فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی البرز، کرج، ایران

2 استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران

3 مربی، گروه مهندسی مکانیک، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

4 دانشیار، مرکز تحقیقات کولورکتال، بیمارستان رسول اکرم، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

10.52547/JCT/13.3.167

چکیده

هدف: مهندسی بافت یک رویکرد جدید برای بازسازی و ترمیم بافت‫های از دست رفته و یا آسیب دیده می‫باشد. هدف از این مطالعه ساخت داربست نانوالیاف الکتروریسی‌شده تصادفی پلی کاپرولاکتون (PCL) برای استفاده در طب بازساختی می‫باشد. مواد و روشها: سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی انسانی (hADSCs)، جدا ( از لایه سطحی چربی شکم)، کشت (در محیط کشت DMEM/Ham's F12) و تایید (فلوسایتومتری برایCD29, CD73, CD34, CD105 و CD45) شدند. از الکتروریسی برای تولید داربست های نانوالیاف PCL استفاده شد. علاوه بر این، برای بررسی اتصال، نفوذ و مورفولوژی hADSCs از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و برای بررسی سمیت داربست‫ها از روش 3-4و5 دی متیل تیازول 2 وای ال 2و5 دی فنیل تترا زولیوم بروماید (MTT) استفاده گردید. نتایج: فلوسایتومتری بیان گسترده CD29، CD73، و CD105 (مثبت) و بیان بسیار کم CD34 و CD45 (منفی) را در hADSCs نشان داد. نتایج سنجش MTT ، قابلیت زنده ماندن و تکثیر سلول های hADSCs کاشته شده بر روی داربست نانوالیاف PCL را نشان داد. عکس‌های میکروسکوپ SEM نشان داد که hADSCs روی داربست‌های نانوالیاف PCL متصل شده و مهاجرت می کنند. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که داربست‌های نانوالیاف PCL الکتروریسی شده برای کاشت، اتصال و تکثیر hADSCs مناسب می‫باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Fabrication and evaluation of electrospun polycaprolactone nanoscaffold for compatibility with human adipose stem cells for tissue engineering

نویسندگان [English]

  • A Yari 1
  • F Heidari 1
  • F Heidari 2
  • A Moarrefzadeh 3
  • A Sarveazad 4

1 Assistant Professor of Anatomical Sciences, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Alborz University of Medical Sciences, Karaj, Iran

2 Assistant Professor of Anatomical Sciences, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Qum University of Medical Sciences, Qum, Iran

3 Department of Mechanical Engineering, Tehran East Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

4 Associate Professor of Anatomical Sciences, Colorectal Research Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran,

چکیده [English]

 
Aim: Tissue engineering is a new approach to regeneration and repair lost or damaged tissues. The aim of this study is to design and manufacture polycaprolactone (PCL) randomly electrospun nanofiber scaffold for use in regenerative medicine.
Material and Methods: Human adipose derived stem cells (hADSCs) were isolated (from superficial layer of abdominal fat), cultured (in DMEM/Ham'sF12 medium) and characterized (flow cytometry for CD29, CD73, CD34, CD105 and CD45). Electrospinning was used to produce PCL nanofiber scaffolds, scanning electron microscopy (SEM) was used to investigate the binding, penetration and morphology of hADSCs, and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) was used to determine the toxicity of scaffolds.
Results: Flow cytometry showed extensive expression of the CD29, CD73 and CD105 (positive) and very low expression of the CD34 and CD45 (negative) in hADSCs. The results of MTT assay, showed the viability and proliferation of hADSCs which were seeded on the nanofiber scaffold. Microscopic photographs of SEM, showed hADSCs attached to PCL nanofiber scaffolds and migrating.
Conclusion: The results of this study showed that electrospun PCL nanofiber scaffolds are suitable for implantation, binding and propagation of hADSCs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Human Adipose Stem Cell
  • Scaffold
  • Polycaprolactone
  • Tissue Engineering
  • مقدمه

   مهندسی بافت رشته جدیدی است که مهندسی و علوم زیستی را در جهت جایگزین‌های بیولوژیکی به‫کار می‌گیرد تا عملکردهای بافتی را به‫دنبال آسیب‌های ناشی از بیماری‫ها و سوانح، بازسازی، حفظ و بهبود ببخشد (1). اصول کلی مهندسی بافت شامل ترکیب سلول‫های زنده با یک داربست طبیعی  یا مصنوعی زیست تخریب پذیر برای تولید یک ساختار زنده سه بعدی می‫باشد که از نظر عملکردی، ساختاری و مکانیکی برابر یا بهتر از بافتی باشد که قرار است جایگزین آن شود. توسعه چنین ساختاری نیاز به انتخاب دقیق چهار پارامتر کلیدی دارد که عبارتند از: 1) نوع داربست، 2) عوامل رشد، 3) ماتریکس خارج سلولی (ECM) و 4) سلول (2). در مهندسی بافت مواد تشکیل دهنده داربست ها به‫عنوان ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی را در رشد، سازماندهی و تمایز سلول‫ها ایفا می‫کنند (3). در حال حاضر برای تولید داربست‫ها با الیاف نانو سه تکنیک وجود دارد که عبارتند از: روش حرارتــی ناشــی از جداســازی اختلاف  فــازی Thermally Induced Phase Separation (TIPS)، روش خود تجمعی (Self-Assembly Method) و روش الکتروریسی (Electrospinning) که در این میان الکتروریسی نسبت به بقیه روش‫ها ساده تر و ارزانتر می‫باشد (4). یکی از نقاط قوت این روش، الکتروریسی از الیاف با قطرهایی در اندازه نانو می‫باشد که شبیه اندازه پروتئین‫های فیبری موجود در ماتریکس خارج سلولی طبیعی مانند کلاژن می‫باشد. توانایی الکتروریسی نانوالیاف برای تقلید ساختار ماتریکس خارج سلولی حیاتی است، زیرا مطالعات نشان داده است که هر دو مقیاس ساختار و توپوگرافی داربست‫ها نقش مهمی در تکثیر و چسبندگی سلولی دارند (5). با تغییر دادن پارامترهای مواد و حلال داربست‫ها، جهت گیری فیبرها (موازی یا تصادفی) و اندازه تخلخل (برای نفوذ سلول‫ها) داربست های الکتروریسی شده، می‫توان آن‫ها را برای مقاصد متفاوت استفاده کرد (6).

پلی کاپرولاکتون (PCL) یک پلی استر آلیفاتیک زیست تخریب پذیر و زیست سازگار است که به راحتی قابلیت الکتروریسی شدن را داشته و برای استفاده در بدن انسان تاییدیه(FDA)  Food and Drug Administration را نیز دارد. با توجه به این‫که این پلیمر در شرایط فیزیولوژیکی (بدن انسان) با هیدرولیز پیوندهای استری تجزیه می‫شود، توانسته است، در مهندسی بافت توجه زیادی را برای استفاده به‫عنوان بیومتریال قابل کاشت در بدن انسان به‫خود جلب کند (7). برای تولید بافت جدید داربست‫ها به‫تنهایی یا همراه با سلول مورد استفاده قرار می‫گیرند. برای طراحی مواد زیستی جدید، ادغام علوم پایه پلیمر با زیست شناسی سلولی و مولکولی امری ضروری می‫باشد (8). یکی از منابع سلولی که برای این منظور می‫تواند مورد استفاده قرار گیرد، سلول‫های بنیادی چربی انسانی می‫باشد که دارای توانایی تقسیم بالا بوده و در بافت زیرجلدی (هیپودرم) بدن به فراوانی یافت می‫شود. این سلول‫ها به‫خاطر دسترسی آسان، کشت راحت و سریع و نداشتن مسائل اخلاقی مثل سلول‫های بنیادی جنینی برای اهداف پزشکی مورد توجه ویژه قرار گرفته است (9). هدف از این مطالعه بررسی مناسب بودن نانوالیاف PCL الکتروریسی شده به‫روش تصادفی برای کاشت سلول‫های بنیادی چربی انسانی جهت استفاده بالقوه در مهندسی بافت می‫باشد.

  • مواد و روش‌ها

   طراحی مطالعه: مطالعه حاضر از نوع تجربی به‫صورت in vitro پس از ثبت در سامانه پژوهشیار معاونت تحقیقات و فن‫آوری دانشگاه علوم پزشکی ایران و تاییدیه‫ی کمیته اخلاق (IR.IUMS.REC.1391.180.68) و حمایت مالی این دانشگاه انجام شد.

تهیه داربست پلی کاپرولاکتون (PCL) با روش الکتروریسی: برای این منظور PCL (Aldrich، امریکا)  با وزن ملکولی حدود 80.000 Mn استفاده شد. محلول PCL با غلظت (W / V 14٪) در اسید فرمیک (مرک، آلمان) و با استفاده از همزن مغناطیسی در دمای محیط حل شد. محلول پلیمر به‫درون سرنگ 5 میلی متری با سر سرنگ G 18 کشیده شد. نازلی به‫طول 3 سانتی متر به سرنگ متصل شد. پس از هوا گیری محلول با سرعت ml/h 5/0، زاویه 25 درجه و ولتاژ  kv20 پمپ شد. فایبرها به‫صورت تصادفی روی یک صفحه آلومینیومی به‫عنوان صفحه جمع کننده که در فاصله 12 سانتی‫متری از نازل قرار داشت جمع شدند. برای تغییر خصوصیات سطحی اسکافولدها تیمار با پلاسما و با استفاده از دستگاه دینر (Germany) انجام شد. این فرایند تحت خلوص بالای گاز اکسیژن با 4/0 میلی بار فشار و 30  وات انجام شد. فرآیند تیمار با پلاسما حدود 5 دقیقه به‫طول انجامید و سپس نمونه‫ها در معرض هوا قرار گرفتند.

بررسی مورفولوژی نانو الیاف: برای بررسی مورفولوژی اسکافولدها از میکروسکوپ الکترونی روبشی  SEM(هیتاچی- ژاپن) استفاده شد. برای عکسبرداری از داربست­ها، آن‫ها را با چسب کربنی بر روی نگه‫دارنده­ چسبانده و با پوششی از طلا پوشیده شدند، سپس نمونه‫ها توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی در ولتاژ kv20 مشاهده و از آن‫ها عکس تهیه شد. همچنین برای بررسی قطر الیاف الکتروریسی شده از تصاویر تهیه شده به‫وسیله SEM استفاده شد. برای این منظور به‫طور راندوم قطر 100 عدد از فایبرها به‫وسیله نرم افزار 3.0Microstructure Mesurment اندازه‫گیری شد. درصد تخلخل اسکافولدها نیز به‫وسیله فرمول P = (1−p/p0) ×100  طبق رفرنس اندازه‫گیری شد (10).

استخراج سلول: بافت چربی از چربی لایه سطحی شکم طی عمل لیپوساکشن از افراد 25 تا 35 سال (با کسب رضایت شخصی) که جهت انجام عمل جراحی لیپوساکشن به اتاق عمل عمومی بیمارستان حضرت رسول اکرم (ایران، تهران) مراجعه می‫کردند، تهیه شد. این افراد با توجه به گزارش پرونده شان هیچگونه سابقه بیماری ایدز و هپاتیت B نداشتند. نمونه گیری در شرایط استریل انجام گرفت سپس در ظرف استریل حاوی DMEM/Ham's F12، FBS 10 درصد و Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 5 درصد به آزمایشگاه منتقل شد. جداسازی سلول‫های بنیادی مشتق از بافت چربی انسانی (hADSCs) طبق پروتکل Duboid et al. تغییر یافته انجام شد (9). نمونه چربی قبل از انجام مراحل استخراج در حمام آب تا 37 درجه سانتی‫گراد گرم شد. از آن تمام مراحل استخراج زیر هود استریل و با مواد و تجهیزات استریل انجام شد. شستشوی بافت چربی در لوله حاوی محلول Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 1 درصد (تهیه شده با PBS گرم) تا برداشت رگ‫های خونی و بافت همبند و در نهایت شفاف شدن بافت ادامه پیدا کرد (معمولا 2 مرتبه شستشو). نمونه جهت هضم بافتی به لوله حاوی کلاژناز 1/0 درصد و Bovine serum albumin (BSA) 1 درصد (تهیه شده با PBS گرم)، منتقل شد. سپس لوله حاوی نمونه به‫مدت 30 دقیقه تا هضم کامل بافت و صاف شدن نمونه در حمام آب نگه‫داری شد. پس از هضم بافتی، لوله حاوی نمونه در دمای اتاق به‫مدت 5 دقیقه با سرعت 1200rpm  سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه مایع رویی، پلیت تشکیل شده با محلولBSA 1 درصد، تعلیق و یک‫بار دیگر سانتریفیوژ شد. در نهایت پلیت تشکیل شده با محیط کشت DMEM/Ham's F12 حاوی FBS 10 درصد و Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 1 درصد تعلیق شده و به فلاسک منتقل شد. فلاسک‫ها در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتی‫گراد، CO2 5 درصد، رطوبت 98 درصد) تا پاساژ سوم نگه‫داری شدند.

تایید hADSCs: به‫منظور شناسایی و تایید hADSCs  از فلوسایتومتری استفاده شد. سلول‫های موجود در فلاسک‫های آماده برای پاساژ سوم پس از تخلیه محیط کشت و شستشو با Phosphate-buffered saline (PBS) ، از طریق مجاورت دادن با تریپسین 25/0  درصد به‫مدت 4 دقیقه در انکوباتور از فلاسک جدا گردیده، پس ازخنثی سازی آنزیمی با استفاده از اضافه نمودن حجم مشابه از محیط کشت و انتقال به لوله آزمایش درب دار، جهت انجام فلوسایتومتری استفاده شدند.

فلوسایتومتری با استفاده از فلوسایتومتر Cyflow Space (Sysmex-Partec) انجام شد. آنتی‫بادی‫های مورد استفاده برای فلوسایتومتری CD29-PE، CD73-PE، CD34-PE، CD105-FITC، و CD45-FITC به‫عنوان آنتی بادی‫های مستقیم و IgG1-PE و IgG1-FITC به‫عنوان کنترل ایزوتیپ  بودند. تمام آنتی بادی‫ها از شرکت BD Biosciences بودند.

کاشت hADSCs بر روی داربست: قبل از کاشت hADSCs، نمونه‌های داربست با غوطه‌ور شدن در اتانول 70 درصد به‫مدت 30 دقیقه استریل شدند و به‫مدت 60 دقیقه در معرض تابش UV قرار گرفتند. سپس نمونه‌ها به‫مدت 24 ساعت در محیط کشت DMEM/Ham's F12 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. برای انجام کاشت سلولی، سلول‌ها به‫وسیله مخلوط (1به1) از 125/0 درصد تریپسین (سیگما، آمریکا) و 02/0 درصد Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (سیگما، آمریکا) از فلاسک کشت سلولی جدا شدند و سلول‌های زنده توسط تریپان بلو شمارش شدند. سلول‫های جدا شده با تراکم 104 × 4 سلول روی داربست‫های آماده شده کاشته شدند.

بررسی چسبندگی و مورفولوژی سلول ها بر روی داربست: برای این منظور یک روز پس از کاشت سلولی، داربست ها از محیط کشت خارج شدند و نمونه‫ها به‫مدت 30 دقیقه در دمای محیط در پارافرمالدئید 4 درصد ثابت شدند. پس از شستشو با PBS (0.2M)، نمونه‫ها به‫مدت 50 دقیقه با درجات صعودی اتانول (50، 70، 80، 95 و 100 درصد) آب‫گیری شدند. سپس نمونه‫ها با هگزا متیل دی سیلازان (سیگما، آمریکا) که یک عامل خشک کننده می‫باشد، تیمار شدند و بعد از پوشانده شدن با ذرات طلا تصاویر SEM تهیه و مورد بررسی قرار گرفت (11).

رنگ آمیزی DAPI سلول های کاشته شده روی داربست: سلول‫های کاشته شده به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق در پارافرمالدئید 4 درصد فیکس شدند و باM)  PBS (0.2 شسته شدند. سپس سلول‫ها به‫مدت 15 دقیقه با استفاده از تریتون 3 درصد (سیگما، آمریکا) نفوذ پذیر شدند. پس از شستشو با M)  PBS (0.2 ، برای رنگ آمیزی هسته ای سلول‫ها به‫مدت 15 دقیقه در تاریکی با 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (سیگما، آمریکا) انکوبه شدند. سلول‫های نشاندار شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس (Olympus Ax70) شناسایی شدند.

تعیین میزان زنده مانی سلولها (Cell Viability)  بر روی داربست: برای بررسی میزان سمیت داربست نسبت به سلول‫های مورد نظر از روش 3-4و5 دی متیل تیازول 2 وای ال 2و5 دی فنیل تترا زولیوم بروماید (MTT) استفاده شد. برای این منظور داربست‫های توام با سلول بعد از 24، 48 و72 ساعت همراه با گروه کنترل (سلول موجود در کف پلیت) مورد ارزیابی قرار گرفتند. ابتدا در زیر هود و در تاریکی به میزان 10 درصد حجم محیط داخل پلیت محلول MTT (که با غلظت 5 میلی‫گرم در میلی‫لیتر تهیه شده است) اضافه شد. نمونه‫ها به‫مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور قرار داده شدند، سپس محیط حاوی MTT خارج و به هر کدام از چاهک‫ها یک میلی‫لیتر Dimethyl sulfoxide (DMSO) اضافه شد. پس از 20 دقیقه محلول DMSO به پلیت­های 96 خانه منتقل شده و میزان جذب نوری محلول با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 570 نانومتر ثبت و مورد بررسی قرار گرفت.

3-آنالیز آماری

   تمام آزمایش‫ها در سه تکرار انجام شد و داده‫ها به‫صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. با استفاده از آزمون تی مستقل و آنالیز واریانس یک‫طرفه و سپس آزمون تعقیبی توکی ارزیابی معنی‌داری آماری بین گروه‌های مختلف انجام شد. مقدار (p<0.05 ) از نظر آماری معنی‫دار در نظر گرفته شد.

  • نتایج

مورفولوژی سلول

   سلول‫های hADSCs در محیط DMEM/ Ham's F12 با FBS 10%  کشت داده شدند. در پاساژ سوم سلول‫ها با میکروسکوپ اینورت مجهز به دوربین بررسی شدند که شکل دوکی hADSCs با زواید شبه فیبروبلاستی کاملا مشخص بود (شکل1A ).

فلوسایتومتری

hADSCs    دارای مارکر‫های سطحی ویژه سلول‫های مزانشیمی هستند یعنی CD29, CD73 و CD105 مثبت اند.  سلول‫ها در پاساژ سوم درصد بالایی از این مارکر‫ها را بیان کردند. بدین شرح: CD29 (31/97درصد)، CD73 (11/99 درصد) و CD105 (08/86 درصد). بر خلاف این مارکرها، سلول‫های hADSCs فاقد مارکرهای سطحی  CD34 و CD45هستند یعنی CD34 و CD45 منفی اند. سلول‫ها در پاساژ سوم درصد خیلی کمی از این مارکر‫ها را بیان کردند. بدین شرح: CD34 (82/5  درصد) و CD45 (67/10 درصد) (شکل 1B-D).

 

B

 

D

C

 

 

 

 

 

شکل 1: کشت سلولی و فلوسیتومتری: A) شکل دوکی سلول‫ها با زواید شبه فیبروبلاستی در پاساژ سوم، میکروسکوپ معکوس، بزرگ‫نمایی × 100. B-D) بیان گسترده CD29، CD73، و CD105 (مثبت) و بیان بسیار کم CD34 و CD45 (منفی)

بررسی مورفولوژی و قطر الیاف های داربست

   برای بررسی مورفولوژی و قطر الیاف‫های داربست از تصاویر میکروسکوپ الکترونی استفاده شد. برای بررسی و به‫دست آوردن قطر الیاف‫های داربست به‫طور تصادفی تعداد ١٠٠ عدد از الیاف انتخاب و قطر آن‫ها به‫وسیله نرم افزار Mesurment Microstructure اندازه گیری شد و نمودار میانگین اندازه قطر آن‫ها توسط نرم افزار GraphPad Prism رسم شد. همان‫طور که نمودار نشان می‫دهد قطر اکثر الیاف (54 درصد) در محدوده بین 101 تا150 نانومتر قرار دارند (شکل 2A,B و شکل 3).

 

 

شکل 2: الکترو میکروگراف با میکروسکوپ الکترونی روبشی داربست PCL .A) الیاف‫ها به‫صورت تصادفی درهم بافته شده اند.  B) الیاف با بزرگ‫نمایی بیشتر نشان داده شده‫اند و قطر یکی از الیاف (R=95nm) نشان داده شده است (Scale bars (A) = 10μm, (B) = 750nm) .

 

 

شکل 3: نمودار میانگین اندازه قطر الیاف. قطر اکثر الیاف (54 درصد) در محدوده بین 101 تا150 نانومتر قرار دارند.

 

بررسی چسبندگی hADSCs بر روی داربست

   با توجه به نتایج به‫دست آمده از تصاویر ایمونوسیتوشیمی که نشان دهنده خاصیت چسبندگی hADSCs به داربست بود، تصاویر به‫دست آمده از میکروسکوپ الکترونی نیز چسبندگی این سلول‫ها بر روی داربست PCL را تایید کرد (شکل 4، A,B).

 

شکل 4: عکس میکروسکوپ الکترونی روبشی hADSCs بر روی داربست. A) هسته‫های رنگ شده با DAPI که حضور سلول‫ها را در لابلای ل رشته‫های داربست نشان می‫دهد. B) اتصال و چسبندگی hADSCs را 24 ساعت بعد از کاشت سلول روی رشته‫های داربست را نشان می‫دهد  .(Scale bars (A) = 200, (B) = 20μm)

بررسی قابلیت زنده ماندن سلول روی داربست

   جهت بررسی میزان زنده بودن سلول‫ها، 24، 48 و 72 ساعت پس از کاشت سلول‫ها روی داربست و پلیت (کنترل) آزمونMTT انجام شد. نتایج به‫دست آمده (شکل 5) نشان داد که داربست PCL نه تنها برای کشت سلول سمیت نداشت، بلکه توانست میزان زنده ماندن سلول‫ها را افزایش دهد. چنان‫که مقایسه میزان جذب نوری بین گروه کنترل و سلول + داربست نشان داد که این افزایش در گروه سلول + داربست 48 و 72 ساعت بعد از کاشت سلول از نظر آماری معنی‫دار بود (P<0.05).

 

شکل 5: آزمون MTT بین گروه پلیت و سلول + داربست، 24 ، 48 و 72 ساعت بعد از کاشت سلول‫ها

*افزایش معنی دار نسبت به گروه کنترل (پلیت) p<0.05),).

  • بحث

تحقیق در مورد استفاده از سلول‫های بنیادی در مهندسی بافت یک مفهوم در حال ظهور می‫باشد. مطمئنا بسیاری از بخش‫های تحقیقات در مورد سلول‫های بنیادی و کاربرد بالقوه آن‫ها با چالش‫هایی همراه است، بنابراین پرداختن به مسائل اخلاقی، قانونی و اجتماعی ضروری می‫باشد. سلول‫های بنیادی سوماتیک (سلول‫های بنیادی بالغ) به‫طور طبیعی در بدن وجود دارند (12) و در صورت دسترسی به آن‫ها بسیاری از مشکلات فوق حل خواهد شد. تحقیقات نشان داده‫اند که سلول‫های بنیادی در بافت‫های مختلف بدن از جمله بافت چربی، اسکلتی- عضلانی، کبد، عصبی و ... وجود دارد (13). سلول‫های بنیادی بافت چربی که در قسمت‫های مختلف بدن به‫وفور یافت می‫شود، ویژگی‫های سلول‫های بنیادی پرتوان مثل پتانسیل تکثیر بالا و ورود به حالت سکون را دارند. در این مطالعه نیز سلول‫های بنیادی از بافت چربی زیر جلدی جدا و توسط مارکرهای خاص خودش مورد تایید قرار گرفت. مطالعات نشان داده اند این سلول‫ها توانایی تمایز به سلول‫های عصبی، کراتوسیت، استئوبلاست، کندروسیت و سلول‫های عضلانی را در شرایط آزمایشگاهی دارند (14)، بنابراین می‫تواند کاندید مناسبی برای تولید انواع بافت‫ها باشد.

مطالعات در زمینه مهندسی بافت نشان داده اند که پلیمرهای مصنوعی برای ترمیم بسیاری از آسیب ها مفید بوده است. نانو الیاف‫ها به‫طور گسترده در مهندسی بافت استفاده می‫شوند و با افزایش سطح نسبت به حجم، برهم‫کنش بین سلول و داربست و در نتیجه تکثیر سلولی را افزایش می‫دهد (15) که در مطالعه حاضر و مطالعات مشابه به‫وسیله نتایج MTT و تصاویر SEM تایید شده است. در این مطالعه سلول‫های بنیادی چربی انسانی بر روی داربست PCL کشت داده شدند تا مشخص شود، آیا داربست فوق برای سلول سمیت دارد یا نه. نتایج حاصل از بررسی به‫روش  MTT نشان داد که این داربست نه تنها برای سلول‫ها سمیت ندارد بلکه با افزایش سطح قابل اتصال سلول‫ها باعث تکثیر و افزایش تعداد آن‫ها می‫شوند و می‫توانند در زمان کم نسبت به گروه کنترل زمینه افزایش تعداد سلول‫ها را فراهم آورند که این کاهش زمان و افزایش تولید سلول در بالین از اهمیت ویژه‫ای برخوردار می‫باشد. نتایج مطالعات مشابه نیز نشان داده اند که قابلیت زنده ماندن و میزان تکثیر سلول‫های فیبروبلاست و همچنین سلول‫های بنیادی فولیکول مو بر روی داربست PCL در مقایسه با سلول‫های کشت داده شده بر روی پلیت افزایش قابل توجهی یافته است (10, 15) که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد. خصوصیت آب دوست یا آب‫گریز بودن داربست‫ها برای کشت بافت مهم می‫باشد و می‫تواند توانایی اتصال، تکثیر و تمایز سلولی را تحت تاثیر قرار دهد (15). جهت آب دوست کردن داربست‫ها آن‫ها را با پلاسما آغشته می‫کنند (16). در این مطالعه نیز که سطح داربست‫ها با پلاسما پوشانده شده بود، نتایج حاصل از تصاویر SEM سلول‫ها بر روی داربست و نتایج بررسی قابلیت زنده مانی سلول‫ها با MTT نشان داد که سلول‫ها در مقایسه با گروه کنترل به‫خوبی روی داربست‫ها اتصال یافته و تکثیر پیدا کردند. نتایج مطالعات مشابه نشان داد که پوشاندن داربست‫های PCL با پلاسما آبدوستی آن‫ها را بیشتر کرده و در نتیجه اتصال و تکثیر فیبروبلاست‫های انسانی را افزایش داده است (15). مطالعات نشان داده اند که در نانو الیاف‫ها به‫دلیل کوچک بودن اندازه منافذ، سلول ها قادر به نفوذ به داخل داربست ها نمی باشند (17). برای غلبه بر این مشکل روش‫هایی مثل الکتروریسی و لیچینگ الیاف کمک کننده می باشد (18). در مصالعه حاضر نتایج تصاویر  SEM اندازه گیری شده با نرم افزار Mesurment Microstructure نشان داد که داربست PCL اصلاح شده با تخلخل بالا (78 درصد) برای نفوذ سلول‫ها مناسب می‫باشد. نانو الیاف الکتروریسی شده شباهت مورفولوژیکی بالایی با ماتریکس خارج سلولی طبیعی دارد، ساختارهای متخلخل آن‫ها مهاجرت سلولی و جابه‫جایی مواد و متابولیت‫ها را تسهیل می‫کند. قطر الیاف یکی دیگر از ویژگی‫های داربست‫ها می‫باشد که می‫تواند به‫وسیله افزایش نسبت سطح به حجم و تخلخل بر چسبندگی، مهاجرت و تکثیر تاثیر بگذارد (19). افزایش نسبت سطح به حجم و افزایش تخلخل ساختار نانو الیاف می‫تواند سطح تماس بین سلول‫ها و داربست را افزایش دهد. این خاصیت جذب فاکتورهای رشد به‫وسیله سلول‫ها را تسهیل می‫کند و به مهاجرت، تکثیر و تمایز سریع سلول‫ها منجر می‫شود، که به‫وسیله تصاویر SEM و نتایج MTT تایید شده است. در این مطالعه از روش الکتروریسی برای ساخت داربست‫های تصادفی اصلاح شده نسبت به مطالعات دیگر به‫وسیله تغییر دادن قطر الیاف، افزایش تخلخل و تغییر خصوصیات سطحی به‫وسیله کوت کردن با پلاسما استفاده شد و سلول‫های بنیادی چربی انسانی روی آن کاشته شد.

  • نتیجه­گیری

 نتایج نشان داد که این داربست برای سلول بنیادی چربی انسانی سمی نبوده و برای کشت آن مناسب می‫باشد. امیدواریم نتایج این مطالعه برای توسعه تکنیک الکتروریسی برای بهینه سازی داربست PCL و طراحی نانو الیاف برای کاربرد در مهندسی بافت مفید واقع شود.

  • تشکر و قدردانی

مطالعه حاضر تحت حمایت مالی معاونت تحقیقات و فن آوری دانشگاه علوم پزشکی ایران انجام شده است لذا بدین‫وسیله نویسندگان این مقاله مراتب قدردانی خود را از این معاونت اعلام می‫دارند.

-

  1. Shieh SJ, Vacanti JP. State-of-the-art tissue engineering: from tissue engineering to organ building. Surgery. 2005;137(1):1-7.
  2. Naughton GK. From lab bench to market: critical issues in tissue engineering. Ann N Y Acad Sci. 2002;961(1):372-85.
  3. Santoro M, Shah SR, Walker JL, Mikos AG. Poly(lactic acid) nanofibrous scaffolds for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2016;107:206-12.
  4. Smith LA, Liu X, Ma PX. Tissue Engineering with Nano-Fibrous Scaffolds. Soft Matter. 2008;4(11):2144-9.
  5. Recum AFV, Shannon CE, Cannon CE, Long KJ, Kooten TGV, Meyle J. Surface roughness, porosity, and texture as modifiers of cellular adhesion. Tissue Engineering. 1996;2(4):241-53.
  6. Vellayappan M, Venugopal J, Ramakrishna S, Ray S, Ismail A, Mandal M, et al. Electrospinning applications from diagnosis to treatment of diabetes. RSC Advances. 2016;6(87):83638-55.
  7. Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, et al. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009;54(2):73-83.
  8. Nassif L, El Sabban M. Mesenchymal Stem Cells in Combination with Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials (Basel). 2011;4(10):1793-804.
  9. Dubois SG, Floyd EZ, Zvonic S, Kilroy G, Wu X, Carling S, et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 2008;449:69-79.
  10. Yari A, Teimourian S, Amidi F, Bakhtiyari M, Heidari F, Sajedi N, et al. The role of biodegradable engineered random polycaprolactone nanofiber scaffolds seeded with nestin-positive hair follicle stem cells for tissue engineering. Adv Biomed Res. 2016;5:22.
  11. Yang F, Murugan R, Wang S, Ramakrishna S. Electrospinning of nano/micro scale poly (L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 2005;26(15):2603-10.
  12. Lobo NA, Shimono Y, Qian D, Clarke MF. The biology of cancer stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 2007;23:675-99.
  13. Bhartiya D. Adult tissue-resident stem cells—fact or fiction? Stem Cell Research & Therapy. 2021;12(1):1-4.
  14. Huang SJ, Fu RH, Shyu WC, Liu SP, Jong GP, Chiu YW, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cell Transplant. 2013;22(4):701-9.
  15. Safaeijavan R, Soleimani M, Divsalar A, Eidi A, Ardeshirylajimi A. Biological behavior study of gelatin coated PCL nanofiberous electrospun scaffolds using fibroblasts. Archives of Advances in Biosciences. 2014;5(1).
  16. de Valence S, Tille J-C, Chaabane C, Gurny R, Bochaton-Piallat M-L, Walpoth BH, et al. Plasma treatment for improving cell biocompatibility of a biodegradable polymer scaffold for vascular graft applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2013;85(1):78-86.
  17. Townsend-Nicholson A, Jayasinghe SN. Cell electrospinning: a unique biotechnique for encapsulating living organisms for generating active biological microthreads/scaffolds. Biomacromolecules. 2006;7(12):3364-9.
  18. Pham QP, Sharma U, Mikos AG. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 2006;7(10):2796-805.
  19. Cao H, Liu T, Chew SY. The application of nanofibrous scaffolds in neural tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61(12):1055-64.