F 708, F 175, F 176, F 177, F 178, F 174, F 184, F 185, F 186, F 188, F 234 |
خربزه |
جوادآباد |
6 |
F 662, F 678, F 679, F 199, F689, F677 |
هندوانه |
جوادآباد |
11 |
F 112, F 195, F 687, F 686, F 600, F 602, F 603, F 604, F 607, F 608, F611 |
طالبی |
جوادآباد |
1 |
F189 |
خیار زمینی |
دماوند |
2 |
F 615, F 852 |
کدو خورشتی |
دماوند |
1 |
F 141 |
خیار زمینی |
رباطکریم |
6 |
F 816, F 817, F 806, F 807, F 808, F 821 |
خیار گلخانه |
رباطکریم |
2 |
F 829, F 832 |
خیار زمینی |
ورامین |
1 |
FOM1 |
مرکز تحقیقات کشاورزی |
ورامین |
95 |
مجموع جدایهها |
|
|
جدول 1 : شمارهی جدایهها، میزبان و محل جمعآوری آنها
از خاکهای آماده شده به نسبت g1: ml50 در آب مقطر استریل حاوی آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین ppm 500، در ارلنهای با حجم 100 میلیلیتر یک سوسپانسیون تهیهشد و سپس جهت آزاد شدن بهتر اجزای قارچی در سوسپانسیون حاصله، ارلنها بهمدت 2 ساعت بر روی دستگاه شیکر با دور rpm 150 قرار داده شدند. در مورد نمونههای ریشه و ساقه نیز، ابتدا آنها را به با چاقو یا اسکالپل به قطعات ریز چند میلیمتری برش داده و سپس مانند مرحله بالا مقدار یک گرم از این قطعات به 50 میلیلیتر آب اضافه شد. مقدار یک میلیلیتر از این سوسپانسیونها بر روی پلیتهای 10 سانتیمتری حاوی محیط کشتPPA (Peptone PCNB Agar) حاوی ppm 500 آنتیبیوتیک سیپروفلوکساسین (Ciprofloxacin 500 mg) پخش شد.
پلیتها بهمدت 48 ساعت در دمای 2±27 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند و پس از این مدت در زیر میکروسکوپ تک کلونیهای فوزاریوم با سوزن جداسازی شده و به یک محیط کشت جدید PPA انتقال دادهشدند. خالص سازی جدایههای قارچی بهروش تک اسپور کردن انجام شد.
شناسایی قارچها: جدایههای قارچی پس از خالصسازی بر اساس خصوصیات ریختشناسی پرگنه (قطر، رنگ، بافت و رنگدانهها و ...) و میکروسکوپی مانند تولید ماکرو و میکروکنیدیوم، نوع فیالیدها، شکل و تعداد سلولهای ماکرو و میکروکنیدی، شکل، نحوه تشکیل و تعداد سلولهای کلامیدوسپورها مورد بررسی قرار گرفتند (18،5).
استخراج DNA: جدایههای فوزاریوم بر روی محیط کشت PDA و دمای 25 درجه سانتیگرادکشت دادهشدند. بعد از گذشت 10 روز، با اضافه کردن 3 میلیلیتر آب مقطر استریل به سطح محیط کشت و با کمک یک قاشقک، میسیلیومها به آرامی ساییده شده و در یک ویال 2 میلیلیتر جمعآوری شدند. DNA ژنومی قارچها بر اساس روش گونزالس و همکاران (2010) استخراجشد. میکروتیوبها بهمدت 5 دقیقه در دور rpm4000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. سپس قسمت رویی (سوپرناتانت) دور ریخته شد و به قسمت تهنشین شده (پلت) مقدار 5/0 میلیلیتر از بافر استخراج [SDS 3% w/v, EDTA 0.5 mM, NaCl 1 M, Tris-HCl 0.1 mM pH:8] SDS داغ (65 درجه سانتیگراد) اضافه شد و با عمل برگرداندن متناوب کاملاَ یکنواخت شدند. سپس بهمدت 10 دقیقه در حمام آبگرم (65 درجه سانتیگراد) قرار دادهشدند مجدداَ با آرام برگرداندن متناوب (صد مرتبه) محتویات آنها مخلوط شده و سپس 4/0 میلیلیتر از مخلوط کلروفرم/فنول (v/v 1:1) به آنها اضافه شد. با عمل برگرداندن میکروتیوبها مخلوط شده و سپس بهمدت 5 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند. محتویات ویالها سه فاز شده که فاز رویی حاوی DNA میباشد. فاز رویی (8/0 میلیلیتر) به یک ویال جدید انتقال داده شد و 8/0میلیلیتر پروپانول خنک در حد یخ به آن اضافه شد. پس از یکنواخت کردن محتویات میکروتیوبها با عمل برگرداندن متناوب، بهمدت 10 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند. ( بهمنظور رسوب بیشتر DNA ، بهتر است قبل از انجام این سانتریفیوژ، ویالها بهمدت 30 دقیقه در دمای 20- میلیلیتر نگهداری شوند). پس از سانتریفیوژ، ایزوپروپانول رویی با دقت و بهآرامی کشیده شد و سپس 1 میلیلیتر اتانول 75 درصد به DNA رسوب شده در ته ویالها اضافه شد و با عمل برگرداندن متناوب DNA رسوب شده کاملا شسته شد. سپس بهمدت 5 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت و با کج کردن آرام تیوبها دور ریخته شد تا پلت DNA در ته تیوب باقی بماند. سپس در معرض هوا (حدود 30 دقیقه) خشک شد. به پلت DNAی کاملا خشک شده 50 میکرولیتر از بافر [%0.122 w/v Tris-Base pH:8 10mM, %0.02 w/v EDTA 1mM] TE اضافه شد و اجازه داده شد تا DNA کاملا در آن حل شده و سپس در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداریشد. از دستگاه اسپکتروفوتومتر جهت بررسی کیفیت و غلظت DNAی ژنومی استفاده شد (19).
واکنشهای PCR: جهت تکثیر ناحیه ژنومی ITS مربوط به گونههای فوزاریوم (یک قطعه DNA با طول تقریبا bp 600) از آغازگرهای ITS1 (5ʹ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ʹ) و ITS4 (5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ) استفادهشد (5). تکثیرها در یک واکنش با حجم 25 میکرولیتر، حاوی 5/12 میکرولیتر مسترمیکس (2X)، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (µM 5/0) ، µL 5/2 از DNA الگو و 8 میکرولیتر آب مقطر مخصوص PCR انجام شد. ویالهای حاوی مخلوط واکنش در دستگاه PCR (Bioer®) قرار دادهشدند. مراحل واکنش PCR بدین نحو انجام شد: واسرشتهسازی اول به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، سپس 35 چرخه از سه مرحلهی واسرشته سازی دوم بهمدت 1 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد ، اتصال پرایمرها بهمدت 1 دقیقه در دمای 58 درجه سانتیگراد و بسط رشتهها بهمدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد و در نهایت 10 دقیقه در بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام شد (16). جهت بررسی قطعات ژنومی تکثیری احتمالی، محصول نهایی PCR در ژل آگارز 1 درصد حاوی DNA Safe Stain (Sinaclon™) (5/1 میکرولیتر در mL 100میلیلیتر ژل) در دستگاه الکتروفورز با ولتاژ 80 ولت و مقاومت 80 میلیآمپر بهمدت 60 دقیقه بارگذاری شد. سپس جهت آشکارسازی باندها، ژلها بر روی دستگاه ژل داکیومنت با نور UV و شدت نور 320 قرار داده شدند.
مخلوط واکنش هضم آنزیمی: مقدار 12 تا 15میکرولیتر از محصول PCR با استفاده از 10- 5 واحد آنزیمی از آنزیمهای Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι بههمراه 5 میکرولیتر از بافر عمومی همراه آنزیم، بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (Jena Bioscience) مورد هضم قرارگرفتند. در پایان، این محصولات بر روی ژل آگارز 5/2 درصد حاوی مادهی رنگآمیزی DNA Safe Stain، بهمدت 30 دقیقه در 80 ولت و 200 میلیآمپر بارگذاری شدند. قطعات برش خوردهی DNA بههمراه خطکش 1Kb DNA در زیر نور UV 320 nm آشکارسازی شدند.
تجزیه و تحلیل دادهها: جهت بررسی اندازهی مولکولی قطعات تکثیر شده، با استفاده از نرمافزار Digimizer®، بر اساس منحنی استاندارد بهدست آمده از حرکت هر باند در مقابل لگاریتم اندازه مولکولی آن باند از خطکش مولکولی 1Kb، طول قطعات ژنی تکثیر شده، محاسبه شد. قطعاتی که بر روی ژل آگارز، فاصله یکسانی را طی کرده بودند بهعنوان یک باند مشترک در نظر گرفته شدند. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار NTSYS-PC V2.02 انجام شد. بدین نحو که ابتدا یک ماتریکس داده از وجود (1) یا عدم وجود (0) هر باند برای هر جدایه ترسیم شد. سپس با استفاده از ضریب شباهت SM، ماتریکس فاصله ژنتیکی تولید و بر اساس مقیاس SAHN و روش UPGMA دندوگرام شباهت جدایهها ترسیمشد.
3-نتایج
جمعآوری و شناسایی مورفولوژیک قارچها
در مجموع تعداد 95 جدایه فوزاریوم متعلق به گونههای Fusarium solani و F. oxysporum شناسایی شد که از این تعداد، 45 جدایه متعلق به F. solani و 50 جدایه بهعنوان F. oxysporum تشخیص داده شد (شکل 1).
شکل 1: خصوصیات ظاهری Fusarium solani: ردیف بالا A- کنیدیوفور، B- ماکروکنیدیوم و میکروکنیدیوم، C- کلامیدوسپور. Fusarium oxysporum: ردیف پایین D- کنیدیوفور، E- ماکروکنیدیوم و میکروکنیدیوم، F- کلامیدوسپور.
واکنشهای PCR
تکثیر ناحیه بین ITS1 و ITS4 در جدایههای F. oxysporum یک ناحیهی bp 25±550 را تولید کرد و در جدایههای F. solani ، ناحیهای به اندازهی bp 25±575 تکثیر شد (شکل 2).
شکل 2: باندهای تکثیرشده از ناحیهیITS (ITS1, 5.8S, ITS2) در جدایههای فوزاریوم. Fusarium oxysporum (F654, F180) و Fusarium solani (F623, F73, F678, F679, F743, F624)
هضم آنزیمی و تجزیه و تحلیل های باندهای RFLP
پس از تکثیر ناحیهی ITS، این محصول PCR توسط آنزیمهای Sma Ι Bgl ΙΙ, و Mbo Ι مورد هضم قرار گرفت. آنزیم Bgl ΙΙ هیچگونه برشی در محصول PCR انجام نداد که نشان میدهد این آنزیم فاقد جایگاه برشی در ناحیهی ITS این دو گونهی فوزاریوم میباشد. آنزیم Sma Ι در گونهی F. oxysporum فاقد جایگاه برشی بود. ولی در گونههای F. solani ایجاد دو قطعهی 350 و 230 جفت بازی کرد (شکل 3).
شکل 3: الگوی قطعات هضمشده از ناحیهی ITS توسط آنزیم Sma Ι در برخی جدایههای Fusarium solani
آنزیم Mbo Ι در جدایههای F. solani بهاستثنای چند جدایه فاقد جایگاه برشی بود. این آنزیم در برخی جدایههای F. oxysporum چهار باند به اندازههای 180، 160، 130و 90 جفت باز، و در دیگر جدایهها دو قطغهی 320 و 190 جفت بازی تولید کرد. احتمالاَ باندهایی با اندازه کوچکتری نیز تولید میشوند که در این آزمایشها رویت نشدند (شکل 4).
شکل شماره 4: الگوی قطعات هضمشده از ناحیهی ITS توسط آنزیم Mbo Ι. Fusarium oxysporum (F756, F188, F177, F134, F180), F. solani (F817), F.redolens (F770, F829, F36, F20, F808, F806)
رسم درختواره تشابه جدایههای فوزاریوم بر اساس نتایج هضم آنزیمی نشانداد،. جدایههای F. redolens در گروهی جدا از F. oxysporum قرار گرفتند که این نتایج با نتایج برخی محققین مطابقت داشت (شکل 5)
شکل 5: دندوگرام شباهت بین جدایههای فوزاریوم، حاصل از قطعات برش خوردهی آنزیمی از ناحیه ITS ریبوزومی، بر اساس روش UPGMA و ضریب تشابه SM.
- بحث
با توجه به اینکه بخش Elegans شامل دو گونهی F. oxysporum و F. redolens و بخشهایMartiella-Ventricosum شامل تک جنس F. solani میباشد (20)، لذا مراحل ریختشناسی و استفاده از نشانگرهای مولکولی بر روی تفکیک و تمایز این گونهها از همدیگر استوار شد. شناسایی جدایهها بر اساس صفات ظاهری مانند رنگ پرگنه، داشتن سر دروغین، مونوفیالید بودن، نوع میکروکنیدیوم، شکل و تعداد سلول ماکروکنیدیوم و همچنین تشکیل کلامیدوسپور و شکل آن انجام شد. رنگ پرگنهها در هر دو گونه عمدتا سفید پنبهای است و در گونههای سولانی گاهی به رنگ نخودی با تجمع قطرات ریز آب بر روی میسیلیومها که حاوی انبوهی از ماکروکنیدی و یا میکروکنیدیها است، میباشد. پشت تشتکهای پتری در گونهی سولانی عمدتاَ زرد نخودی گاهی متمایل به قهوهای میباشد. در گونههای اکسیسپوروم پشت تشتک محیط کشت دارای تنوع رنگ از سفید، صورتی تا سیاهرنگ دیدهمیشود. در هر دو گونه برخی جدایهها به صورت دایرههای متحدالمرکز رشد میکنند.
در این بررسیها شاید مهمترین وجه تمایز گونههی سولانی و اکسیسپوروم از همدیگر، طول فیالیدها و شکل و اندازهی میکروکنیدیومها بود. در گونهی اکسیسپوروم، طول فیالید کوتاهتر بوده (11) و ادغام میسیلومها در همدیگر و تولید حالت بندکفشی شدن بیشتر است. میکروکنیدیومهای گونهی اکسیسپوروم نیز عمدتاَ یک سلولی و تخممرغی شکل است. میکروکنیدیوم در برخی گونهی سولانی عمدتاَ دو سلولی و در گروه دیگر نیز، یک سلولی بیضی یا تخممرغی شکل ولی بسیار بزرگتر از میکروکنیدیومهای اکسیسپوروم است (16).
ماکروکنیدیومها در گونهی اکسیسپوروم عمدتا با 3 دیواره سلولی و کمی خمیده و دارای سلول پاشنه کاملاَ مشخص، ولی ماکروکنیدیومها در گونهی سولانی صاف تا کمی خمیده با 5-4-3 دیواره عرضی و پاشنه اسپور کاملا واضح نیست.
کلامیدوسپورهای هر دو قارچ تقریبا مشابه هم، به صورت تکی، جفت سلول (عمدتاَ) و زنجیر سه تایی دیدهشد. به نظر میرسد تنها تفاوت جزیی بین آنها در این باشد که سطح کلامیدوسپورهای گونهی سولانی کمی خاردار میباشد.
در بررسیهای ریختشناسی گونههای F. oxysporum و گونهی F. redolens، از همدیگر تمایز دادهنشدند. و این امر قابل پیشبینی بود. زیرا برخی محققین نیز در آزمایشات خود قادر به تفکیک این دو گونه از همدیگر نشدهبودند (17).
در تکثیر ناحیهی ITS ریبوزومی توالیهایی به طول حدود bp 630-500 تکثیر شد. با توجه به اینکه در گونههای F. oxysporum و همچنین برخی فرم مخصوصهایی از مجموعهی F. solani مانند F.s. f.sp. piperis طول rDNA-ITS حدود bp 550 است و مضافاَ اینکه در مجموعهی F. solani برخی گونهها bp 570 و برخی دیگر bp 620 است، لذا تفکیک قطعی گونههای این دو بخش مهم و پیچیده از همدیگر بر اساس طول توالی ناحیهی ITS ریبوزومی کار آسانی نخواهد بود (8). در این آزمایشات نیز این موضوع کاملاَ صدق میکرد و تنها جدیههای از F. solani که باند حدود bp 600 تولید کردند به راحتی و با اطمینان از گونههای بخش Elegans قابل شناسایی بودند.
این نتایج امکان وجود چندشکلی را در ناحیهی rDNA-ITS در میان جدایههای مختلف این گونهها، تقویت کرد که این موضوع در ادامه با هضم این توالیها توسط آنزیمهای برشی بررسی شد.
با توجه به شباهتهای بسیار نزدیک ظاهری و مولکولی گونههای F. oxysporum و F. redolens به همدیگر و عدم تفکیک آنها در مراحل قبل، تلاش شد، از آنزیمهایی که در تفکیک این دو گونه از همدیگر و همچنین این دو گونه از F. solani کارایی داشته باشند استفاده شود
آنزیم Sma I در جدایههای متعلق به بخش Elegans فاقد جایگاه برشی بود. در جدایههایی که تحت نام F. solani شناسایی شده بودند داری یک جایگاه برشی بود که منجر به تولید دو قطعهی حدود bp 350 و bp 230 شد. (به استثنای شش جدایهی F123, F234, F602, F608, F662 و F718 که هیچگونه باندی مشاهدهنشد). این آنزیم برشی در تفکیک این دو گروه قارچی از همدیگر کارایی مناسبی دارد. این نتایج با نتایج سایر محققان نیز مطابقت داشت (16،11). بهنظر میرسد، شش گونهی ذکر شده در بالا جزو جدایههایی از F. solani مانند F.s. f.sp. piperis باشند که از لحاظ ظاهری به F. solani شباهت دارند ولی از لحاظ الگوی rDNA-RFLP-ITS به F. oxysporum شبیه هستند.
با توجه به اینکه اطلاعاتی در مورد ایجاد چندشکلی در ناحیهی rDNA-ITS توسط آنزیم Bgl Π و در نهایت شناسایی فوزاریومهای بخشهای Elegans و Martiella توسط نگارندگان یافت نشده بود، از آنزیم Bgl Π بهعنوان یک آنزیم جدید در این بررسیها استفاده شد تا شاید نتایج احتمالی آن به حل این موضوع کمک کند. نتایج نشان داد که آنزیم Bgl Π بر روی جدایههای مورد مطالعه در این تحقیق از این دو بخش فوزاریوم، فاقد هر گونه جایگاه برشی است و هیچگونه باند تمایز کنندهای که در تقسیم بندی این گونههای فوزاریوم تعیینکننده باشد تولید نمیشود.
آنزیم Mbo Ι بهدلیل توانایی تولید باندهایی با اندازههای مختلف، در تفکیک دو گونهی F. oxysporum و F. redolens از همدیگر،کارایی خوبی از خود نشان داده بود (17). نتایج حاصل از این تحقیق نیز این موضوع راتایید کرد. این آنزیم در برخی جدایههای F. oxysporum چهار باند به اندازههایی حدود bp 180،bp 160، bp 130و bp 90 تولید کرد که با نتایج Waalwijk و همکاران 1996 مشابهت داشت و این جدایهها بهعنوان F. redolens تشخیص داده شدند. در برخی دیگر از جدایههای شناسایی شده بهنام F. oxysporum نیز دو باند bp 320 و bp 190 تولیدشد که این گروه بهعنوان F. oxysporum تشخیص داده شدند. در هر دو گروه احتمالاَ باندهایی با اندازههای کوچکتر نیز تولید میشوند که در این آزمایشها رویت نشدند (17).
در پنج جدایه (F183, F184, F185, F186 و F72 ) که از لحاظ ریختشناسی بهعنوان F. oxysporum تشخیص داده شده بودند هیچگونه چند شکلی مشاهده نشد. که علت این امر شاید شناسایی اشتباه برخی گونههای بسیار شبیه از گروه F. solani یا F. subglutinans بهجای F. oxysporum باشد (5).
در جدایههای تحت نام F. solani به استثنای پنج جدایه F626 ,F770, F725, F756 و F817 آنزیم Mbo Ι فاقد جایگاه برشی بود و هیچگونه چندشکلی مشاهده نشد. در جدایههای F756 و F817 مانند جدایههای F. oxysporum دو باند bp 320 و bp 190 و در جدایه F725 سه باند bp 180،bp 160 و bp 130، و در دو جدایهی F626 و F770 یک تک باند bp 180 مشاهدهشد.
با توجه به شباهت بسیار زیاد برخی ویژگیهای F. redolens و F. solani خصوصاَ در ماکروکنیدی، و یا وجود گونهها بینابینی در میان F. redolens و F. oxysporum حصول این نتایج دور از انتظار نبود (5).
در این تحقیق جدایههای متعلق به بخش Elegans تنوع داخل گونهای بیشتری نسبت به جدایههای متعلق به بخش Martiella از خود نشان دادند. جدایههای F. redolens در گروهی جدا از F. oxysporum قرار گرفتند که این نتایج با نتایج برخی محققین مطابقت دارد (17).
- نتیجهگیری
در پایان، بهنظر میرسد که استفاده از روش rDNA-RFLP با استفاده از آنزیمهای برشی Sma I و Mbo I میتواند روش مناسبی برای تفکیک گونههای فوزاریوم متعلق به دو بخش Elegans و Martiella از همدیگر و خصوصاَ بررسی تنوعهای داخل یا بین گونهای در بخش Elegans باشد.
- تشکر و قدردانی
از مسئولین آزمایشگاه بیماریشناسی گروه گیاهپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، جهت همکاری صمیمانهاشان در انجام گرفتن برخی آزمایشها و همچنین از جناب آقای مهندس داریوش شهریاری- مرکز تحقیقات کشاورزی ورامین- جهت دریافت جدایه Fom1 تشکر و قدردانی ویژه به عمل میآید.
-
- Anonymous. Agricultural Statistics. Crop year. 1397-98. Ministry of agriculture, duputy of planning and economy. Volume 1 (Crops). 1399 (In Persian). 87 pp.
- Avinash TS, Ravishankar RV. Biocontrol potentials of plant growth promoting Rhizobacteria against Fusarium wilt disease of cucurbit. eSci Journal of Plant Pathology. 2013,02 (03) : 155-161.
- Namiki F, Shiomi T, Kayamura T, Tsuge T. Characterization of the formae speciales of Fusarium oxysporum causing wilts of cucurbits by DNA fingerprinting with nuclear repetitive DNA sequences. Applied and Environmental Microbiology. 1994, 60: 2684-2691.
- Pivonia S, Cohen R, Kafkafi U, Ben Ze’ev IS, et al. Sudden wilt of melons in southern Israel: fungal agents and relationship with plant development. Plant Disease. 1997, 81: 1264–1268.
- Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual. UK: Blackwell Publish Ltd. 2006, 388 pp.
- Malvick DK, Percich JA. Genotypic and pathogenic diversity among pea-infecting isolates of Aphanomyces euteiches from the central and western United States. Phytopathology. 1998, 88: 915–921.
- Leung H, Nelson RJ, Leach JE. Population structure of plant pathogenic fungi and bacteria. In: Andrews, J.H., Tomm-erup, I.C. (Eds.), Advances in Plant Pathology. Academic Press, London. 1993; pp. 157–204.
- Brasileiro BTRV, Coimbra MRM, De Morais Jr, MA, De Oliveria, NT. Genetic variability within Fusarium solani species as revealed by PCR-fingerprinting based on PCR markers. Brazilian Journal of Microbiology. 2004, 35, 205–210.
- O’Donnell K, Sutton DA, Fothergill A, McCarthy D, et al. Molecular phylogenetic diversity, multilocus haplotype nomenclature, and in vitro antifungal resistance within the Fusarium solani species complex. J. Clinical Microbiol. 2008, 46: 2477–2490.
- Zhang N, O’Donnell K, Sutton DA, Nalim FA, et al. Members of the Fusarium solani species complex that cause infections in both humans and plants are common in the environment. Journal of Clinical Microbiology. 2006, 44: 2186–2190.
- Lee YM, Choi YK, Min BR. PCR-RFLP and Sequence Analysis of rDNA ITS Region in the Fusarium spp. The Journal of Microbiology. 2000, 38(2): 66-73.
- Bruns TD, White TJ, Taylor JW. Fungal molecular systematics. Annual Review. Ecology and Systematic. 1991; 22: 525-564.
- Samuels GJ, Seifert KA. The impact of molecular characters on systematics of filamentous Ascomycetes. Annual review. Phytopathology. 1995; 33: 37-67.
- Depriest PT, Been MD. Numerous group I introns with variable distributions in the ribosomal DNA of a lichen fungus. Journal of Molecular Biology. 1992, 228: 315–321.
- Hibbett DS, Vilgalys R. Evolutionary relationships of Lentinus to the Polyporaceae: evidence from restriction analysis of enzymatically amplified ribosomal DNA. Mycologia 1991, 83: 425-439.
- Chehri k, Salleh B, Yli-Mattila T, Reddy K.R.N. and Abbasi S. Molecular characterization of pathogenic Fusarium species in cucurbit plants from Kermanshah province, Iran. Saudi Journal of Biological Sciences. 2011, 18: 341-351.
- Waalwijk C, Baayen RP, De Koning JRA, Gams W. Ribosomal DNA analyses challenge the status of Fusarium sections Liseola and Elegans. Sydowia. 1996, 48(1): 90-104.
- Nelson PE, Toussoun TA, Marasas WFO. Fusarium species. An illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press, University Park, Philadelphia. 1983; 193 pp.
- González Mendoza D, Argumedo-Delira R, Morales-Trejo A, Pulido-Herrera A, et al.,. A rapid method for isolation of total DNA from pathogenic filamentous plant fungi. Genetics and Molecular Research. 2010; 9 (1): 162-166.
- Refai M, Hassan A, Hamed M. Monograph on the genus Fusarium. Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University. Giza, Egypt. 2015; Pp.275.