فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرم‎آباد، ایران

2 استاد، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرم‎آباد، ایران

3 استادیار، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه لرستان، خرم‎آباد، ایران

10.52547/JCT/3.3.187

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق جمع­آوری و شناسایی فوزاریوم­های مرتبط با گیاهان تیره کدوئیان در مناطق کشت این محصولات در استان تهران و ارزیابی چندشکلی ITS-rDNA RFLP به عنوان یک نشانگر مولکولی در بررسی روابط خویشاوندی این گروه از فوزاریوم­ها می­باشد. مواد و روش­ها: در طول فصل زراعی از مناطق عمده‌ی کشت محصولات جالیزی استان تهران، از محل ریشه، طوقه، ساقه تا ارتفاع 15 سانتی­متری و همچنین خاک اطراف گیاه (ریزوسفر)، نمونه‌برداری ها به‌عمل آمد. جدایه‌های قارچی بر روی محیط­کشت PPA کشت، و به روش تک اسپور کردن خالص سازی شده و سپس بر اساس ویژگی‌های ریخت­شناسی شناسایی شدند. DNA ژنومی قارچ‌ها استخراج‌شد. ناحیه ژنومی rDNA ITS جدایه‌های فوزاریوم با استفاده از پرایمرهای ITS1 و ITS4، تکثیر شد. محصولات­PCR با استفاده از آنزیم‌های Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι مورد هضم قرار گرفتند و سپس بر روی ژل آگارز 5/2 درصد بارگذاری­شدند. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار NTSYS-PC V2.02 انجام شد. بدین نحو که ابتدا یک ماتریکس داده از وجود (1) یا عدم وجود (0) هر باند برای هر جدایه ترسیم شد. سپس با استفاده از ضریب شباهت SM، ماتریکس فاصله ژنتیکی تولید و بر اساس مقیاس SAHN و روش UPGMA دندوگرام شباهت جدایه‌ها ترسیم­شد. نتایج: در مجموع تعداد 95 جدایه فوزاریوم متعلق به گونه­های Fusarium solani و F. oxysporum شناسایی شد که از این تعداد، 45 جدایه متعلق به F. solani و 50 جدایه به عنوان F. oxysporum تشخیص داده شد. از تکثیر ناحیه بین ITS1 و ITS4 در جدایه­های F. oxysporum یک ناحیه­ی  bp 25±550 و در جدایه­های F. solani ، ناحیه­ای به اندازه‌ی bp 25±575 به­دست آمد.آنزیم Bgl ΙΙ فاقد جایگاه برشی در ناحیه­ی ITS بود. آنزیم Sma Ι در گونه‌های F. oxysporum بدون جایگاه برشی، ولی در گونه­های F. solani دارای یک جایگاه برشی بود و دو قطعه­ی 350 و 230 جفت بازی تولید­شد. آنزیم Mbo Ι در برخی جدایه­های تشخیص­داده‌شده به نام F. oxysporum چهار باند (bp 180،bp 160، bp 130و bp 90 )تولید کرد که این جدایه­ها به عنوان F. redolens تشخیص داده­شدند و در دیگر جدایه­های F. oxysporum دو باند bp 320 و bp 190 تولید شد. آنزیم Mbo Ι در جدایه­های F. solani به استثنای چند جدایه فاقد جایگاه برشی بود. نتیجه­گیری: به نظر می­رسد، استفاده از روش rDNA-RFLP با استفاده از آنزیم­های برشی Sma I و Mbo I می­تواند روش مناسبی برای تفکیک گونه­های فوزاریوم متعلق به دو بخش Elegans و Martiella-Ventricosum از همدیگر و همچنین بررسی تنوع داخل یا بین گونه­ای در بخش Elegans باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Investigation of ITS-rDNA polymorphisms in Fusarium of Elegans and Martiella-Ventricosum sections related to Cucurbits using RFLP marker in Tehran province

نویسندگان [English]

  • FA Khazaee 1
  • M Darvishnia 2
  • E Bazgir 3

1 Ph.D. student, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran.

2 Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran

3 Assistant Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Lorestan University, Khorramabad, Iran

چکیده [English]

Aim: The aim of this study was to collect and identify Fusarium of Elegans and Martiella-Ventricosum sections related to cucurbits plant in Tehran province and evaluation the efficiency of ITS-RDNA RFLP polymorphisms as a molecular marker in assessment of relationships between these Fusaria. Materials and Methods: During the cropping season, sampling from cucurbit field was done from the root, crown, stem up to height of 15 cm, as well as the soil (rhizosphere). Fungal isolates were cultured on PPA culture medium, purified by single sporulation method, and then identified based on morphological characteristics. Genomic DNA of fungi was extracted. The genomic DNA of Fusarium isolates was extracted and ITS-rDNA region was amplified with ITS1 and ITS4 primers. PCR products were digested with SmaI, BglΠ and MboI restriction enzymes and then loaded on 2.5% agarose gel. Data analyses were performed by NTSYS-PC V2.02 software. At first, a data matrix of the presence (1) or absence (0) of each band was drawn for each isolate. Then using the SM similarity coefficient, the genetic distance matrix was produced and the similarity dendogram of isolates was drawn based on the SAHN coefficient and the UPGMA method. Results: A total of 95 Fusarium isolates belonging to species of Fusarium solani and Fusarium oxysporum were identified. Of which, 45 isolates belonging to F. solani and 50 isolates were identified as F. oxysporum. In this research, based on morphological characteristics, F. redolens isolates were not differentiated from F. oxysporum isolates and both were placed under F. oxysporum group. PCR reproduction of ITS region result in fragments in size of 550±25 bp in F. oxysporum isolates, and 575±25 bp in F. solani isolates. Bgl Π enzyme had no cleavage site in ITS products in both species, neither in F. solani nor in F. oxysporum. SmaI enzyme had one cleavage site in F. solani isolates and produced two fragments (350bp and 230bp) but had no cleavage site in F. oxysporum isolates. The MboI enzyme in some F. oxysporum isolates produced four fragments (180bp, 160bp, 130 bp and 90 bp), so these isolates called as Fusarium redolens. MboI enzyme in others Fusarium oxysporum isolates produced two bands (320 bp and 190 bp). MboI enzyme had no restriction site in F. solani isolates. Conclusion: It seems that the use of rDNA-ITS RFLP marker is a suitable method to differentiate Fusarium species belonging to section Elegance from those of Martiella-Ventricosum sections. It is more efficient method for studying diversity within and between species in section Elegans.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cucurbit
  • Fusarium
  • Elegans
  • Martiella-Ventricosum
  • rDNA-ITS-RFLP
  • مقدمه

گیاهان خانواده کدوییان (Cucurbitaceae) یا گیاهان جالیزی، یکی از مهمترین گروه­های گیاهی هستند که در ایران و به‌خصوص استان تهران کشت می­شوند. از مهمترین گونه­های اقتصادی این خانواده می­توان به هندوانه ((Citrullus lunatus L. خیار (Cucumis sativus L. )، طالبی (C. melo var. cantalupenses ) و خربزه (C. melo var. inodorus) اشاره کرد. استان تهران با دارا­بودن بیش از 5000 هکتار زمین زیر کشت جالیز، یکی از استان­های مهم در تولید این محصولات می­باشد (1). گونه‌های مختلف فوزاریوم مهمترین عوامل بیماریزای خاک­زاد و همچنین بذرزاد هستند که باعث پوسیدگی­ها و پژمردگی­ها در بیش از 80 گونه‌گیاهی و از جمله کدوییان می‌شوند (2). از مهمترین این عوامل بیماری‌زا می‌توان به Fusarium oxysporum f.sp. melonis, (بیمارگر گروه ملون­ها)  F. proliferatumو F. solani f.sp. cucurbitae (عامل پوسیدگی طوقه و ریشه­ی ملون‌ها، کدو خورشتی، کدو حلوایی و میوه­ی کدو حلوایی) اشاره­کرد (4،3).

Wollenweber و Reinking در سال 1935 گونه‌های فوزاریوم موجود را در شانزده بخش قرار دادند. در این تقسیم­بندی، بخش Elegans شامل گونه­های F. oxysporum و F. redolens و بخش Martierella شامل تک گونه­ی F. solani بود. بعدا Snyder و Hansen (1941)، همه‌ی گونه‌ها، نژادها و فرم مخصوص‌ها را از بخش‌های Martiella و Ventricosum به F. solani منتقل کردند و این چیدمان به طور وسیعی مورد استفاده قرار­گرفت (5).

تشخیص ساختار جمعیتی قارچ­های بیمارگر در جهت دانستن زیست­شناسی موجود و توسعه راهکارهای کنترل بیماری (6) و همچنین مطالعات مولکولی بین افراد که جزیی از این ساختار جمعیتی می­باشند بسیار مهم است (7).

گروه مرکب F. solani دارای دامنه میزبانی گسترده و تنوع بالایی در بیماریزایی و ریخت­شناسی است (8). هر چند که سیستم رده­بندی بر مبنای ریخت­شناسی تنها، ابزار دقیقی در جهت شناسایی گروه F. solani و یا فهم روابط بین جدایه­های این گروه را فراهم نمی­کند. لذا داشتن یک دستاورد مولکولی در جهت نیل به این هدف، می­تواند امیدوارکننده باشد (10،9). وجود تنوع زیاد در گونه­ها، خصوصاَ درشرایط محیطی مختلف، دانشمندان علم رده­بندی را بر آن داشته است تا ویژگی­های خاص دارای اهمیت را در رده­بندی گونه­ها مورد توجه قرار دهند. به‌همین دلیل، روش­ها و کلیدهای مختلفی برای شناسایی گونه­ها ارائه شده­است (5). شناسایی گونه­های فوزاریوم عمدتا بر اساس ویژگی­های متمایز کننده­ی شکل و اندازه­ی ماکرو و میکروکنیدی­ها، وجود یا عدم وجود کلامیدوسپور و همچنین خصوصیات ظاهری پرگنه­ها، رنگدانه­ها و سرعت رشد بر روی محیط­های کشت آگار بنا شده است (5). از میان روش­هایی که توسط محققین در جهت تجزیه و تحلیل­های تبارشناسی گونه­های F. solani استفاده می­شود، می­توان به مواردی مانند ناحیه­های بین ژنی در DNA ریبوزومی (rDNA-IGS)، ناحیه‌های نسخه­برداری شده میان­ژنی (rDNA-ITS)، ژن زیر واحد بزرگ RNA (LSU) و فاکتور آلفای طویل­شدن ترجمه (tef-α) اشاره کرد (11).

 واحدهای تکرار شونده­ی DNA ریبوزومی (rDNA) شامل توالی­های ژنی و غیر ژنی یا فاصله‌ها می‌باشند. هر واحد تکراری شامل یک کپی از ژنهای 18S, 5.8S, 28S و دو فاصله، یعنی فاصله­ی بین نواحی نسخه­برداری شونده (ITS2 وITS1)(Internal Transcribed Spacer) و فاصله­ی بین دو ژن (IGS)( Intergenic spacer) می­باشد. ژن­های rDNA به‌دلیل اینکه از حفاظت شدگی خیلی بالایی برخوردار هستند، در جهت مطالعات تکاملی در سطوح بالا مورد استفاده قرار می­گیرند. در حالی­که فاصله­های بین نواحی نسخه­برداری شده ITS2)  و (ITS1 بسیار متغیر هستند و لذا در بررسی­ها جهت مطالعه روابط خویشاوندی در

سطح گونه از آنها استفاده می­شود. بنابراین به‌دلیل سودمندی ناحیه ITS در علم سیستماتیک و تاکسونومی، در رده­بندی دیگر گونه­های قارچی نیز مورد استفاده قرار می‎گیرد (13،12). ناحیه rDNA-ITS احتمالا بیشترین ناحیه‌ای است که از DNA قارچ­ها، توالی­یابی شده­است. نواحی rDNA-ITS و rDNA-IGS بیشترین درجه­ی تنوع را در مقایسه با دیگر نواحی ژنومی مانند LSU و SSU از خود نشان داده­اند (14). آغازگرهای مختلفی از جمله آغازگرهای ITS1 و ITS4 جهت مطالعه این قارچها استفاده ‌شده‌اند (15). برای بررسی میزان شباهت ژنومی بین گونه­های فوزاریوم، ناحیه‌ی ITS تکثیر شده با استفاده از آنزیم­های برشی متعددی مورد برش (هضم) قرار می­گیرند. از جمله­ی آنزیم‌هایی که کاربرد بیشتر در مطالعات ژنتیکی قارچ­ها دارند می­توان به, SmaΙ, HinfΙ, ,SphΙ, HaeΙΙΙ, BglΙΙ, HindΙΙΙ, MspΙ, MobΙ, SacΙ, SalΙI, HincI, XhoΙ, EcoRIIPstΙ و ... اشاره کرد (17، 16، 11). در این پژوهش نیز از سه آنزیم برشی Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι جهت هضم توالی­های ITS استفاده شد. پژوهش حاضر با هدف جمع­آوری و شناسایی فوزاریوم­های مرتبط با گیاهان تیره کدوئیان در مناطق کشت این محصولات در استان تهران و همچنین ارزیابی کارایی ناحیه‌ی ژنومی ITS به‌عنوان یک نشانگر مولکولی در بررسی روابط خویشاوندی این گروه از فوزاریوم­ها، انجام گرفت.

  • مواد و روش‌ها

جمع­آوری و جداسازی قارچ­ها: در طول فصل زراعی 97-1396 از مناطق عمده‌ی کشت محصولات جالیزی استان تهران، نمونه‌برداری ها به‌عمل آمد. از ریشه، طوقه و ساقه تا ارتفاع 15 سانتی­متری و همچنین از خاک اطراف گیاه (ریزوسفر تا عمق 10 تا 20 سانتی­متری و فاصله 15 سانتی متری از گیاه)، به‌عنوان نمونه جمع­آوری شد (جدول 1).

 

 

 

 

 

تعداد جدایه

شماره جدایه

گیاه میزبان

منطقه/ بخش

3

F 791, F 779, F 781

خربزه

پاکدشت

13

F 670, F 654, F 72, F73, F 51, F 134, F 770, F 771, F 82, F 84, F 91, F 92, F 20

خیار گلخانه

پیشوا

5

F 736, F 36, F 1002, F 1004, F 1006

خربزه

پیشوا

2

F 800, F 805

هندوانه

پیشوا

20

F 718, F 696, F 698, F 756, F 725, F 727, F 731, F 753, F 623, F 624, F 626, F 627, F 620, F 622, F 633, F 628, F 632, F 743, F 744, F 746

کدو خورشتی

پیشوا

8

F 643, F 645, F 653, F 47, F 63, F 64, F 66, F 123

خیار گلخانه

جوادآباد

2

F 180, F 183

خیار زمینی

جوادآباد

12

F 710, F 708, F 175, F 176, F 177, F 178, F 174, F 184, F 185, F 186, F 188, F 234

خربزه

جوادآباد

6

F 662, F 678, F 679, F 199, F689, F677

هندوانه

جوادآباد

11

F 112, F 195, F 687, F 686, F 600, F 602, F 603, F 604, F 607, F 608, F611

طالبی

جوادآباد

1

F189

خیار زمینی

دماوند

2

F 615, F 852

کدو خورشتی

دماوند

1

F 141

خیار زمینی

رباط‌کریم

6

F 816, F 817, F 806, F 807, F 808, F 821

خیار گلخانه

رباط‌کریم

2

F 829, F 832

خیار زمینی

ورامین

1

FOM1

مرکز تحقیقات کشاورزی

ورامین

95

مجموع جدایه‌ها

 

 

 جدول  1 : شماره‌ی جدایه‌ها، میزبان و محل جمع‌آوری آنها

 

از خاک‌های آماده شده به نسبت g1: ml50 در آب مقطر استریل حاوی آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین ppm 500، در ارلن‌های با حجم 100 میلی‎لیتر یک سوسپانسیون تهیه­شد و سپس جهت آزاد شدن بهتر اجزای قارچی در سوسپانسیون حاصله، ارلن‌ها به‌مدت 2 ساعت بر روی دستگاه شیکر با دور rpm  150 قرار داده شدند. در مورد نمونه­های ریشه و ساقه نیز، ابتدا آنها را به با چاقو یا اسکالپل به قطعات ریز چند میلی­متری برش داده و سپس مانند مرحله بالا مقدار یک گرم از این قطعات به 50 میلی‎لیتر آب اضافه شد. مقدار یک میلی‎لیتر از این سوسپانسیون­ها بر روی پلیت­های 10 سانتی‌متری حاوی محیط کشتPPA  (Peptone PCNB Agar) حاوی ppm 500 آنتی­بیوتیک سیپروفلوکساسین (Ciprofloxacin 500 mg) پخش شد.

پلیت‌ها به‌مدت 48 ساعت در دمای 2±27 درجه سانتی‎گراد گرمخانه­گذاری شدند و پس از این مدت در زیر میکروسکوپ تک کلونی­های فوزاریوم با سوزن جداسازی شده و به یک محیط کشت جدید PPA انتقال داده­شدند. خالص سازی جدایه­های قارچی به‌روش تک اسپور کردن انجام شد.

شناسایی قارچها: جدایه­های قارچی پس از خالص­سازی بر اساس خصوصیات ریخت­شناسی پرگنه (قطر، رنگ، بافت و رنگدانه­ها و ...) و میکروسکوپی مانند تولید ماکرو و میکروکنیدیوم، نوع فیالیدها، شکل و تعداد سلول­های ماکرو و میکروکنیدی، شکل، نحوه تشکیل و تعداد سلول­های کلامیدوسپورها مورد بررسی قرار گرفتند (18،5).

استخراج DNA: جدایه‌های فوزاریوم بر روی محیط کشت PDA و دمای 25 درجه سانتی‎گرادکشت داده‌شدند. بعد از گذشت 10 روز، با اضافه کردن 3 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به سطح محیط کشت و با کمک یک قاشقک، میسیلیوم‌ها به آرامی ساییده‌ شده و در یک ویال 2 میلیلیتر جمع‌آوری شدند. DNA ژنومی قارچ‌ها بر اساس روش گونزالس و همکاران (2010) استخراج‌شد. میکروتیوب­ها به‌مدت 5 دقیقه در دور rpm4000 در دمای 4 درجه سانتی‎گراد سانتریفیوژ شدند. سپس قسمت رویی (سوپرناتانت) دور ریخته شد و به قسمت ته‌نشین شده (پلت) مقدار 5/0 میلی‌لیتر از بافر استخراج  [SDS 3% w/v, EDTA 0.5 mM, NaCl 1 M, Tris-HCl 0.1 mM pH:8] SDS داغ (65 درجه سانتی‌گراد) اضافه شد و با عمل برگرداندن متناوب کاملاَ یکنواخت شدند. سپس به‌مدت 10 دقیقه در حمام آب‌گرم (65 درجه سانتی‌گراد) قرار داده‌شدند مجدداَ با آرام برگرداندن متناوب (صد مرتبه) محتویات آنها مخلوط شده و سپس 4/0 میلی‌لیتر از مخلوط کلروفرم/فنول (v/v 1:1) به آنها اضافه شد. با عمل برگرداندن میکروتیوبها مخلوط شده و سپس به‌مدت 5 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند. محتویات ویال‌ها سه فاز شده که فاز رویی حاوی DNA می‌باشد. فاز رویی (8/0 میلی‌لیتر) به یک ویال جدید انتقال داده شد و 8/0میلی‌لیتر پروپانول خنک در حد یخ به آن اضافه ‌شد. پس از یکنواخت کردن محتویات میکروتیوب‌ها با عمل برگرداندن متناوب، به‌مدت 10 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند. ( به‌منظور رسوب بیشتر DNA ، بهتر است قبل از انجام این سانتریفیوژ، ویال­ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای 20- میلیلیتر نگهداری شوند). پس از سانتریفیوژ، ایزوپروپانول رویی با دقت و به‌آرامی کشیده شد و سپس 1 میلی‌لیتر اتانول 75 درصد به DNA رسوب شده در ته ویال‌ها اضافه شد و با عمل برگرداندن متناوب DNA رسوب شده کاملا شسته شد. سپس به‌مدت 5 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت و با کج کردن آرام تیوب‌ها دور ریخته شد تا پلت DNA در ته تیوب باقی بماند. سپس در معرض هوا (حدود 30 دقیقه) خشک شد. به پلت DNAی کاملا خشک شده 50 میکرولیتر از بافر [%0.122 w/v Tris-Base pH:8 10mM, %0.02 w/v EDTA 1mM]  TE اضافه ­شد و اجازه داده­ شد تا DNA کاملا در آن حل شده و سپس در دمای 20- درجه سانتی‎گراد نگهداری­شد. از دستگاه اسپکتروفوتومتر جهت بررسی کیفیت و غلظت DNAی ژنومی استفاده شد (19).

واکنش‌های PCR: جهت تکثیر ناحیه ژنومی ITS مربوط به گونه­های فوزاریوم (یک قطعه DNA با طول تقریبا bp 600) از آغازگرهای ITS1 (5ʹ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ʹ) و ITS4 (5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ) استفاده‌شد (5). تکثیرها در یک واکنش با حجم  25 میکرولیتر، حاوی 5/12 میکرولیتر مستر‌میکس (2X)، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (µM 5/0) ، µL 5/2 از DNA الگو و 8 میکرولیتر آب مقطر مخصوص PCR انجام شد. ویال‌های حاوی مخلوط واکنش در دستگاه PCR (Bioer®) قرار داده‌شدند. مراحل واکنش PCR بدین نحو انجام شد: واسرشته‌سازی اول به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، سپس 35 چرخه از سه مرحله‌ی واسرشته سازی دوم به‌مدت 1 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد ، اتصال پرایمرها به‌مدت 1 دقیقه در دمای 58 درجه سانتی‌گراد و بسط رشته‌ها به‌مدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و در نهایت 10 دقیقه در بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد انجام شد (16). جهت بررسی قطعات ژنومی تکثیری احتمالی، محصول نهایی PCR در ژل آگارز 1 درصد حاوی DNA Safe Stain (Sinaclon™) (5/1 میکرولیتر در mL 100میلیلیتر ژل) در دستگاه الکتروفورز با ولتاژ 80 ولت و مقاومت 80 میلی‌آمپر به‌مدت 60 دقیقه بارگذاری شد. سپس جهت آشکارسازی باندها، ژل­ها بر روی دستگاه ژل داکیومنت با نور UV و شدت نور 320  قرار داده شدند.

مخلوط واکنش هضم آنزیمی: مقدار 12 تا 15میکرولیتر از محصول PCR با استفاده از 10- 5 واحد آنزیمی از آنزیم‌های Sma Ι، Bgl ΙΙ و Mbo Ι به‌همراه 5 میکرولیتر از بافر عمومی همراه آنزیم، بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (Jena Bioscience) مورد هضم قرار‌گرفتند. در پایان، این محصولات بر روی ژل آگارز 5/2 درصد حاوی ماده‌ی رنگ‌آمیزی DNA Safe Stain، به‌مدت 30 دقیقه در 80 ولت و 200 میلی‌آمپر بارگذاری شدند. قطعات برش خورده‌ی DNA به‌همراه خط‌کش 1Kb DNA در زیر نور UV 320 nm آشکارسازی شدند.

تجزیه و تحلیل داده‌ها: جهت بررسی اندازه­ی مولکولی قطعات تکثیر شده، با استفاده از نرم­افزار Digimizer®، بر اساس منحنی استاندارد به‌دست آمده از حرکت هر باند در مقابل لگاریتم اندازه مولکولی آن باند از خط­کش مولکولی 1Kb، طول قطعات ژنی تکثیر شده، محاسبه شد. قطعاتی که بر روی ژل آگارز، فاصله یکسانی را طی کرده­ بودند به‌عنوان یک باند مشترک در نظر گرفته­ شدند. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار NTSYS-PC V2.02 انجام شد. بدین نحو که ابتدا یک ماتریکس داده از وجود (1) یا عدم وجود (0) هر باند برای هر جدایه ترسیم شد. سپس با استفاده از ضریب شباهت SM، ماتریکس فاصله ژنتیکی تولید و بر اساس مقیاس SAHN و روش UPGMA دندوگرام شباهت جدایه‌ها ترسیم­شد.

3-نتایج

جمع­آوری و شناسایی مورفولوژیک قارچ­ها

در مجموع تعداد 95 جدایه فوزاریوم متعلق به گونه­های Fusarium solani و F. oxysporum شناسایی شد که از این تعداد، 45 جدایه متعلق به F. solani و 50 جدایه به‌عنوان F. oxysporum تشخیص داده شد (شکل 1).

 

شکل 1: خصوصیات ظاهری Fusarium solani: ردیف بالا A- کنیدیوفور، B- ماکروکنیدیوم و میکروکنیدیوم، C- کلامیدوسپور. Fusarium oxysporum: ردیف پایین D- کنیدیوفور، E- ماکروکنیدیوم و میکروکنیدیوم، F- کلامیدوسپور.

واکنش­های PCR

تکثیر ناحیه بین ITS1 و ITS4 در جدایه­های F. oxysporum یک ناحیه­ی  bp 25±550 را تولید کرد و در جدایه­های F. solani ، ناحیه­ای به اندازه‌ی bp 25±575 تکثیر شد (شکل 2).

 

شکل 2: باندهای تکثیر­شده از ناحیه­یITS (ITS1, 5.8S, ITS2)  در جدایه‌های فوزاریوم. Fusarium oxysporum (F654, F180) و Fusarium solani (F623, F73, F678, F679, F743, F624)

هضم آنزیمی و تجزیه و تحلیل های باندهای RFLP

پس از تکثیر ناحیه­ی ITS، این محصول PCR توسط آنزیم­های Sma Ι Bgl ΙΙ, و Mbo Ι مورد هضم قرار گرفت. آنزیم Bgl ΙΙ هیچ‌گونه برشی در محصول PCR انجام نداد که نشان می‌دهد این آنزیم فاقد جایگاه برشی در ناحیه­ی ITS این دو گونه­ی فوزاریوم می­باشد. آنزیم Sma Ι در گونه­ی F. oxysporum فاقد جایگاه برشی بود. ولی در گونه­های F. solani ایجاد دو قطعه­ی 350 و 230 جفت بازی کرد (شکل 3).

 

شکل 3: الگوی قطعات هضم­شده از ناحیه‌ی ITS توسط آنزیم Sma Ι در برخی جدایه‌های Fusarium solani

آنزیم Mbo Ι در جدایه­های F. solani به‌استثنای چند جدایه فاقد جایگاه برشی بود. این آنزیم در برخی جدایه­های F. oxysporum چهار باند به اندازه­های 180، 160، 130و 90 جفت باز، و در دیگر جدایه­ها دو قطغه­ی 320 و 190 جفت بازی تولید کرد. احتمالاَ باندهایی با اندازه کوچکتری نیز تولید می­شوند که در این آزمایش‌ها رویت نشدند (شکل 4).

 

شکل شماره 4: الگوی قطعات هضم­شده از ناحیه‌ی ITS توسط آنزیم Mbo Ι. Fusarium oxysporum (F756, F188, F177, F134, F180), F. solani (F817), F.redolens (F770, F829, F36, F20, F808, F806)

رسم درخت­واره تشابه جدایه­های فوزاریوم بر اساس نتایج هضم آنزیمی نشان­داد،. جدایه­های F. redolens در گروهی جدا از F. oxysporum قرار گرفتند که این نتایج با نتایج برخی محققین مطابقت داشت (شکل 5)

 

شکل 5: دندوگرام شباهت بین جدایه­های فوزاریوم، حاصل از قطعات برش خورده­ی آنزیمی از ناحیه ITS ریبوزومی، بر اساس روش UPGMA و ضریب تشابه SM.

  • بحث

   با توجه به اینکه بخش Elegans شامل دو گونه­ی F. oxysporum و F. redolens و بخش‌هایMartiella-Ventricosum شامل تک جنس F. solani می­باشد (20)، لذا مراحل ریخت­شناسی و استفاده از نشانگرهای مولکولی بر روی تفکیک و تمایز این گونه­ها از همدیگر استوار شد. شناسایی جدایه­ها بر اساس صفات ظاهری مانند رنگ پرگنه، داشتن سر دروغین، مونوفیالید بودن، نوع میکروکنیدیوم، شکل و تعداد سلول ماکروکنیدیوم و همچنین تشکیل کلامیدوسپور و شکل آن انجام شد. رنگ پرگنه­ها در هر دو گونه عمدتا سفید پنبه­ای است و در گونه­های سولانی گاهی به رنگ نخودی با تجمع قطرات ریز آب بر روی میسیلیوم­ها که حاوی انبوهی از ماکروکنیدی و یا میکروکنیدی­ها است، می­باشد. پشت تشتک­های پتری در گونه­ی سولانی عمدتاَ زرد نخودی گاهی متمایل به قهوه­ای می­باشد. در گونه­های اکسیسپوروم پشت تشتک محیط کشت دارای تنوع رنگ از سفید، صورتی تا سیاهرنگ دیده­می­شود. در هر دو گونه برخی جدایه­ها به صورت دایره­های متحدالمرکز رشد می‌کنند.

در این بررسی­ها شاید مهمترین وجه تمایز گونه­هی سولانی و اکسیسپوروم از همدیگر، طول فیالیدها و شکل و اندازه­ی میکروکنیدیوم­ها بود. در گونه­ی اکسیسپوروم، طول فیالید کوتاه­تر بوده (11) و ادغام میسیلوم­ها در همدیگر و تولید حالت بندکفشی شدن بیشتر است. میکروکنیدیوم­های گونه­ی اکسیسپوروم نیز عمدتاَ یک سلولی و تخم­مرغی شکل است. میکروکنیدیوم در برخی گونه­ی سولانی عمدتاَ دو سلولی و در گروه دیگر نیز، یک سلولی بیضی یا تخم­مرغی شکل ولی بسیار بزرگتر از میکروکنیدیوم‌های اکسیسپوروم است (16).

ماکروکنیدیوم­ها در گونه­ی اکسیسپوروم عمدتا با 3 دیواره سلولی و کمی خمیده و دارای سلول پاشنه کاملاَ مشخص، ولی ماکروکنیدیوم­ها در گونه­ی سولانی صاف تا کمی خمیده با 5-4-3 دیواره ­عرضی و پاشنه اسپور کاملا واضح نیست.

کلامیدوسپورهای هر دو قارچ تقریبا مشابه هم، به صورت تکی، جفت سلول (عمدتاَ) و زنجیر سه تایی دیده­شد. به نظر می­رسد تنها تفاوت جزیی بین آنها در این باشد که سطح کلامیدوسپورهای گونه­ی سولانی کمی خاردار می­باشد.

در بررسی­های ریخت‌شناسی گونه­های F. oxysporum و گونه­ی F. redolens، از همدیگر تمایز داده­نشدند. و این امر قابل پیش­بینی بود. زیرا برخی محققین نیز در آزمایشات خود قادر به تفکیک این دو گونه از همدیگر نشده­بودند (17).

 در تکثیر ناحیه­ی ITS ریبوزومی توالی­هایی به طول حدود bp 630-500 تکثیر شد. با توجه به اینکه در گونه­های F. oxysporum و همچنین برخی فرم مخصوص­هایی از مجموعه­ی F. solani مانند F.s. f.sp. piperis طول rDNA-ITS حدود bp 550 است و مضافاَ اینکه در مجموعه­ی F. solani برخی گونه­ها bp 570 و برخی دیگر bp 620 است، لذا تفکیک قطعی گونه­های این دو بخش مهم و پیچیده از همدیگر بر اساس طول توالی ناحیه­ی ITS ریبوزومی کار آسانی نخواهد بود (8). در این آزمایشات نیز این موضوع کاملاَ صدق می­کرد و تنها جدیه­های از F. solani که باند حدود bp 600 تولید کردند به راحتی و با اطمینان از گونه­های بخش Elegans قابل شناسایی بودند.

این نتایج امکان وجود چند­شکلی را در ناحیه­ی rDNA-ITS در میان جدایه­های مختلف این گونه­ها، تقویت کرد که این موضوع در ادامه با هضم این توالی­ها توسط آنزیم­های برشی بررسی شد.

با توجه به شباهت­های بسیار نزدیک ظاهری و مولکولی گونه­های F. oxysporum و F. redolens به همدیگر و عدم تفکیک آنها در مراحل قبل، تلاش شد، از آنزیم­هایی که در تفکیک این دو گونه از همدیگر و همچنین این دو گونه از F. solani کارایی داشته ­باشند استفاده شود

آنزیم Sma I در جدایه­های متعلق به بخش Elegans فاقد جایگاه برشی بود. در جدایه­هایی که تحت نام F. solani  شناسایی شده ­بودند داری یک جایگاه برشی بود که منجر به تولید دو قطعه­ی حدود bp 350 و bp 230 شد. (به استثنای شش جدایه‌ی F123, F234, F602, F608, F662 و F718 که هیچ‌گونه باندی مشاهده­نشد). این آنزیم برشی در تفکیک این دو گروه قارچی از همدیگر کارایی مناسبی دارد. این نتایج با نتایج سایر محققان نیز مطابقت داشت (16،11). به‌نظر می­رسد، شش گونه­ی ذکر شده در بالا جزو جدایه­هایی از F. solani مانند F.s. f.sp. piperis باشند که از لحاظ ظاهری به F. solani شباهت دارند ولی از لحاظ الگوی rDNA-RFLP-ITS به F. oxysporum شبیه هستند.

با توجه به اینکه اطلاعاتی در مورد ایجاد چند‌شکلی در ناحیه‌ی rDNA-ITS توسط آنزیم Bgl Π و در نهایت شناسایی فوزاریوم­های بخش­های Elegans و Martiella توسط نگارندگان یافت نشده ­بود، از آنزیم Bgl Π به‌عنوان یک آنزیم جدید در این بررسی­ها استفاده شد تا شاید نتایج احتمالی آن به حل این موضوع کمک کند. نتایج نشان داد که آنزیم Bgl Π بر روی جدایه­های مورد مطالعه در این تحقیق از این دو بخش فوزاریوم، فاقد هر گونه جایگاه برشی است و هیچگونه باند تمایز کننده‌ای که در تقسیم بندی این گونه­های فوزاریوم تعیین­کننده­ باشد تولید نمی­شود.

آنزیم Mbo Ι به‌دلیل توانایی تولید باندهایی با اندازه­های مختلف، در تفکیک دو گونه­ی F. oxysporum و F. redolens از همدیگر،کارایی خوبی از خود نشان داده بود (17). نتایج حاصل از این تحقیق نیز این موضوع راتایید کرد. این آنزیم در برخی جدایه­های F. oxysporum چهار باند به اندازه­هایی حدود bp 180،bp 160، bp 130و bp 90 تولید کرد که با نتایج Waalwijk و همکاران 1996 مشابهت داشت و این جدایه­ها به‌عنوان F. redolens تشخیص داده ­شدند. در برخی دیگر از جدایه­های شناسایی شده به‌نام F. oxysporum نیز دو باند bp 320 و bp 190 تولید‌شد که این گروه به‌عنوان F. oxysporum تشخیص داده ­شدند. در هر دو گروه احتمالاَ باندهایی با اندازه­های کوچکتر نیز تولید می­شوند که در این آزمایش‌ها رویت نشدند (17).

در پنج جدایه (F183, F184, F185, F186 و F72 ) که از لحاظ ریخت­شناسی به‌عنوان F. oxysporum تشخیص داده شده بودند هیچ‌گونه چند شکلی مشاهده نشد. که علت این امر شاید شناسایی اشتباه برخی گونه­های بسیار شبیه از گروه F. solani یا F. subglutinans به‌جای F. oxysporum باشد (5).

در جدایه­های تحت نام F. solani به استثنای پنج جدایه F626 ,F770, F725, F756 و F817 آنزیم Mbo Ι فاقد جایگاه برشی بود و هیچگونه چندشکلی مشاهده ­نشد. در جدایه­های F756 و F817 مانند جدایه­های F. oxysporum دو باند bp 320 و bp 190 و در جدایه F725 سه باند bp 180،bp 160 و bp 130، و در دو جدایه­ی F626 و F770 یک تک باند bp 180 مشاهده‌شد.

با توجه به شباهت بسیار زیاد برخی ویژگی­های F. redolens و F. solani خصوصاَ در ماکروکنیدی، و یا وجود گونه­ها بینابینی در میان F. redolens و F. oxysporum حصول این نتایج دور از انتظار نبود (5).

در این تحقیق جدایه­های متعلق به بخش Elegans تنوع داخل گونه­ای بیشتری نسبت به جدایه­های متعلق به بخش Martiella از خود نشان دادند. جدایه­های F. redolens در گروهی جدا از F. oxysporum قرار گرفتند که این نتایج با نتایج برخی محققین مطابقت دارد (17).

  • نتیجه­گیری

در پایان، به‌نظر می­رسد که استفاده از روش rDNA-RFLP با استفاده از آنزیم­های برشی Sma I و Mbo I می­تواند روش مناسبی برای تفکیک گونه­های فوزاریوم متعلق به دو بخش Elegans و Martiella از همدیگر و خصوصاَ بررسی تنوع­های داخل یا بین گونه­ای در بخش Elegans باشد.

  • تشکر و قدردانی

 از مسئولین آزمایشگاه بیماری­شناسی گروه گیاهپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، جهت همکاری صمیمانه­اشان در انجام گرفتن برخی آزمایش­ها و همچنین از جناب آقای مهندس داریوش شهریاری- مرکز تحقیقات کشاورزی ورامین- جهت دریافت جدایه Fom1 تشکر و قدردانی ویژه به عمل می­آید.

-

  1. Anonymous. Agricultural Statistics. Crop year. 1397-98. Ministry of agriculture, duputy of planning and economy. Volume 1 (Crops). 1399 (In Persian). 87 pp.
  2. Avinash TS, Ravishankar RV. Biocontrol potentials of plant growth promoting Rhizobacteria against Fusarium wilt disease of cucurbit. eSci Journal of Plant Pathology. 2013,02 (03) : 155-161.
  3. Namiki F, Shiomi T, Kayamura T, Tsuge T. Characterization of the formae speciales of Fusarium oxysporum causing wilts of cucurbits by DNA fingerprinting with nuclear repetitive DNA sequences. Applied and Environmental Microbiology. 1994, 60: 2684-2691.
  4. Pivonia S, Cohen R, Kafkafi U, Ben Ze’ev IS, et al. Sudden wilt of melons in southern Israel: fungal agents and relationship with plant development. Plant Disease. 1997, 81: 1264–1268.
  5. Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual. UK: Blackwell Publish Ltd. 2006, 388 pp.
  6. Malvick DK, Percich JA. Genotypic and pathogenic diversity among pea-infecting isolates of Aphanomyces euteiches from the central and western United States. Phytopathology. 1998, 88: 915–921.
  7. Leung H, Nelson RJ, Leach JE. Population structure of plant pathogenic fungi and bacteria. In: Andrews, J.H., Tomm-erup, I.C. (Eds.), Advances in Plant Pathology. Academic Press, London. 1993; pp. 157–204.
  8. Brasileiro BTRV, Coimbra MRM, De Morais Jr, MA, De Oliveria, NT. Genetic variability within Fusarium solani species as revealed by PCR-fingerprinting based on PCR markers. Brazilian Journal of Microbiology. 2004, 35, 205–210.
  9. O’Donnell K, Sutton DA, Fothergill A, McCarthy D, et al. Molecular phylogenetic diversity, multilocus haplotype nomenclature, and in vitro antifungal resistance within the Fusarium solani species complex. J. Clinical Microbiol. 2008, 46: 2477–2490.
  10. Zhang N, O’Donnell K, Sutton DA, Nalim FA, et al. Members of the Fusarium solani species complex that cause infections in both humans and plants are common in the environment. Journal of Clinical Microbiology. 2006, 44: 2186–2190.
  11. Lee YM, Choi YK, Min BR. PCR-RFLP and Sequence Analysis of rDNA ITS Region in the Fusarium spp. The Journal of Microbiology. 2000, 38(2): 66-73.
  12. Bruns TD, White TJ, Taylor JW. Fungal molecular systematics. Annual Review. Ecology and Systematic. 1991; 22: 525-564.
  13. Samuels GJ, Seifert KA. The impact of molecular characters on systematics of filamentous Ascomycetes. Annual review. Phytopathology. 1995; 33: 37-67.
  14. Depriest PT, Been MD. Numerous group I introns with variable distributions in the ribosomal DNA of a lichen fungus. Journal of Molecular Biology. 1992, 228: 315–321.
  15. Hibbett DS, Vilgalys R. Evolutionary relationships of Lentinus to the Polyporaceae: evidence from restriction analysis of enzymatically amplified ribosomal DNA. Mycologia 1991, 83: 425-439.
  16. Chehri k, Salleh B, Yli-Mattila T, Reddy K.R.N. and Abbasi S. Molecular characterization of pathogenic Fusarium species in cucurbit plants from Kermanshah province, Iran. Saudi Journal of Biological Sciences. 2011, 18: 341-351.
  17. Waalwijk C, Baayen RP, De Koning JRA, Gams W. Ribosomal DNA analyses challenge the status of Fusarium sections Liseola and Elegans. Sydowia. 1996, 48(1): 90-104.
  18. Nelson PE, Toussoun TA, Marasas WFO. Fusarium species. An illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press, University Park, Philadelphia. 1983; 193 pp.
  19. González Mendoza D, Argumedo-Delira R, Morales-Trejo A, Pulido-Herrera A, et al.,. A rapid method for isolation of total DNA from pathogenic filamentous plant fungi. Genetics and Molecular Research. 2010; 9 (1): 162-166.
  20. Refai M, Hassan A, Hamed M. Monograph on the genus Fusarium. Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University. Giza, Egypt. 2015; Pp.275.