نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی البرز، کرج، ایران
2 استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران
3 مربی، گروه مهندسی مکانیک، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
4 دانشیار، مرکز تحقیقات کولورکتال، بیمارستان رسول اکرم، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران
چکیده
هدف: مهندسی بافت یک رویکرد جدید برای بازسازی و ترمیم بافتهای از دست رفته و یا آسیب دیده میباشد. هدف از این مطالعه ساخت داربست نانوالیاف الکتروریسیشده تصادفی پلی کاپرولاکتون (PCL) برای استفاده در طب بازساختی میباشد. مواد و روشها: سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی انسانی (hADSCs)، جدا ( از لایه سطحی چربی شکم)، کشت (در محیط کشت DMEM/Ham's F12) و تایید (فلوسایتومتری برایCD29, CD73, CD34, CD105 و CD45) شدند. از الکتروریسی برای تولید داربست های نانوالیاف PCL استفاده شد. علاوه بر این، برای بررسی اتصال، نفوذ و مورفولوژی hADSCs از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و برای بررسی سمیت داربستها از روش 3-4و5 دی متیل تیازول 2 وای ال 2و5 دی فنیل تترا زولیوم بروماید (MTT) استفاده گردید. نتایج: فلوسایتومتری بیان گسترده CD29، CD73، و CD105 (مثبت) و بیان بسیار کم CD34 و CD45 (منفی) را در hADSCs نشان داد. نتایج سنجش MTT ، قابلیت زنده ماندن و تکثیر سلول های hADSCs کاشته شده بر روی داربست نانوالیاف PCL را نشان داد. عکسهای میکروسکوپ SEM نشان داد که hADSCs روی داربستهای نانوالیاف PCL متصل شده و مهاجرت می کنند. نتیجهگیری: نتایج این مطالعه نشان داد که داربستهای نانوالیاف PCL الکتروریسی شده برای کاشت، اتصال و تکثیر hADSCs مناسب میباشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Fabrication and evaluation of electrospun polycaprolactone nanoscaffold for compatibility with human adipose stem cells for tissue engineering
نویسندگان [English]
- A Yari 1
- F Heidari 1
- F Heidari 2
- A Moarrefzadeh 3
- A Sarveazad 4
1 Assistant Professor of Anatomical Sciences, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Alborz University of Medical Sciences, Karaj, Iran
2 Assistant Professor of Anatomical Sciences, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Qum University of Medical Sciences, Qum, Iran
3 Department of Mechanical Engineering, Tehran East Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
4 Associate Professor of Anatomical Sciences, Colorectal Research Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran,
چکیده [English]
Aim: Tissue engineering is a new approach to regeneration and repair lost or damaged tissues. The aim of this study is to design and manufacture polycaprolactone (PCL) randomly electrospun nanofiber scaffold for use in regenerative medicine.
Material and Methods: Human adipose derived stem cells (hADSCs) were isolated (from superficial layer of abdominal fat), cultured (in DMEM/Ham'sF12 medium) and characterized (flow cytometry for CD29, CD73, CD34, CD105 and CD45). Electrospinning was used to produce PCL nanofiber scaffolds, scanning electron microscopy (SEM) was used to investigate the binding, penetration and morphology of hADSCs, and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) was used to determine the toxicity of scaffolds.
Results: Flow cytometry showed extensive expression of the CD29, CD73 and CD105 (positive) and very low expression of the CD34 and CD45 (negative) in hADSCs. The results of MTT assay, showed the viability and proliferation of hADSCs which were seeded on the nanofiber scaffold. Microscopic photographs of SEM, showed hADSCs attached to PCL nanofiber scaffolds and migrating.
Conclusion: The results of this study showed that electrospun PCL nanofiber scaffolds are suitable for implantation, binding and propagation of hADSCs.
کلیدواژهها [English]
- Human Adipose Stem Cell
- Scaffold
- Polycaprolactone
- Tissue Engineering
- مقدمه
مهندسی بافت رشته جدیدی است که مهندسی و علوم زیستی را در جهت جایگزینهای بیولوژیکی بهکار میگیرد تا عملکردهای بافتی را بهدنبال آسیبهای ناشی از بیماریها و سوانح، بازسازی، حفظ و بهبود ببخشد (1). اصول کلی مهندسی بافت شامل ترکیب سلولهای زنده با یک داربست طبیعی یا مصنوعی زیست تخریب پذیر برای تولید یک ساختار زنده سه بعدی میباشد که از نظر عملکردی، ساختاری و مکانیکی برابر یا بهتر از بافتی باشد که قرار است جایگزین آن شود. توسعه چنین ساختاری نیاز به انتخاب دقیق چهار پارامتر کلیدی دارد که عبارتند از: 1) نوع داربست، 2) عوامل رشد، 3) ماتریکس خارج سلولی (ECM) و 4) سلول (2). در مهندسی بافت مواد تشکیل دهنده داربست ها بهعنوان ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی را در رشد، سازماندهی و تمایز سلولها ایفا میکنند (3). در حال حاضر برای تولید داربستها با الیاف نانو سه تکنیک وجود دارد که عبارتند از: روش حرارتــی ناشــی از جداســازی اختلاف فــازی Thermally Induced Phase Separation (TIPS)، روش خود تجمعی (Self-Assembly Method) و روش الکتروریسی (Electrospinning) که در این میان الکتروریسی نسبت به بقیه روشها ساده تر و ارزانتر میباشد (4). یکی از نقاط قوت این روش، الکتروریسی از الیاف با قطرهایی در اندازه نانو میباشد که شبیه اندازه پروتئینهای فیبری موجود در ماتریکس خارج سلولی طبیعی مانند کلاژن میباشد. توانایی الکتروریسی نانوالیاف برای تقلید ساختار ماتریکس خارج سلولی حیاتی است، زیرا مطالعات نشان داده است که هر دو مقیاس ساختار و توپوگرافی داربستها نقش مهمی در تکثیر و چسبندگی سلولی دارند (5). با تغییر دادن پارامترهای مواد و حلال داربستها، جهت گیری فیبرها (موازی یا تصادفی) و اندازه تخلخل (برای نفوذ سلولها) داربست های الکتروریسی شده، میتوان آنها را برای مقاصد متفاوت استفاده کرد (6).
پلی کاپرولاکتون (PCL) یک پلی استر آلیفاتیک زیست تخریب پذیر و زیست سازگار است که به راحتی قابلیت الکتروریسی شدن را داشته و برای استفاده در بدن انسان تاییدیه(FDA) Food and Drug Administration را نیز دارد. با توجه به اینکه این پلیمر در شرایط فیزیولوژیکی (بدن انسان) با هیدرولیز پیوندهای استری تجزیه میشود، توانسته است، در مهندسی بافت توجه زیادی را برای استفاده بهعنوان بیومتریال قابل کاشت در بدن انسان بهخود جلب کند (7). برای تولید بافت جدید داربستها بهتنهایی یا همراه با سلول مورد استفاده قرار میگیرند. برای طراحی مواد زیستی جدید، ادغام علوم پایه پلیمر با زیست شناسی سلولی و مولکولی امری ضروری میباشد (8). یکی از منابع سلولی که برای این منظور میتواند مورد استفاده قرار گیرد، سلولهای بنیادی چربی انسانی میباشد که دارای توانایی تقسیم بالا بوده و در بافت زیرجلدی (هیپودرم) بدن به فراوانی یافت میشود. این سلولها بهخاطر دسترسی آسان، کشت راحت و سریع و نداشتن مسائل اخلاقی مثل سلولهای بنیادی جنینی برای اهداف پزشکی مورد توجه ویژه قرار گرفته است (9). هدف از این مطالعه بررسی مناسب بودن نانوالیاف PCL الکتروریسی شده بهروش تصادفی برای کاشت سلولهای بنیادی چربی انسانی جهت استفاده بالقوه در مهندسی بافت میباشد.
- مواد و روشها
طراحی مطالعه: مطالعه حاضر از نوع تجربی بهصورت in vitro پس از ثبت در سامانه پژوهشیار معاونت تحقیقات و فنآوری دانشگاه علوم پزشکی ایران و تاییدیهی کمیته اخلاق (IR.IUMS.REC.1391.180.68) و حمایت مالی این دانشگاه انجام شد.
تهیه داربست پلی کاپرولاکتون (PCL) با روش الکتروریسی: برای این منظور PCL (Aldrich، امریکا) با وزن ملکولی حدود 80.000 Mn استفاده شد. محلول PCL با غلظت (W / V 14٪) در اسید فرمیک (مرک، آلمان) و با استفاده از همزن مغناطیسی در دمای محیط حل شد. محلول پلیمر بهدرون سرنگ 5 میلی متری با سر سرنگ G 18 کشیده شد. نازلی بهطول 3 سانتی متر به سرنگ متصل شد. پس از هوا گیری محلول با سرعت ml/h 5/0، زاویه 25 درجه و ولتاژ kv20 پمپ شد. فایبرها بهصورت تصادفی روی یک صفحه آلومینیومی بهعنوان صفحه جمع کننده که در فاصله 12 سانتیمتری از نازل قرار داشت جمع شدند. برای تغییر خصوصیات سطحی اسکافولدها تیمار با پلاسما و با استفاده از دستگاه دینر (Germany) انجام شد. این فرایند تحت خلوص بالای گاز اکسیژن با 4/0 میلی بار فشار و 30 وات انجام شد. فرآیند تیمار با پلاسما حدود 5 دقیقه بهطول انجامید و سپس نمونهها در معرض هوا قرار گرفتند.
بررسی مورفولوژی نانو الیاف: برای بررسی مورفولوژی اسکافولدها از میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM(هیتاچی- ژاپن) استفاده شد. برای عکسبرداری از داربستها، آنها را با چسب کربنی بر روی نگهدارنده چسبانده و با پوششی از طلا پوشیده شدند، سپس نمونهها توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی در ولتاژ kv20 مشاهده و از آنها عکس تهیه شد. همچنین برای بررسی قطر الیاف الکتروریسی شده از تصاویر تهیه شده بهوسیله SEM استفاده شد. برای این منظور بهطور راندوم قطر 100 عدد از فایبرها بهوسیله نرم افزار 3.0Microstructure Mesurment اندازهگیری شد. درصد تخلخل اسکافولدها نیز بهوسیله فرمول P = (1−p/p0) ×100 طبق رفرنس اندازهگیری شد (10).
استخراج سلول: بافت چربی از چربی لایه سطحی شکم طی عمل لیپوساکشن از افراد 25 تا 35 سال (با کسب رضایت شخصی) که جهت انجام عمل جراحی لیپوساکشن به اتاق عمل عمومی بیمارستان حضرت رسول اکرم (ایران، تهران) مراجعه میکردند، تهیه شد. این افراد با توجه به گزارش پرونده شان هیچگونه سابقه بیماری ایدز و هپاتیت B نداشتند. نمونه گیری در شرایط استریل انجام گرفت سپس در ظرف استریل حاوی DMEM/Ham's F12، FBS 10 درصد و Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 5 درصد به آزمایشگاه منتقل شد. جداسازی سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی انسانی (hADSCs) طبق پروتکل Duboid et al. تغییر یافته انجام شد (9). نمونه چربی قبل از انجام مراحل استخراج در حمام آب تا 37 درجه سانتیگراد گرم شد. از آن تمام مراحل استخراج زیر هود استریل و با مواد و تجهیزات استریل انجام شد. شستشوی بافت چربی در لوله حاوی محلول Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 1 درصد (تهیه شده با PBS گرم) تا برداشت رگهای خونی و بافت همبند و در نهایت شفاف شدن بافت ادامه پیدا کرد (معمولا 2 مرتبه شستشو). نمونه جهت هضم بافتی به لوله حاوی کلاژناز 1/0 درصد و Bovine serum albumin (BSA) 1 درصد (تهیه شده با PBS گرم)، منتقل شد. سپس لوله حاوی نمونه بهمدت 30 دقیقه تا هضم کامل بافت و صاف شدن نمونه در حمام آب نگهداری شد. پس از هضم بافتی، لوله حاوی نمونه در دمای اتاق بهمدت 5 دقیقه با سرعت 1200rpm سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه مایع رویی، پلیت تشکیل شده با محلولBSA 1 درصد، تعلیق و یکبار دیگر سانتریفیوژ شد. در نهایت پلیت تشکیل شده با محیط کشت DMEM/Ham's F12 حاوی FBS 10 درصد و Streptomaycin(P/S) Penicilin/ 1 درصد تعلیق شده و به فلاسک منتقل شد. فلاسکها در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتیگراد، CO2 5 درصد، رطوبت 98 درصد) تا پاساژ سوم نگهداری شدند.
تایید hADSCs: بهمنظور شناسایی و تایید hADSCs از فلوسایتومتری استفاده شد. سلولهای موجود در فلاسکهای آماده برای پاساژ سوم پس از تخلیه محیط کشت و شستشو با Phosphate-buffered saline (PBS) ، از طریق مجاورت دادن با تریپسین 25/0 درصد بهمدت 4 دقیقه در انکوباتور از فلاسک جدا گردیده، پس ازخنثی سازی آنزیمی با استفاده از اضافه نمودن حجم مشابه از محیط کشت و انتقال به لوله آزمایش درب دار، جهت انجام فلوسایتومتری استفاده شدند.
فلوسایتومتری با استفاده از فلوسایتومتر Cyflow Space (Sysmex-Partec) انجام شد. آنتیبادیهای مورد استفاده برای فلوسایتومتری CD29-PE، CD73-PE، CD34-PE، CD105-FITC، و CD45-FITC بهعنوان آنتی بادیهای مستقیم و IgG1-PE و IgG1-FITC بهعنوان کنترل ایزوتیپ بودند. تمام آنتی بادیها از شرکت BD Biosciences بودند.
کاشت hADSCs بر روی داربست: قبل از کاشت hADSCs، نمونههای داربست با غوطهور شدن در اتانول 70 درصد بهمدت 30 دقیقه استریل شدند و بهمدت 60 دقیقه در معرض تابش UV قرار گرفتند. سپس نمونهها بهمدت 24 ساعت در محیط کشت DMEM/Ham's F12 در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. برای انجام کاشت سلولی، سلولها بهوسیله مخلوط (1به1) از 125/0 درصد تریپسین (سیگما، آمریکا) و 02/0 درصد Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (سیگما، آمریکا) از فلاسک کشت سلولی جدا شدند و سلولهای زنده توسط تریپان بلو شمارش شدند. سلولهای جدا شده با تراکم 104 × 4 سلول روی داربستهای آماده شده کاشته شدند.
بررسی چسبندگی و مورفولوژی سلول ها بر روی داربست: برای این منظور یک روز پس از کاشت سلولی، داربست ها از محیط کشت خارج شدند و نمونهها بهمدت 30 دقیقه در دمای محیط در پارافرمالدئید 4 درصد ثابت شدند. پس از شستشو با PBS (0.2M)، نمونهها بهمدت 50 دقیقه با درجات صعودی اتانول (50، 70، 80، 95 و 100 درصد) آبگیری شدند. سپس نمونهها با هگزا متیل دی سیلازان (سیگما، آمریکا) که یک عامل خشک کننده میباشد، تیمار شدند و بعد از پوشانده شدن با ذرات طلا تصاویر SEM تهیه و مورد بررسی قرار گرفت (11).
رنگ آمیزی DAPI سلول های کاشته شده روی داربست: سلولهای کاشته شده بهمدت 30 دقیقه در دمای اتاق در پارافرمالدئید 4 درصد فیکس شدند و باM) PBS (0.2 شسته شدند. سپس سلولها بهمدت 15 دقیقه با استفاده از تریتون 3 درصد (سیگما، آمریکا) نفوذ پذیر شدند. پس از شستشو با M) PBS (0.2 ، برای رنگ آمیزی هسته ای سلولها بهمدت 15 دقیقه در تاریکی با 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (سیگما، آمریکا) انکوبه شدند. سلولهای نشاندار شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس (Olympus Ax70) شناسایی شدند.
تعیین میزان زنده مانی سلولها (Cell Viability) بر روی داربست: برای بررسی میزان سمیت داربست نسبت به سلولهای مورد نظر از روش 3-4و5 دی متیل تیازول 2 وای ال 2و5 دی فنیل تترا زولیوم بروماید (MTT) استفاده شد. برای این منظور داربستهای توام با سلول بعد از 24، 48 و72 ساعت همراه با گروه کنترل (سلول موجود در کف پلیت) مورد ارزیابی قرار گرفتند. ابتدا در زیر هود و در تاریکی به میزان 10 درصد حجم محیط داخل پلیت محلول MTT (که با غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر تهیه شده است) اضافه شد. نمونهها بهمدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار داده شدند، سپس محیط حاوی MTT خارج و به هر کدام از چاهکها یک میلیلیتر Dimethyl sulfoxide (DMSO) اضافه شد. پس از 20 دقیقه محلول DMSO به پلیتهای 96 خانه منتقل شده و میزان جذب نوری محلول با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 570 نانومتر ثبت و مورد بررسی قرار گرفت.
3-آنالیز آماری
تمام آزمایشها در سه تکرار انجام شد و دادهها بهصورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. با استفاده از آزمون تی مستقل و آنالیز واریانس یکطرفه و سپس آزمون تعقیبی توکی ارزیابی معنیداری آماری بین گروههای مختلف انجام شد. مقدار (p<0.05 ) از نظر آماری معنیدار در نظر گرفته شد.
- نتایج
مورفولوژی سلول
سلولهای hADSCs در محیط DMEM/ Ham's F12 با FBS 10% کشت داده شدند. در پاساژ سوم سلولها با میکروسکوپ اینورت مجهز به دوربین بررسی شدند که شکل دوکی hADSCs با زواید شبه فیبروبلاستی کاملا مشخص بود (شکل1A ).
فلوسایتومتری
hADSCs دارای مارکرهای سطحی ویژه سلولهای مزانشیمی هستند یعنی CD29, CD73 و CD105 مثبت اند. سلولها در پاساژ سوم درصد بالایی از این مارکرها را بیان کردند. بدین شرح: CD29 (31/97درصد)، CD73 (11/99 درصد) و CD105 (08/86 درصد). بر خلاف این مارکرها، سلولهای hADSCs فاقد مارکرهای سطحی CD34 و CD45هستند یعنی CD34 و CD45 منفی اند. سلولها در پاساژ سوم درصد خیلی کمی از این مارکرها را بیان کردند. بدین شرح: CD34 (82/5 درصد) و CD45 (67/10 درصد) (شکل 1B-D).
|
|
||
|
|
شکل 1: کشت سلولی و فلوسیتومتری: A) شکل دوکی سلولها با زواید شبه فیبروبلاستی در پاساژ سوم، میکروسکوپ معکوس، بزرگنمایی × 100. B-D) بیان گسترده CD29، CD73، و CD105 (مثبت) و بیان بسیار کم CD34 و CD45 (منفی)
بررسی مورفولوژی و قطر الیاف های داربست
برای بررسی مورفولوژی و قطر الیافهای داربست از تصاویر میکروسکوپ الکترونی استفاده شد. برای بررسی و بهدست آوردن قطر الیافهای داربست بهطور تصادفی تعداد ١٠٠ عدد از الیاف انتخاب و قطر آنها بهوسیله نرم افزار Mesurment Microstructure اندازه گیری شد و نمودار میانگین اندازه قطر آنها توسط نرم افزار GraphPad Prism رسم شد. همانطور که نمودار نشان میدهد قطر اکثر الیاف (54 درصد) در محدوده بین 101 تا150 نانومتر قرار دارند (شکل 2A,B و شکل 3).
شکل 2: الکترو میکروگراف با میکروسکوپ الکترونی روبشی داربست PCL .A) الیافها بهصورت تصادفی درهم بافته شده اند. B) الیاف با بزرگنمایی بیشتر نشان داده شدهاند و قطر یکی از الیاف (R=95nm) نشان داده شده است (Scale bars (A) = 10μm, (B) = 750nm) .
شکل 3: نمودار میانگین اندازه قطر الیاف. قطر اکثر الیاف (54 درصد) در محدوده بین 101 تا150 نانومتر قرار دارند.
بررسی چسبندگی hADSCs بر روی داربست
با توجه به نتایج بهدست آمده از تصاویر ایمونوسیتوشیمی که نشان دهنده خاصیت چسبندگی hADSCs به داربست بود، تصاویر بهدست آمده از میکروسکوپ الکترونی نیز چسبندگی این سلولها بر روی داربست PCL را تایید کرد (شکل 4، A,B).
شکل 4: عکس میکروسکوپ الکترونی روبشی hADSCs بر روی داربست. A) هستههای رنگ شده با DAPI که حضور سلولها را در لابلای ل رشتههای داربست نشان میدهد. B) اتصال و چسبندگی hADSCs را 24 ساعت بعد از کاشت سلول روی رشتههای داربست را نشان میدهد .(Scale bars (A) = 200, (B) = 20μm)
بررسی قابلیت زنده ماندن سلول روی داربست
جهت بررسی میزان زنده بودن سلولها، 24، 48 و 72 ساعت پس از کاشت سلولها روی داربست و پلیت (کنترل) آزمونMTT انجام شد. نتایج بهدست آمده (شکل 5) نشان داد که داربست PCL نه تنها برای کشت سلول سمیت نداشت، بلکه توانست میزان زنده ماندن سلولها را افزایش دهد. چنانکه مقایسه میزان جذب نوری بین گروه کنترل و سلول + داربست نشان داد که این افزایش در گروه سلول + داربست 48 و 72 ساعت بعد از کاشت سلول از نظر آماری معنیدار بود (P<0.05).
شکل 5: آزمون MTT بین گروه پلیت و سلول + داربست، 24 ، 48 و 72 ساعت بعد از کاشت سلولها
*افزایش معنی دار نسبت به گروه کنترل (پلیت) p<0.05),).
- بحث
تحقیق در مورد استفاده از سلولهای بنیادی در مهندسی بافت یک مفهوم در حال ظهور میباشد. مطمئنا بسیاری از بخشهای تحقیقات در مورد سلولهای بنیادی و کاربرد بالقوه آنها با چالشهایی همراه است، بنابراین پرداختن به مسائل اخلاقی، قانونی و اجتماعی ضروری میباشد. سلولهای بنیادی سوماتیک (سلولهای بنیادی بالغ) بهطور طبیعی در بدن وجود دارند (12) و در صورت دسترسی به آنها بسیاری از مشکلات فوق حل خواهد شد. تحقیقات نشان دادهاند که سلولهای بنیادی در بافتهای مختلف بدن از جمله بافت چربی، اسکلتی- عضلانی، کبد، عصبی و ... وجود دارد (13). سلولهای بنیادی بافت چربی که در قسمتهای مختلف بدن بهوفور یافت میشود، ویژگیهای سلولهای بنیادی پرتوان مثل پتانسیل تکثیر بالا و ورود به حالت سکون را دارند. در این مطالعه نیز سلولهای بنیادی از بافت چربی زیر جلدی جدا و توسط مارکرهای خاص خودش مورد تایید قرار گرفت. مطالعات نشان داده اند این سلولها توانایی تمایز به سلولهای عصبی، کراتوسیت، استئوبلاست، کندروسیت و سلولهای عضلانی را در شرایط آزمایشگاهی دارند (14)، بنابراین میتواند کاندید مناسبی برای تولید انواع بافتها باشد.
مطالعات در زمینه مهندسی بافت نشان داده اند که پلیمرهای مصنوعی برای ترمیم بسیاری از آسیب ها مفید بوده است. نانو الیافها بهطور گسترده در مهندسی بافت استفاده میشوند و با افزایش سطح نسبت به حجم، برهمکنش بین سلول و داربست و در نتیجه تکثیر سلولی را افزایش میدهد (15) که در مطالعه حاضر و مطالعات مشابه بهوسیله نتایج MTT و تصاویر SEM تایید شده است. در این مطالعه سلولهای بنیادی چربی انسانی بر روی داربست PCL کشت داده شدند تا مشخص شود، آیا داربست فوق برای سلول سمیت دارد یا نه. نتایج حاصل از بررسی بهروش MTT نشان داد که این داربست نه تنها برای سلولها سمیت ندارد بلکه با افزایش سطح قابل اتصال سلولها باعث تکثیر و افزایش تعداد آنها میشوند و میتوانند در زمان کم نسبت به گروه کنترل زمینه افزایش تعداد سلولها را فراهم آورند که این کاهش زمان و افزایش تولید سلول در بالین از اهمیت ویژهای برخوردار میباشد. نتایج مطالعات مشابه نیز نشان داده اند که قابلیت زنده ماندن و میزان تکثیر سلولهای فیبروبلاست و همچنین سلولهای بنیادی فولیکول مو بر روی داربست PCL در مقایسه با سلولهای کشت داده شده بر روی پلیت افزایش قابل توجهی یافته است (10, 15) که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد. خصوصیت آب دوست یا آبگریز بودن داربستها برای کشت بافت مهم میباشد و میتواند توانایی اتصال، تکثیر و تمایز سلولی را تحت تاثیر قرار دهد (15). جهت آب دوست کردن داربستها آنها را با پلاسما آغشته میکنند (16). در این مطالعه نیز که سطح داربستها با پلاسما پوشانده شده بود، نتایج حاصل از تصاویر SEM سلولها بر روی داربست و نتایج بررسی قابلیت زنده مانی سلولها با MTT نشان داد که سلولها در مقایسه با گروه کنترل بهخوبی روی داربستها اتصال یافته و تکثیر پیدا کردند. نتایج مطالعات مشابه نشان داد که پوشاندن داربستهای PCL با پلاسما آبدوستی آنها را بیشتر کرده و در نتیجه اتصال و تکثیر فیبروبلاستهای انسانی را افزایش داده است (15). مطالعات نشان داده اند که در نانو الیافها بهدلیل کوچک بودن اندازه منافذ، سلول ها قادر به نفوذ به داخل داربست ها نمی باشند (17). برای غلبه بر این مشکل روشهایی مثل الکتروریسی و لیچینگ الیاف کمک کننده می باشد (18). در مصالعه حاضر نتایج تصاویر SEM اندازه گیری شده با نرم افزار Mesurment Microstructure نشان داد که داربست PCL اصلاح شده با تخلخل بالا (78 درصد) برای نفوذ سلولها مناسب میباشد. نانو الیاف الکتروریسی شده شباهت مورفولوژیکی بالایی با ماتریکس خارج سلولی طبیعی دارد، ساختارهای متخلخل آنها مهاجرت سلولی و جابهجایی مواد و متابولیتها را تسهیل میکند. قطر الیاف یکی دیگر از ویژگیهای داربستها میباشد که میتواند بهوسیله افزایش نسبت سطح به حجم و تخلخل بر چسبندگی، مهاجرت و تکثیر تاثیر بگذارد (19). افزایش نسبت سطح به حجم و افزایش تخلخل ساختار نانو الیاف میتواند سطح تماس بین سلولها و داربست را افزایش دهد. این خاصیت جذب فاکتورهای رشد بهوسیله سلولها را تسهیل میکند و به مهاجرت، تکثیر و تمایز سریع سلولها منجر میشود، که بهوسیله تصاویر SEM و نتایج MTT تایید شده است. در این مطالعه از روش الکتروریسی برای ساخت داربستهای تصادفی اصلاح شده نسبت به مطالعات دیگر بهوسیله تغییر دادن قطر الیاف، افزایش تخلخل و تغییر خصوصیات سطحی بهوسیله کوت کردن با پلاسما استفاده شد و سلولهای بنیادی چربی انسانی روی آن کاشته شد.
- نتیجهگیری
نتایج نشان داد که این داربست برای سلول بنیادی چربی انسانی سمی نبوده و برای کشت آن مناسب میباشد. امیدواریم نتایج این مطالعه برای توسعه تکنیک الکتروریسی برای بهینه سازی داربست PCL و طراحی نانو الیاف برای کاربرد در مهندسی بافت مفید واقع شود.
- تشکر و قدردانی
مطالعه حاضر تحت حمایت مالی معاونت تحقیقات و فن آوری دانشگاه علوم پزشکی ایران انجام شده است لذا بدینوسیله نویسندگان این مقاله مراتب قدردانی خود را از این معاونت اعلام میدارند.
-
- Shieh SJ, Vacanti JP. State-of-the-art tissue engineering: from tissue engineering to organ building. Surgery. 2005;137(1):1-7.
- Naughton GK. From lab bench to market: critical issues in tissue engineering. Ann N Y Acad Sci. 2002;961(1):372-85.
- Santoro M, Shah SR, Walker JL, Mikos AG. Poly(lactic acid) nanofibrous scaffolds for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2016;107:206-12.
- Smith LA, Liu X, Ma PX. Tissue Engineering with Nano-Fibrous Scaffolds. Soft Matter. 2008;4(11):2144-9.
- Recum AFV, Shannon CE, Cannon CE, Long KJ, Kooten TGV, Meyle J. Surface roughness, porosity, and texture as modifiers of cellular adhesion. Tissue Engineering. 1996;2(4):241-53.
- Vellayappan M, Venugopal J, Ramakrishna S, Ray S, Ismail A, Mandal M, et al. Electrospinning applications from diagnosis to treatment of diabetes. RSC Advances. 2016;6(87):83638-55.
- Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, et al. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009;54(2):73-83.
- Nassif L, El Sabban M. Mesenchymal Stem Cells in Combination with Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials (Basel). 2011;4(10):1793-804.
- Dubois SG, Floyd EZ, Zvonic S, Kilroy G, Wu X, Carling S, et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 2008;449:69-79.
- Yari A, Teimourian S, Amidi F, Bakhtiyari M, Heidari F, Sajedi N, et al. The role of biodegradable engineered random polycaprolactone nanofiber scaffolds seeded with nestin-positive hair follicle stem cells for tissue engineering. Adv Biomed Res. 2016;5:22.
- Yang F, Murugan R, Wang S, Ramakrishna S. Electrospinning of nano/micro scale poly (L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 2005;26(15):2603-10.
- Lobo NA, Shimono Y, Qian D, Clarke MF. The biology of cancer stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 2007;23:675-99.
- Bhartiya D. Adult tissue-resident stem cells—fact or fiction? Stem Cell Research & Therapy. 2021;12(1):1-4.
- Huang SJ, Fu RH, Shyu WC, Liu SP, Jong GP, Chiu YW, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cell Transplant. 2013;22(4):701-9.
- Safaeijavan R, Soleimani M, Divsalar A, Eidi A, Ardeshirylajimi A. Biological behavior study of gelatin coated PCL nanofiberous electrospun scaffolds using fibroblasts. Archives of Advances in Biosciences. 2014;5(1).
- de Valence S, Tille J-C, Chaabane C, Gurny R, Bochaton-Piallat M-L, Walpoth BH, et al. Plasma treatment for improving cell biocompatibility of a biodegradable polymer scaffold for vascular graft applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2013;85(1):78-86.
- Townsend-Nicholson A, Jayasinghe SN. Cell electrospinning: a unique biotechnique for encapsulating living organisms for generating active biological microthreads/scaffolds. Biomacromolecules. 2006;7(12):3364-9.
- Pham QP, Sharma U, Mikos AG. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 2006;7(10):2796-805.
- Cao H, Liu T, Chew SY. The application of nanofibrous scaffolds in neural tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61(12):1055-64.